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Scuola
Il sistema maggiore di
istocompatibilità: struttura e
tipizzazione HLA
Prof. Amedeo Amedei
Dipartimento Medicina Interna
[email protected]
1
Major Histocompatibility Complex
Gruppo di geni polimorfici costituito da 30 unità (ad oggi): cromosoma 6 (uomo), 17 ( topo).
Proteine Tradotte: Proteine del MHC espresse sulla membrana cellulare, 21 Idrossilasi,
Frazioni del complemento C4B,C4A,BF e C2, Proteina chaperone HSP70 , proteine della
famiglia del TNF.
Due principali classi MHC: la classe I (MHC-I: tre copie per ogni cromosoma) e la classe II
(MHC-II: sei copie per ogni cromosoma). Essi sono responsabili di situazioni fisiologiche, e
talvolta patologiche, nettamente differenti nell'ambito dell'organismo.
I prodotti dei geni MHC-I sono antigeni direttamente implicati nel fenomeno del rigetto, quelli
che derivano dall' MHC-II sono attivi nei fenomeni di cooperazione cellulare che si verificano
nell'ambito della risposta immunitaria.
Nell'uomo l'MHC prende il nome di Human leukocyte antigen (HLA).
2
Major Histocompatibility Complex
Le molecole di Classe I vengono espresse pressoché su tutte le cellule nucleate (in cellule
prive di nucleo, come i globuli rossi, poco espressi) e sono formate da un polipeptide
transmembrana di 44.000 dalton, codificato dall'MHC, associato alla β2-microglobulina, una
molecola invariante di 15.000 dalton codificata dal cromosoma 15.
Le molecole HLA di Classe II sono presenti solo su alcune cellule immunocompetenti: APC
(antigen presenting cell), quali cellule dentritiche, linfociti B e macrofagi. Inoltre la loro
presenza, anche su queste cellule, non è costante, ma soggetta a modulazione, a seconda
dello stato di attivazione della cellula. Questa espressione viene modulata dalla presenza o
meno di alcune interleuchine.
Le molecole di Classe II sono proteine di membrana eterodimeriche, formate cioè da una
catena α (che varia fra i 33.000 e i 34.000 dalton), e da una catena β (fra i 28.000 e i 29.000
dalton), entrambe codificate dall'MHC. C'è poi una terza catena, detta invariante, che non
attraversa la membrana cellulare.
3
Major Histocompatibility Complex
Sia le molecole di classe I che quelle di classe II fungono da bersaglio per i linfociti T, che
regolano la risposta immunitaria. Affinché un antigene venga legato su una molecola di
membrana MHC dev'essere processato ( processo al termine del quale si legherà ad una
molecola MHC classe I o II).
Processazione in fase citosolica (comune per proteine di derivazione virale) l'Ag si
legherà ad MHC I implicando l'attivazione dei linfociti T "citotossici" o "CD8+", effettori
diretti delle risposta immunitaria specifica cellulo-mediata, che lisano le cellule che li
hanno attivati.
Processazione esclusivamente in vescicole endosomiali (tipico per proteine di
derivazione batterica), L'Ag si legherà ad una molecola MHC II ed attivazione dei
linfociti T "helper" o "CD4+". Questi svolgono la propria attività producendo citochine
che contribuiranno all'attivazione di linfociti B(linea Th2) o all'attività citotossica dei
linfociti T CD8+ o dei fagociti mononucleati ( lineaTh1).
4
Sistema HLA
Insieme di geni localizzati sul cromosoma 6 (6p21.3)
Parte della regione genetica MHC (Major Histocompatibility Complex)
MHC = 4 x 106 paia di basi (0,1 % genoma nucleare):
HLA classe I
1/3 della porzione
HLA classe II
HLA classe III (complemento, ormoni, altri geni indefiniti)
Struttura Molecolare dei geni: simile per i geni di classe I e II
sequenza di introni (non codificanti e di regolazione) ed esoni (codificanti)
Piccole differenze che rispecchiano differenze strutturali
5
HLA Classe I
3 loci funzionanti: HLA-A, HLA-B, HLA-C
Glicoproteine altamente polimorfe espresse sulla membrana cellulare
Classe I : geni codificano per la catena a dell’eterodimero a/b
b = b2-microglobulina (cromosoma 15), fondamentale per l’espressione del complesso
Sruttura: 4 regioni extracellulari: 3 a (a1,a2, a3) 1 b2-microglobulina
Catena a = aa idrofobici (ancoraggio) + regione intracitoplasmatica
Elevato Polimorfismo: 50-100 alleli (topo – uomo)
Esigenza Tipizzazione (impossibile trovare due individui uguali)
6
HLA Classe I
Meccanismi alla base della eterogenicità:
Sostituzioni di singoli nucleotidi
Ricombinazioni Reciproche
Conversioni Geniche
Espressione:Tutte le cellule nucleate (no eritrociti)
Eccezioni: cell. Nervose, spermatozoi, cell.ossee
Differenza di concentrazione
Funzione HLA Classe I:
Presentazione Peptidi ai T CD8
Fibroblasti
Cell. Nervose
Cell. Muscolari
Bassi Livelli
APC
Alti Livelli
Domini a1 ed a2
7
HLA Classe II
Espressione: numero limitato di cellule
Dopo stimolazione con INF-g
Trasformazione neoplastica
Cell. Epiteliali del Timo
APC
Precursori Mieloidi ed Eritroidi
Struttura : catena a + catena b (legame no covalente)
Cell. Endoteliali
Cell. Gastriche
Linfociti T
Nell’uomo = 3 Famiglie di geni e proteine: HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP
Caratteristica = Elevato Polimorfismo
Geni per le classi degli eterodimeri a/b : DR = DRb1, DRb2, DRa
DQ = DQb e DQa
DP = DPb e DPa
8
HLA Classe II
Ruolo: presentazione peptidi ai linfociti T helper
Le differenti molecole di classe II = responsabili varietà individuale della risp. Imm. Ag
Regolazione della risposta immune: cell. epiteliali del Timo = tolleranza del self
Restrizione del fenomeno citotossico per i linfociti T CD4+ citotossici
9
Major Histocompatibility Complex
MHC
•Regione genomica conservata
presente in tutti vertebrati
HLA
Human Leukocyte Antigen
Negli anfibi
(xenopus) sono
presenti geni di
classe I,II e III in
stretto linkage tra
loro, il che
suggerisce l’ipotesi
che questa regione
possa essere
presente da più di
370 milioni di anni
10
11
The biological importance of
HLA
Nature had certainly not maintained a polymorphism
such as that of HLA only to frustrate transplant
surgeons.
(Ceppellini, 1967)
12
13
Processamento e presentazione
dell’Ag: tappe principali
•Endocitosi dal compartimento extracellulare all’interno delle APC
•Processamento dell’Ag in specifici compartimenti cellulari con
generazione di frammenti peptidici
•Legame del peptide alle molecole di MHC di classe II all’interno
di particolari vescicole
•Espressione del complesso MHC-peptide sulla superficie cellulare
•Riconoscimento del complesso da parte dei linfociti TH
14
Presentazione dell’antigene in associazione
a molecole MHC di classe I
15
HLA
16
Molecole HLA
Le molecole di classe I sono il risultato dell’assemblaggio
di una catena pesante a codificata dai geni MHC e da una
catena leggera, la b 2-microglobulina il cui gene è situato
sul cromosoma 15.
La catena pesante
è suddivisa in tre
porzioni (dominii)
di cui la 1° e la 2°
sono polimorfiche.
17
Struttura terziaria
La variabilità è massima in tre regioni dei primi due
dominii:le posizioni da ~60 a 83; da 92 a ~120 e da ~ 145 a
165.
Queste aree sono anche chiamate regioni ipervariabili (HVR - in
analogia con la terminologia delle immunoglobuline).
dominio a1
dominio a2
dominio a3
18
Posizione nella sequenza
Le molecole di classe II, sostanzialmente simili a quelle
di classe I, sono costituite da una catena a e una catena
b codificate da geni della regione MHC.
Entrambe le catene hanno due dominii e partecipano, con il
primo, alla formazione della tasca ABC:
la diversità è situata nel dominio-b1, dell’esone 2,
Catena a
Catena b
Struttura terziaria
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Base Molecolare dei tipi e delle varianti MHC
POLIGENIA
Monogenia : un gene è responsabile da solo per la presenza di un
Molti geni MHC di classe I e di classe II codificano per tipi
carattere (p.e. gene del daltonismo nell’uomo):
differenti di molecole MHC con un range di specificità di
legame per il peptide da presentare
Poligenia : per determinare un carattere specifico servono diversi
geni che si possono trovare
anche su diversi cromosomi
POLIMORFISMO
Presenza ad in singolo locus genetico di varianti (alleli) con
POLIGENIA ADDITIVA:
Quando
ogni
gene, preso
frequenza >1%
in una
popolazione.
singolarmente,
avrebbe unil effetto
piuttosto
limitato,
ma in grado
I geni MHC presentano
massimo
grado di
polimorfismo
noto
di cumularsi con l'azione modesta, ma simile, degli altri Poligéni.
I tipi e le varianti delle molecole MHC di un individuo non variano nel corso
della sua vita.
POLIGENIA COMPLEMENTARE: (geni modificatori) Quando
l'azione
dei delle
poligéni
non MHC
si somma,
contribuisce
La diversità
molecole
esiste ma
soprattutto
a livello parzialmente
di popolazione.
alla formazione di un carattere complesso.
Ciò è in netto contrasto con la diversità dei recettori dei linfociti T e B e delle
20
immunoglobuline che si riscontra nell’individuo stesso.
HLA
Posizione: braccio corto cromosoma 6 (6p21.3), a circa 6.000 Kb dal centromero una parte della regione MHC, che si estende
per circa 4 milioni di paia di basi (pb), circa 0.1 % del genoma nucleare
MHC = 2/3 geni HLA I e II, 1/3 HLA classe III (fattori complemento, ormoni, shock protein …)
Disposizione (a partire dal centromero):
21
HLA
Regione HLA: circa 4.000kb, 3 serie di loci
che codificano per 3 tipi di molecole diverse
Classe I, II e III.
22
23
Mappa dettagliata della regione HLA
24
HLA map 2005
25
Codominanza
•
La codominanza è un evento genetico che si riscontra quando due alleli si manifestano entrambi
in modo completo, e quindi entrambi sono riconoscibili negli eterozigoti, dal punto di vista del
fenotipo.
•
La codominanza si manifesta negli individui diploidi o poliploidi. Un individuo diploide (come
l'uomo) è dotato di un doppio assetto cromosomico, i due cromosomi di una stessa coppia
cromosomica porteranno due alleli (uno per ogni cromosoma) per uno stesso gene. Gli alleli
possono essere uguali e dominanti (omozigote dominante), uguali e recessivi (omozigote
recessivo) o diversi (eterozigote). Nell'eterozigote un allele (dominante) può prevalere sull'altro
(recessivo) ed il fenotipo è determinato solo da un allele (quello dominante). In alcuni casi la
dominanza può non essere completa ed in altri casi si può manifestare la codominanza:
entrambi gli alleli si manifestano nel fenotipo.
•
Un esempio è il sistema sanguigno A,B,0, che è costituito da 3 alleli (IA,IB,I0), la cui
combinazione determina 4 fenotipi (gruppi sanguigni): tipo A (IAIA o IAI0 ), B (IBIB o IB I0), 0
(I0 I0) ed AB (IA IB), IA IB sono dominanti su I0 e codominanti fra loro. Ogni allele specifica
per un antigene (gli individui A avranno l'antigene A, i B l'antigene B, gli 0 nessun antigene e gli
AB entrambi) che verrà riconosciuto da un anticorpo (tenendo presente che generalmente un
individuo non produce anticorpi contro se stesso). Così un individuo A avrà l'antigene A, se il
suo sangue viene trasferito in un individuo B, questo riconoscerà l'antigene come estraneo e
svilupperà una azione immunitaria. I globuli rossi verranno agglutinati portando ad
insufficienza nell'azione di alcuni organi ed anche la morte. Gli individui AB esprimono
entrambi gli antigeni (codominanza) e quindi non sviluppano anticorpi, per questo sono detti
accettori universali. Gli individui 0 non esprimono alcun antigene e quindi sono detti donatori
26
universali.
genetica HLA
alleli codominanti
Es. locus A
A2 A3
A1
A11
X
A1
A3
A2
A3
A1
A11 A2
A11
27
genetica HLA
A1
B8
DR3
A1
B8
DR3
A3 A2
B7 B12
DR2 DR7
i geni MHC tendono ad essere ereditati
en bloc (aplotipi)
A2
A3
B12 B7
DR7 DR2
X
A3 A1
B7 B8
DR2 DR3
A11
B13
DR5
25% identità
A11 A2
B13 B12
DR5 DR7
A11
B13
DR5
28
29
genetica HLA
l’entità del polimorfismo
Gli alleli HLA hanno mediamente bassa frequenza nella
popolazione, tranne alcune eccezioni, e sono assai
numerosi.
HLA A
489
HLA B
830
HLA C
266
Se consideriamo
solo i loci ABC,
sono possibili:
489 x 830 x 266 = 107.961.420
teoriche* combinazioni alleliche!
Estrema variabilità
inter-individuale
* v. “linkage disequilibrium”
30
NUMERO TEORICO
COMBINAZIONI ATTESE
A
B
C
DRB1
attesi
Alleli 489 X 830 X 266 X 463 = 49.986.137.460
31
32
Il polimorfismo e la specificità antigenica consiste:
1. in molteplici variazioni nucleotidiche nella sequenza
(cui corrispondono sostituzioni aminoacidiche)
§
5
10
15
20
25
A*01010101 - ----TCC CAC TCC ATG AGG TAT TTC TTC ACA TCC GTG TCC CGG CCC GGC CGC GGG GAG CCC CGC TTC ATC GCC GTG GGC
A*02010101
--T --- --- --- --- --- --- --- --- ----- --- - -- --- --------- --- --- --- --- --A --- ---
A*01010101
A*02010101
30
35
40
45
50
TAC GTG GAC GAC ACG CAG TTC GTG CGG TTC GAC AGC GAC GCC GCG AGC CAG AAG ATG GAG CCG CGG GCG CCG TGG
--- ------- --- --- --- --- --- --- --- --- --------- --- -G- --- --- ----- ----- ---
A*01010101
A*02010101
55
60
65
70
75
ATA GAG CAG GAG GGG CCG GAG TAT TGG GAC CAG GAG ACA CGG AAT ATG AAG GCC CAC TCA CAG ACT GAC CGA GCG
--- ----- ----T --- --- --- --- --- GG- --- --- --- --A G-- --- ----- ----- --- C---- -T-
A*01010101
A*02010101
80
85
90
95
100
AAC CTG GGG ACC CTG CGC GGC TAC TAC AAC CAG AGC GAG GAC G|GT TCT CAC ACC ATC CAG ATA ATG TAT GGC TGC ----G-- --- -- - --- ------- ----- --- --- -----C- -|- - --- --- --- G-- --- -GG --- --- --- ---
§ primi 100 codoni
33
genetica HLA
come si mantiene il polimorfismo
Il polimorfismo, anche nella regione HLA, è il risultato di
eventi casuali (mutazioni, conversione genica, ecc.).
Il suo mantenimento a livelli così elevati è il risultato
dell’azione di forze selettive nel corso dell’evoluzione,
tra cui sopratutto:
• Pressione selettiva da parte di agenti patogeni =
“Pathogen-driven balancing selection” (PDBS) → + probabile.
Pathogen-driven selection and worldwide HLA class I diversity
(Curr Biol. 2005 June 7; 15(11): 1022–1027)
•Tipo di incrocio =
“Assortative mating”: Positive assortative mating or Negative assortative mating
34
1) vantaggio dell’eterozigote
Molecole MHC differenti sono in grado di legare diversi
tipi di peptidi antigenici; pertanto gli eterozigoti per
MHC presentano una grande varietà di peptidi patogeni in
confronto a soggetti omozigoti.
Maggiore resistenza ad agenti patogeni
Vantaggio riproduttivo (fitness)
Con incremento degli eterozigoti rispetto agli altri genotipi
35
2) selezione frequenza–dipendente
La selezione si ritiene che abbia favorito i genotipi MHC
rari in quanto i patogeni avrebbero maggiore probabilità di
sviluppare meccanismi atti a evitare l’immunità MHCdipendente sostenuta da genotipi comuni.
Maggiore resistenza ad agenti patogeni
Vantaggio riproduttivo (fitness)
la frequenza di alleli rari tende ad
aumentare mentre la frequenza degli
alleli comuni tende a diminuire
(polimorfismo dinamico).
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Replacement substitutions occur at a higher
frequency than silent substitution
Suggests that selective pressures may operate on MHC polymorphism
Evolution of pathogens to evade MHC-mediated
antigen presentation
In south east China & Papua New Guinea up to 60% of
individuals express HLA-A11
HLA-A11 binds an important peptide of Epstein Barr Virus
Many EBV isolates from these areas have mutated this peptide
so that it can not bind to HLA-A11 MHC molecules
Evolution of the MHC to eliminate pathogens
In west Africa where malaria is endemic HLA-B53 is commonly
associated with recovery from a potentially lethal form of malaria
37
-tipo di incrocio = “assortative mating”:
unioni preferenziali basate su una maggiore diversità per
geni MHC rispetto ad unioni casuali.
In questo caso l’MHC viene
utilizzato per agire contro una
identità genetica per loci
altamente polimorfici al fine di
conservare l’eterozigosi.
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Applicazioni della Tipizzazione
Tissutale
Pazienti candidati al trapianto di midollo osseo o organi solidi
HLA di urgenza (possibile donatore in punto di morte)
Riconoscimento di paternità
Associazione tra HLA e malattie
Ricerca Biomedica
39
HLA e trapianti:
Alla ricerca del donatore istocompatibile
40
Trapianto del midollo osseo e delle cellule
staminali
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Compatibilità HLA essenziale (per i trapianti solidi importante ma non
imprescindibile)
Persone HLA identiche: coppia formata da fratelli (uguali anche nelle zone non
caratterizzate) o non consaguinei (fenotipi uguali ma non aplotipi)
Preferenza donatore :1) gemello monozigote, 2) fratello HLA genotipicamente
identico (25%), 3)familiare HLA compatibile (3-4 %), 4) donatore non apparentato
HLA fenotipicamente identico, 5) donatore non apparentato diverso per 1 o +
caratteristiche HLA, 6) familiare aploidentico.
70% dei TMO non donatore fra i familiari
La frequenza genica è differente da popolazione a popopolazione
Linkage disequilibrium (associazioni negative e positive)
Aplotipi ancestrali (1/3 in alcune popolazioni caucasiche)
6.500.000 (3.500.000 tipizzati anche per DR) 80 % almeno un volontario HLAABDR, con anche compatibilità DRB1* (50%)
Oggi tipizzazione ad alta risoluzione anche per gli alleli DRB,DQB1* e DPB1*
41
Ricerca di donatore non consaguineo
• Il paziente tipizzato: HLA classe I ed i loci
DRB1*, DRB3*, DRB4*, DRB5* e DQB1*
• Standard IBMDR (Italian Bone Marrow Donor Registry ):
compatibile quando fenotipicamente identico
almeno per HLA-AB e gli alleli DRB1* (in
diverse occasioni: anche differenze per una
caratteristica HLA di classe I)
42
43
44
45
HLA e malattie
46
HLA & Malattie
Alcune malattie sono associate alla presenza di un determinato HLA
Definire una frequenza significativamente elevata rispetto alla popolazione sana
RR = Frequenza Atg HLA negli affetti
Frequenza Atg HLA nei sani
RR > 1 = Associazione positiva
RR < 1 = Associazione negativa
RR = 1 = No Associazione
Malattie a patogenesi immunitaria con caratt. a comune:
eziologia multifattoriale
familiarità (comp. ered. polig.)
47
HLA & Malattie
48
49
HLA-B27
Spondilite anchilosante
50
51
HLA come fattore di rischio nelle
malattie autoimmunitarie
Modello 1
alcune molecole HLA presentano meglio peptidi patogeni
simili a peptidi “self” alle cellule T
il risultato sarà una risposta autoimmunitaria
Modello 2
alcune molecole HLA sono più o meno efficienti nella
presentazione di peptidi “self” alle cellule T
il risultato sarà una mancata selezione negativa e
conseguente risposta autoimmunitaria
52
53
Diabete di tipo I
•
•
•
•
•
Nei giovani diabetici gli antigeni DR3 e/o DR4 sono presenti nel 97% dei casi
(contro il 60% della popolazione); il genotipo DR3/DR4 ricorre nel 30% dei
casi (contro il 6% della popolazione). Nella nostra etnia il DR4 sembra conferire
maggiore rischio rispetto al DR3. La presenza di entrambi fa aumentare il
rischio di quasi 10 volte (sempre nei confronti della popolazione).
Sono particolarmente a rischio i fratelli HLA identici di un giovane diabetico: si
ammalano di diabete nel 58% dei casi. Sono a rischio anche i fratelli HLA
aploidentici che ammalano nel 37% dei casi
Per i soggetti HLA DR3 e/o DR4 è auspicabile la tipizzazione degli alleli DQ
La presenza di una acido aspartico alla posizione 57 dell'HLA DQb si è
dimostrata fortemente protettiva per l'insorgenza del diabete. D'altra parte, la
presenza nella stessa posizione degli aa Alanina, Valina o Serina, predispone
allo sviluppo del diabete. Un analogo discorso può essere fatto in alcuni soggetti
per l'arginina alla posizione 52 dell'HLA DQa
E' possibile che queste regioni HLA siano implicate nel legame di peptidi
importanti per l'inizio della reazione autoimmune contro il pancreas. Secondo
calcoli matematici però, l'HLA è in grado di spiegare solo il 35 % circa della
suscettibilità genetica.
54
55
56
Celiachia
•
•
•
•
•
•
Condizione necessaria per sviluppare la celiachia è infatti la presenza sulla membrana delle cellule
immunocompetenti di una molecola HLA di classe II (codificata dagli alleli a 0501 e b 0201), in
grado di legare con alta affinità peptidi di gliadina e di presentarli agli specifici linfociti T.
Quando la tipizzazione HLA veniva effettuata con tecniche sierologiche questa configurazione
prendeva il nome di DQ2.
In realtà non sempre al fenotipo DQ2 (identificato per via sierologica) corrisponde la presenza
dell'eterodimero caratteristico della celiachia. L'eterodimero "celiaco" è sempre presente quando al
DQ2 si associa il DR3 (aplotipo DQ2-DR3) e in soggetti con aplotipo DQ2-DR7/DR5. Nel
primo caso, l'analisi di linkage ci mostra che sullo stesso cromosoma sono presenti sia i geni della
catena a, A0501, che quelli della b, B0201, (configurazione in cis). Nel secondo caso i due geni
si trovano su cromosomi diversi (in trans): sul cromosoma che esprime la specificità sierologia
DR7 è presente la sequenza B 0201 per la catena b mentre sul cromosoma che esprime DR5 la
sequenza A 0501 per la catena a.
In una minoranza dei celiaci (8%) la predisposizione è legata al DQ8 associato al DR53,
ugualmente dotato di alta affinità per la gliadina.
Per quanto necessario, l'HLA non è però sufficiente a far sì che si sviluppi la malattia. Solo una
piccola parte dei soggetti con gli HLA descritti (presenti quasi nel 40% della popolazione)
hanno la celiachia.
L'assenza degli HLA tipici ha comunque un elevato valore predittivo negativo nella diagnosi di
celiachia.
57
Celiachia
•
Alcune molecole HLA sono state selezionate dall'evoluzione per la loro
capacità di legare e presentare proteine appartenenti ai patogeni più comuni
•
Tra questi HLA, probabilmente è anche il DQ2, tipico del soggetto celiaco,
(presente complessivamente in circa il 30% della popolazione)
•
Semplificando, possiamo ipotizzare che nell'era pre-agricola l'utilità dell'HLA
DQ2 nella risposta alle infezioni (allora comuni) sia stata di gran lunga più
importante della sua dannosità dovuta al riconoscimento del glutine (che in
quell'epoca era quasi assente dall'alimentazione umana). Per questo motivo
questo HLA sarebbe stato trasmesso così frequentemente dai nostri antenati.
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59
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61
62
63
HLA e Ricerca
• Determinazione dei peptidi immunodominanti
• Immunoterapia
64
Immunodominanza
• Peptidi più immunogeni di altri
• Programmi specifici in grado di predire quali
peptidi di una singola proteina sono più
immunodominanti
• http://www.mpiibberlin.mpg.de/MAPPP/binding.html
• http://www.imtech.res.in/raghava/propred/
65
http://www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP/binding.html
ESAT-6:
HLA A1 - 9 mers
mteqqwnfagieaaasaiqgnvtsihslldegkqsltklaaawggsgseayqgvqqkwdatateln
nalq
Max. score that could've been reached using this molecule type
50
Rank
Start position
Sequence
% of max. score
Score
1
61
ATELNNALQ
40 %
20
2
0
MTEQQWNFA
36 %
18
3
42
WGGSGSEAY
34 %
17
4
46
GSEAYQGVQ
32 %
16
5
21
VTSIHSLLD
30 %
15
6
27
LLDEGKQSL
26 %
13
7
28
LDEGKQSLT
26 %
13
8
9
GIEAAASAI
20 %
10
9
22
TSIHSLLDE
20 %
10
10
56
KWDATATEL
20 %
10
11
14
ASAIQGNVT
18 %
9
12
29
DEGKQSLTK
16 %
8
66
http://www.imtech.res.in/raghava/propred/
ESAT-6:
mteqqwnfagieaaasaiqgnvtsihslldegkqsltklaaawggsgseayqgvqqk
wdatatelnnalq
DRB1_0101:
MTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSE
AYQGVQQKWDATATELNNALQ
DRB1_0307:
MTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEA
YQGVQQKWDATATELNNALQ
67
HLA ed IMMUNOTERAPIA
Cancro gastrico
68
ADENOCARCINOMA GASTRICO
SUDDIVISO FENOTIPICAMENTE IN:
• Carcinoma di “tipo intestinale”
(+ frequente, prevalenza uomini > 50 anni)
• Carcinoma di “tipo diffuso”
(- frequente, uomini/donne: 45 anni)
69
Carcinogenesi
70
Trattamenti
(Consolidati)
 Asportazione del tumore primitivo e
dell’intera rete linfatica di drenaggio
 Rimozione chirurgica + Chemioterapia
 Rimozione chirurgica + Radioterapia
Tasso di sopravivenza 5 anni: 15-35 %
87 % recidive loco-regionali
71
Trattamenti
(Innovativi)
Inibitori dell’ EGFR
Agenti Anti-angiogenesi
Promotori dell’apoptosi
Immunoterapia Specifica (Pub med: 749 citazioni/119
rev.)
72
Immunoterapia
73
Antigeni Tumore-Associati
CDX1- CDX2
ITF (Intestinal-Trefoil
Factor)
MAGE-1
MAGE-2
MAGE-3
c-ErB-1
c-ErB-2
 Sart (1/2/3)
 lck
Her-2/neu
74
Scopo
Verificare risposta T specifica per antigeni (peptidi)
tumorali in pazienti con adenocarcinoma gastrico
Livello locale (isolamento e caratterizzazione fenotipica/
funzionale dei linfociti intratumorali)
Livello periferico (isolamento e caratterizzazione
fenotipica/ funzionale dei linfociti dal sangue periferico)
75
MESSA IN COLTURA DEL TESSUTO
NEOPLASTICO
PRELIEVO
FRAMMENTAZIONE
LAVAGGI
CLONAZIONE
AD ALTA EFFICIENZA
TERRENO DI COLTURA (rIL-2)
(7gg RPMI 1640 + 50U IL-2)
SPECIFICITA’
LINEE CELLULARI T ATTIVATI
PRODUZIONE CITOCHINE
FUNZIONI CITOTOSSICHE
76
Peptidi Usati (GCAA)
16
•
SART: Squamous cell carcinoma antigen
recognized by T cells
•
Cyp: Peptidylprolyl isomerase B (cyclophilin B)
•
lck: lymphocyte-specific protein tyrosine kinase
•
ART: adenocarcinoma antigen
•
EIF4BP: elF-binding protein
•
ppMAPkkk: partial putative mitogen-activated
protein kinase kinase kinase
•
WHSC2: Wolf-Hirschhorn syndrome candidate
2 protein
•
UBE2V: ubiquitin-conjugating enzyme variant
Kua
•
HNRPL: heterogeneous nuclear
ribonucleoprotein L
14
Amedei A .Cancer Immunol Immunother. 2009
77
Pazienti
8
Età media: 68 anni
Asportazione del tumore primario
No chemioterapia
No immunosoppressione, Autoimmunità
No Infezioni
Aplotipo Pazienti
5: HLA- A02/24
8: HLA-A02
7: HLA-A24
78
Amedei A .Cancer Immunol Immunother. 2009
79
Linfociti T GCAA-specifici infiltrano il tessuto neoplastico
Pazienti
Cloni T CD4+: 65/437 (15 %)
30: peptidi HLA-A24
35: peptidi HLA-A02
Cloni T CD8+: 59/316 (18 %)
29: peptidi HLA-A24
30: peptidi HLA-A02
Controlli
Cloni T CD4+: 0/282
Cloni T CD8+: 0/120
80
Repertorio delle GCAA-specificità dei cloni T
40
31
81
Clonicità dei linfociti T GCAA-specifici
Batteria di 24
anticorpi
monoclonali
(TCR Vß
Repertoire Kit,
Beckman
Coulter): Vß1,
Vß2, Vß3, Vß4,
Vß5.1, Vß5.2,
Vß5.3, Vß7.1,
Vß7.2, Vß8,
Vß9, Vß11,
Vß12,Vß13.1,
Vß13.2,Vß13.6
Vß14, Vß16,
Vß17, Vß18,
Vß20, Vß21.3,
Vß22 Vß23.
82
Effetto sulla proliferazione dei cloni GCAA-specifici
degli Ab-HLA-I/II
38/65 (58%) = HLA class I-ristretti
83
Circa 1 clone CD4+ per paziente
Riferimenti Bibliografici
84
Profilo Th1 dei cloni T TIL-derivati
17% CD4+ = Th0
25% CD8+ = Th0
Stimolazione: 48 Ag(10mg/ml) +
5 x 105 APC autologhe irradiate
85
Citotossicità (perforina-mediata) indotta dalla
stimolazione con GCAA-peptidi
Cell.Effettrice/Cell. Bersaglio = 10/1
CD8+= 44 Tc1 + 15 Tc0
100%
CD4+= 50 Th1 + 11/15 Th0
94%
I blasti T coltivati con le EBV-B
autologhe, caricate con Ag-specifico e
marcate Cr51 8 h 37 C°
86
Attività pro-apoptotica (Fas-FasL) dei cloni
TIL-derivati
Blasti stimolati (PMA10 ng/ml + Iono. 1mmol/ml) in presenza di cellule Jurkat Fas+ marcate Cr51 18 h 37 C°
CD4+ = 50/ 65 (77%)
CD8+ = 50/ 59 (85%)
87
88
Linfociti T GCAA-specifici nel sangue
periferico dei pazienti con AG
PBMC (3x 105) coltivati per 5 gg in presenza di terreno e terreno + GCAA antigene (10mg/ml)
14/ 20 (70%) PBMC pazienti proliferavano in presenza dei peptidi GCAA
4 (HLA-02+/HLA-A24+) : proliferavano a peptidi di ambedue le classi
6 (HLA-02+/HLA-A24-) : proliferavano a peptidi HLA-A02-ristretti
4 (HLA-02-/HLA-A24+) : proliferavano a peptidi HLA-A24-ristretti
6 pazienti + 15 controlli : non proliferavano a nessun peptide
89
Linee T GCAA-Indotte da PBMC dei
pazienti con Adenocarcinoma gastrico
5 gg di stimolo con il peptide GCAA
7 gg con terreno + rIL-2
10 gg = valutazione intracitoplasmatica CKS
Stimolo (6 h) = Pep (10mg/ml) + a-CD28 (1mg/ml) + a-CD49d (1mg/ml)
16/20 pazienti (80%) = linee GCAA-indotte
4 pazienti = no linee GCAA-indotte
6 pazienti = no proliferazione PBMC
3 pazienti (1.BB, 7.CS, 16.MG) = no
cloni TIL-deriv
90
Profilo Th1 nelle linee GCAA-Indotte ed
ottenute da PBMC
Media : 15 %
Media : 11 %
91
Conclusioni (i)
Maggioranza dei cloni T (CD4+/CD8+) TIL-derivati e GCAA-peptidi-specifici
mostra profilo citochinico Th1/Tc1
Artefatto della coltura in vitro (rIL-2) ?: studi precedenti mostrano predominanza di
cloni T Th0 isolati da pazienti con gastrite cronica o Th2 se isolati da pazienti con
Asma allergico.
92
Conclusioni (I)
Simili percentuali di cloni T GCAA-peptide-specifici ottenuti dai CD8+ (18 %) e
CD4+ (15%) ottenuti dai TIL della neoplasia gastrica
Repertorio vario delle specificità dei cloni T peptide-specifici ottenuti dai TIL;
Predominanza SART3 (24 cloni) e lck (32)
93
Conclusioni (i)
15% dei pazienti impossibile isolare ed espandere linfociti T GCAA-peptide-specifici
No risposta ?
Risposta debole (no rilevabile) ?
100 % cloni CD8+ e 94% cloni CD4+ presentano armamentario citotossicità
(usando E-BVB autologhe + peptidi dei GCAA)
81% cloni TIL – derivati sono capaci di indurre apoptosi Fas-FasL
(usando Jurkat cells + mitogeno)
94
Conclusioni (i)
I cloni T derivati dai TIL isolati dal tessuto dell’Adenocarcinoma gastrico
mostrano
citotossicità specifica per i peptidi degli antigeni tumorali
Importante requisito per rendere efficace l’immunoterapia del
Cancro Gastrico
95
Conclusioni (iI)
Linfociti T specifici per i peptidi GCAA evidenziati nel sangue periferico del 70 %
Dei pazienti (14/20) con adenocarcinoma gastrico (proliferazione PBMC)
Numero troppo basso di linfociti T tumore-specifici in
circolo (metodica non sensibile)
Confinamento dei linfociti T
tumore-specifici
3/6 pazienti: 1.BB, 7.CS, 16.MG no isolamento linfociti T peptide-specifici
96
Conclusioni (iI)
Stimolazione
peptidespecifica
16/ 20 pazienti indotte linee GCAA-specifiche
Molti linfociti evidenziano IFN-g intracitoplas. (Th1) ma poca/nulla IL-4 (Th0)
1.BB, 7.CS, 16.MG no induzione linee T peptide-specifiche
97
Ipotesi: Incapaci di montare risposta contro cellule della neoplasia gastrica
Linfociti T GCAA-specifici Th1 e con spiccata attività citotossica
Inefficaci nel bloccare la crescita tumorale
98
Condizioni In Vivo differenti dalle condizioni di attivazione in vitro
dei linfociti T Tumore-specifici
Inattivazione della risposta immune specifica
Escape tumorale
Produzione di fattori bloccanti (cks, etc)
Arruolamento di linfociti T regolatori
99
Immunoterapia del cancro gastrico :
Illusione o possibilità terapeutica?
Possibilità Terapeutica:
Inizio di un cammino ancora lungo
Non importa, se stai procedendo molto lentamente;
ciò che importa è che tu non ti sia fermato.
Confucio
A volte il vincitore
è semplicemente chi
non ha mai mollato
Jim Morrison 100
Tipizzazione HLA
(Tissutale)
Tecnica
Sierologica
Test di Linfotossicità Complemento Dipendente
Tecnica Biologia
Molecolare
PCR – SSP
PCR – SSO
PCR - RFLP
101
Test di Linfotossicità Complemento
Dipendente
Antigeni caratterizzati tramite utilizzo di Alloanticorpi naturali che fissandosi
Agli antigeni HLA che sono presenti sulle cell. bersaglio attivano il complemento
Disporre di una serie di antisieri in grado di riconoscere le diverse specificità HLA
Antisieri monoclonali o alloantisieri
Metodica:
Estrazione dei linfociti: una provetta per classe: 4 ml (Classe I) 2 ml (Classe II)
100 ml di biglie immunogenetiche (ant. Specifici per B e T)
Centrifugazione: I linfociti T e B si dispongono a rosetta attorno alle biglie
Portaprovette con magnete; T e B si legano alla parete
Sospensione dei linfociti in PBS
Semina in piastre tipizzanti: 144 pozzi (classe I) e 72 (classe II) contenenti antisieri
Incubazione 40/60 min
Dispensazione del Complemento di coniglio (incubazione 60 min)
Dispensazione di Fluoroquence
Lettura al microscopio a fluorescenza
102
Test di Linfotossicità Complemento
Dipendente
103
Tecnica di Biologia Molecolare
PCR - SSP
Uso di coppie di primers sequenza specifica: riconoscono in modo specifico un allele
PCR contemporanee ( 96 totali) ciascuna caratt. da una diversa coppia di primers
Primers: stessa lunghezza e temp. di allineamento = unico programma
coppia di primers aspecifici = controllo positivo
primer mix
Molto precisa ma si adatta poco alla grande mole
Fasi: Estrazione del DNA
Amplificazione con primers sequenza-specifici
Rivelazione su gel di Agarosio
Lettura
104
PCR – SSP
Risultati
105
PCR – SSP
Risultati
106
PCR – SSP
Risultati
107
Tecnica di Biologia Molecolare
PCR - SSO
Principio: Oligonucleotidi sequenza specifici che si comportano come sonde
che indicano la presenza o l’assenza della seq. caratt, di un allele o gruppo di alleli
Ottimo metodo per la tipizzazione molecolare a bassa risoluzione di
un grande numero di campioni (diagnostica di routine)
Fasi: Estrazione del DNA
Amplificazione con primers oligonucleotidi-sequenza-specifici
Rivelazione su striscia di nylon
Lettura
108
Tecnica di Biologia Molecolare
PCR – RFLP
(Restriction Fragment Lenght Polymorphism)
Principio: polimorfismo di lunghezza dei frammenti di restrizione ottenuti
dalla digestione con enzimi di restrizione di un amplificato di DNA
Metodica : 2 passaggi
Amplificazione specifiche regioni
Caratterizzazione Allelica con digestione
Tempo di esecuzione: 10-24 h
Tecnica obsoleta: in passato per tipizzare DP e DQ
109
Corso per tecnici di laboratorio
Anno Accademico 2016-2017
La presentazione dell’antigene
Prof. Amedeo Amedei
110
Antigeni ed immunogeni
Antigenicità: descrive la capacità dell’antigene a legarsi ad un
recettore, ovvero di essere riconosciuto dal sistema
immunitario.
Immunogenicità: descrive la capacità di un antigene di
stimolare una risposta immune
Un antigene può non essere
necessariamente un immunogeno
111
I tre dogmi della presentazione
convenzionale dell’antigene
1. Gli antigeni sono riconosciuti dopo digestione (processing)
2. Gli antigeni sono riconosciuti in associazione con le molecole
di istocompatibilità di classe I o II (presentazione)
3. Il riconoscimento degli antigeni extra-cellulari è associato
alla molecola CD4 mentre il riconoscimento degli antigeni
citosolici è associato alla molecola CD8 (costimolo)
112
I tre dogmi
della presentazione convenzionale
dell’antigene
1. Gli antigeni sono riconosciuti dopo digestione (processing)
2. Gli antigeni sono riconosciuti in associazione con le molecole
di istocompatibilità di classe I o II (presentazione)
3. Il riconoscimento degli antigeni extra-cellulari è associato
alla molecola CD4 mentre il riconoscimento degli antigeni
citosolici è associato alla molecola CD8 (costimolo)
Presentazione MHC-dipendente
113
Altre modalità di riconoscimento
dell’antigene
(presentazione non convenzionale)
1. Riconoscimento dei superantigeni
2. Presentazione MHC-indipendente
3. Presentazione attraverso la molecola CD1
4. Cross-presentazione
114
I tre dogmi della presentazione
dell’antigene
1. Gli
antigeni
(processing)
sono
riconosciuti
dopo
digestione
2. Gli antigeni sono riconosciuti in associazione con le molecole
di istocompatibilità di classe I o II (presentazione)
3. Il riconoscimento degli antigeni extra-cellulari è associato
alla molecola CD4 mentre il riconoscimento degli antigeni
citosolici è associato alla molecola CD8
115
APC e risposta T cellulare
sangue
+
Antigene solubile
T
=
Nessuna risposta immune
116
APC e risposta T cellulare
sangue
+
Antigene solubile
APC
Antigene presentato
T
=
Nessuna risposta immune
Th
=
Risposta immunitaria specifica
117
APC e risposta T cellulare
sangue
+
Antigene solubile
APC
Antigene presentato
T
=
Nessuna risposta immune
Th
=
Risposta immunitaria specifica
proliferazione
118
APC e risposta T cellulare
sangue
+
Antigene solubile
APC
Antigene presentato
T
=
Nessuna risposta immune
Th
=
Risposta immunitaria specifica
proliferazione
119
Processazione e presentazione degli Ag
extracellulari e citosolici
sangue
T
+
APC
Linfociti CD4
Linfociti CD8
Endocitosi
Si
No
Atg solubile
120
Processazione e presentazione degli Ag
extracellulari e citosolici
sangue
T
+
Plasmide
Transfezione
APC
Linfociti CD4
No
Linfociti CD8
Si
121
Processazione e presentazione degli Ag
extracellulari e citosolici
sangue
T
APC
Shock osmotico
Linfociti CD4
No
Linfociti CD8
Si
122
Processazione e presentazione degli Ag
extracellulari e citosolici
Risposta CD4
+
APC
Risposta CD8
Si
No
No
Si
No
Si
Endocitosi
+
APC
Trasfezione
+
APC
Shock osmotico
I linfociti CD4 riconoscono antigeni solubili mentre le cellule
123
CD8 riconoscono antigeni presenti nel citosol cellulare
Processazione e presentazione degli Ag
extracellulari e citosolici
Risposta CD4
+
APC
Risposta CD8
Si
No
No
Si
No
Si
Endocitosi
+
APC
Trasfezione
+
APC
Shock osmotico
I linfociti CD4 riconoscono antigeni solubili presentati 124
in
associazione con le molecole di MHC classe II
Processazione e presentazione degli Ag
extracellulari e citosolici
The immunological
synapsis
125
La molecola CD4 si lega all’MHC classe II (costimolo)
Processazione e presentazione degli Ag
extracellulari e citosolici
126
La molecola CD4 si lega all’MHC classe II (costimolo)
Processazione e presentazione degli Ag
extracellulari e citosolici
Risposta CD4
+
APC
Risposta CD8
Si
No
No
Si
No
Si
Endocitosi
+
APC
Trasfezione
+
APC
Shock osmotico
I linfociti CD8 riconoscono antigeni citosolici presentati127in
associazione con le molecole di MHC classe I
Processazione e presentazione degli Ag
extracellulari e citosolici
CD8
MHC
Class I
The immunological
synapsis
128
La molecola CD8 si lega all’ MHC classe I (costimolo)
Processazione e presentazione degli Ag
extracellulari e citosolici
129
La molecola CD8 si lega all’ MHC classe I (costimolo)
Significato del processing
130
Significato del processing
131
MHC class I-dependent
presentation
132
Evidence of MHC-Class I restriction in
virus presentation
MHCa
MHCa
Virus X
MHCb
MHCb
Virus X
133
Evidence of MHC-Class I restriction in
virus presentation
MHCa
MHCa
Virus X
Virus X
MHCa
sangue
cellule
infette
sangue
cellule
infette
134
Evidence of MHC-Class I restriction in
virus presentation
MHCa
MHCa
Virus X
Virus X
MHCa
sangue
cellule
infette
sangue
cellule
infette
135
Evidence of MHC-Class I restriction in
virus presentation
MHCb
MHCb
Virus X
MHCb
sangue
sangue
Virus X
cellule
infette
cellule
infette
136
Evidence of MHC-Class I restriction in
virus presentation
MHCb
MHCb
Virus X
MHCb
sangue
sangue
Virus X
cellule
infette
cellule
infette
137
Evidence of MHC-Class I restriction in
virus presentation
138
Evidence of MHC-Class I restriction in
virus presentation
MHCa
MHCa
Virus X
Virus X
MHCb
sangue
cellule
infette
sangue
cellule
infette
139
Evidence of MHC-Class I restriction in
virus presentation
MHCb
MHCb
Virus X
sangue
MHCa
sangue
Virus X
cellule
infette
cellule
infette
140
Evidence of MHC-Class I restriction in
virus presentation
141
Evidence of MHC-Class I restriction in
virus presentation
142
MHC class Idependent
presentation
1° phase
processing
143
La struttura del proteasoma
Ubiquitination favors a more
efficient peptide presentation
The proteasome is part of the ubiquitin-dependent
degradation process of cytoplasmic proteins. The
26S proteasome is a multicatalytic protease that is
144
found in the cytosol, perinuclear regions and
nucleus of eukaryotic cells.
Struttura del proteasoma
28 sub-units
(20S proteasome)
The 20S proteasome (2,100 kDa)
as an assembly of two outer (α)
and two inner (β) heptameric rings.
It forms a cylindrical structure
where proteolysis occurs (β rings)
 hydrolysis of proteins at the
COOH- terminus of hydrophobic,
basic
and
acidic
residues
(chymotrypsin-like,
trypsin-like
and
peptidylglutamyl-peptide
hydrolytic activities).
This prevents the indiscriminate
degradation
of
intracellular
proteins.
145
Struttura del proteasoma
The 20S proteasome could be
responsible for the degradation of
oxidatively damaged proteins, which
occurs in an ATP- and ubiquitinindependent manner.
The PA28 (11S) regulatory (REG) complex
(180 kDa) opens the channel through the
complex, via an ATP-independent process
and mediates the degradation of nonubiquitinated short peptides
146
Struttura del proteasoma
7 sub-units
+
The outer rings comprise seven
different α subunits, without
catalytic activity, serving as an
anchor
for
the
multisubunit
ATPase-containing PA700 (19S)
regulator (700 kDa) and forming
the 26S proteasome.
7 sub-units
constitutively or inducibly expressed,
and assembled selectively to form
complexes with distinct proteolytic
characteristics, adapting to altered
physiological conditions
147
Struttura del proteasoma
7 sub-units
+
The outer rings comprise seven
different α subunits, without
catalytic activity, serving as an
anchor
for
the
multisubunit
ATPase-containing PA700 (19S)
regulator (700 kDa) and forming
the 26S proteasome.
7 sub-units
26S proteasome
148
Struttura del proteasoma
7 sub-units
+
The outer rings comprise seven
different α subunits, without
catalytic activity, serving as an
anchor
for
the
multisubunit
ATPase-containing PA700 (19S)
regulator (700 kDa) and forming
the 26S proteasome.
7 sub-units
26S proteasome
149
8-10AA
Assemblaggio del proteasoma
MECL-1
LMP2
LMP7
multicatalytic endopeptidase
complex-like-1
low-molecular
mass polypeptides
150
Assemblaggio del proteasoma
+
MECL-1
IFNs
+
LMP2
+
LMP7
151
Proteasoma: genes and DRIPs
152
MHC class Idependent
presentation
2° phase
Peptide transport
153
Alternative for production of adequate
peptides
154
The cellular chaperons
The molecular chaperones are a diverse set of protein families required
for the correct folding, transport and degradation of other proteins in
vivo. The chaperonins are large, double-ring oligomeric proteins that
act as containers.
bacterial chaperonin GroEL
The eukaryotic chaperonin
TCP1 ring complex (TRiC) is
structurally related to GroEL,
but has greater similarity to
the chaperonins of archaea
(thermosomes). TRiC has two
rings of eight different
subunits, which also have
equatorial ATPase domains and
apical
substrate-binding
domains. It takes peptides
155
from proteasome to ER.
MHC class Idependent
presentation
3° phase
Peptide entry in ER
156
Function of
Transporters associated with antigen
processing (TAP 1 and 2)
157
TAP 1 and 2: structure and genes
158
TAP 1 and 2: structure and genes
IFN-alfa
Up-regulation of TAP transcription
159
Scoperta delle molecole TAP
160
Scoperta delle molecole TAP
161
Scoperta delle molecole TAP
ATP-binding cassette
NON
PRESENTA
162
ABC proteins
Series of membrane transporters
(both importers or exporters) which
utilize the energy of ATP hydrolysis
to transport various substrates
across cellular membranes. They are
present both in prokariotic and
eukariotic organisms.
They can transport ions, amino acids, peptides, sugars,toxins,
drugs, lipids, polysaccharides, nucleotides.
All are constituted by 4 domains
(2 hydrophobic transmembrane domains
and 2 ATP-binding domains)
163
Scoperta delle molecole TAP
PRESENTA
164
Biology of TAPs
4
3
2
1
1
165
Biology of TAPs
4
3
2
1
2/3
166
Biology of TAPs
4
3
2
1
4
167
Scoperta delle molecole TAP
PRESENTA
Peptides are necessary for correct and stable expression
168
of MHC class I molecules
The reduction in class I MHC
expression is due to TAP2 deficiency.
169
TAP deficiency
Isotype control
Anti-TAP1
Anti-TAP2
Intracellular
FACS
staining of TAP1 and TAP2
proteins in two TAP1deficient patients, their
mother,
an
unrelated
healthy control patient,
and the TAP competent
and
incompetent
Blymphoblast lines T0 and
T2 respectively. Mean
fluorescence
intensities
and the isotype control
background staining are
displayed (y-axis counts).
Lymphocyte gated analysis
170
(x-axis FL1-H)
TAP deficiency
Congenital HLA class I
deficiency is a rare disease
frequently
resulting
in
chronic inflammation of the
respiratory tract, and/or
skin granulomas. A possible
further manifestation is
toxoplasmic
retinochoroiditis
(in
absence of HIV infection).
Isotype control
Anti-TAP1
Anti-TAP2
171
TAPs and virus escape
The loading of peptide on MHC by TAP
is targeted by several viruses.
ICP47 from HHV-1 binds to the peptide
binding site of TAP, with 10-1000 fold
higher affinity than most peptides,
thereby blocking the first step of the
translocation pathway.
HCMV US6 instead interacts with TAP
from the RE luminal side and inhibits ATP
binding and peptide stimulated ATP
hydrolysis.
UL49.5
proteins
have
different
strategies to inhibit TAP including block
of the binding of ATP to TAP.
BNLF2a protein from Epstein-Barr
virus prevents the binding of peptides
and ATP to TAP.
172
Mechanisms of viral escape
ICP47 from HHV-1
binds to the peptide
binding site of TAP,
with 10-1000 fold
higher affinity than
most peptides,
thereby blocking the
first step of the
translocation
pathway.
HCMV
US6
instead
interacts with
TAP from the
RE luminal side
and
inhibits
ATP binding and
peptide
stimulated ATP
hydrolysis.
UL49.5 proteins
have
different
strategies
to
inhibit
TAP
including block of
the binding of
ATP to TAP.
BNLF2a protein
from EpsteinBarr
virus
prevents
the
binding
of
peptides
and
ATP to TAP
173
MHC class Idependent
presentation
4° phase
Association with MHC
174
MHC class I assembling
175
Correct folding of MHC class I molecules when
in presence of presented peptides
1^ fase
176
Correct folding of MHC class I molecules when
in presence of presented peptides
Degen and Williams (1994) first discovered
calnexin in association with MHC class I
molecules synthesized by lymphoma cell lines.
Anti-Calnexin - ER membrane marker
antibody
177
Correct folding of MHC class I molecules when
in presence of presented peptides
Calnexin is a 88 kDa chaperone protein found
in the ER.
a) Newly synthesized MHC class I alpha
chains bind to calnexin until two β
microglobulins and possiby a peptide bind
to the alpha chain. The heterodimer then
dissociates from calnexin and continues
on its pathway (Janeway et al, 1999).
b) In addition, calnexin binds with partially
folded immunoglobulin proteins and partial
complexes of T cell receptor and retains
them in the E.R. until they are completely
178
folded (Janeway et al, 1999).
Correct folding of MHC class I molecules when
in presence of presented peptides
2^ fase
179
Correct folding of MHC class I molecules when
in presence of presented peptides
2^ fase
180
Calreticulina ed Epr57
Calreticulin is a luminal protein (chaperonine), travels freely within the
ER lumen, interacts with its protein-folding intermediates and is vital in
several cellular functions (cell-cell communication and recognition; immune
responses and recognition; ion, solute, and metabolite fluxes; intracellular
processing of metabolites).
It binds monoglucosylated carbohydrate which is typically found on newlysynthesized proteins before they leave the ER. The C-terminal region is
highly acidic, binds Ca2+ and is involved in Ca2+ storage. Ca2+ binding to
calreticulin and, consequently, changes in the ER Ca2+ storage capacity,
181
affect the protein’s chaperone function.
Calreticulina ed Epr57
Calreticulin
deficiency is
embryonic lethal
because it causes
lesions during
cardiac
development
Calreticulin is a luminal protein (chaperonine), travels freely within the
ER lumen, interacts with its protein-folding intermediates and is vital in
several cellular functions (cell-cell communication and recognition; immune
responses and recognition; ion, solute, and metabolite fluxes; intracellular
processing of metabolites).
It binds monoglucosylated carbohydrate which is typically found on newlysynthesized proteins before they leave the ER. The C-terminal region is
highly acidic, binds Ca2+ and is involved in Ca2+ storage. Ca2+ binding to
calreticulin and, consequently, changes in the ER Ca2+ storage capacity,
182
affect the protein’s chaperone function.
Calreticulina ed Epr57
ERp57
is
a
thiol
oxidereductase, member
of the PDI family of
proteins
which
associates
with
the
substrates
recognized
by both calreticulin and
calnexin.
ERp57 has
disulphide
interaction
interaction
been shown to catalyse the formation of native
bonds in glycoproteins and to form a stable
with the MHC class I loading complex via an
with tapasin (THE EMBO JOURNAL (2007 ).
183
Correct folding of MHC class I molecules when
in presence of presented peptides
Tapasin serves as a 'bridge'
protein
for
uniting
this
complex to TAP.
Garbi et. al. (2003) have
shown that mice who lack
tapasin have a 100-fold
reduction in TAP expression
and the final 50 amino acids
of tapasin that lead to a
strong
bond
to
TAP
upregulates TAP1 and TAP2
(Bangia et. al. 1999)
184
Tapasin-associated immunodeficiency
The loss of tapasin is associated with would seem to lead to
similar phenotypes as loss of TAP (Yabe et. al. 2002).
The disorder known as bare lymphocyte syndrome (BLS)
where a reduced MHCI : peptide on the cell surface but
completely normal TAP are observed.
Results and discussion
S.M. was a 54-year-old woman suffering from a
primary chronic glomerulonephritis for 10
years. She has been receiving hemodynamic
dialysis for 5 years. She had a history of
herpes zoster and polyps of stomach and colon.
Because kidney transplantation has been
considered, S.M. was subjected to serological
HLA typing. Her class II antigens could be
typed, but class I typing was not successful.
185
Several ways for viruses to escape
186
Correct folding of MHC class I molecules when
in presence of presented peptides
3-4^ fase
187
How peptides are generated in proteasome and
fit inside the MHC groove
The MHC class I binding
groove with antigenic peptide fitted
into the pocket.
NEED TO BE
OF ADEQUATE LENGHT !
188
Alternative for production of adequate
peptides
189
Alternative for production of adequate
peptides
ERAAP (the endoplasmic reticulum aminopeptidase
associated with antigen processing) trims the extra
N-terminal residues to generate final peptides of
the correct length, which are bound by MHC class I
molecules
190
Alternative for production of adequate
peptides
Article Nature Immunology. 2007. 8, 101 - 108
In the absence of aminopeptidase ERAAP, MHC class I
molecules present many unstable and highly immunogenic
peptides
Gianna Elena Hammer, Federico Gonzalez, Edward James, Hector Nolla & Nilabh Shastri
Those peptides are generated by proteolysis,
which begins in the cytoplasm and continues in
the endoplasmic reticulum by the unique
aminopeptidase ERAAP. The overall extent to
which trimming by ERAAP modifies the peptide
pool and the immunological consequences of
ERAAP deficiency are unknown. Here we show
that the peptide-MHC repertoire of ERAAPdeficient mice was missing many peptides.
Furthermore, ERAAP-deficient cells presented
many unstable and structurally unique peptideMHC complexes, which elicited potent CD8+ T
cell and B cell responses. Thus, ERAAP is a
'quintessential editor' of the peptide-MHC
repertoire and, paradoxically, its absence
enhances immunogenicity.
No CD8
Low IFN-gamma
Autoimmunity
191
Alternative for production of adequate
peptides
192
Source of cytosolic antigens
193
Source of cytosolic antigens
194
Proteasoma: genes and DRIPs
A relatively large percentage of nascent proteins never reach
a functional state owing to errors in translation or folding.
These defective ribosomal products (DRiPs) are rapidly
ubiquitylated during translation and are degraded by
proteasomes. DRiPs could therefore represent an important
source of MHC class I peptides.
195
196
197