Biologia Molecolare: Introduzione e Concetti Chiave

Che cos’è la Biologia molecolare?
• Disciplina diretta alla comprensione dei
fenomeni biologici in termini molecolari
• Lo studio della struttura di un gene e della sua
funzione a livello molecolare
• La Biologia molecolare è una disciplina “ibrida”
che si è sviluppata dalla Genetica e dalla
Biochimica
Biologia Molecolare
• I primi esperimenti genetici furono condotti da
Gregor Mendel nella metà del XIX secolo. I
primi studi non si possono definire di vera e
propria biologia molecolare né di genetica
molecolare, ma di genetica della trasmissione
• Fino al 1944 la struttura chimica del gene era
sconosciuta, solo dopo questa scoperta fu
possibile studiare i geni come molecole
La genetica della trasmissione
• 1865 Mendel pubblica le sue scoperte sulla
ereditarietà di sette caratteri della pianta del
pisello verde
• L’ereditarietà è “particolata”
• Fattori particolati = geni
• L’ereditarietà che segue le leggi di Mendel
viene definita ereditarietà mendeliana
Biologia Molecolare
• Alleli = forme alternative dello stesso gene.
Un allele può essere dominante rispetto all’altro
o recessivo
• Individui eterozigoti (una sola copia per ogni
allele) ed omozigoti (due copie dello stesso
allele)
Biologia Molecolare
• Dopo il 1900 venne accettata la natura particolata
del gene ed il campo della genetica cominciò a
sbocciare
• Ogni gene ha una sua determinata localizzazione sul
cromosoma detta locus
• Gli organismi diploidi presentano due copie di tutti i
cromosomi, fatta eccezione per quelli che
determinano il sesso. Ciò significa che possiedono
due copie della maggior parte dei geni
• La teoria cromosomica dell’ereditarietà afferma che
i geni sono disposti in maniera lineare lungo i
cromosomi.
Biologia Molecolare
• In che modo viene conservato il materiale
genetico?
• Come viene decodificata l’informazione
contenuta nel materiale genetico?
Definizioni
• Acidi nucleici:
molecole che codificano l’informazione
genetica: DNA, RNA
• Gene:
segmento di DNA che codifica una
catena polipeptidica
• Genoma:
insieme delle sequenze di DNA di un
organismo
Breve storia della genetica
1865
1903
1910
1913
1927
1931
1944
1945
1953
1958
1961
1977
1997
2001
I geni sono dei fattori particolati Primi studi chimici sul DNA
I cromosomi sono unità ereditarie
I geni sono localizzati nei cromosomi
I cromosomi contengono degli insiemi lineari di geni
Le mutazioni sono dei cambiamenti fisici nei geni
La ricombinazione è causata dal “crossing-over”
Il DNA è il materiale genetico
Un gene codifica una proteina
Il DNA ha una struttura a doppia elica
Il DNA si replica in maniera semiconservativa
Il codice genetico è costituito da triplette di basi
Sequenziamento del DNA
Sequenziamento di interi genomi
Sequenziamento del genoma umano
Friedrich Miescher
(1844-1895)
The laboratory located in the vaults of an old castle
where Miescher isolated nuclein (1879)
Friedrich Miescher
• Intorno al 1860 si dedicò allo studio di meccanismi
biochimici e cellulari indispensabili per la vita
• Presso le cliniche chirurgiche raccoglieva le bende
usate, dalle quali recuperava il pus, grattandolo via
• Scoprì che il pus delle ferite infette era formato dai
globuli bianchi del sangue che avevano reagito con i
batteri responsabili dell’infezione
• Nel corso dei suoi esperimenti scoprì una sostanza
ignota nei nuclei delle cellule del pus, che estrasse
trattando le cellule con pepsina, un enzima che
digerisce le proteine
• Definì tale sostanza “nucleina” e dimostrò che essa
era presente anche nei nuclei di altre cellule
Levene working in the lab
Levene's laboratory with
some of his students (1909).
Strutture del tetranucleotide
proposte
da Levene e Tips
da Takahashi
1865
1903
1910
1913
1927
1931
1944
1945
1953
1958
1961
1977
1997
2001
I geni sono dei fattori particolati
I cromosomi sono unità ereditarie
I geni sono localizzati nei cromosomi
I cromosomi contengono degli insiemi lineari di geni
Le mutazione sono dei cambiamenti fisici nei geni
La ricombinazione è causata dal “crossing-over”
Il DNA è il materiale genetico
Un gene codifica una proteina
Il DNA ha una struttura a doppia elica
Il DNA si replica in maniera semiconservativa
Il codice genetico è costituito da triplette di basi
Sequenzamento del DNA
Sequenzamento di interi genomi
Sequenziamento del genoma umano
Il DNA è il materiale genetico dei batteri
Concetti chiave
 La trasformazione batterica ha fornito la prima prova
che il DNA è il materiale genetico. Le proprietà
genetiche possono essere trasferite da un ceppo
batterico ad un altro estraendo il DNA dal primo
ceppo e aggiungendolo al secondo
Esperimento di "trasformazione" batterica: Griffith, 1929
Pneumococco (Streptococcus pneumoniae)
Esperimento di "trasformazione" batterica: Griffith, 1929
Pneumococco (Streptococcus pneumoniae)
• Un principio “trasformante” converte il
ceppo R in S
Oswald Avery at work in the laboratory, around 1930
Trasformazione di pneumococchi mutanti R
in tipo S mediante estratto cellulare
moltiplicazione del ceppo S
preparazione del principio trasformante
lisi
estratto
precipitazione cellulare
trasformazione del ceppo R
fattori
sierici
principio
trasformante
Il DNA è il materiale genetico dei virus
Concetti chiave
 L’infezione fagica ha dimostrato che il DNA è il
materiale genetico dei virus. Quando il DNA ed i
componenti proteici dei batteriofagi sono marcati con
isotopi radioattivi diversi, soltanto il DNA è
trasmesso alla progenie fagica prodotta infettando
dei batteri
Alfred Hershey and Martha Chase (1953)
L'esperimento del "frullatore” - Hershey e Chase, 1952
Fagi marcati con P32 nel DNA
e con S35 nelle proteine
infettano i batteri
frullatore
I capsidi fagici contengono
l'80 % del S35 mentre
i batteri infettati contengono
il 70 % del P32
lisi
La progenie fagica
contiene il 30 % del P32
e < 1% del S35
Il DNA è il materiale genetico delle cellule animali
Concetti chiave
 Il DNA può essere utilizzato per introdurre nuove
caratteristiche genetiche in cellule animali o in animali
interi
 In alcuni virus il materiale genetico è RNA
Il DNA è il materiale genetico delle cellule animali
 Quando si aggiunge DNA a popolazioni di cellule
eucariotiche singole che crescono in coltura, l’acido
nucleico entra nelle cellule e in alcune di esse porta
alla produzione di nuove proteine
 Quando si usa DNA purificato, la sua incorporazione
porta alla produzione di una particolare proteina
 Il DNA che viene introdotto nella cellula ricevente
diventa parte del suo materiale genetico e viene
ereditato nello stesso modo di qualunque altra parte
del genoma
La struttura chimica del DNA
Acidi nucleici
Macromolecole InformazionaliAcidi Nucleici: Polimeri di nucleotidi
Gli acidi nucleici sono polimeri di nucleotidi che
consistono di un gruppo fosfato, uno zucchero e
una base contenente azoto.
Le basi nel DNA sono: adenina, guanina, citosina
e timina.
Nell’RNA l’uracile sostituisce la timina.
Componenti chimici degli acidi nucleici
5 CH2OH O
1
4
2-desossiribosio
( 2-deoxyribose )
6
3
5
OH
1
4
2
3
OH
2
OH
ribosio
OH
NH2
7
1N
5 CH2OH O
OH
N
O
N
N
HN
N
8
2
N
4
N9
H
3
N
purina
N
H
adenina
N
H
N
H2N
guanina
NH2
O
O
4
CH3
3N
5
2
6
N
1
N
H
pirimidina
citosina
N
O
HN
HN
O
N
H
uracile
O
N
H
timina
Zuccheri
Basi azotate
Nucleoside
Costituito dal legame
tra lo zucchero
pentoso e la base
azotata
Nucleotide
Costituito dal legame
tra un nucleoside e
il/i gruppi fosfato
-O
O
O
O
P O
P O
P O CH2
O-
O-

O-


OH
O
OH
Basi, nucleosidi e nucleotidi
Base
Nucleoside
Nucleotide
RNA
DNA
Adenina
Adenosina
Adenosina-5’-fosfato
(Acido adenilico)
AMP
dAMP
Guanina
Guanosina
Guanosina-5’-fosfato
(Acido Guanilico)
GMP
dGMP
Citosina
Citidina
Citidina-5’-fosfato
(Acido citidilico)
CMP
dCMP
Timina
Timidina
Timidina-5’-fosfato
(Acido timidilico)
Uridina
Uridina-5’-fosfato
(Acido uridilico)
Uracile
dTMP
UMP
O
CH2OH
O
-O
-O
O
OH
P O CH2
O-
OH
O
OH
P O
O-
(Pirimidina)
3'- monofosfato
(Purina)
5'- monofosfato
I nucleotidi possono portare il gruppo fosfato
in posizione 5' o 3'
Una catena polinucleotidica consiste di una serie di
legami zucchero-fosfato 5’-3’ che forma
un’ossatura dalla quale sporgono le basi
Studi chimici
 Il DNA è il materiale genetico in tutti gli organismi
(con l’eccezione di alcuni virus)
 I costituenti chimici degli acidi nucleici sono i
nucleotidi
Rimane da decifrare la struttura esatta del DNA
Come sono organizzate le catene polinucleotidiche
all’interno del DNA?
Il DNA è costituito da una o più catene
polinucleotidiche?
Come sono legate tra loro?
Come è correlata la struttura di questa molecola con le
diverse funzioni genetiche cui deve assolvere?
Erwin Chargaff
Per primo misurò accuratamente la percentuale dei
quattro nucleotidi nel DNA
Composizione in basi del DNA di varie specie
Organismo
Escherichia coli
Mycobact. tuberc.
Lievito
Bue
Maiale
Uomo
A
G
C
T
A/T
G/C
G+C
Py/Pu
26.0
15.1
31.7
29.0
29.8
30.4
24.9
34.9
18.3
21.2
20.7
19.9
25.2
35.4
17.4
21.2
20.7
19.9
23.9
14.6
32.6
28.7
29.1
30.1
1.08
1.03
0.97
1.01
1.02
1.01
0.99
0.99
1.05
1.00
1.00
1.00
50.1
70.3
35.7
42.4
41.4
39.8
1.04
1.00
1.00
1.01
1.01
1.01
Regole di Chargaff
 La composizione in basi del DNA varia da una specie
ad un’altra
Le molecole di DNA isolate da tessuti diversi della
stessa specie hanno la stessa composizione
La composizione in basi del DNA di una data specie
non si modifica con l’età dell’organismo, con lo stato
nutrizionale o in seguito a variazioni ambientali
In tutte le molecole di DNA, il numero di residui di
Adenina è uguale al numero di residui di Timina e il
numero di residui di Guanina è uguale al numero di
residui di Citosina
La struttura fisica del DNA
Maurice Wilkins
(1916 - 2004)
Francis Crick
(1916 - 2004)
Linus Pauling
(1901 - 1994)
Rosalind Franklin
(1920 - 1958)
James Watson
(1928 )
Diffrazione dei raggi X di fibre di DNA
configurazione B
Franklin R.E. & Gosling R., 1953
configurazione A
Wilkins M.H.F., 1956
Diffrazione dei raggi X di fibre di DNA
(Franklin e Wilkins 1950)
configurazione B
Il Dna ha una struttura ad
elica regolare (segnali
centrali)
La distanza tra i nucleotidi
è di 3,4Å (le tracce scure in
alto e in basso forniscono una
stima della periodicità delle
basi azotate)
Franklin R.E. & Gosling R., 1953
1953:James Watson e Francis Crick scoprono la
struttura del DNA
La struttura del DNA
Dati di diffrazione ai raggi X
dimostravano che il DNA ha la forma
di un’elica regolare con un giro
completo di 34Å ed un diametro di
20Å. Poichè la distanza fra nucleotidi
adiacenti è di 3,4Å, devono esserci
10 nucleotidi per giro
La densità del DNA suggeriva che
l’elica dovesse contenere due catene
polinucleotidiche. Il diametro
costante dell’elica può essere
spiegato assumendo che le basi di
ciascuna catena siano rivolte verso
l’interno, su una superficie piatta,
perpendicolari all’asse longitudinale
della molecola e ad una distanza di
3,4Å l’una dall’altra
20
La struttura del DNA
Le basi sono sottoposte alla
restrizione che una purina è sempre
opposta ad una pirimidina, evitando
coppie purina-purina (troppo larga)
e pirimidina-pirimidina (troppo
stretta)
Indipendentemente dalle quantità
assolute di ciascuna base, nel DNA
la proporzione di G è sempre la
stessa di quella di C e la
proporzione di A è sempre la stessa
di quella di T. Così la composizione
di qualunque DNA può essere
descritta dalla proporzione delle
sue basi G+C, che varia dal 26% al
74% in specie diverse
La struttura del DNA
Le basi azotate di catene opposte
si appaiono mediante legami
idrogeno (appaiamento delle basi)
L’Adenina è sempre legata alla
Timina mediante due legami
idrogeno (basi complementari)
La Guanina è sempre legata alla
Citosina mediante tre legami
idrogeno (basi complementari)
L’ossatura di zuccheri-fosfati si
trova all’esterno e porta cariche
negative sui fosfati
Le due catene sono antiparallele
cioè, il loro orientamento, nel senso
5’-3’, è opposto
Legami idrogeno tra le basi azotate
La struttura del DNA
Si può considerare la doppia elica
come se fosse una scala a
chiocciola: le coppie di basi formano
i gradini; procedendo lungo l’elica, le
basi sono impilate l’una sull’altra
Ciascuna coppia di basi è ruotata di
circa 36° intorno all’asse dell’elica
rispetto alla coppia successiva di
basi e quindi circa 10 coppie di basi
compiono un giro completo di 360°
L’avvolgimento dei due filamenti
forma una scanalatura principale
(larga circa 22Å) ed una scanalatura
secondaria (larga circa 12Å)
La doppia elica è destrogira