cobas® TaqScreen West Nile Virus Test

cobas® TaqScreen West Nile Virus Test
for use on the cobas s 201 system
PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO.
cobas® TaqScreen West Nile Virus Test
®
cobas TaqScreen West Nile Virus Control Kit
cobas® TaqScreen Wash Reagent
WNV
96 Tests
P/N: 04741722 190
WNV CTL
6 Sets
P/N: 04741749 190
TS WR
5.1 L
P/N: 04404220 190
Per l'analisi dei campioni cadaverici con il test cobas® TaqScreen per il virus del Nilo occidentale, è
necessario utilizzare il seguente kit, oltre ai kit sopraelencati:
cobas® TaqScreen Cadaveric Specimen Diluent Kit CADV SPEC DIL 96 Tests
P/N: 05002125 190
INDICE GENERALE
INDICE GENERALE ....................................................................................................................................................................... 1
Indice delle tabelle ................................................................................................................................................................... 2
USO PREVISTO ............................................................................................................................................................................... 3
RIASSUNTO E SPIEGAZIONE DEL TEST................................................................................................................................ 3
PRINCIPI DELLA PROCEDURA................................................................................................................................................. 3
Creazione automatizzata dei pool e pipettamento dei campioni con lo strumento
Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor........................................................................................................ 4
Preparazione automatizzata dei campioni con lo strumento COBAS® AmpliPrep ............................................. 4
Amplificazione automatizzata degli acidi nucleici con l'analizzatore COBAS® TaqMan® ................................ 4
Trascrizione inversa e amplificazione mediante PCR .............................................................................................. 4
Amplificazione selettiva .................................................................................................................................................... 5
Rilevazione automatizzata real-time dei prodotti della PCR con l'analizzatore COBAS® TaqMan® ............. 5
Rilevazione dei prodotti della PCR ................................................................................................................................ 5
Gestione automatizzata dei dati con il software PDM ................................................................................................. 5
MATERIALI FORNITI DA ROCHE ............................................................................................................................................. 6
ALTRI MATERIALI NECESSARI MA FORNITI A PARTE
(ACQUISTABILI PRESSO ROCHE)........................................................................................................................................... 7
Strumentazione e software per il sistema cobas s 201 Configurazione C o Configurazione C MR1
(Maintenance Release 1)....................................................................................................................................................... 7
Rack e materiali di consumo ................................................................................................................................................ 7
REAGENTI ........................................................................................................................................................................................ 8
REQUISITI PER LA MANIPOLAZIONE E LA CONSERVAZIONE ..................................................................................10
PRECAUZIONI...............................................................................................................................................................................11
PREPARAZIONE DEI REAGENTI.............................................................................................................................................12
RACCOLTA, CONSERVAZIONE E CREAZIONE DI POOL DI CAMPIONI..................................................................12
Campioni di donatori viventi ...............................................................................................................................................12
Campioni cadaverici ..............................................................................................................................................................14
CREAZIONE DI POOL E PIPETTAMENTO DEI CAMPIONI.............................................................................................15
NOTE SULLA PROCEDURA .....................................................................................................................................................15
ISTRUZIONI PER L'USO.............................................................................................................................................................16
CONTROLLO DI QUALITÀ........................................................................................................................................................19
La sezione Revisione del documento si trova in fondo a questo documento.
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RISULTATI ......................................................................................................................................................................................20
Creazione di pool secondari................................................................................................................................................20
LIMITI DELLA PROCEDURA ....................................................................................................................................................21
CARATTERISTICHE DELLA PERFORMANCE .....................................................................................................................21
CAMPIONI DI DONATORI VIVENTI .......................................................................................................................................21
Riproducibilità..........................................................................................................................................................................21
Sensibilità analitica - Health Canada Standard - Lineage 1......................................................................................23
Sensibilità analitica - Roche WNV Secondary Standard - Lineage 1 .....................................................................24
Sensibilità analitica - CBER/FDA West Nile Virus Panel - Lineage 1.....................................................................25
Sensibilità analitica - West Nile Virus RNA Qualification Panel QWN701 - Lineage 2.....................................25
Specificità analitica - Microrganismi potenzialmente interferenti e reattività crociata.....................................26
Specificità analitica - Altre condizioni patologiche......................................................................................................26
Sostanze potenzialmente interferenti...............................................................................................................................27
Sostanze interferenti di tipo endogeno......................................................................................................................27
Sostanze interferenti di tipo esogeno.........................................................................................................................27
CAMPIONI CADAVERICI...........................................................................................................................................................28
Riproducibilità..........................................................................................................................................................................28
Specificità .................................................................................................................................................................................29
Sensibilità analitica nei campioni cadaverici con Roche WNV Secondary Standard.........................................29
Sensibilità ..................................................................................................................................................................................30
PERFORMANCE CLINICA - CAMPIONI DI DONATORI VIVENTI ................................................................................31
Sensibilità clinica - Analisi di campioni confermati positivi al virus del Nilo occidentale.................................31
Specificità clinica....................................................................................................................................................................32
Risultati dei test in pool .......................................................................................................................................................32
Risultati dei test sui campioni individuali.........................................................................................................................33
RIFERIMENTI ................................................................................................................................................................................34
Indice delle tabelle
Tabella 1. Test cobas® TaqScreen WNV - Dati di riproducibilità.................................................................................22
Tabella 2. Riepilogo della sensibilità analitica - Health Canada West Nile Virus Standard ...................................23
Tabella 3. Riepilogo della sensibilità analitica - Roche WNV Secondary Standard .................................................24
Tabella 4. Riepilogo della sensibilità analitica - CBER/FDA West Nile Virus Panel .................................................25
Tabella 5. Riepilogo della sensibilità analitica - West Nile Virus RNA Qualification Panel QWN701 Lineage 2 ........................................................................................................................................................................25
Tabella 6. Microrganismi analizzati.........................................................................................................................................26
Tabella 7. Riepilogo dei dati di riproducibilità per campioni cadaverici e campioni di donatori viventi Risultati in base al lotto del kit ................................................................................................................................28
Tabella 8. Riepilogo dei dati di riproducibilità per campioni cadaverici e campioni di donatori viventi Risultati in base alla coppia operatore-strumento ............................................................................................28
Tabella 9. Riepilogo dei risultati del test cobas® TaqScreen WNV in materia di specificità dei campioni
cadaverici e dei campioni di donatori viventi......................................................................................................29
Tabella 10. Riepilogo della sensibilità analitica con Roche WNV Secondary Standard in
campioni cadaverici moderatamente emolizzati..............................................................................................30
Tabella 11. Riepilogo della sensibilità analitica con Roche WNV Secondary Standard in
una matrice di campioni altamente emolizzati ................................................................................................30
Tabella 12. Riepilogo della sensibilità per il virus WNV con campioni cadaverici
moderatamente emolizzati (MH) e con campioni altamente emolizzati (HH)........................................31
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Tabella 13. Sensibilità clinica di campioni confermati positivi al virus del Nilo occidentale .................................31
Tabella 14. Specificità clinica del test cobas® TaqScreen WNV - Test in pool .......................................................32
Tabella 15. Specificità clinica del test cobas® TaqScreen WNV - Test di campioni individuali..........................33
USO PREVISTO
Il test cobas® TaqScreen West Nile Virus (WNV) è un test qualitativo in vitro destinato all'uso con il sistema
cobas s 201 per la determinazione diretta dell'RNA del virus del Nilo occidentale (RNA di WNV).
Il test consente di individuare la presenza dell'RNA di WNV in campioni di plasma umano ed è destinato
all'uso nello screening dei donatori di sangue intero e/o di emocomponenti e degli altri donatori viventi.
Inoltre il test può essere utilizzato per lo screening dei donatori di organi (campioni di plasma prelevati in
presenza di battito cardiaco del donatore) e per l'analisi di campioni cadaverici (campioni ematici prelevati
in assenza di battito cardiaco). Il test non è destinato all'uso con sangue di cordone ombelicale.
È possibile eseguire lo screening del plasma di tutti i donatori analizzando i campioni individuali. Nel caso
delle donazioni di sangue intero e/o di emocomponenti, i campioni di plasma possono essere analizzati in
pool costituiti da non più di sei aliquote identiche di campioni individuali. Nel caso delle donazioni di
organi e tessuti (in assenza di battito cardiaco), è possibile eseguire lo screening dei campioni di plasma e
di siero soltanto come campioni individuali.
Questo test non può essere utilizzato a sostegno della diagnosi.
RIASSUNTO E SPIEGAZIONE DEL TEST
Il virus del Nilo occidentale (West Nile Virus, WNV) della famiglia dei Flaviviridiae appartiene al genere
Flavivirus e al gruppo di virus dell'encefalite giapponese (Japanese Encephalitis Serocomplex). I virus di
questo gruppo sono arbovirus potenzialmente in grado di causare meningite, encefalite e
meningoencefalite. Appartengono al gruppo dei virus dell'encefalite giapponese il virus dell'encefalite
giapponese, il virus dell'encefalite della Murray Valley, il virus Kunjin (ora formalmente riconosciuto come
variante di WNV) e il virus dell'encefalite di Saint Louis, che causò un'epidemia di encefalite negli Stati
Uniti attorno alla metà degli anni '701,2.
Il test cobas® TaqScreen WNV è un test qualitativo che consente di effettuare lo screening e la rilevazione
dell'RNA di WNV in campioni individuali o in pool di campioni infetti. Il test cobas® TaqScreen WNV
prevede la preparazione degli acidi nucleici sullo strumento COBAS® AmpliPrep secondo una tecnica di
estrazione generica. Per determinare la presenza dell'RNA di WNV viene eseguita un'amplificazione PCR
real-time automatizzata sull'analizzatore COBAS® TaqMan®. Nel kit è incluso un Controllo Interno (Internal
Control, IC), per il monitoraggio della performance di ogni singolo test, e l'enzima AmpErase, che consente
di ridurre la potenziale contaminazione da materiale amplificato in precedenza (amplicon).
PRINCIPI DELLA PROCEDURA
Il test cobas® TaqScreen WNV utilizzato sul sistema cobas s 201 si basa su 4 procedure principali:
1.
Creazione automatizzata dei pool di campioni e pipettamento dei controlli con il pipettatore opzionale
Hamilton MICROLAB® STAR/STARlet IVD
2.
Preparazione automatizzata dei campioni con lo strumento COBAS® AmpliPrep
3.
Amplificazione automatizzata degli acidi nucleici e rilevazione automatizzata real-time dei prodotti
della PCR con l'analizzatore COBAS® TaqMan®
4.
Gestione automatizzata dei dati con il software PDM (Pooling and Data Management)
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Creazione automatizzata dei pool e pipettamento dei campioni con lo strumento Hamilton
MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor
Lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor consente di automatizzare il pipettamento
dei pool e dei campioni individuali dei donatori, il trasferimento delle aliquote nelle piastre a pozzetti
profondi (facoltativo) e il pipettamento dei controlli del test. Il sistema cobas s 201 viene utilizzato per i
test di risoluzione dei pool reattivi e per l'identificazione dei campioni individuali reattivi presenti nel pool.
Il sistema cobas s 201 è progettato per il trattamento dei campioni in batch. Un batch è un gruppo di
campioni e controlli che vengono sottoposti insieme alle procedure di pipettamento, estrazione,
amplificazione e rilevazione. Al termine del pipettamento di un batch sullo strumento Hamilton MICROLAB
STAR/STARlet IVD Pipettor, l'intero rack per campioni viene trasferito sullo strumento COBAS® AmpliPrep
per la fase successiva della procedura.
Nota: per eseguire il test sui campioni cadaverici, diluire il campione con rapporto 1:5 utilizzando
il diluente cobas® TaqScreen per campioni cadaverici (CADV SPEC DIL) prima di avviare il
pipettamento con lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor.
Preparazione automatizzata dei campioni con lo strumento COBAS® AmpliPrep
Vengono analizzati simultaneamente gli acidi nucleici dei target e le molecole del Controllo Interno (IC)
dell'Armored RNA aggiunte, che agiscono da controllo per la procedura di preparazione e amplificazione/
rilevazione dei campioni. Il test cobas® TaqScreen WNV contiene reagenti sufficienti per completare cinque
fasi in sequenza sullo strumento COBAS® AmpliPrep. La soluzione di Proteasi è preposta alla digestione
enzimatica delle proteine per indurre la lisi, inattivare le nucleasi e facilitare il rilascio di RNA e DNA dalle
particelle virali. L'aggiunta del Reagente di lisi nel campione induce la lisi virale e l'inattivazione delle nucleasi
attraverso la denaturazione delle proteine. L'RNA e il DNA vengono rilasciati e allo stesso tempo protetti dalle
nucleasi. Gli acidi nucleici rilasciati si legano alla superficie di silice delle particelle di vetro magnetizzate
(Magnetic Glass Particles, MGP) aggiunte. Ciò è dovuto principalmente alla presenza di una carica netta
positiva sulla superficie delle particelle di vetro e di una carica netta negativa degli acidi nucleici sotto la
concentrazione dei sali caotropici e la forza ionica della reazione di lisi. Il Reagente di lavaggio rimuove le
sostanze non legate e le impurità, come le proteine denaturate, i detriti cellulari e i potenziali inibitori della PCR
(ad esempio, l'emoglobina ecc.), riducendo la concentrazione salina. Gli acidi nucleici purificati vengono
rilasciati dalle particelle di vetro magnetizzate a una temperatura elevata con il Tampone di eluizione.
Amplificazione automatizzata degli acidi nucleici con l'analizzatore COBAS® TaqMan®
Dopo l'isolamento degli acidi nucleici purificati, durante la preparazione automatizzata del campione, viene
utilizzata la soluzione cobas® TaqScreen WNV Master Mix (WNV MMX) per amplificare e rilevare l'RNA
del virus del Nilo occidentale (RNA di WNV) e l'RNA del Controllo Interno (RNA IC). Dopo l'attivazione
mediante aggiunta di acetato di manganese, la soluzione WNV MMX consente la trascrizione inversa,
seguita dall'amplificazione PCR di una regione altamente conservata di RNA di WNV e di RNA IC, grazie
all'uso di primer specifici. La rilevazione simultanea del DNA amplificato è possibile grazie alla generazione
di segnali fluorescenti dalla degradazione 5'-nucleolitica delle sonde WNV-specifiche e IC-specifiche
presenti anche nella soluzione WNV MMX. Vengono utilizzati due coloranti fluorescenti: il primo marca la
sonda IC-specifica e il secondo marca la sonda target-specifica, consentendo l'identificazione
indipendente di WNV e IC.
Trascrizione inversa e amplificazione mediante PCR
Le reazioni di trascrizione inversa e di amplificazione vengono eseguite con un enzima ricombinante
termostabile, denominato DNA Polimerasi Z05. In presenza di manganese (Mn2+), la DNA Polimerasi Z05
induce le attività di trascrittasi inversa e di DNA polimerasi. Ciò fa sì che nella stessa miscela di reazione
possano avere luogo sia la trascrizione inversa, sia l'amplificazione mediante PCR.
L'amplificazione
lungo gli stampi
processo viene
L'amplificazione
interi genomi.
mediante PCR si ottiene grazie alla DNA polimerasi Z05, che estende i primer appaiati
target e produce una molecola di DNA a doppio filamento, denominata amplicon. Questo
ripetuto per svariati cicli e, ad ogni ciclo, la quantità di DNA amplicon raddoppia.
interessa soltanto la regione dei genomi target compresa tra i primer, ma non coinvolge
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Amplificazione selettiva
L'amplificazione selettiva degli acidi nucleici target nei campioni è ottenuta dal test cobas® TaqScreen WNV
grazie all'uso dell'enzima AmpErase (uracil-N-glicosilasi) e del trifosfato di deossiuridina (dUTP). L'enzima
AmpErase riconosce e catalizza la distruzione dei filamenti di DNA contenenti deossiuridina3, ma non del DNA
contenente deossitimidina o dell'RNA contenente ribouridina4,5. La desossiuridina non è presente nel DNA
naturale, ma è sempre presente nell'amplicon in quanto il trifosfato di desossiuridina viene utilizzato con il
trifosfato di timidina come uno dei dNTP nel reagente WNV MMX e pertanto solamente l'amplicon contiene
deossiuridina. La deossiuridina rende l'amplicon contaminante sensibile alla distruzione da parte dell'enzima
AmpErase prima dell'amplificazione dell'RNA target. Inoltre, qualsiasi prodotto non specifico eventualmente
formatosi dopo l'attivazione iniziale della soluzione WNV MMX tramite manganese viene distrutto dall'enzima
AmpErase. L'enzima AmpErase, che è contenuto nella soluzione WNV MMX, catalizza la segmentazione del
DNA contenente deossiuridina a livello dei residui di deossiuridina, aprendo la catena di deossiribosi in
posizione C1. Quando viene riscaldata nella prima fase del ciclo termico, la catena di DNA dell'amplicon si
spezza in corrispondenza della posizione della deossiuridina, rendendo il DNA non amplificabile. L'enzima
AmpErase rimane inattivo per un periodo di tempo prolungato dopo essere stato esposto a temperature
superiori a 55°C, di conseguenza non distrugge l'amplicon target che si è formato dopo la reazione PCR.
Rilevazione automatizzata real-time dei prodotti della PCR con l'analizzatore COBAS® TaqMan®
Durante l'amplificazione PCR, l'elevata temperatura intermittente durante i cicli induce la denaturazione
dell'amplicon target e dell'amplicon IC, formando un DNA a filamento singolo. Le sonde oligonucleotidiche
specifiche del test si ibridizzano al filamento singolo del DNA amplificato. L'amplificazione, l'ibridizzazione e la
rilevazione sono simultanee.
Rilevazione dei prodotti della PCR
La soluzione cobas® TaqScreen WNV MMX contiene sonde di rilevazione specifiche per gli acidi nucleici
di WNV e IC. Ogni sonda di rilevazione è marcata con due coloranti fluorescenti, uno che agisce da
reporter e l'altro da quencher. Alle sonde target-specifiche è associato un tipo di colorante reporter, che
viene misurato a una determinata lunghezza d'onda. Alla sonda IC-specifica è associato un secondo
colorante reporter, che viene misurato a una lunghezza d'onda diversa. In entrambe le sonde è presente
uno stesso tipo di colorante quencher. Questo sistema consente di rilevare il target di WNV amplificato a
una specifica lunghezza d'onda e, simultaneamente, di rilevare l'acido nucleico di IC a una diversa
lunghezza d'onda.
Prima che l'amplificazione mediante PCR abbia inizio, le sonde sono intatte e la fluorescenza del colorante
reporter è soppressa dal colorante quencher in virtù del trasferimento di energia tipo Förster. Durante
l'amplificazione mediante PCR, le sonde si ibridizzano a specifiche sequenze di DNA a filamento singolo e
vengono segmentate dall'attività della 5'-3' nucleasi della DNA polimerasi Z05 nello stesso momento in cui ha
luogo l'amplificazione. Una volta che i coloranti reporter e quencher si separano per effetto di questa
segmentazione, l'attività di fluorescenza del reporter è rilevata. Ad ogni ciclo di PCR viene generato un numero
maggiore di sonde segmentate e il segnale cumulativo del colorante reporter aumenta progressivamente.
Le rilevazione real-time dei prodotti della PCR è ottenuta misurando la fluorescenza dei coloranti reporter
rilasciati, i quali rappresentano uno il target WNV, uno l'IC.6, 7
Gestione automatizzata dei dati con il software PDM
L'applicazione Roche PDM Data Manager consente all'utente di rivedere e stampare i risultati. Roche PDM
Data Manager classifica i risultati di tutti i test come non reattivi, reattivi o non validi. Oltre che per
recuperare ed esaminare i risultati della PCR, il software Roche PDM può essere utilizzato dall'operatore
per stampare report, eseguire ricerche dei risultati, accettare i risultati dei donatori e, facoltativamente,
trasmettere i risultati a un sistema LIS.
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Doc Rev. 3.0
MATERIALI FORNITI DA ROCHE
Per la rilevazione dell'RNA di WNV nei campioni di plasma vengono forniti i tre kit necessari:
(1) il test cobas® TaqScreen West Nile Virus, (2) il kit di controlli cobas® TaqScreen West Nile Virus e
(3) il reagente di lavaggio cobas® TaqScreen. Le schede di sicurezza dei materiali (Material Safety Data
Sheets, MSDS) sono disponibili su richiesta presso l'ufficio Roche locale.
cobas® TaqScreen West Nile Virus Test
(P/N: 04741722 190)
WNV
96 test
WNV CS1
(Cassetta di reagente MGP per WNV)
WNV CS2
(Cassetta di reagente di lisi per WNV)
WNV CS3
(Cassetta di multi-reagente per WNV)
WNV CS4
(Cassetta di reagente test-specifico per WNV)
cobas® TaqScreen West Nile Virus Control Kit
Kit di controlli cobas® TaqScreen WNV
(P/N: 04741749 190)
WNV CTL
6 set
WNV (+) C
(Controllo positivo WNV)
WNV (–) C
[Controllo negativo WNV (plasma umano)]
cobas® TaqScreen Wash Reagent
Reagente di lavaggio cobas® TaqScreen
(P/N: 04404220 190)
TS WR
5,1 litri
TS WR
(Reagente di lavaggio cobas® TaqScreen)
Nota: per rilevare l'RNA di WNV nei campioni cadaverici, è necessario utilizzare il seguente kit (in
dotazione) oltre ai kit sopraelencati: cobas® TaqScreen Cadaveric Specimen Diluent Kit.
cobas® TaqScreen Cadaveric Specimen Diluent Kit
Kit di diluenti cobas® TaqScreen per campioni cadaverici
(P/N: 05002125 190)
CADV SPEC DIL
96 test
CADV SPEC DIL
(Diluente cobas® TaqScreen per campioni cadaverici)
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ALTRI MATERIALI NECESSARI MA FORNITI A PARTE
(ACQUISTABILI PRESSO ROCHE)
Questo test deve essere eseguito sul sistema cobas s 201. Il sistema cobas s 201 deve essere installato
da un rappresentante dell'Assistenza Tecnica Roche Diagnostics e utilizzato in una configurazione
completa. I singoli componenti del sistema cobas s 201 non possono essere utilizzati come dispositivi
indipendenti dal sistema, né possono essere sostituiti con altri componenti. Il sistema cobas s 201 utilizza i
componenti elencati di seguito. Per ulteriori informazioni fare riferimento alla scheda informativa del
prodotto.
Strumentazione e software per il sistema cobas s 201
•
Pipettatore Hamilton MICROLAB STAR e/o STARlet IVD (opzionale), workstation e software
Pooling Manager
•
Strumento COBAS® AmpliPrep
•
Analizzatore COBAS® TaqMan®
•
Stazione dati e software AMPLILINK
•
Server Roche PDM Data Manager, workstation e software Data Manager
•
Manuale operativo del sistema cobas s 201 Configurazione D
•
File di definizione del test WNV per il test COBAS® TaqScreen WNV
Rack e materiale di consumo
•
Rack per campioni COBAS® AmpliPrep (SK24) (P/N: 28122172001)
•
Rack per SPU COBAS® AmpliPrep (P/N: 05471664001)
•
Rack per reagenti COBAS® AmpliPrep (P/N: 28122199001)
•
Unità di trattamento campioni (SPU) (P/N: 03755525001)
•
Provette per campioni iniziali (provette campione) con clip dei codici a barre
(P/N: 03137040001)
•
Rack per puntali K (P/N: 03287343001)
•
Confezione di provette K da 12 x 96 (P/N: 03137082001)
•
K-carrier COBAS® TaqMan® (P/N: 28150397001)
•
Puntali CO-RE a volume elevato (1000 μl), filtro (P/N: 04639642001)
•
Piastre a pozzetti profondi con etichette per codice a barre (P/N: 04639634001)
•
Coperture per piastre a pozzetti profondi (P/N: 04789288001)
•
Rack portacampioni per 24 provette (P/N: 04639502001)
•
Rack portacampioni per 32 provette (P/N: 04639529001)
•
Rack portapuntali (P/N: 04639545001)
•
Rack per piastre a pozzetti profondi (P/N: 04639553001)
•
Carrier portarack SK24 (P/N: 04639600001)
•
Spray disinfettante Microcide SQ™ o HAMILTON (P/N: 04592557001)
•
Guanti monouso, senza talco
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Doc Rev. 3.0
REAGENTI
cobas® TaqScreen West Nile Virus Test
(P/N: 04741722 190)
WNV
WNV CS1
MGP
(Particelle di vetro magnetizzate)
Particelle di vetro magnetizzate
93% Isopropanolo
Xi
96 test
2 x 48 test
2 x 7,0 ml
93% (p/p) Isopropanolo
Irritante
F
93% (p/p) Isopropanolo
Facilmente
infiammabile
WNV CS2
LYS
(Reagente di lisi)
Diidrato di citrato di sodio
42,5% Tiocianato di guanidina
< 14% Polidocanolo
0,9% Ditiotreitolo
Xn
2 x 48 test
2 x 78 ml
42,5% (p/p) Tiocianato di guanidina
Nocivo
N
< 14% (p/p) Polidocanolo
Pericoloso per
l'ambiente
WNV CS3
Pase
(Soluzione Proteinasi)
Tampone TRIS
< 0,05% EDTA
Cloruro di calcio
Acetato di calcio
≤ 7,8% Proteinasi
Glicerolo
2 x 48 test
2 x 3,8 ml
≤ 7,8% (p/p) Proteinasi
Xn
Nocivo
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Doc Rev. 3.0
WNV EB
(Tampone di eluizione WNV)
Tampone TRIS
≤ 0,002% Poly rA RNA (sintetico)
EDTA
0,09% Sodio azide
2 x 7,0 ml
WNV CS4
WNV MMX
(Master Mix WNV)
Tampone tricina
Acetato di potassio
Glicerolo
< 18% Dimetilsolfossido
< 0,07% dATP, dCTP, dGTP, dUTP
< 0,002% Primer a monte e a valle per WNV
< 0,002% Sonda a marcatura fluorescente WNV-specifica
< 0,002% Sonda a marcatura fluorescente IC-specifica
< 0,002% Aptamero oligonucleotidico
< 0,05% DNA Polimerasi Z05 (batterica)
< 0,1% Enzima AmpErase (uracil-N-glicosilasi) (batterico)
0,08% Sodio azide
2 x 48 test
2 x 2,5 ml
WNV Mn2+
(Soluzione di manganese WNV)
< 0,6% Manganese acetato
Acido acetico glaciale
0,09% Sodio azide
2 x 19,8 ml
WNV IC
(Controllo Interno WNV)
Tampone TRIS
≤ 0,002% Poly rA RNA (sintetico)
EDTA
0,05% Sodio azide
< 0,001% RNA di controllo interno sintetico, non infettivo,
incapsulato in proteina di rivestimento batteriofaga MS2
cobas® TaqScreen West Nile Virus Control Kit
Kit di controlli cobas® TaqScreen WNV
(P/N: 04741749 190)
2 x 3,6 ml
WNV CTL
WNV (+) C
(Controllo positivo WNV)
Tampone TRIS
≤ 0,002% Poly rA RNA (sintetico)
EDTA
0,05% Sodio azide
< 0,001% RNA di WNV sintetico, non infettivo, incapsulato in
proteina di rivestimento batteriofaga MS2
05462975001-03IT
9
6 set
6 x 1,1 ml
Doc Rev. 3.0
WNV (–) C
[Controllo negativo WNV (plasma umano)]
Plasma umano negativo, confermato non reattivo da test
brevettati per la determinazione dell'anticorpo anti-HCV,
dell'anticorpo anti-HIV-1/2 e dell'antigene HBsAg; RNA di
WNV non rilevabile mediante i metodi PCR
0,1% Conservante ProClin® 300
Xi
Miscela (3:1) di 5-cloro-2metil-3(2H)-isotiazolone e
2metil-3(2H)-isotiazolone
12 x 1,6 ml
Irritante
R36/38: Irritante per gli occhi e la pelle.
R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle.
cobas® TaqScreen Wash Reagent
Reagente di lavaggio cobas® TaqScreen
(P/N: 04404220 190)
TS WR
5,1 litri
CADV SPEC DIL
96 test
TS WR
(Reagente di lavaggio cobas® TaqScreen)
Diidrato di citrato di sodio
0,1% Conservante Metilparaben
cobas® TaqScreen Cadaveric Specimen Diluent Kit
Kit di diluenti cobas® TaqScreen per campioni cadaverici
(P/N: 05002125 190)
CADV SPEC DIL
(Diluente cobas® TaqScreen per campioni cadaverici)
EDTA
4 x 100 ml
REQUISITI PER LA MANIPOLAZIONE E LA CONSERVAZIONE
A. La temperatura tra 15 e 30°C è definita temperatura ambiente.
B. Non congelare i reagenti e i controlli.
C. Conservare i reagenti WNV CS1, WNV CS2, WNV CS3 e WNV CS4 tra 2 e 8°C. Se inutilizzati, questi
reagenti restano stabili fino alla data di scadenza indicata.
D. Dopo l'uso, i reagenti restano stabili per 30 giorni a 2-8°C oppure fino alla data di scadenza indicata,
se precedente.
E.
I reagenti possono essere utilizzati al massimo per 6 sedute, complessivamente per 40 ore, sullo
strumento COBAS® AmpliPrep. I reagenti devono essere conservati a 2-8°C tra una seduta e la
successiva. Il software AMPLILINK controlla le ore di utilizzo cumulativo delle cassette di reagente
nello strumento COBAS® AmpliPrep e impedisce l'uso delle cassette una volta raggiunte le 40 ore
cumulative.
F.
I reagenti sono stabili per un totale di 24 ore continuative sullo strumento COBAS® AmpliPrep. Il
software AMPLILINK non tiene conto delle ore di presenza continuativa delle cassette di reagente
sullo strumento, né del numero totale di sedute dello strumento in occasione delle quali sono state
utilizzate le cassette. È compito dell'utente gettare via le cassette di reagente una volta raggiunto il
limite massimo di 24 ore continuative o di 6 sedute dello strumento.
G. Conservare i reagenti WNV (+) C e WNV (–) C a 2-8°C. I controlli restano stabili fino alla data di
scadenza indicata. Dopo l'apertura è necessario gettare via le parti inutilizzate.
H. Conservare il reagente TS WR a 15-30°C. Se non è aperto, il reagente TS WR resta stabile fino alla data di
scadenza indicata. Dopo l'apertura, il reagente resta stabile per 30 giorni a 15-30°C o fino alla data di
scadenza, se precedente.
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10
Doc Rev. 3.0
I.
Conservare il diluente CADV SPEC DIL a 15-30°C. Il diluente è stabile fino alla data di scadenza
indicata. Dopo l'apertura è necessario gettare via il diluente inutilizzato rimasto nel contenitore.
PRECAUZIONI
PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO.
A. I campioni potrebbero essere infettivi. Adottare le Precauzioni Universali durante lo svolgimento del
test8,9. La procedura dovrebbe essere affidata esclusivamente a personale con esperienza nella
manipolazione di materiali infettivi e nell'uso del test cobas® TaqScreen West Nile Virus. Pulire e
disinfettare accuratamente tutte le superfici di lavoro del laboratorio con una soluzione fresca a base
di ipoclorito di sodio allo 0,5% in acqua deionizzata o distillata. Successivamente pulire la superficie
con etanolo al 70%.
B. ATTENZIONE: il reagente WNV (–) C contiene plasma umano derivato da sangue umano.
Il materiale d'origine è stato analizzato e confermato non reattivo all'anticorpo anti-HIV-1/2,
all'anticorpo anti-HCV e all'antigene HBsAg. L'analisi di plasma umano negativo mediante
i metodi PCR ha evidenziato l'assenza di RNA di WNV rilevabile. Allo stato attuale, tuttavia,
nessun metodo di analisi garantisce con assoluta certezza che i prodotti derivati da sangue
umano non trasmettano agenti infettivi. Tutti i materiali derivati da sangue umano devono
essere considerati potenzialmente infettivi e quindi manipolati adottando le Precauzioni
Universali. In caso di fuoriuscite, disinfettare immediatamente l'area con una soluzione fresca a base
di ipoclorito di sodio allo 0,5% (candeggina diluita) oppure seguire le procedure di laboratorio
opportune.
C. Rispettare le precauzioni di routine del laboratorio. Non pipettare con la bocca. Non mangiare, bere o
fumare nelle aree di lavoro designate. Durante la manipolazione dei campioni e dei reagenti del kit,
indossare guanti, camici da laboratorio e protezioni per gli occhi di tipo monouso. Dopo avere
manipolato i campioni e i reagenti del kit, lavarsi accuratamente le mani.
D. I reagenti WNV EB, WNV MMX, WNV Mn2+, WNV IC e WNV (+) C contengono sodio azide come
conservante. Non utilizzare tubi di metallo per il trasferimento dei reagenti. Se le soluzioni contenenti
sodio azide devono essere smaltite attraverso l'impianto di scarico, è necessario diluire e sciacquare
con abbondante acqua corrente, onde evitare che nelle tubature metalliche si accumulino depositi in
grado di dare luogo a reazioni esplosive.
E.
È dimostrato che l'eparina inibisce la PCR. Non utilizzare plasma eparinizzato con questa
procedura.
F.
Si consiglia di utilizzare pipette sterili e puntali per pipette privi di nucleasi, di tipo monouso.
Potrebbero verificarsi risultati falsi positivi se non si previene la contaminazione crociata durante la
manipolazione e l'analisi dei campioni.
G. Per garantire una performance ottimale del test, utilizzare soltanto i materiali di consumo forniti e
consigliati.
H. Manipolare tutti i materiali contenenti campioni o controlli secondo la Buona Prassi di Laboratorio,
onde evitare la contaminazione crociata di campioni o controlli.
I.
Prima dell'uso, ispezionare visivamente le singole cassette di reagente, le provette di controllo e il
Reagente di lavaggio per verificare che non vi siano segni di perdite. In presenza di perdite, non
utilizzare il materiale per il test.
J.
Smaltire tutti i reagenti che sono entrati in contatto con i campioni e i reagenti nel rispetto delle
normative locali e nazionali in materia.
K.
I seguenti prodotti non devono essere utilizzati dopo la data di scadenza indicata: il test cobas® TaqScreen
West Nile Virus, il kit di controlli cobas® TaqScreen West Nile Virus, il reagente di lavaggio cobas®
TaqScreen o il kit di diluenti cobas® TaqScreen per campioni cadaverici. Non scambiare, mescolare o
combinare reagenti appartenenti a kit o a lotti diversi. Non caricare lotti di reagenti misti sullo strumento
COBAS® AmpliPrep.
L.
Le schede di sicurezza dei materiali (Material Safety Data Sheets, MSDS) sono disponibili su richiesta
presso l'ufficio Roche locale.
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Doc Rev. 3.0
M. Evitare che i reagenti entrino in contatto con la pelle, gli occhi o le mucose. In caso di contatto,
lavare immediatamente con abbondante acqua per prevenire possibili ustioni. In caso di
fuoriuscita dei reagenti, diluire il liquido con acqua prima di asciugare. Evitare che il reagente LYS,
che contiene tiocianato di guanidina, entri in contatto con la soluzione di ipoclorito di sodio
(candeggina). L'eventuale miscela di queste soluzioni può produrre gas fortemente tossici.
N. Per assicurare il corretto svolgimento del test, attenersi scrupolosamente alle procedure e alle linee
guida fornite. Qualunque deviazione dalle procedure e dalle linee guida approvate potrebbe
compromettere la performance del test.
O. L'uso di campioni eccessivamente emolizzati da donatori viventi dovrebbe essere evitato.
P.
La contaminazione dei campioni di plasma con globuli rossi (> 5%) potrebbe inibire il funzionamento
del test cobas® TaqScreen West Nile Virus.
Q. Non utilizzare mai, in nessuna fase del test, componenti con etichette dei codici a barre danneggiate.
R. Nei test dei campioni cadaverici, i colori tra il giallo paglierino e il rosa sono classificati come
moderatamente emolizzati (Moderately Hemolyzed, MH), mentre i colori tra il rosso, il rosso scuro e il
marrone sono classificati come altamente emolizzati (Highly Hemolyzed, HM).
PREPARAZIONE DEI REAGENTI
A. Prima dell'uso, equilibrare i reagenti e i controlli cobas® TaqScreen WNV a temperatura ambiente
per 30 minuti.
RACCOLTA, CONSERVAZIONE E CREAZIONE DI POOL DI CAMPIONI
Nota: manipolare tutti i campioni come se fossero agenti infettivi.
Campioni di donatori viventi
A. È possibile utilizzare campioni di plasma raccolti in EDTA, CPD, CPDA1, CP2D, ACDA e citrato di sodio
al 4% con il test cobas® TaqScreen West Nile Virus. Attenersi alle istruzioni fornite dal produttore delle
provette. La stabilità dei campioni risente delle temperature elevate.
B. Per conservare il sangue raccolto con gli anticoagulanti K2 EDTA e K3 EDTA sono disponibili due
alternative.
Alternativa n°1: prima della plasmaferesi, è possibile conservare il sangue fino a 24 ore a 2-30°C, poi per
altre 24 ore a 2-25°C e infine per altre 72 ore a 2-8°C. Per conservare il campione per più di cinque giorni,
procedere alla separazione del plasma dai globuli rossi mediante centrifugazione a 800-1.600 x g per
20 minuti. Dopo la separazione, il plasma può essere conservato a 2-8°C per sette giorni, quindi per altri
30 giorni a ≤ -20°C.
Anticoagulante EDTA – Condizione n°1
30°C
Temperatura (°C)
30
25°C
20
2-8°C
10
Sangue intero
Plasma
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15
Giorni post-prelievo
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Alternativa n°2: prima della plasmaferesi, è possibile conservare il sangue fino a 72 ore a 2-25°C, poi per
altre 48 ore a 2-8°C. Per conservare il campione per più di cinque giorni, procedere alla separazione del
plasma dai globuli rossi mediante centrifugazione a 800-1.600 x g per 20 minuti. Dopo la separazione, il
plasma può essere conservato a 2-8°C per sette giorni, quindi per altri 30 giorni a ≤ -20°C.
Il plasma conservato in K2 EDTA e K3 EDTA può essere congelato e scongelato per tre (3) volte al
massimo
Anticoagulante EDTA – Condizione n°2
Temperatura (°C)
30
25°C
20
2-8°C
10
Sangue intero
Plasma
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15
Giorni post-prelievo
C. Il sangue raccolto con gli anticoagulanti CPD, CPDA1 e CP2D può essere conservato fino a 24 ore a
2-30°C prima della plasmaferesi. Per conservare il campione per più di un giorno, procedere alla
separazione del plasma dai globuli rossi mediante centrifugazione a 800-1.600 x g per 20 minuti. Dopo
la separazione, il plasma può essere conservato a 2-8°C per sette giorni, quindi per altri 30 giorni a
≤ -20°C. Per periodi di conservazione più lunghi, è possibile conservare il plasma separato dai globuli
rossi a ≤ -70°C per un massimo di 30 mesi. Il plasma con CPD, CPDA1 e CP2D può essere congelato e
scongelato per tre (3) volte al massimo.
Anticoagulanti CPD, CPDA1, CP2D
30 °C
Temperatura (°C)
30
20
10
2- 8°C
Whole
Sangue
Blood
intero
Pla s ma
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Giorni post-prelievo
D. Il plasma in aferesi con gli anticoagulanti ACDA o citrato di sodio al 4% può essere conservato per
24 ore a 2-30°C dopo il prelievo. Il plasma in aferesi può essere conservato fino a 30 giorni a ≤ -20°C.
Il plasma in aferesi con ACDA o citrato di sodio al 4% può essere congelato e scongelato per tre (3)
volte al massimo.
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E.
Le seguenti linee guida relative ai volumi di plasma si basano sul pipettamento da provette di plastica
o vetro da 13 x 100 mm, eseguito con lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor.
I volumi indicati, che si riferiscono al plasma oltre ai globuli rossi stratificati, dovranno essere utilizzati
per l'analisi cobas® TaqScreen West Nile Virus Test.
Tipo di pool
Volume minimo di plasma
Pool primario di 6 *
3 ml
Pool primario di 1 *
3 ml
Pool ripetuto da provetta
1,5 ml
Pool di risoluzione da provetta
2 ml
*Include la creazione di una piastra a pozzetti profondi
F.
Non congelare il sangue intero.
G. È dimostrato che l'eparina inibisce la PCR. Si sconsiglia di utilizzare campioni eparinizzati.
H. Le piastre a pozzetti profondi con la loro copertura possono essere conservate a 2-8°C per sette giorni
a partire dalla data della plasmaferesi. In alternativa, le piastre a pozzetti profondi con la loro copertura
possono essere conservate a ≤ -18°C per periodi più lunghi.
I.
Non sono stati osservati effetti negativi sulla performance del test quando i campioni di plasma sono
stati sottoposti a tre (3) cicli di congelamento/scongelamento.
J.
Prima dell'uso, equilibrare a temperatura ambiente i campioni individuali o i pool di campioni dei
donatori.
K. Se i campioni devono essere trasportati, impacchettare ed etichettare le provette nel rispetto delle
normative nazionali e internazionali per il trasporto di campioni e agenti eziologici.10
L.
Potrebbero essere generati risultati falsi positivi se non si previene adeguatamente la
contaminazione crociata durante la manipolazione e l'analisi dei campioni.
Campioni cadaverici
A. Con il test cobas® TaqScreen WNV è possibile utilizzare campioni cadaverici di sangue raccolti in
provette con anticoagulante EDTA o in provette per siero. Attenersi alle istruzioni fornite dal produttore
delle provette. La stabilità dei campioni risente delle temperature elevate.
B. Il sangue cadaverico raccolto in anticoagulante EDTA può essere conservato fino a 24 ore a 2-25°C
prima della plasmaferesi. Per conservare il campione per più di un giorno, procedere alla separazione
del plasma dai globuli rossi mediante centrifugazione a 800-1.600 x g per 20 minuti. Dopo la
separazione, il plasma può essere conservato a 2-8°C per altri sette giorni, quindi altri 30 giorni a
≤-18°C. Il plasma cadaverico in EDTA può essere congelato e scongelato per tre (3) volte al massimo.
C. Il sangue cadaverico raccolto sotto forma di siero può essere conservato fino a 24 ore a 2-8°C (e di
queste, 4 ore possono essere a 2-25°C) prima della plasmaferesi. Per conservare il campione per più di
un giorno, procedere alla separazione del siero dal coagulo mediante centrifugazione a 800-1.600 x g
per 20 minuti. Dopo la separazione, il campione di siero può essere conservato a 2-8°C fino a tre giorni.
In alternativa, qualora il siero sia separato dal coagulo, i campioni cadaverici di siero moderatamente
emolizzati possono essere conservati a ≤ -18°C fino a 15 giorni, mentre i campioni cadaverici di siero
altamente emolizzati possono essere conservati a ≤ -18°C fino a 8 giorni. I campioni cadaverici di siero
possono essere congelati e scongelati per tre (3) volte al massimo.
D. I campioni cadaverici diluiti con rapporto 1:5 nel diluente cobas® TaqScreen per campioni cadaverici
possono essere conservati fino a 7 giorni a 2-8°C e, dopo la rimiscelazione (pipettando su e giù quattro
(4) volte in ogni provetta), possono essere analizzati con il test cobas® TaqScreen WNV.
E. Per l'eventuale trasporto, impacchettare ed etichettare i campioni nel rispetto delle normative nazionali
e internazionali per il trasporto dei campioni e degli agenti eziologici. 10
F. Potrebbero essere generati risultati falsi positivi se non si previene adeguatamente la
contaminazione crociata durante la manipolazione e il trattamento dei campioni.
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CREAZIONE DI POOL E PIPETTAMENTO DEI CAMPIONI
1.
Il sistema cobas s 201 utilizza lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor per le
attività di pipettamento e creazione di pool dei campioni. Lo strumento Hamilton MICROLAB
STAR/STARlet IVD Pipettor acquisisce i codici a barre dei campioni e crea i poll utilizzando aliquote dei
campioni di identico volume.
2.
Se vengono individuati pool reattivi dal test cobas® TaqScreen West Nile Virus, lo strumento Hamilton
MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor viene utilizzato per pipettare i singoli campioni dalle piastre a
pozzetti profondi o dalle provette con i campioni di origine ed eseguire i test di risoluzione.
NOTE SULLA PROCEDURA
A. Attrezzatura
1.
Preparare il sistema cobas s 201 seguendo le istruzioni contenute nel Manuale operativo del
sistema cobas s 201.
2.
Eseguire tutti gli interventi di manutenzione consigliati per garantire il corretto funzionamento
degli strumenti.
B. Reagenti
1.
Prima dell'uso, equilibrare per 30 minuti a temperatura ambiente i reagenti del test cobas®
TaqScreen West Nile Virus, il kit di controlli cobas® TaqScreen West Nile Virus e il reagente di
lavaggio cobas® TaqScreen. Per informazioni sulle condizioni di conservazione dei reagenti,
vedere la sezione Requisiti per la manipolazione e la conservazione.
2.
Ogni kit cobas® TaqScreen West Nile Virus Test contiene materiale sufficiente per eseguire
96 test, preferibilmente suddivisi in batch da 24 test ciascuno per ogni rack SK24. Con ogni batch
o rack SK24 è necessario analizzare anche un replicato del controllo negativo [WNV (–) C] e un
replicato del controllo positivo [WNV (+) C].
3.
Ogni kit di diluenti cobas® TaqScreen per campioni cadaverici contiene materiale sufficiente per
un totale di 96 test, preferibilmente suddivisi in sedute in batch fino a 24 test per ogni rack SK24.
Con ogni batch o rack SK24 è necessario analizzare anche un replicato del controllo negativo
[WNV (–) C] e un replicato del controllo positivo [WNV (+) C]. Con il test cobas® TaqScreen
WNV il trattamento dei controlli è lo stesso, sia con i campioni di donatori viventi, sia con
i campioni cadaverici.
4.
Tutti i controlli sono monouso.
5.
Il sistema impedirà l'uso di eventuali reagenti rimasti sullo strumento COBAS® AmpliPrep per un
numero di ore superiore al consentito (più di 40 ore cumulative e 30 giorni dopo il primo utilizzo),
di eventuali reagenti scaduti o di eventuali cassette miste, appartenenti a un set di quattro
cassette già utilizzate nel sistema.
C. Trattamento dei campioni
1.
Evitare di contaminare i guanti durante la manipolazione dei campioni e dei controlli.
2.
Fare attenzione ad evitare la contaminazione dei campioni e del controllo negativo [WNV (–) C] con
i controlli positivi.
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Doc Rev. 3.0
ISTRUZIONI PER L'USO
Il sistema cobas s 201 si basa su quattro procedure principali: pipettamento di campioni e controlli con lo
strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor; preparazione dei campioni con lo strumento
COBAS® AmpliPrep e il test cobas® TaqScreen WNV; amplificazione/rilevazione con l’analizzatore
COBAS® TaqMan®; gestione dei dati.
In base alla configurazione del sistema cobas s 201, è possibile utilizzare fino a sei strumenti Hamilton
MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor, cinque stazioni di lavoro Data Manager e dieci stazioni dati
AMPLILINK. Ogni stazione dati AMPLILINK supporta fino a tre strumenti COBAS® AmpliPrep e due
analizzatori COBAS® TaqMan®. Per informazioni più dettagliate sul sistema cobas s 201, fare riferimento al
Manuale operativo del sistema cobas s 201.
Ogni kit cobas® TaqScreen West Nile Virus Test contiene otto cassette: due cassette di reagente
WNV CS1 con particelle di vetro magnetiche (Magnetic Glass Particles, MGP); due cassette di reagente
WNV CS2 con il Reagente di lisi; due cassette di reagente WNV CS3 con la Proteasi e il Tampone di
eluizione; due cassette di reagente WNV CS4 con controllo interno (IC), Master Mix (MMX) e soluzione di
manganese. Questo kit di analisi è destinato all'uso con il kit di controlli cobas® TaqScreen WNV e con il
reagente di lavaggio cobas® TaqScreen, mentre per l'analisi dei campioni cadaverici è necessario utilizzare
il kit di diluenti cobas® TaqScreen per campioni cadaverici.
Nota: non aprire le cassette.
Nota: non unire reagenti di lotti diversi o flaconi diversi dello stesso lotto.
Nota: non mescolare reagenti (incluse le cassette) provenienti da kit diversi. Non caricare lotti di
reagenti misti sullo strumento COBAS® AmpliPrep.
Nota: non separare le provette di controllo dai rispettivi adattatori (portaprovette in plastica).
Nota: il software PDM verifica che un batch venga eseguito su un solo strumento COBAS®
AmpliPrep e un solo analizzatore COBAS® TaqMan® collegati alla stessa stazione dati
AMPLILINK.
Nota: non suddividere i batch tra più strumenti COBAS® AmpliPrep o analizzatori COBAS®
TaqMan®.
Eseguire tutti gli interventi di manutenzione consigliati, come descritto nel Manuale operativo del sistema
cobas s 201.
Per istruzioni dettagliate per l'uso, fare riferimento al Manuale operativo del sistema cobas s 201. È importante
che l'utente segua attentamente le istruzioni fornite nel Manuale operativo del sistema cobas s 201.
A. Pipettamento di controlli e campioni con lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet
IVD Pipettor
Nota: evitare di contaminare i guanti durante la preparazione dei campioni e dei controlli.
Nota: miscelare i controlli per inversione almeno 3 volte, evitando la formazione di bolle d'aria
(come descritto più avanti).
• Miscelare per inversione significa capovolgere il controllo a testa in giù e riportarlo a
testa in su ogni volta.
• Durante ogni inversione mantenere il controllo in ognuna delle posizioni per almeno
2 secondi: in altre parole, capovolgere il controllo a testa in giù e mantenerlo in questa
posizione per 2 secondi, quindi riportare il controllo a testa in su e mantenerlo in questa
posizione per 2 secondi.
Nota: per l'esecuzione del test sui campioni cadaverici, l'uso delle piastre a pozzetti profondi è
disattivato al momento dell'installazione del sistema cobas s 201.
A1. Eseguire le procedure di avvio dello strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor,
quindi avviare la procedura guidata Roche PDM Pooling Wizard e attenersi alle istruzioni visualizzate.
A2. Fare attenzione a non danneggiare il codice a barre sulle provette campione e sugli adattatori delle
provette di controllo. Se il codice a barre è danneggiato, il sistema non riconosce i campioni e
i controlli.
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Doc Rev. 3.0
A3. Rimuovere il tappo dalle provette di controllo e caricare i campioni, i materiali di consumo e i controlli
sul pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD. Dopo che i campioni, il materiale di consumo
e i controlli sono stati caricati, lo strumento trasferisce i controlli e i campioni nelle provette campione.
I campioni e i controlli sono stabili per 5 ore al massimo nelle provette aperte e per altre 5 ore nelle
provette campione.
A4. Nel caso di campioni cadaverici individuali, pipettare 2000 μl di diluente CADV SPEC DIL in provette
da 13 x 100 mm debitamente etichettate, aggiungere 500 μl di campione cadaverico in ogni singola
provetta, quindi miscelare i campioni uno ad uno pipettandoli su e giù per quattro (4) volte. A questo
punto è possibile caricare i campioni cadaverici diluiti, il materiale di consumo e i controlli sul
pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD. Dopo che i campioni cadaverici diluiti, i materiali
di consumo e i controlli sono stati caricati, lo strumento trasferisce i controlli e i campioni diluiti nelle
provette campione. I campioni cadaverici diluiti e i controlli WNV sono stabili fino a 5 ore nelle provette
aperte.
Nota: per ottenere una diluizione 1:10 del reagente [WNV (+) C], è necessario caricare due
provette di controllo [WNV (–) C] per ogni provetta di controllo [WNV (+) C] utilizzata.
A5. Al termine della seduta di pipettamento, visualizzare gli allarmi e stampare i report dei pool.
Ispezionare i pool e i pozzetti della piastra a pozzetti profondi. Invalidare i pool e/o i pozzetti se si
osserva la contaminazione con globuli rossi o se i volumi non sono uniformi.
A6. Tappare le provette campione e trasferire i rack SK24 sullo strumento COBAS® AmpliPrep per
l'estrazione degli acidi nucleici. Dopo il trasferimento sullo strumento COBAS® AmpliPrep, tutti i target
virali e i controlli sono stabili per 5 ore nelle provette campione.
A7. Tappare e riporre le piastre a pozzetti profondi (se sono state create durante la sessione di
pipettamento). Le piastre a pozzetti profondi possono essere conservate fino a 7 giorni a 2-8°C o a
≤ -18°C per periodi più lunghi.
A8. Rimuovere e conservare le provette dei donatori. Per informazioni sulle condizioni di conservazione,
vedere la sezione "Raccolta, conservazione e creazione di pool di campioni".
A9. Rimuovere e gettare via le provette di controllo (le provette di controllo sono monouso).
B. Preparazione e caricamento dei reagenti del test cobas® TaqScreen West Nile Virus
Nota: fare attenzione a non danneggiare le etichette delle cassette. Il lettore di codici a barre
dello strumento COBAS® AmpliPrep acquisisce automaticamente il codice a barre di ogni
cassetta mentre vengono caricati i rack per reagenti.
B1. Equilibrare i reagenti a temperatura ambiente per almeno 30 minuti prima di trattare il primo campione.
Non è necessario preparare i reagenti in altro modo.
B2. Prima di iniziare, provvedere a caricare un numero di cassette sufficiente per il trattamento ininterrotto
di tutti i campioni inclusi nella seduta sullo strumento COBAS® AmpliPrep. Ogni cassetta contiene
reagenti sufficienti per 48 test. Per informazioni su come caricare un numero di reagenti sufficiente per
evitare di interrompere la seduta, fare riferimento al Manuale operativo del sistema cobas s 201.
B3. Inserire la cassetta WNV CS1 in un rack per reagenti, verificando che il codice a barre della cassetta
sia allineato al codice a barre del rack, sul lato destro del rack. Le cassette WNV CS1 devono essere
caricate tutte insieme in un rack per reagenti diverso da quello delle altre cassette.
B4. Caricare il rack per reagenti contenente la cassetta WNV CS1 nella posizione per rack A, farlo
scorrere fino al perno di arresto sullo strumento COBAS® AmpliPrep, quindi attendere che il LED del
rack per reagenti diventi verde prima di spingere il rack verso la parte posteriore dello strumento, nella
posizione finale. Non caricare lotti di reagenti misti sullo strumento.
B5. Per ogni cassetta WNV CS1 inserire un set di cassette WNV CS2, WNV CS3 e WNV CS4 in un rack
per reagenti, verificando che i codici a barre delle cassette siano allineati al codice a barre del rack, sul
lato destro del rack.
B6. Caricare il rack per reagenti nella posizione per rack B, C, D o E, farlo scorrere fino al perno di arresto
sullo strumento COBAS® AmpliPrep, quindi attendere che il LED del rack per reagenti diventi verde
prima di spingere il rack verso la parte posteriore dello strumento, nella posizione finale.
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Doc Rev. 3.0
B7. I LED sulla barra di stato dello strumento COBAS® AmpliPrep diventeranno verdi quando tutti
i componenti del kit necessari saranno stati caricati e riconosciuti dal sistema.
C. Estrazione degli acidi nucleici da campioni e controlli pipettati
Nota: eseguire questa procedura su una superficie di lavoro pulita.
C1. Rimuovere il rivestimento dall'involucro delle unità SPU, lasciando intatto il nastro e la copertura in
plastica.
C2. Dopo aver rivolto il bordo più largo del rack per SPU verso l’operatore, inserire l'involucro con le unità
SPU facendo attenzione che sia a livello con il lato destro del rack per SPU.
C3. Rimuovere il nastro e il coperchio di plastica dalle unità SPU, dopo averle inserite nel rack. Assicurarsi che
tutte le unità SPU siano perfettamente inserite dentro il rack e siano a livello. Se vi sono unità SPU sollevate,
lo strumento potrebbe smettere di funzionare. Non esercitare pressioni sull'ago per campioni nell'unità
SPU.
C4. Spingere i rack per SPU caricati nelle posizioni J, K o L dello strumento COBAS® AmpliPrep finché il
rack non sarà perfettamente inserito e identificato. Lo strumento può ospitare un massimo di 72 unità
SPU alla volta. Caricare almeno le unità SPU necessarie per completare la seduta, o eventualmente un
numero maggiore.
C5. Rimuovere il rivestimento in cellophane dalle confezioni originali dei rack per provette K e per
puntali K, facendo attenzione a non rovesciare i rack. Controllare che siano tutti inseriti perfettamente.
C6. Spingere il numero necessario di rack per provette K e per puntali K nelle posizioni M, N, O o P dello
strumento COBAS® AmpliPrep.
C7. Nelle posizioni F, G o H dello strumento COBAS® AmpliPrep caricare i rack SK24 contenenti i campioni
e i controlli pipettati con lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor. Spingere
finché i rack non si bloccano. Controllare lo stato del sistema nella finestra Sample, verificando che
siano stati identificati tutti i campioni in ogni rack.
C8. Nel software AMPLILINK verificare che sia stato caricato un numero sufficiente di reagenti e materiali
di consumo per la preparazione dei campioni desiderati.
C9. Sulla stazione di lavoro con il software AMPLILINK premere Start, in modo da avviare la procedura di
preparazione dei campioni sullo strumento COBAS® AmpliPrep.
C10. Tutti i puntali K e le provette K inutilizzati potranno essere monitorati sullo strumento COBAS®
AmpliPrep ed eventualmente utilizzati per la seduta successiva, se non verranno rimossi.
D. Amplificazione e rilevazione
Nota: la soluzione di lavoro Master Mix con i campioni trattati contenuti nel rack SK24 hanno una
stabilità limitata. L'analizzatore COBAS® TaqMan® deve essere pronto ad accettare i campioni
trattati non appena lo strumento COBAS® AmpliPrep avrà completato la preparazione dei
campioni.
D1. Trasferire il rack SK24, contenente i campioni trattati, sull'analizzatore COBAS® TaqMan®.
L'analizzatore COBAS® TaqMan® avvierà automaticamente l'amplificazione e la rilevazione. La seduta
dell'analizzatore COBAS® TaqMan® deve essere avviata entro 1 ora dal completamento della
preparazione dei campioni per il rack SK24. I rack SK24 semipieni che non vengono trasferiti entro
1 ora potrebbero ancora assicurare un batch valido. Il software AMPLILINK tiene traccia del tempo
trascorso tra l'aggiunta del reagente Master Mix e l'inizio dell'amplificazione/rilevazione per ogni
campione, pertanto considera non valido l'intero rack se il primo campione trattato supera il limite
temporale.
D2. Al termine dell'amplificazione e della rilevazione con l'analizzatore COBAS® TaqMan®, i campioni
vengono espulsi automaticamente nel contenitore dei rifiuti.
D3. I risultati sulla workstation che esegue il software AMPLILINK vengono accettati automaticamente.
D4. I risultati vengono inviati automaticamente al software PDM.
05462975001-03IT
18
Doc Rev. 3.0
E.
Revisione e approvazione dei risultati
E1.
Avviare la stazione di lavoro Roche PDM.
E2.
Nella stazione di lavoro Data Manager procedere al recupero dei batch non ancora valutati (opzione
"Unevaluated Batches" della scheda "Review Batches").
E3.
Per rivedere gli allarmi, evidenziare un batch e quindi fare clic su "Next".
E4.
Rivedere i risultati dei controlli nella scheda "Controls Review". Per una descrizione dei criteri di
validità dei controlli, vedere la sezione "Controllo di qualità".
E5.
Rivedere i risultati dei pool nella scheda "Pools Review" relativa al batch selezionato. I pool non
reattivi possono essere invalidati manualmente dall'utente, se necessario. I campioni dei donatori in
un pool non valido devono essere analizzati di nuovo.
E6.
Rivedere e approvare i donatori nella scheda "Donor Review" relativa al batch selezionato.
E7.
Stampare i report e, se necessario, inviarli al sistema LIS (Laboratory Information System).
CONTROLLO DI QUALITÀ
1.
Con ogni batch è necessario analizzare un replicato del controllo negativo [WNV (–) C] e un replicato del
controllo positivo [WNV (+) C].
2.
Stato del batch: lo stato del batch diventa "Complete, Valid" quando i controlli del batch sono validi. Se
i controlli del batch non sono validi, l'intero batch non è valido. Il software PDM invalida
automaticamente i risultati sulla base degli errori dei controlli.
a.
Controllo negativo
Il controllo negativo [WNV (–) C] è valido solo se l'interpretazione del risultato è "non reattivo" e il
Controllo Interno associato è valido. Se il controllo interno non è valido, il risultato del controllo
negativo viene considerato non valido. Se il risultato del controllo negativo è considerato non
valido, l'intero batch sarà non valido e il test dovrà essere ripetuto.
b.
Controllo positivo
Affinché il controllo positivo [WNV (+) C] possa essere considerato valido, il risultato deve essere
interpretato come reattivo e il controllo interno associato deve essere valido. Se il controllo interno
non è valido, il risultato del controllo positivo è considerato non valido. Se il risultato del controllo
positivo è considerato non valido, l'intero batch sarà non valido e il test dovrà essere ripetuto.
3.
Controllo interno per i campioni dei donatori
a.
Affinché al campione di un donatore possa essere associato un risultato non reattivo valido (-), il
controllo interno associato deve essere valido; in caso contrario, il risultato non reattivo non sarà
valido e il test dovrà essere ripetuto.
b.
Affinché al campione di un donatore possa essere associato un risultato reattivo valido, il controllo
interno associato può essere valido o non valido.
05462975001-03IT
19
Doc Rev. 3.0
RISULTATI
1.
I risultati dei campioni sono validi solo se il batch che li contiene è valido. Per informazioni sui criteri di
validità, vedere la sezione Controllo di qualità. Per ogni campione vengono misurati due parametri, uno
per il target WNV e un altro per il controllo interno.
2.
I risultati finali del donatore al test cobas® TaqScreen West Nile Virus sono indicati in un report
generato dal software PDM nel modo seguente:
Stato
Significato
Completed Non-Reactive Il donatore non è reattivo al virus WNV.
Completed Reactive
Il donatore è reattivo al virus WNV.
Il limite di vitalità è stato superato prima che uno stato (reattivo o non reattivo)
potesse essere assegnato al donatore. Non è possibile eseguire altri test sul
Completed Unresolved
sistema per questo donatore. Per una descrizione del limite di vitalità, vedere il
Manuale operativo del sistema cobas s 201.
Creazione di pool secondari
Per le provette donatori con stato individuale o con stato del pool di appartenenza "invalid" è richiesta la
ripetizione del test. Quando un pool di campioni viene segnalato come reattivo dal sistema cobas s 201,
viene generata una richiesta di creazione di pool secondari con i campioni dei donatori associati a tale pool
e viene utilizzato lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor per pipettare i singoli
campioni dalle piastre a pozzetti profondi o dalle provette contenenti i campioni originali. Il test cobas®
TaqScreen West Nile Virus consente di identificare i singoli campioni reattivi utilizzando gli stessi metodi
(test in singolo) applicati ai campioni in pool.
Se un pool contiene uno o più campioni reattivi, questi campioni vengono segnalati come "Completed
Reactive", mentre i restanti campioni negativi del pool che inizialmente era risultato positivo vengono
segnalati come "Completed, Non-reactive". Se tutti i campioni individuali contenuti nel pool generano
risultati negativi, i campioni del pool vengono tutti segnalati come "Completed, Non-reactive".
05462975001-03IT
20
Doc Rev. 3.0
LIMITI DELLA PROCEDURA
1.
L'uso del test cobas® TaqScreen West Nile Virus è stato valutato esclusivamente con il kit di controlli
cobas® TaqScreen West Nile Virus, con il reagente di lavaggio cobas® TaqScreen e con il sistema
cobas s 201.
2.
Per l'esecuzione del test sui campioni cadaverici è stato valutato esclusivamente l'uso del test cobas®
TaqScreen WNV contestualmente al kit di diluenti cobas® TaqScreen per campioni cadaverici, al kit di
controlli cobas® TaqScreen WNV, al reagente di lavaggio cobas® TaqScreen e al sistema cobas s 201.
3.
È dimostrato che l'eparina inibisce la PCR. Non utilizzare plasma eparinizzato con questa procedura.
4.
L'affidabilità dei risultati dipende dall'adeguatezza delle procedure seguite per la raccolta e il trasporto
dei campioni.
5.
L'identificazione dell’RNA di WNV dipende dal numero di particelle virali presenti nel campione e può
essere influenzata dai metodi di raccolta del campione, da fattori legati al paziente (come l'età e la
presenza di sintomi), nonché dallo stadio dell'infezione e dalle dimensioni del pool.
6.
Per la preparazione automatizzata dei pool di plasma è stato validato soltanto l'uso dello strumento
Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor con il test cobas® TaqScreen West Nile Virus.
Attenersi alle istruzioni hardware e alle precauzioni per la sicurezza descritte nel Manuale operativo del
sistema cobas s 201 e nel manuale utente dello strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD
Pipettor.
7.
Anche gli altri virus del gruppo dell'encefalite giapponese (encefalite giapponese, encefalite della
Murray Valley, encefalite di Saint Louis e Kunjin) potrebbero risultare reattivi al test cobas® TaqScreen
West Nile Virus.
8.
Anche se rare, le mutazioni della regione altamente conservata del genoma virale coperta dai primer
e/o dalla sonda del test cobas® TaqScreen West Nile Virus possono dare luogo alla mancata
identificazione del virus.
9.
A causa delle differenze intrinseche tra le tecnologie, è consigliabile che gli utenti, prima di passare da
una tecnologia a un'altra, svolgano studi sulla correlazione tra i metodi nei propri laboratori alla scopo
di qualificare tali differenze. Si consiglia agli utenti di seguire le proprie strategie e procedure interne.
CARATTERISTICHE DELLA PERFORMANCE
CAMPIONI DI DONATORI VIVENTI
Riproducibilità
La riproducibilità del test cobas® TaqScreen WNV con il sistema cobas s 201 è stata valutata analizzando alla
cieca un pannello di 21 componenti randomizzati, così costituiti: sei campioni di plasma negativi, sei campioni
di plasma positivi con una concentrazione pari a 0,49 volte il limite di sensibilità del test cobas® TaqScreen
WNV e tre campioni di plasma positivi, ciascuno con concentrazioni 2,5 volte, 5 volte e 10 volte il limite di
sensibilità. I test sono stati eseguiti presso 3 laboratori e da 1 operatore in ogni laboratorio con 3 lotti del test
cobas® TaqScreen West Nile Virus e 1 sistema cobas s 201. In ciascun laboratorio sono stati analizzati
4 pannelli con i controlli positivi e negativi associati, tutti i giorni per 5 giorni, per un totale di 180 test per ogni
componente del pannello. Tutti i dati validi sulla riproducibilità sono stati valutati calcolando la percentuale di
risultati reattivi ai test per ogni livello del pannello. I dati sono stati analizzati in base ai diversi parametri: lotto
del kit, laboratorio/operatore, giorno/seduta e generale (Tabella 1). Lo studio dimostra la coerenza della
performance del test cobas® TaqScreen West Nile Virus tra lotti di kit, laboratori/operatori e giorni/sedute.
05462975001-03IT
21
Doc Rev. 3.0
Tabella 1
Test cobas® TaqScreen WNV - Dati di riproducibilità
Concentrazione
Lotto
del
kit
A
B
Negativi
C
Concentrazione
Lotto
del
kit
0,49 x limite di
sensibilità
A
B
C
2,5 x limite di
sensibilità
A
B
C
5,0 x limite di
sensibilità
A
B
C
10,0 x limite di
sensibilità
A
B
C
*
*
% risultati
negativi per
lotto del kit
Tra lotti
100,0
(359/359)
100,0
(359/359)
100,0
(359/359)
% risultati
reattivi per
lotto del kit
Tra lotti
73,9
(264/357)
72,2
(260/360)
74,2
(267/360)
99,4
(179/180)
100,0
(179/179)
100,0
(180/180)
99,4
(178/179)
100,0
(179/179)
100,0
(180/180)
100,0
(179/179)
100,0
(180/180)
100,0
(180/180)
Labora% risultati negativi
torio/
per laboratorio/
Operaoperatore
tore
Tra laboratori
Giorno/
Seduta*
% risultati
negativi per
giorno/seduta
Tra saggi
1
100,0 (360/360)
1
100,0 (209/209)
2
100,0 (359/359)
2
100,0 (198/198)
3
100,0 (358/358)
3
100,0 (209/209)
4
5
6
100,0 (192/192)
100,0 (203/203)
100,0 (66/66)
Giorno/
Seduta*
% risultati
reattivi per
giorno/seduta
Labora% risultati reattivi
torio/
per laboratorio/
Operaoperatore
tore
Tra laboratori
Tra saggi
1
75,5 (271/359)
1
71,5 (148/207)
2
74,7 (269/360)
2
68,2 (135/198)
3
70,1 (251/358)
3
74,6 (156/209)
4
5
6
78,1 (150/192)
74,6 (153/205)
74,2 (49/66)
100,0 (105/105)
1
100,0 (180/180)
1
2
100,0 (179/179)
2
100,0 (98/98)
3
99,4 (179/180)
3
100,0 (105/105)
4
5
6
100,0 (96/96)
99,0 (101/102)
100,0 (33/33)
99,0 (103/104)
1
100,0 (180/180)
1
2
100,0 (179/179)
2
100,0 (99/99)
3
99,4 (178/179)
3
100,0 (104/104)
4
5
6
100,0 (96/96)
100,0 (102/102)
100,0 (33/33)
100,0 (105/105)
1
100,0 (180/180)
1
2
100,0 (179/179)
2
100,0 (98/98)
3
100,0 (180/180)
3
100,0 (105/105)
4
5
6
100,0 (96/96)
100,0 (102/102)
100,0 (33/33)
% generale
(IC 95%)**
Totale
100,0
(1077/1077)
(99,7, 100,0)
% generale
(IC 95%)**
Totale
73,4
(791/1077)
(70,7, 76,1)
99,8
(538/539)
(99,0, 100,0)
99,8
(537/538)
(99,0, 100,0)
100,0
(539/539)
(99,3, 100,0)
Si è reso necessario un Giorno 6 per ripetere i test sui batch che erano risultati non validi nei Giorni 1-5.
IC 95% = intervallo di confidenza al 95% esatto, in base alla distribuzione binomiale.
05462975001-03IT
22
Doc Rev. 3.0
Sensibilità analitica - Health Canada Standard - Lineage 1
Il limite di sensibilità del test cobas® TaqScreen WNV è stato valutato utilizzando lo standard di riferimento
Health Canada West Nile Virus Reference Standard11 (Infectious Diseases, Canadian Blood Services,
1800 Alta Vista, Ottawa, Ontario, K1G 4J5). Sono stati preparati dei pannelli diluendo lo standard in plasma
umano normale, negativo al virus. Ogni diluizione è stata analizzata utilizzando tre diversi lotti del test
cobas® TaqScreen West Nile Virus. In totale sono stati analizzati 30 replicati per ogni lotto del kit, per un
totale di 90 replicati per ogni concentrazione. I dati combinati di tutti i replicati analizzati sono serviti per
determinare il limite di sensibilità in base al tasso di positività, considerando il limite inferiore di confidenza
al 95% come per il calcolo mediante Analisi PROBIT per stimare il limite della sensibilità al 95% ed entambi
gli intervalli di confidenza al 95% del pannello (Tabella 2). Il limite di sensibilità al 95% stimato utilizzando
lo standard di riferimento Health Canada Standard - Lineage 1 è di 40,3 copie/ml.
Tabella 2
Riepilogo della sensibilità analitica - Health Canada West Nile Virus Standard
Input nominale
Numero di reattivi
(copie/ml)
Numero di test
individuali
0
5
10
20
25
30
35
50
0
10
43
70
74
76
85
89
89*
90
90
90
90
90
90
90
Analisi PROBIT
Tasso di
sensibilità (%)
Concentrazione
(copie/ml)
95
40,3
% di reattivi
0
11,1
47,8
77,8
82,2
84,4
94,4
98,9
Limite inferiore di
confidenza al 95%
(copie/ml)
35,1
Limite inferiore di
confidenza al 95%
(unilaterale)
NA
6,2%
38,7%
69,4%
74,3%
76,8%
88,7%
94,8%
Limite superiore di
confidenza al 95%
(copie/ml)
47,8
* Un replicato non valido
05462975001-03IT
23
Doc Rev. 3.0
Sensibilità analitica - Roche WNV Secondary Standard - Lineage 1
Il limite di sensibilità del test cobas® TaqScreen West Nile Virus è stato valutato utilizzando Roche WNV
Secondary Standard (Zeptometrix West Nile Virus Stock, NY 2001-6263, lotto numero 302142, calibrato in base
allo standard di riferimento Health Canada West Nile Virus Reference Standard). Sono stati preparati dei
pannelli diluendo lo standard in plasma umano normale, negativo al virus. Ogni diluizione è stata analizzata
utilizzando tre diversi lotti del test cobas® TaqScreen West Nile Virus. In totale sono stati analizzati 64 replicati
per ogni lotto del kit, per un totale di 192 replicati per ogni concentrazione. Utilizzando i dati combinati di tutti i
replicati analizzati, è stato possibile determinare il limite di sensibilità in base al tasso di positività con il limite
inferiore di confidenza al 95% (monolaterale), nonché eseguire calcoli mediante Analisi PROBIT per stimare il
limite di sensibilità al 95% e gli intervalli di confidenza al 95% (bilaterali) per il pannello (Tabella 3). Il limite di
sensibilità al 95% stimato utilizzando Roche WNV Secondary Standard - Lineage 1 è di 36,9 copie/ml.
Tabella 3
Riepilogo della sensibilità analitica - Roche WNV Secondary Standard
Input nominale
Numero di reattivi
(copie/ml)
Numero di test
individuali
0
5
10
20
25
30
35
50
0
68
110
153
173
182
183
187
192
192
191*
192
192
192
192
192
Analisi PROBIT
Tasso di
sensibilità (%)
Concentrazione
(copie/ml)
95
36,9
% di reattivi
0
35,4
57,6
79,7
90,1
94,8
95,3
97,4
Limite inferiore di
confidenza al 95%
(copie/ml)
32,7
Limite inferiore di
confidenza al 95%
(unilaterale)
NA
29,7%
51,4%
74,3%
85,8%
91,3%
92,0%
94,6%
Limite superiore di
confidenza al 95%
(copie/ml)
42,6
* Un replicato non valido
05462975001-03IT
24
Doc Rev. 3.0
Sensibilità analitica - CBER/FDA West Nile Virus Panel - Lineage 1
Il limite di sensibilità del test cobas® TaqScreen West Nile Virus è stato valutato utilizzando il pannello
CBER/FDA West Nile Virus Panel. Il pannello è costituito da 14 componenti derivati da un virus WNV
isolato da uomo, Lineage 1 (Hu2002), e da un virus WNV isolato da fenicottero, Lineage 1 (NY99) (prodotti
per CBER da BBI Diagnostics, 375 West Street, West Bridgewater MA, 02379). Ogni componente del
pannello è stato analizzato in duplicato con tre diversi lotti del test cobas® TaqScreen West Nile Virus
(Tabella 4).
Tabella 4
Riepilogo della sensibilità analitica - CBER/FDA West Nile Virus Panel
ID componente
Input nominale
(copie/ml)
0
0
5
5
10
10
50
50
100
100
500
500
1000
1000
Isolato Lineage 1
CBER/FDA – 03
CBER/FDA – 05
CBER/FDA – 09
CBER/FDA – 10
CBER/FDA – 12
CBER/FDA – 02
CBER/FDA – 04
CBER/FDA – 13
CBER/FDA – 07
CBER/FDA – 01
CBER/FDA – 14
CBER/FDA – 11
CBER/FDA – 08
CBER/FDA – 06
* Un replicato non valido
Hu2002
NY99
Hu2002
NY99
Hu2002
NY99
Hu2002
NY99
Hu2002
NY99
Hu2002
NY99
Hu2002
NY99
% di reattivi
0% (0/6)
0% (0/6)
50% (3/6)
83% (5/6)
50% (3/6)
33% (2/6)
100% (6/6)
100% (6/6)
100% (6/6)
100% (5/5)*
100% (6/6)
100% (6/6)
100% (6/6)
100% (6/6)
Sensibilità analitica - West Nile Virus RNA Qualification Panel QWN701 - Lineage 2
Il limite di sensibilità del test cobas® TaqScreen WNV è stato valutato utilizzando il pannello West Nile Virus
RNA Qualification Panel QWN701 (West Nile Virus Stock, Lineage 212,13, Uganda - BBI Diagnostics, 375 West
Street, West Bridgewater MA, 02379). Lo stock di virus è stato calibrato dal fornitore utilizzando un saggio PCR
real-time basato sull'analizzatore TaqMan®14. Sono stati preparati dei pannelli diluendo gli standard in plasma
umano normale, negativo al virus. Ogni diluizione è stata analizzata utilizzando tre diversi lotti del test cobas®
TaqScreen West Nile Virus. In totale sono stati analizzati 30 replicati per ogni lotto del kit, per un totale di
90 replicati per ogni concentrazione. Utilizzando i dati combinati di tutti i replicati analizzati, è stato possibile
determinare il limite di sensibilità in base al tasso di positività con il limite inferiore di confidenza al 95%
(monolaterale), nonché eseguire calcoli mediante Analisi PROBIT per stimare il limite di sensibilità al 95% e gli
intervalli di confidenza al 95% (bilaterali) per il pannello (Tabella 5). Il limite di sensibilità al 95% stimato
utilizzando il pannello West Nile Virus RNA Qualification Panel QWN701 - Lineage 2 è di 3,8 copie/ml.
Tabella 5
Riepilogo della sensibilità analitica - West Nile Virus RNA
Qualification Panel QWN701 – Lineage 2
Input nominale
Numero di reattivi
(copie/ml)
Numero di test
individuali
0,00
0,25
0,50
1,00
1,50
3,00
5,00
0
22
29
48
68
85
90
90
90
90
90
90
90
90
Analisi PROBIT
Tasso di
sensibilità (%)
Concentrazione
(copie/ml)
95
3,8
05462975001-03IT
25
% di reattivi
0
24
32
53
76
94
100
Limite inferiore di
confidenza al 95%
(copie/ml)
2,3
Limite inferiore di
confidenza al 95%
(unilaterale)
NA
17,2%
24,1%
44,1%
67,0%
88,7%
96,7%
Limite superiore di
confidenza al 95%
(copie/ml)
11,1
Doc Rev. 3.0
Specificità analitica – Microrganismi potenzialmente interferenti e reattività crociata
La specificità analitica del test cobas® TaqScreen West Nile Virus è stata valutata analizzando un pannello
di 52 microrganismi così costituito: 47 isolati virali, 4 ceppi batterici e 1 isolato da lievito (Tabella 6). Dopo
avere arricchito con i microrganismi il plasma umano normale, negativo al virus, è stata eseguita l'analisi
dei campioni con e senza l'aggiunta del virus WNV, a una concentrazione pari a 3 volte il limite di
sensibilità del test cobas® TaqScreen West Nile Virus. Fatta eccezione per i 4 isolati della famiglia dei virus
dell'encefalite giapponese (encefalite giapponese, encefalite della Murray Valley, encefalite di Saint Louis e
virus Kunjin), il test cobas® TaqScreen West Nile Virus ha generato risultati non reattivi per tutti i campioni
con microrganismi senza l'aggiunta del virus WNV e risultati reattivi per tutti i campioni con microrganismi
contenenti il virus WNV. I 4 isolati della famiglia dei virus dell'encefalite giapponese sono risultati reattivi in
tutti e 8 i replicati. Tali risultati erano attesi, in quanto esiste un'omologia fra la sequenza nucleotidica di
questi virus, la sequenza nucleotidica del virus WNV, dei primer e delle sonde del test cobas® TaqScreen
West Nile Virus.
Tabella 6
Microrganismi analizzati
Adenovirus tipo 2
Adenovirus tipo 3
Adenovirus tipo 7
Candida albicans
Cytomegalovirus Davis
Cytomegalovirus Towne
Virus di Epstein-Barr RAJI
Virus di Epstein Barr P3
Virus dell'epatite A (PA 21)
Virus dell'epatite B, genotipo A
Virus dell'epatite B, genotipo B
Virus dell'epatite C, genotipo 1a
Virus dell'epatite C, genotipo 1b
Virus dell'epatite C, genotipo 2a
Virus dell'epatite C, genotipo 2b
Virus dell'epatite C, genotipo 6
MJ (G11), cellule che producono
HTLV-I
MJ (C5), cellule che producono HTLV-I
(MoT) cellule che producono HTLV-II
(DeltaH6H11) HTLV-II a lunghezza
completa
Herpes simplex tipo I, F
Herpes simplex tipo I, HF
Herpes simplex tipo I, MacIntyre
Herpes simplex tipo II, G
Herpes simplex tipo II, MS
Virus del papilloma umano, tipo 11
Virus del papilloma umano, tipo 18
Virus del papilloma umano, tipo 6B
Virus dell'influenza A
(A/New Jersey/8/76)
Virus dell'influenza B
(B/Hong Kong/5/72)
Virus dell'epatite C, genotipo 3
Virus Varicella-Zoster Ellen
Virus dell'epatite C, genotipo 4
Virus dell'epatite C, genotipo 5
Virus Varicella-Zoster Oka
HIV-1 sottotipo A
HIV-1 sottotipo B
HIV-1 sottotipo C
HIV-1 sottotipo D
HIV-1 sottotipo E
HIV-1 sottotipo F
HIV-1 sottotipo G
HIV-1 sottotipo H
HIV-2
Pneumocystis carinii D&D
Propionibacterium acnes
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Virus dell'encefalite
giapponese
Virus dell'encefalite
della Murray Valley
Virus dell'encefalite
di Saint Louis
Virus Kunjin
Specificità analitica - Altre condizioni patologiche
Per ogni patologia esaminata (infezione da Cytomegalovirus, infezione da virus dell'epatite A, infezione da
virus dell'epatite B, infezione da virus dell'epatite C, virus dell'immunodeficienza umana (HIV-1), infezione
da virus di Epstein Barr) sono stati analizzati tra 10 e 20 campioni di pazienti, con e senza l'aggiunta del
virus WNV a una concentrazione pari a 3 volte il limite di sensibilità del test cobas® TaqScreen West Nile
Virus. Il test cobas® TaqScreen West Nile Virus ha generato risultati non reattivi per tutti i campioni nelle
condizioni patologiche indicate e privi del virus WNV, mentre ha generato risultati reattivi per tutti
i campioni nelle condizioni patologiche indicate e ai quali era stato aggiunto il virus WNV. Le patologie
prese in esame non hanno interferito con la sensibilità e la specificità del test cobas® TaqScreen West
Nile Virus.
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Sostanze potenzialmente interferenti
Sostanze interferenti di tipo endogeno
Sono stati analizzati campioni di plasma con livelli eccezionalmente elevati di trigliceridi (fino a 2487 mg/dl),
emoglobina (fino a 516 mg/dl), bilirubina (fino a 23,5 mg/dl) o albumina (fino a 6900 mg/dl), con e senza
l'aggiunta del virus WNV, a una concentrazione pari a 3 volte il limite di sensibilità del test cobas®
TaqScreen West Nile Virus. Le sostanze endogene prese in esame non hanno interferito con la sensibilità e
la specificità del test cobas® TaqScreen West Nile Virus.
Sono stati analizzati campioni di plasma con condizioni/patologie autoimmuni confermate (positivi all'anticorpo
antinucleare, al fattore reumatoide e al lupus eritematoso sistemico), con e senza l'aggiunta del virus WNV, a
una concentrazione pari a 3 volte il limite di sensibilità del test cobas® TaqScreen West Nile Virus. Le sostanze
endogene prese in esame non hanno interferito con la sensibilità e la specificità del test cobas® TaqScreen
West Nile Virus.
Sono stati analizzati campioni di plasma arricchiti con livelli eccezionalmente elevati di globuli rossi (fino al
10% v/v), con e senza l'aggiunta del virus WNV, a una concentrazione pari a 3 volte il limite di sensibilità
del test cobas® TaqScreen West Nile Virus. L'aggiunta di globuli rossi al plasma a un livello del 10% (v/v)
ha effettivamente interferito con la sensibilità e la specificità del test cobas® TaqScreen West Nile Virus.
Sostanze interferenti di tipo esogeno
Sono stati analizzati campioni di plasma contenenti concentrazioni eccezionalmente elevate di
acetaminofene (1324 μmol/l), acido acetilsalicilico (3,62 μmol/l), atorvastatina (600 Eq/l), fluoxetina
(11,2 μmol/l), loratadina (0,78 μmol/l), nadololo (3,88 μmol/l), naprossene (2170 μmol/l), paroxetina
(3,04 μmol/l), sertralina (1,96 μmol/l), acido ascorbico (284 μmol/l), ibuprofene (2425 μmol/l) e fenilefrina
HCl (327,5 μmol/l), con e senza l'aggiunta del virus WNV, a una concentrazione pari a 3 volte il limite di
sensibilità del test cobas® TaqScreen West Nile Virus. Le sostanze esogene prese in esame non hanno
interferito con la sensibilità e la specificità del test cobas® TaqScreen West Nile Virus.
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CAMPIONI CADAVERICI
Riproducibilità
Venti campioni di plasma in EDTA da donatori viventi e 20 campioni individuali di plasma in EDTA da
donatori cadaverici sono stati arricchiti con target virale WNV utilizzando Roche WNV Secondary Standard
a una concentrazione finale tre volte superiore al limite di sensibilità, in base al livello di emolisi presente in
ogni campione. I campioni cadaverici sono stati diluiti manualmente con rapporto 1:5 con il diluente
cobas® TaqScreen per campioni cadaverici e sono stati sottoposti alla procedura prevista per i test dei
campioni cadaverici. Ognuno dei 20 campioni di donatori viventi e campioni cadaverici è stato analizzato
da 2 operatori, i quali hanno utilizzato tre diversi lotti del test cobas® TaqScreen WNV. Ogni operatore è
stato abbinato ad un sistema cobas s 201 per creare due coppie operatore-strumento.
Tutti i dati di riproducibilità validi sono stati analizzati confrontando i tassi di reattività al target virale WNV
aggiunto ai campioni dei donatori viventi e ai campioni cadaverici rispetto ai tre lotti del kit (Tabella 7) e
rispetto alle due coppie operatore-strumento (Tabella 8). La valutazione dei risultati si è basata sul metodo
esatto di Fisher (test a 1 coda), con il quale è stato possibile determinare se le differenze tra i tassi di
reattività dei campioni dei donatori viventi e dei campioni cadaverici sono o meno significative.
Tabella 7
Riepilogo dei dati di riproducibilità per campioni cadaverici e campioni di donatori viventi Risultati in base al lotto del kit
Target
virale
Tipo di
donatore
Lotto n. 1
Lotto n. 2
Lotto n. 3
valore p
Campioni di
donatori viventi /
Campioni
cadaverici
Post-mortem 40 / 40 (100%) 39 / 39* (100%) 40 / 40 (100%)
1,0
Vivente
39 / 39* (100%) 39 / 39* (100%) 40 / 40 (100%)
Valore p a 1 coda
Campioni di donatori
1,0
1,0
1,0
viventi/cadaverici in base
al lotto reagente
* Un replicato non valido
Nota: per il test esatto di Fisher, i valori p maggiori di 0,05 non sono rilevanti dal punto di vista statistico
WNV
Tabella 8
Riepilogo dei dati di riproducibilità per campioni cadaverici e campioni di donatori viventi Risultati in base alla coppia operatore-strumento
Target
virale
Tipo di
donatore
OperatoreStrumento
n. 1
OperatoreStrumento
n. 2
valore p
Campioni di
donatori viventi /
Campioni
cadaverici
60 / 60 (100%) 59 / 59* (100%)
Post-mortem
1,0
59 / 59* (100%) 59 / 59* (100%)
Vivente
Valore p a 1 coda
Campioni di donatori
1,0
1,0
viventi/cadaverici in base alla
coppia operatore-strumento
* Un replicato non valido
Nota: per il test esatto di Fisher, i valori p maggiori di 0,05 non sono rilevanti dal punto di vista statistico
WNV
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Specificità
Settanta campioni individuali di plasma in EDTA appartenenti a donatori viventi e settantuno campioni
cadaverici individuali di plasma in EDTA precedentemente risultati negativi all'RNA di WNV sono stati
suddivisi in tre gruppi, quindi ogni gruppo è stato analizzato utilizzando tre lotti del test cobas® TaqScreen
West Nile Virus. I campioni cadaverici di plasma in EDTA sono stati suddivisi in tre gruppi da 25, 21 e 25,
diluiti manualmente con rapporto 1:5 con il diluente cobas® TaqScreen per campioni cadaverici, infine
sottoposti alla procedura prevista per i test dei campioni cadaverici. I campioni di plasma in EDTA dei
donatori viventi sono stati suddivisi in tre gruppi da 25, 20 e 25, quindi sono stati diluiti manualmente con
rapporto 1:6 con un pool di campioni di plasma in EDTA risultati negativi all'RNA di WNV prima del test, in
modo da simulare la procedura consigliata per l'esecuzione del test cobas® TaqScreen West Nile Virus su
pool costituiti da sei campioni.
Per quanto riguarda i campioni cadaverici, i risultati validi ottenuti con tre lotti del kit sono stati in totale
sessantanove, tutti di non reattività all'RNA di WNV, per una specificità del 100%. Per quanto riguarda
i campioni dei donatori viventi, i risultati validi ottenuti con gli stessi tre lotti del kit sono stati in totale
settanta. Un campione inizialmente reattivo al test è invece risultato non reattivo all'RNA di WNV dopo la
ripetizione del test in duplicato. I risultati del test di specificità sono riassunti nella Tabella 9.
Tabella 9
Riepilogo dei risultati del test cobas® TaqScreen WNV in materia di specificità
dei campioni cadaverici e dei campioni di donatori viventi
Campioni di donatori viventi
(diluizione 1:6)
Campioni cadaverici
Lotto
reagente
Numero di
Numero di
Numero di
Numero di
risultati di
risultati di
risultati di
risultati validi
non reattività reattività
non reattività
Lotto n. 1
23
23
0
25
25
Lotto n. 2
21
21
0
20
20
Lotto n. 3
25
25
0
25
24
Totale
69*
69
0
70
69
Specificità
100%
98,6%
*Esclusi i risultati iniziali non validi
** Risultati di non reattività con ripetizione del test in duplicato
Numero di
risultati validi
Numero di
risultati di
reattività
0
0
1**
1
Sensibilità analitica nei campioni cadaverici con Roche WNV Secondary Standard
Il limite di sensibilità del test cobas® TaqScreen West Nile Virus nei campioni cadaverici di plasma in
EDTA è stato valutato utilizzando Roche WNV Secondary Standard (Zeptometrix West Nile Virus Stock, NY
2001-6263, Lotto n. 302142, calibrato in base allo standard di riferimento Health Canada West Nile Virus
Reference Standard). I pannelli moderatamente emolizzati sono stati preparati diluendo lo standard in un
pool di campioni cadaverici di plasma in EDTA negativi al virus, costituiti da campioni cadaverici individuali
per i quali era stata precedentemente verificata l'appartenenza alla categoria dei campioni moderatamente
emolizzati (colore tra il giallo paglierino e il rosa). La matrice dei campioni altamente emolizzati era di tipo
artificiale ed era costituita da sangue intero prelevato in precedenza e quindi lisato, miscelato con plasma
in EDTA, quindi rappresentativo di un campione clinico altamente emolizzato (colore dal rosso al rosso
scuro o il marrone). Prima della preparazione dei pannelli di diluizione era stata verificata la negatività della
matrice dei campioni altamente emolizzati all'RNA di WNV. Sono stati utilizzati due lotti del test cobas®
TaqScreen WNV per analizzare i pannelli moderatamente emolizzati e un lotto del test cobas® TaqScreen
WNV per analizzare i pannelli altamente emolizzati. Utilizzando i dati combinati di tutti i replicati analizzati
per ogni matrice, è stato possibile determinare il limite di sensibilità in base al tasso di positività con il
limite inferiore di confidenza al 95% (monolaterale), nonché eseguire calcoli mediante Analisi PROBIT per
stimare il limite di sensibilità al 95% e gli intervalli di confidenza al 95% (bilaterali) per il pannello
(Tabella 10 e Tabella 11). Il limite di sensibilità al 95% stimato mediante Analisi PROBIT e utilizzando
Roche WNV Secondary Standard è risultato essere di 117,4 copie/ml nei campioni cadaverici
moderatamente emolizzati e di 365,1 copie/ml nella matrice di campioni altamente emolizzati.
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Tabella 10
Riepilogo della sensibilità analitica con Roche WNV Secondary
Standard in campioni cadaverici moderatamente emolizzati
Input
nominale
(copie/ml)
Numero
di reattivi
Numero
di test
individuali
40
90
120
140
160
200
28
38
64
64
65
65
43
44
66
66
66
66
Analisi PROBIT
Tasso di
sensibilità (%)
Concentrazione
(copie/ml)
95
117,4
%
Reattivi
Limite inferiore di
confidenza al 95%
(monolaterale)
65,1
86,4
97,0
97,0
98,5
98,5
Limite inferiore di
confidenza al
95% (copie/ml)
97,8
51,5%
74,9%
90,8%
90,8%
93,0%
93,0%
Limite superiore di
confidenza al 95%
(copie/ml)
150,7
Tabella 11
Riepilogo della sensibilità analitica con Roche WNV Secondary Standard in
una matrice di campioni altamente emolizzati
Input
nominale
(copie/ml)
Numero
di reattivi
Numero
di test
individuali
200
330
400
425
450
525
39
43
43
43
43
43
44
44
44
43*
44
44
Analisi PROBIT
Tasso di
sensibilità (%)
Concentrazione
(copie/ml)
95
365,1
%
Reattivi
Limite inferiore di
confidenza al 95%
(monolaterale)
88,6
97,7
97,7
100,0
97,7
97,7
Limite inferiore di
confidenza al
95% (copie/ml)
285,6
77,6%
89,7%
89,7%
93,3%
89,7%
89,7%
Limite superiore di
confidenza al 95%
(copie/ml)
873,0
* Un replicato non valido
Sensibilità
Sessanta campioni cadaverici di plasma in EDTA, selezionati in modo random, non reattivi all'RNA di WNV
e classificati in base al livello di emolisi [campione moderatamente emolizzato (colore dal giallo paglierino
al rosa) o campione altamente emolizzato (colore dal rosso al rosso scuro o il marrone)] sono stati
suddivisi equamente in 5 gruppi di 12 campioni ciascuno. I campioni di ogni gruppo sono stati arricchiti
con il target virale di WNV utilizzando un isolato clinico diverso per gruppo e raggiungendo così una
concentrazione finale di circa 570 copie/ml (3 x 190 copie/ml) per i campioni cadaverici moderatamente
emolizzati e di circa 990 copie/ml (3 x 330 copie/ml) per i campioni cadaverici altamente emolizzati. Questi
campioni arricchiti con l'RNA di WNV sono stati analizzati subito dopo l'aggiunta del target virale e ad un
mese di distanza, dopo essere stati conservati a ≤ -80°C. In tutti i casi, prima di eseguire il test i singoli
campioni sono stati diluiti manualmente con rapporto 1:5 con il diluente cobas® TaqScreen per campioni
cadaverici. Quattro campioni dei dodici che costituivano ogni gruppo sono stati analizzati con un lotto del
kit di reagenti. Nello studio sono stati utilizzati tre lotti del kit di reagenti, quindi complessivamente sono
stati analizzati 20 campioni per ogni lotto del kit di reagenti. Il tasso di reattività al test cobas® TaqScreen
West Nile Virus è risultato essere del 100% [IC 95%: 94 - 100%] per tutti i campioni cadaverici che sono stati
analizzati in questo studio. I risultati del test di sensibilità sono riassunti nella Tabella 12.
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Doc Rev. 3.0
Tabella 12
Riepilogo dei dati di sensibilità per il virus WNV con campioni cadaverici moderatamente
emolizzati (MH) e con campioni cadaverici altamente emolizzati (HH)
Lotto del kit
Tipo di campione cadaverico
WNV
MH
HH
MH
HH
MH
HH
MH + HH
14/14
6/6
13/13
7/7
16/16
4/4
60/60
Lotto n. 1
Lotto n. 2
Lotto n. 3
Totale
100%
[IC 95% 94,0 - 100%]
Sensibilità
PERFORMANCE CLINICA - CAMPIONI DI DONATORI VIVENTI
Sensibilità clinica - Analisi di campioni confermati positivi al virus del Nilo occidentale
La sensibilità clinica del test cobas® TaqScreen West Nile Virus è stata valutata analizzando
individualmente 315 campioni clinici positivi al virus del Nilo occidentale. La positività all'RNA del virus
WNV era stata accertata in precedenza eseguendo un test degli acidi nucleici sui campioni, in base a uno
dei tre metodi disponibili. Lo studio si è svolto in 3 laboratori di analisi. In ogni laboratorio sono stati
analizzati approssimativamente 100 campioni, sia non diluiti che diluiti con rapporto 1:6, utilizzando tre
diversi lotti del test cobas® TaqScreen West Nile Virus.
Lo studio ha rivelato che la sensibilità del test cobas® TaqScreen West Nile Virus è del 100% (IC 95%:
98,8-100,0) per i campioni non diluiti e del 97,5% (IC 95%: 95,1-98,9) per i campioni diluiti con rapporto 1:6
(Tabella 13). Gli otto (8) campioni non reattivi, diluiti con rapporto 1:6, sono stati ottenuti da campioni non
diluiti con cariche virali inferiori a 100 copie/ml, determinate mediante il saggio PCR del National Genetics
Institute per la determinazione quantitativa del virus WNV.
Tabella 13
Sensibilità clinica di campioni confermati positivi al virus del Nilo occidentale
Numero di
campioni
analizzati
Numero di
campioni
reattivi
Numero di
campioni
non reattivi
Sensibilità
(%)
Non diluito
314*
314
0
Diluito 1:6
315
307
8
Sensibilità (limite
confidenza 95%)
Limite
inferiore
Limite
superiore
100
98,8
100,0
97,5
95,1
98,9
* Un campione non diluito non valido
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Doc Rev. 3.0
Specificità clinica
La specificità clinica del test cobas® TaqScreen West Nile Virus è stata valutata analizzando donazioni di
sangue intero selezionate in modo random presso sei laboratori esterni. Sono stati analizzati campioni
singoli e pool di sei campioni. Nello studio sono stati utilizzati tre diversi lotti del test cobas® TaqScreen
West Nile Virus. La specificità clinica del test cobas® TaqScreen West Nile Virus è stata calcolata come
percentuale (intervallo di confidenza binomiale bilaterale esatto al 95% [IC]) di donatori negativi al virus
WNV che avevano espresso risultati non reattivi al kit cobas® TaqScreen West Nile Virus Test. I donatori
valutabili erano 86.935 per i test in pool e 10.375 per i test individuali.
Risultati dei test in pool
Nella Tabella 14 è illustrato il calcolo della specificità clinica del test cobas® TaqScreen West Nile Virus
per gli 86.935 donatori valutabili dai test in pool. In questo studio, la specificità clinica del test cobas®
TaqScreen WNV per i test in pool è stata del 100% (86.935 su 86.935; IC 95% = 99,996% -100,000%).
Tabella 14
Specificità clinica del test cobas® TaqScreen WNV - Test in pool
Punto finale
WNV*
Positivi
Reattivi a WNV
0 (n/a)
Non reattivi a WNV
0 (n/a)
Totale
Specificità clinica
(Limite di
confidenza al 95%)
0
Stato donatore WNV**
Presunti
Negativi
positivi***
0
0 (n/a)
(0,000%)
86.935
0 (n/a)
(100,000%)
0
86.935
100,000%
(99,996%,
100,000%)
Sconosciuti****
Totale
0 (n/a)
0
0 (n/a)
86.935
0
86.935
®
*
Il punto finale WNV è stato derivato dal risultato valido del test cobas TaqScreen West Nile Virus, ottenuto analizzando la
prima donazione mediante l'algoritmo dei test in pool.
**
Lo stato del donatore WNV è stato assegnato automaticamente in base agli schemi di reattività al test in occasione della
prima donazione e, qualora disponibili, anche nelle donazioni successive.
*** Lo stato di presunta positività doveva essere assegnato automaticamente ai donatori WNV che non avessero donazioni di
®
follow-up per lo studio ma che avessero ottenuto un risultato di reattività al test cobas TaqScreen West Nile Virus in
occasione della prima donazione e almeno 1 risultato di reattività/positività nella prima donazione in relazione a saggi di
fonti di plasma alternative, saggi NAT (amplificazione degli acidi nucleici) alternativi o saggi IgM.
**** Coloro che sono stati classificati con lo stato "donatore WNV ignoto" avevano un numero insufficiente di risultati dei test per
poter conseguire lo stato di donatore WNV.
La specificità dei pool del test cobas® TaqScreen West Nile Virus per le prime donazioni è del 99,986%
(14.387 su 14.389; IC 95% = 99,950% - 99,998%). Due pool di 6 campioni sono risultati reattivi al test
cobas® TaqScreen West Nile Virus, ma dalla scomposizione dei pool si è verificato che entrambi
contenevano campioni individualmente non reattivi al test cobas® TaqScreen West Nile Virus. La
percentuale di risultati non validi è del 2,3% ed è imputabile ad errori strumentali o inerenti ai controlli
interni per i campioni in pool.
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Risultati dei test sui campioni individuali
Nella Tabella 15 è illustrato il calcolo della specificità clinica del test cobas® TaqScreen West Nile Virus
per i 10.375 donatori che sono stati analizzati da test individuali. Lo studio ha rivelato che la specificità
clinica del test cobas® TaqScreen West Nile Virus per i test sui campioni individuali è del 100% (10.375 su
10.375; IC 95% = 99,964% -100,000%). La percentuale di risultati non validi è dell'1,1% ed è imputabile ad
errori strumentali o inerenti i controlli interni per i campioni individuali.
Tabella 15
Specificità clinica del test cobas® TaqScreen WNV - Test di campioni individuali
Punto finale
WNV*
Positivi
Reattivi a WNV
0 (n/a)
Non reattivi a WNV
0 (n/a)
Totale
Specificità clinica
(Limite di
confidenza al 95%)
0
Stato donatore WNV**
Presunti
Negativi
positivi***
0
0 (n/a)
(0,000%)
10.375
0 (n/a)
(100,000%)
0
10.375
100,000%
(99,964%,
100,000%)
Sconosciuti****
0 (n/a)
Totale
0
0 (n/a)
10.375
0
10.375
®
*
Il punto finale WNV è stato derivato dal risultato valido del test cobas TaqScreen West Nile Virus, ottenuto analizzando la
prima donazione mediante l'algoritmo dei test in pool.
**
Lo stato del donatore WNV è stato assegnato automaticamente in base agli schemi di reattività al test in occasione della
prima donazione e, qualora disponibili, anche nelle donazioni successive.
*** Lo stato di presunta positività doveva essere assegnato automaticamente ai donatori WNV che non avessero donazioni di
®
follow-up per lo studio ma che avessero ottenuto un risultato di reattività al test cobas TaqScreen West Nile Virus in
occasione della prima donazione e almeno 1 risultato di reattività/positività nella prima donazione in relazione a saggi di
fonti di plasma alternative, saggi NAT (amplificazione degli acidi nucleici) alternativi o saggi IgM.
**** Coloro che sono stati classificati con lo stato "donatore WNV ignoto" avevano un numero insufficiente di risultati dei test per
poter conseguire lo stato di donatore WNV.
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Doc Rev. 3.0
RIFERIMENTI
1.
Petersen L.R., Marfin, A.A. A primer for the clinician, Ann Intern Med 2002; 137:173-179.
2.
Kramer, L.D., Bernard, K.A. West Nile Virus in the western hemisphere, Curr Opin Infect Dis 2001;
14(5):519-525.
3.
Longo, M.C., Berninger, M.S., Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over
contamination in polymerase chain reactions. Gene 93:125-128.
4.
Savva, R., McAuley-Hecht, K., Brown, T., Pearl, L. 1995. The structural basis of specific base-excision
repair by uracil-DNA glycosylase. Nature 373:487-493.
5.
Mol, C. D., Arvai, A. S., Slupphaug, G., Kavli, B., Alseth, I., Krokan, H. E., Tainer, J. A. 1995. Crystal
structure and mutational analysis of human uracil-DNA glycosylase: structural basis for specificity and
catalysis. Cell 80:869-878
6.
Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S., Griffith, R. 1992. Simultaneous amplification and detection of
specific DNA sequences. Biotechnology (N Y). 10:413-417.
7.
Heid, C.A., Stevens, J., Livak, J.K., Williams, P.M. 1996. Real time quantitative PCR. Genome Research
6:986-994.
8.
Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. (eds.). 1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical
Laboratories HHS Publication Number (CDC) 93-8395.
9.
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers from
Occupationally Acquired Infections. Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29-A3 Wayne,
PA:CLSI, 2005.
10. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition. 2000. 704 pp.
11. Saldanha, J., Shead, S., Heath, A., Drebot, M., and the West Nile Virus Collaborative Group. 2005.
Collaborative study to evaluate a working reagent for West Nile virus RNA detection by nucleic acid
testing. Transfusion 45:97-102.
12. Briese, T., Rambaut, A., Pathmajeyan, M., Bishara, J., Weinberger, M., Pitlik, S., Lipkin, W.I. 2002.
Phylogenetic analysis of human isolate from the 2000 Israel West Nile virus epidemic. Emererging
Infectious Diseases 8(5):528-531.
13. Hayes, C.G., West Nile Virus: Uganda, 1937, to New York City, 1999. Annals of the New York Academy
of Sciences, 951:25-37.
14. Ji, J., Chen, X., Manak, M., 2001. TaqMan® Probe Assay for the Detection of West Nile Virus, 16th
Annual San Diego Conference New Technologies for Molecular Diagnostics. Clinical Chem. 2001;
47:2078-2085. (Poster 11).
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Doc Rev. 3.0
Revisione del documento
Doc Rev. 3.0
01/2013
La Sezione A delle ISTRUZIONI PER L'USO è stata modificata e ora riporta le
seguenti istruzioni:
Miscelare i controlli per inversione almeno 3 volte, evitando la formazione di
bolle d'aria (come descritto più avanti).
• Miscelare per inversione significa capovolgere il controllo a testa in giù e
riportarlo a testa in su ogni volta.
• Durante ogni inversione mantenere il controllo in ognuna delle posizioni per
almeno 2 secondi: in altre parole, capovolgere il controllo a testa in giù e
mantenerlo in questa posizione per 2 secondi, quindi riportare il controllo a
testa in su e mantenerlo in questa posizione per 2 secondi.
Alla sezione "Strumentazione e software per il sistema cobas s 201" sono state
apportate le seguenti modifiche:
• Rimossa la configurazione del sistema
• Rimossa la versione del software AMPLILINK
• Rimosse le versioni del software PDM
• Aggiunto riferimento al file TDF WNV per il test cobas® TaqScreen West Nile
Virus
• Rimosso il paragrafo "Elenco dei problemi noti per il sistema cobas s 201 Configurazione C o Configurazione C (MR1)"
• Aggiornata la configurazione per il Manuale operativo del sistema
Aggiornato il paragrafo "Pipettamento e creazione di pool di campioni":
• Procedura per la creazione di pool secondari
• Creazione automatica degli ordini
• Rimosso il riferimento alla richiesta "Repeat Needed"
Aggiornati gli indirizzi del Fabbricante e del Mandatario.
Aggiornate le descrizioni della pagina dei simboli armonizzati al termine del foglio
illustrativo.
Aumentate le dimensioni dei simboli di pericolo.
Per ulteriori domande e chiarimenti, è possibile rivolgersi al rappresentante Roche
locale.
05462975001-03IT
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Doc Rev. 3.0
Roche Molecular Systems, Inc.
1080 US Highway 202 South
Branchburg, NJ 08876 USA
Licenza USA n°1636
Roche Diagnostics (Schweiz) AG
Industriestrasse 7
6343 Rotkreuz, Switzerland
Roche Diagnostics
2, Avenue du Vercors
38240 Meylan, France
Roche Diagnostics GmbH
Sandhofer Straße 116
68305 Mannheim, Germany
Distributore in Italia:
Roche Diagnostics S.p.A.
Viale G. B. Stucchi 110
20052 Monza, Milano, Italy
Distributed by
Roche Diagnostics, SL
Avda. Generalitat, 171-173
E-08174 Sant Cugat del Vallès
Barcelona, Spain
Distribuidor em Portugal:
Roche Sistemas de Diagnósticos Lda.
Estrada Nacional, 249-1
2720-413 Amadora, Portugal
Roche Diagnostica Brasil Ltda.
Av. Engenheiro Billings, 1729
Jaguaré, Building 10
05321-010 São Paulo, SP Brazil
COBAS, COBAS S, TAQMAN, TAQSCREEN, AMPLILINK, AMPERASE e AMPLIPREP sono marchi di Roche.
MICROLAB è un marchio di Hamilton Company.
ARMORED RNA è una tecnologia brevettata sviluppata da Ambion, Inc. e da Cenetron Diagnostics LLC.
Brevetti USA #5,677,124, #5,919,625 e #5,939,262 e brevetti in corso di registrazione. ARMORED RNA è
un marchio di Ambion e Cenetron.
PROCLIN è un marchio di Rohm and Haas Company.
MICROCIDE SQ è un marchio di Global Biotechnologies, Inc.
I coloranti cianino di questo prodotto sono coperti da brevetto di proprietà di GE Healthcare Bio-Sciences
Corp. e Carnegie Mellon University. Sono stati concessi in licenza a Roche esclusivamente per l'uso nei
componenti dei kit di ricerca e di diagnostica in vitro. Qualsiasi impiego di questi kit per scopi diversi dalla
ricerca o dalla diagnostica in vitro dovrà essere approvato tramite il rilascio di licenze secondarie da parte
di GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, New Jersey (U.S.A.) e di Carnegie Mellon University,
Pittsburgh, Pennsylvania (U.S.A.).
Copyright 2013 Roche Molecular Systems, Inc. Tutti i diritti riservati.
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Doc Rev. 3.0
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Doc Rev. 3.0
I seguenti simboli appaiono su tutte le confezioni di prodotti diagnostici PCR di Roche.
Software ausiliario
Dispositivo medico-diagnostico in vitro
Mandatario nella Comunità Europea
Limite inferiore dell'intervallo
assegnato
Foglio di dati del codice a barre
Fabbricante
Codice del lotto
Conservare al buio
Rischio biologico
Sufficiente per
Numero di catalogo
Limiti di temperatura
SW
Consultare le istruzioni per l'uso
File di definizione del test
TDF
Contenuto del kit
Limite superiore dell'intervallo
assegnato
Distribuito da
Utilizzare entro
Solo per valutazione delle
prestazioni IVD
Questo prodotto è conforme ai requisiti della Direttiva Europea 98/79/CE
relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro.
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