cobas® TaqScreen West Nile Virus Test
annuncio pubblicitario
cobas® TaqScreen West Nile Virus Test for use on the cobas s 201 system PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO. cobas® TaqScreen West Nile Virus Test ® cobas TaqScreen West Nile Virus Control Kit cobas® TaqScreen Wash Reagent WNV 96 Tests P/N: 04741722 190 WNV CTL 6 Sets P/N: 04741749 190 TS WR 5.1 L P/N: 04404220 190 Per l'analisi dei campioni cadaverici con il test cobas® TaqScreen per il virus del Nilo occidentale, è necessario utilizzare il seguente kit, oltre ai kit sopraelencati: cobas® TaqScreen Cadaveric Specimen Diluent Kit CADV SPEC DIL 96 Tests P/N: 05002125 190 INDICE GENERALE INDICE GENERALE ....................................................................................................................................................................... 1 Indice delle tabelle ................................................................................................................................................................... 2 USO PREVISTO ............................................................................................................................................................................... 3 RIASSUNTO E SPIEGAZIONE DEL TEST................................................................................................................................ 3 PRINCIPI DELLA PROCEDURA................................................................................................................................................. 3 Creazione automatizzata dei pool e pipettamento dei campioni con lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor........................................................................................................ 4 Preparazione automatizzata dei campioni con lo strumento COBAS® AmpliPrep ............................................. 4 Amplificazione automatizzata degli acidi nucleici con l'analizzatore COBAS® TaqMan® ................................ 4 Trascrizione inversa e amplificazione mediante PCR .............................................................................................. 4 Amplificazione selettiva .................................................................................................................................................... 5 Rilevazione automatizzata real-time dei prodotti della PCR con l'analizzatore COBAS® TaqMan® ............. 5 Rilevazione dei prodotti della PCR ................................................................................................................................ 5 Gestione automatizzata dei dati con il software PDM ................................................................................................. 5 MATERIALI FORNITI DA ROCHE ............................................................................................................................................. 6 ALTRI MATERIALI NECESSARI MA FORNITI A PARTE (ACQUISTABILI PRESSO ROCHE)........................................................................................................................................... 7 Strumentazione e software per il sistema cobas s 201 Configurazione C o Configurazione C MR1 (Maintenance Release 1)....................................................................................................................................................... 7 Rack e materiali di consumo ................................................................................................................................................ 7 REAGENTI ........................................................................................................................................................................................ 8 REQUISITI PER LA MANIPOLAZIONE E LA CONSERVAZIONE ..................................................................................10 PRECAUZIONI...............................................................................................................................................................................11 PREPARAZIONE DEI REAGENTI.............................................................................................................................................12 RACCOLTA, CONSERVAZIONE E CREAZIONE DI POOL DI CAMPIONI..................................................................12 Campioni di donatori viventi ...............................................................................................................................................12 Campioni cadaverici ..............................................................................................................................................................14 CREAZIONE DI POOL E PIPETTAMENTO DEI CAMPIONI.............................................................................................15 NOTE SULLA PROCEDURA .....................................................................................................................................................15 ISTRUZIONI PER L'USO.............................................................................................................................................................16 CONTROLLO DI QUALITÀ........................................................................................................................................................19 La sezione Revisione del documento si trova in fondo a questo documento. 05462975001-03IT 1 Doc Rev. 3.0 RISULTATI ......................................................................................................................................................................................20 Creazione di pool secondari................................................................................................................................................20 LIMITI DELLA PROCEDURA ....................................................................................................................................................21 CARATTERISTICHE DELLA PERFORMANCE .....................................................................................................................21 CAMPIONI DI DONATORI VIVENTI .......................................................................................................................................21 Riproducibilità..........................................................................................................................................................................21 Sensibilità analitica - Health Canada Standard - Lineage 1......................................................................................23 Sensibilità analitica - Roche WNV Secondary Standard - Lineage 1 .....................................................................24 Sensibilità analitica - CBER/FDA West Nile Virus Panel - Lineage 1.....................................................................25 Sensibilità analitica - West Nile Virus RNA Qualification Panel QWN701 - Lineage 2.....................................25 Specificità analitica - Microrganismi potenzialmente interferenti e reattività crociata.....................................26 Specificità analitica - Altre condizioni patologiche......................................................................................................26 Sostanze potenzialmente interferenti...............................................................................................................................27 Sostanze interferenti di tipo endogeno......................................................................................................................27 Sostanze interferenti di tipo esogeno.........................................................................................................................27 CAMPIONI CADAVERICI...........................................................................................................................................................28 Riproducibilità..........................................................................................................................................................................28 Specificità .................................................................................................................................................................................29 Sensibilità analitica nei campioni cadaverici con Roche WNV Secondary Standard.........................................29 Sensibilità ..................................................................................................................................................................................30 PERFORMANCE CLINICA - CAMPIONI DI DONATORI VIVENTI ................................................................................31 Sensibilità clinica - Analisi di campioni confermati positivi al virus del Nilo occidentale.................................31 Specificità clinica....................................................................................................................................................................32 Risultati dei test in pool .......................................................................................................................................................32 Risultati dei test sui campioni individuali.........................................................................................................................33 RIFERIMENTI ................................................................................................................................................................................34 Indice delle tabelle Tabella 1. Test cobas® TaqScreen WNV - Dati di riproducibilità.................................................................................22 Tabella 2. Riepilogo della sensibilità analitica - Health Canada West Nile Virus Standard ...................................23 Tabella 3. Riepilogo della sensibilità analitica - Roche WNV Secondary Standard .................................................24 Tabella 4. Riepilogo della sensibilità analitica - CBER/FDA West Nile Virus Panel .................................................25 Tabella 5. Riepilogo della sensibilità analitica - West Nile Virus RNA Qualification Panel QWN701 Lineage 2 ........................................................................................................................................................................25 Tabella 6. Microrganismi analizzati.........................................................................................................................................26 Tabella 7. Riepilogo dei dati di riproducibilità per campioni cadaverici e campioni di donatori viventi Risultati in base al lotto del kit ................................................................................................................................28 Tabella 8. Riepilogo dei dati di riproducibilità per campioni cadaverici e campioni di donatori viventi Risultati in base alla coppia operatore-strumento ............................................................................................28 Tabella 9. Riepilogo dei risultati del test cobas® TaqScreen WNV in materia di specificità dei campioni cadaverici e dei campioni di donatori viventi......................................................................................................29 Tabella 10. Riepilogo della sensibilità analitica con Roche WNV Secondary Standard in campioni cadaverici moderatamente emolizzati..............................................................................................30 Tabella 11. Riepilogo della sensibilità analitica con Roche WNV Secondary Standard in una matrice di campioni altamente emolizzati ................................................................................................30 Tabella 12. Riepilogo della sensibilità per il virus WNV con campioni cadaverici moderatamente emolizzati (MH) e con campioni altamente emolizzati (HH)........................................31 05462975001-03IT 2 Doc Rev. 3.0 Tabella 13. Sensibilità clinica di campioni confermati positivi al virus del Nilo occidentale .................................31 Tabella 14. Specificità clinica del test cobas® TaqScreen WNV - Test in pool .......................................................32 Tabella 15. Specificità clinica del test cobas® TaqScreen WNV - Test di campioni individuali..........................33 USO PREVISTO Il test cobas® TaqScreen West Nile Virus (WNV) è un test qualitativo in vitro destinato all'uso con il sistema cobas s 201 per la determinazione diretta dell'RNA del virus del Nilo occidentale (RNA di WNV). Il test consente di individuare la presenza dell'RNA di WNV in campioni di plasma umano ed è destinato all'uso nello screening dei donatori di sangue intero e/o di emocomponenti e degli altri donatori viventi. Inoltre il test può essere utilizzato per lo screening dei donatori di organi (campioni di plasma prelevati in presenza di battito cardiaco del donatore) e per l'analisi di campioni cadaverici (campioni ematici prelevati in assenza di battito cardiaco). Il test non è destinato all'uso con sangue di cordone ombelicale. È possibile eseguire lo screening del plasma di tutti i donatori analizzando i campioni individuali. Nel caso delle donazioni di sangue intero e/o di emocomponenti, i campioni di plasma possono essere analizzati in pool costituiti da non più di sei aliquote identiche di campioni individuali. Nel caso delle donazioni di organi e tessuti (in assenza di battito cardiaco), è possibile eseguire lo screening dei campioni di plasma e di siero soltanto come campioni individuali. Questo test non può essere utilizzato a sostegno della diagnosi. RIASSUNTO E SPIEGAZIONE DEL TEST Il virus del Nilo occidentale (West Nile Virus, WNV) della famiglia dei Flaviviridiae appartiene al genere Flavivirus e al gruppo di virus dell'encefalite giapponese (Japanese Encephalitis Serocomplex). I virus di questo gruppo sono arbovirus potenzialmente in grado di causare meningite, encefalite e meningoencefalite. Appartengono al gruppo dei virus dell'encefalite giapponese il virus dell'encefalite giapponese, il virus dell'encefalite della Murray Valley, il virus Kunjin (ora formalmente riconosciuto come variante di WNV) e il virus dell'encefalite di Saint Louis, che causò un'epidemia di encefalite negli Stati Uniti attorno alla metà degli anni '701,2. Il test cobas® TaqScreen WNV è un test qualitativo che consente di effettuare lo screening e la rilevazione dell'RNA di WNV in campioni individuali o in pool di campioni infetti. Il test cobas® TaqScreen WNV prevede la preparazione degli acidi nucleici sullo strumento COBAS® AmpliPrep secondo una tecnica di estrazione generica. Per determinare la presenza dell'RNA di WNV viene eseguita un'amplificazione PCR real-time automatizzata sull'analizzatore COBAS® TaqMan®. Nel kit è incluso un Controllo Interno (Internal Control, IC), per il monitoraggio della performance di ogni singolo test, e l'enzima AmpErase, che consente di ridurre la potenziale contaminazione da materiale amplificato in precedenza (amplicon). PRINCIPI DELLA PROCEDURA Il test cobas® TaqScreen WNV utilizzato sul sistema cobas s 201 si basa su 4 procedure principali: 1. Creazione automatizzata dei pool di campioni e pipettamento dei controlli con il pipettatore opzionale Hamilton MICROLAB® STAR/STARlet IVD 2. Preparazione automatizzata dei campioni con lo strumento COBAS® AmpliPrep 3. Amplificazione automatizzata degli acidi nucleici e rilevazione automatizzata real-time dei prodotti della PCR con l'analizzatore COBAS® TaqMan® 4. Gestione automatizzata dei dati con il software PDM (Pooling and Data Management) 05462975001-03IT 3 Doc Rev. 3.0 Creazione automatizzata dei pool e pipettamento dei campioni con lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor Lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor consente di automatizzare il pipettamento dei pool e dei campioni individuali dei donatori, il trasferimento delle aliquote nelle piastre a pozzetti profondi (facoltativo) e il pipettamento dei controlli del test. Il sistema cobas s 201 viene utilizzato per i test di risoluzione dei pool reattivi e per l'identificazione dei campioni individuali reattivi presenti nel pool. Il sistema cobas s 201 è progettato per il trattamento dei campioni in batch. Un batch è un gruppo di campioni e controlli che vengono sottoposti insieme alle procedure di pipettamento, estrazione, amplificazione e rilevazione. Al termine del pipettamento di un batch sullo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor, l'intero rack per campioni viene trasferito sullo strumento COBAS® AmpliPrep per la fase successiva della procedura. Nota: per eseguire il test sui campioni cadaverici, diluire il campione con rapporto 1:5 utilizzando il diluente cobas® TaqScreen per campioni cadaverici (CADV SPEC DIL) prima di avviare il pipettamento con lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor. Preparazione automatizzata dei campioni con lo strumento COBAS® AmpliPrep Vengono analizzati simultaneamente gli acidi nucleici dei target e le molecole del Controllo Interno (IC) dell'Armored RNA aggiunte, che agiscono da controllo per la procedura di preparazione e amplificazione/ rilevazione dei campioni. Il test cobas® TaqScreen WNV contiene reagenti sufficienti per completare cinque fasi in sequenza sullo strumento COBAS® AmpliPrep. La soluzione di Proteasi è preposta alla digestione enzimatica delle proteine per indurre la lisi, inattivare le nucleasi e facilitare il rilascio di RNA e DNA dalle particelle virali. L'aggiunta del Reagente di lisi nel campione induce la lisi virale e l'inattivazione delle nucleasi attraverso la denaturazione delle proteine. L'RNA e il DNA vengono rilasciati e allo stesso tempo protetti dalle nucleasi. Gli acidi nucleici rilasciati si legano alla superficie di silice delle particelle di vetro magnetizzate (Magnetic Glass Particles, MGP) aggiunte. Ciò è dovuto principalmente alla presenza di una carica netta positiva sulla superficie delle particelle di vetro e di una carica netta negativa degli acidi nucleici sotto la concentrazione dei sali caotropici e la forza ionica della reazione di lisi. Il Reagente di lavaggio rimuove le sostanze non legate e le impurità, come le proteine denaturate, i detriti cellulari e i potenziali inibitori della PCR (ad esempio, l'emoglobina ecc.), riducendo la concentrazione salina. Gli acidi nucleici purificati vengono rilasciati dalle particelle di vetro magnetizzate a una temperatura elevata con il Tampone di eluizione. Amplificazione automatizzata degli acidi nucleici con l'analizzatore COBAS® TaqMan® Dopo l'isolamento degli acidi nucleici purificati, durante la preparazione automatizzata del campione, viene utilizzata la soluzione cobas® TaqScreen WNV Master Mix (WNV MMX) per amplificare e rilevare l'RNA del virus del Nilo occidentale (RNA di WNV) e l'RNA del Controllo Interno (RNA IC). Dopo l'attivazione mediante aggiunta di acetato di manganese, la soluzione WNV MMX consente la trascrizione inversa, seguita dall'amplificazione PCR di una regione altamente conservata di RNA di WNV e di RNA IC, grazie all'uso di primer specifici. La rilevazione simultanea del DNA amplificato è possibile grazie alla generazione di segnali fluorescenti dalla degradazione 5'-nucleolitica delle sonde WNV-specifiche e IC-specifiche presenti anche nella soluzione WNV MMX. Vengono utilizzati due coloranti fluorescenti: il primo marca la sonda IC-specifica e il secondo marca la sonda target-specifica, consentendo l'identificazione indipendente di WNV e IC. Trascrizione inversa e amplificazione mediante PCR Le reazioni di trascrizione inversa e di amplificazione vengono eseguite con un enzima ricombinante termostabile, denominato DNA Polimerasi Z05. In presenza di manganese (Mn2+), la DNA Polimerasi Z05 induce le attività di trascrittasi inversa e di DNA polimerasi. Ciò fa sì che nella stessa miscela di reazione possano avere luogo sia la trascrizione inversa, sia l'amplificazione mediante PCR. L'amplificazione lungo gli stampi processo viene L'amplificazione interi genomi. mediante PCR si ottiene grazie alla DNA polimerasi Z05, che estende i primer appaiati target e produce una molecola di DNA a doppio filamento, denominata amplicon. Questo ripetuto per svariati cicli e, ad ogni ciclo, la quantità di DNA amplicon raddoppia. interessa soltanto la regione dei genomi target compresa tra i primer, ma non coinvolge 05462975001-03IT 4 Doc Rev. 3.0 Amplificazione selettiva L'amplificazione selettiva degli acidi nucleici target nei campioni è ottenuta dal test cobas® TaqScreen WNV grazie all'uso dell'enzima AmpErase (uracil-N-glicosilasi) e del trifosfato di deossiuridina (dUTP). L'enzima AmpErase riconosce e catalizza la distruzione dei filamenti di DNA contenenti deossiuridina3, ma non del DNA contenente deossitimidina o dell'RNA contenente ribouridina4,5. La desossiuridina non è presente nel DNA naturale, ma è sempre presente nell'amplicon in quanto il trifosfato di desossiuridina viene utilizzato con il trifosfato di timidina come uno dei dNTP nel reagente WNV MMX e pertanto solamente l'amplicon contiene deossiuridina. La deossiuridina rende l'amplicon contaminante sensibile alla distruzione da parte dell'enzima AmpErase prima dell'amplificazione dell'RNA target. Inoltre, qualsiasi prodotto non specifico eventualmente formatosi dopo l'attivazione iniziale della soluzione WNV MMX tramite manganese viene distrutto dall'enzima AmpErase. L'enzima AmpErase, che è contenuto nella soluzione WNV MMX, catalizza la segmentazione del DNA contenente deossiuridina a livello dei residui di deossiuridina, aprendo la catena di deossiribosi in posizione C1. Quando viene riscaldata nella prima fase del ciclo termico, la catena di DNA dell'amplicon si spezza in corrispondenza della posizione della deossiuridina, rendendo il DNA non amplificabile. L'enzima AmpErase rimane inattivo per un periodo di tempo prolungato dopo essere stato esposto a temperature superiori a 55°C, di conseguenza non distrugge l'amplicon target che si è formato dopo la reazione PCR. Rilevazione automatizzata real-time dei prodotti della PCR con l'analizzatore COBAS® TaqMan® Durante l'amplificazione PCR, l'elevata temperatura intermittente durante i cicli induce la denaturazione dell'amplicon target e dell'amplicon IC, formando un DNA a filamento singolo. Le sonde oligonucleotidiche specifiche del test si ibridizzano al filamento singolo del DNA amplificato. L'amplificazione, l'ibridizzazione e la rilevazione sono simultanee. Rilevazione dei prodotti della PCR La soluzione cobas® TaqScreen WNV MMX contiene sonde di rilevazione specifiche per gli acidi nucleici di WNV e IC. Ogni sonda di rilevazione è marcata con due coloranti fluorescenti, uno che agisce da reporter e l'altro da quencher. Alle sonde target-specifiche è associato un tipo di colorante reporter, che viene misurato a una determinata lunghezza d'onda. Alla sonda IC-specifica è associato un secondo colorante reporter, che viene misurato a una lunghezza d'onda diversa. In entrambe le sonde è presente uno stesso tipo di colorante quencher. Questo sistema consente di rilevare il target di WNV amplificato a una specifica lunghezza d'onda e, simultaneamente, di rilevare l'acido nucleico di IC a una diversa lunghezza d'onda. Prima che l'amplificazione mediante PCR abbia inizio, le sonde sono intatte e la fluorescenza del colorante reporter è soppressa dal colorante quencher in virtù del trasferimento di energia tipo Förster. Durante l'amplificazione mediante PCR, le sonde si ibridizzano a specifiche sequenze di DNA a filamento singolo e vengono segmentate dall'attività della 5'-3' nucleasi della DNA polimerasi Z05 nello stesso momento in cui ha luogo l'amplificazione. Una volta che i coloranti reporter e quencher si separano per effetto di questa segmentazione, l'attività di fluorescenza del reporter è rilevata. Ad ogni ciclo di PCR viene generato un numero maggiore di sonde segmentate e il segnale cumulativo del colorante reporter aumenta progressivamente. Le rilevazione real-time dei prodotti della PCR è ottenuta misurando la fluorescenza dei coloranti reporter rilasciati, i quali rappresentano uno il target WNV, uno l'IC.6, 7 Gestione automatizzata dei dati con il software PDM L'applicazione Roche PDM Data Manager consente all'utente di rivedere e stampare i risultati. Roche PDM Data Manager classifica i risultati di tutti i test come non reattivi, reattivi o non validi. Oltre che per recuperare ed esaminare i risultati della PCR, il software Roche PDM può essere utilizzato dall'operatore per stampare report, eseguire ricerche dei risultati, accettare i risultati dei donatori e, facoltativamente, trasmettere i risultati a un sistema LIS. 05462975001-03IT 5 Doc Rev. 3.0 MATERIALI FORNITI DA ROCHE Per la rilevazione dell'RNA di WNV nei campioni di plasma vengono forniti i tre kit necessari: (1) il test cobas® TaqScreen West Nile Virus, (2) il kit di controlli cobas® TaqScreen West Nile Virus e (3) il reagente di lavaggio cobas® TaqScreen. Le schede di sicurezza dei materiali (Material Safety Data Sheets, MSDS) sono disponibili su richiesta presso l'ufficio Roche locale. cobas® TaqScreen West Nile Virus Test (P/N: 04741722 190) WNV 96 test WNV CS1 (Cassetta di reagente MGP per WNV) WNV CS2 (Cassetta di reagente di lisi per WNV) WNV CS3 (Cassetta di multi-reagente per WNV) WNV CS4 (Cassetta di reagente test-specifico per WNV) cobas® TaqScreen West Nile Virus Control Kit Kit di controlli cobas® TaqScreen WNV (P/N: 04741749 190) WNV CTL 6 set WNV (+) C (Controllo positivo WNV) WNV (–) C [Controllo negativo WNV (plasma umano)] cobas® TaqScreen Wash Reagent Reagente di lavaggio cobas® TaqScreen (P/N: 04404220 190) TS WR 5,1 litri TS WR (Reagente di lavaggio cobas® TaqScreen) Nota: per rilevare l'RNA di WNV nei campioni cadaverici, è necessario utilizzare il seguente kit (in dotazione) oltre ai kit sopraelencati: cobas® TaqScreen Cadaveric Specimen Diluent Kit. cobas® TaqScreen Cadaveric Specimen Diluent Kit Kit di diluenti cobas® TaqScreen per campioni cadaverici (P/N: 05002125 190) CADV SPEC DIL 96 test CADV SPEC DIL (Diluente cobas® TaqScreen per campioni cadaverici) 05462975001-03IT 6 Doc Rev. 3.0 ALTRI MATERIALI NECESSARI MA FORNITI A PARTE (ACQUISTABILI PRESSO ROCHE) Questo test deve essere eseguito sul sistema cobas s 201. Il sistema cobas s 201 deve essere installato da un rappresentante dell'Assistenza Tecnica Roche Diagnostics e utilizzato in una configurazione completa. I singoli componenti del sistema cobas s 201 non possono essere utilizzati come dispositivi indipendenti dal sistema, né possono essere sostituiti con altri componenti. Il sistema cobas s 201 utilizza i componenti elencati di seguito. Per ulteriori informazioni fare riferimento alla scheda informativa del prodotto. Strumentazione e software per il sistema cobas s 201 • Pipettatore Hamilton MICROLAB STAR e/o STARlet IVD (opzionale), workstation e software Pooling Manager • Strumento COBAS® AmpliPrep • Analizzatore COBAS® TaqMan® • Stazione dati e software AMPLILINK • Server Roche PDM Data Manager, workstation e software Data Manager • Manuale operativo del sistema cobas s 201 Configurazione D • File di definizione del test WNV per il test COBAS® TaqScreen WNV Rack e materiale di consumo • Rack per campioni COBAS® AmpliPrep (SK24) (P/N: 28122172001) • Rack per SPU COBAS® AmpliPrep (P/N: 05471664001) • Rack per reagenti COBAS® AmpliPrep (P/N: 28122199001) • Unità di trattamento campioni (SPU) (P/N: 03755525001) • Provette per campioni iniziali (provette campione) con clip dei codici a barre (P/N: 03137040001) • Rack per puntali K (P/N: 03287343001) • Confezione di provette K da 12 x 96 (P/N: 03137082001) • K-carrier COBAS® TaqMan® (P/N: 28150397001) • Puntali CO-RE a volume elevato (1000 μl), filtro (P/N: 04639642001) • Piastre a pozzetti profondi con etichette per codice a barre (P/N: 04639634001) • Coperture per piastre a pozzetti profondi (P/N: 04789288001) • Rack portacampioni per 24 provette (P/N: 04639502001) • Rack portacampioni per 32 provette (P/N: 04639529001) • Rack portapuntali (P/N: 04639545001) • Rack per piastre a pozzetti profondi (P/N: 04639553001) • Carrier portarack SK24 (P/N: 04639600001) • Spray disinfettante Microcide SQ™ o HAMILTON (P/N: 04592557001) • Guanti monouso, senza talco 05462975001-03IT 7 Doc Rev. 3.0 REAGENTI cobas® TaqScreen West Nile Virus Test (P/N: 04741722 190) WNV WNV CS1 MGP (Particelle di vetro magnetizzate) Particelle di vetro magnetizzate 93% Isopropanolo Xi 96 test 2 x 48 test 2 x 7,0 ml 93% (p/p) Isopropanolo Irritante F 93% (p/p) Isopropanolo Facilmente infiammabile WNV CS2 LYS (Reagente di lisi) Diidrato di citrato di sodio 42,5% Tiocianato di guanidina < 14% Polidocanolo 0,9% Ditiotreitolo Xn 2 x 48 test 2 x 78 ml 42,5% (p/p) Tiocianato di guanidina Nocivo N < 14% (p/p) Polidocanolo Pericoloso per l'ambiente WNV CS3 Pase (Soluzione Proteinasi) Tampone TRIS < 0,05% EDTA Cloruro di calcio Acetato di calcio ≤ 7,8% Proteinasi Glicerolo 2 x 48 test 2 x 3,8 ml ≤ 7,8% (p/p) Proteinasi Xn Nocivo 05462975001-03IT 8 Doc Rev. 3.0 WNV EB (Tampone di eluizione WNV) Tampone TRIS ≤ 0,002% Poly rA RNA (sintetico) EDTA 0,09% Sodio azide 2 x 7,0 ml WNV CS4 WNV MMX (Master Mix WNV) Tampone tricina Acetato di potassio Glicerolo < 18% Dimetilsolfossido < 0,07% dATP, dCTP, dGTP, dUTP < 0,002% Primer a monte e a valle per WNV < 0,002% Sonda a marcatura fluorescente WNV-specifica < 0,002% Sonda a marcatura fluorescente IC-specifica < 0,002% Aptamero oligonucleotidico < 0,05% DNA Polimerasi Z05 (batterica) < 0,1% Enzima AmpErase (uracil-N-glicosilasi) (batterico) 0,08% Sodio azide 2 x 48 test 2 x 2,5 ml WNV Mn2+ (Soluzione di manganese WNV) < 0,6% Manganese acetato Acido acetico glaciale 0,09% Sodio azide 2 x 19,8 ml WNV IC (Controllo Interno WNV) Tampone TRIS ≤ 0,002% Poly rA RNA (sintetico) EDTA 0,05% Sodio azide < 0,001% RNA di controllo interno sintetico, non infettivo, incapsulato in proteina di rivestimento batteriofaga MS2 cobas® TaqScreen West Nile Virus Control Kit Kit di controlli cobas® TaqScreen WNV (P/N: 04741749 190) 2 x 3,6 ml WNV CTL WNV (+) C (Controllo positivo WNV) Tampone TRIS ≤ 0,002% Poly rA RNA (sintetico) EDTA 0,05% Sodio azide < 0,001% RNA di WNV sintetico, non infettivo, incapsulato in proteina di rivestimento batteriofaga MS2 05462975001-03IT 9 6 set 6 x 1,1 ml Doc Rev. 3.0 WNV (–) C [Controllo negativo WNV (plasma umano)] Plasma umano negativo, confermato non reattivo da test brevettati per la determinazione dell'anticorpo anti-HCV, dell'anticorpo anti-HIV-1/2 e dell'antigene HBsAg; RNA di WNV non rilevabile mediante i metodi PCR 0,1% Conservante ProClin® 300 Xi Miscela (3:1) di 5-cloro-2metil-3(2H)-isotiazolone e 2metil-3(2H)-isotiazolone 12 x 1,6 ml Irritante R36/38: Irritante per gli occhi e la pelle. R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. cobas® TaqScreen Wash Reagent Reagente di lavaggio cobas® TaqScreen (P/N: 04404220 190) TS WR 5,1 litri CADV SPEC DIL 96 test TS WR (Reagente di lavaggio cobas® TaqScreen) Diidrato di citrato di sodio 0,1% Conservante Metilparaben cobas® TaqScreen Cadaveric Specimen Diluent Kit Kit di diluenti cobas® TaqScreen per campioni cadaverici (P/N: 05002125 190) CADV SPEC DIL (Diluente cobas® TaqScreen per campioni cadaverici) EDTA 4 x 100 ml REQUISITI PER LA MANIPOLAZIONE E LA CONSERVAZIONE A. La temperatura tra 15 e 30°C è definita temperatura ambiente. B. Non congelare i reagenti e i controlli. C. Conservare i reagenti WNV CS1, WNV CS2, WNV CS3 e WNV CS4 tra 2 e 8°C. Se inutilizzati, questi reagenti restano stabili fino alla data di scadenza indicata. D. Dopo l'uso, i reagenti restano stabili per 30 giorni a 2-8°C oppure fino alla data di scadenza indicata, se precedente. E. I reagenti possono essere utilizzati al massimo per 6 sedute, complessivamente per 40 ore, sullo strumento COBAS® AmpliPrep. I reagenti devono essere conservati a 2-8°C tra una seduta e la successiva. Il software AMPLILINK controlla le ore di utilizzo cumulativo delle cassette di reagente nello strumento COBAS® AmpliPrep e impedisce l'uso delle cassette una volta raggiunte le 40 ore cumulative. F. I reagenti sono stabili per un totale di 24 ore continuative sullo strumento COBAS® AmpliPrep. Il software AMPLILINK non tiene conto delle ore di presenza continuativa delle cassette di reagente sullo strumento, né del numero totale di sedute dello strumento in occasione delle quali sono state utilizzate le cassette. È compito dell'utente gettare via le cassette di reagente una volta raggiunto il limite massimo di 24 ore continuative o di 6 sedute dello strumento. G. Conservare i reagenti WNV (+) C e WNV (–) C a 2-8°C. I controlli restano stabili fino alla data di scadenza indicata. Dopo l'apertura è necessario gettare via le parti inutilizzate. H. Conservare il reagente TS WR a 15-30°C. Se non è aperto, il reagente TS WR resta stabile fino alla data di scadenza indicata. Dopo l'apertura, il reagente resta stabile per 30 giorni a 15-30°C o fino alla data di scadenza, se precedente. 05462975001-03IT 10 Doc Rev. 3.0 I. Conservare il diluente CADV SPEC DIL a 15-30°C. Il diluente è stabile fino alla data di scadenza indicata. Dopo l'apertura è necessario gettare via il diluente inutilizzato rimasto nel contenitore. PRECAUZIONI PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO. A. I campioni potrebbero essere infettivi. Adottare le Precauzioni Universali durante lo svolgimento del test8,9. La procedura dovrebbe essere affidata esclusivamente a personale con esperienza nella manipolazione di materiali infettivi e nell'uso del test cobas® TaqScreen West Nile Virus. Pulire e disinfettare accuratamente tutte le superfici di lavoro del laboratorio con una soluzione fresca a base di ipoclorito di sodio allo 0,5% in acqua deionizzata o distillata. Successivamente pulire la superficie con etanolo al 70%. B. ATTENZIONE: il reagente WNV (–) C contiene plasma umano derivato da sangue umano. Il materiale d'origine è stato analizzato e confermato non reattivo all'anticorpo anti-HIV-1/2, all'anticorpo anti-HCV e all'antigene HBsAg. L'analisi di plasma umano negativo mediante i metodi PCR ha evidenziato l'assenza di RNA di WNV rilevabile. Allo stato attuale, tuttavia, nessun metodo di analisi garantisce con assoluta certezza che i prodotti derivati da sangue umano non trasmettano agenti infettivi. Tutti i materiali derivati da sangue umano devono essere considerati potenzialmente infettivi e quindi manipolati adottando le Precauzioni Universali. In caso di fuoriuscite, disinfettare immediatamente l'area con una soluzione fresca a base di ipoclorito di sodio allo 0,5% (candeggina diluita) oppure seguire le procedure di laboratorio opportune. C. Rispettare le precauzioni di routine del laboratorio. Non pipettare con la bocca. Non mangiare, bere o fumare nelle aree di lavoro designate. Durante la manipolazione dei campioni e dei reagenti del kit, indossare guanti, camici da laboratorio e protezioni per gli occhi di tipo monouso. Dopo avere manipolato i campioni e i reagenti del kit, lavarsi accuratamente le mani. D. I reagenti WNV EB, WNV MMX, WNV Mn2+, WNV IC e WNV (+) C contengono sodio azide come conservante. Non utilizzare tubi di metallo per il trasferimento dei reagenti. Se le soluzioni contenenti sodio azide devono essere smaltite attraverso l'impianto di scarico, è necessario diluire e sciacquare con abbondante acqua corrente, onde evitare che nelle tubature metalliche si accumulino depositi in grado di dare luogo a reazioni esplosive. E. È dimostrato che l'eparina inibisce la PCR. Non utilizzare plasma eparinizzato con questa procedura. F. Si consiglia di utilizzare pipette sterili e puntali per pipette privi di nucleasi, di tipo monouso. Potrebbero verificarsi risultati falsi positivi se non si previene la contaminazione crociata durante la manipolazione e l'analisi dei campioni. G. Per garantire una performance ottimale del test, utilizzare soltanto i materiali di consumo forniti e consigliati. H. Manipolare tutti i materiali contenenti campioni o controlli secondo la Buona Prassi di Laboratorio, onde evitare la contaminazione crociata di campioni o controlli. I. Prima dell'uso, ispezionare visivamente le singole cassette di reagente, le provette di controllo e il Reagente di lavaggio per verificare che non vi siano segni di perdite. In presenza di perdite, non utilizzare il materiale per il test. J. Smaltire tutti i reagenti che sono entrati in contatto con i campioni e i reagenti nel rispetto delle normative locali e nazionali in materia. K. I seguenti prodotti non devono essere utilizzati dopo la data di scadenza indicata: il test cobas® TaqScreen West Nile Virus, il kit di controlli cobas® TaqScreen West Nile Virus, il reagente di lavaggio cobas® TaqScreen o il kit di diluenti cobas® TaqScreen per campioni cadaverici. Non scambiare, mescolare o combinare reagenti appartenenti a kit o a lotti diversi. Non caricare lotti di reagenti misti sullo strumento COBAS® AmpliPrep. L. Le schede di sicurezza dei materiali (Material Safety Data Sheets, MSDS) sono disponibili su richiesta presso l'ufficio Roche locale. 05462975001-03IT 11 Doc Rev. 3.0 M. Evitare che i reagenti entrino in contatto con la pelle, gli occhi o le mucose. In caso di contatto, lavare immediatamente con abbondante acqua per prevenire possibili ustioni. In caso di fuoriuscita dei reagenti, diluire il liquido con acqua prima di asciugare. Evitare che il reagente LYS, che contiene tiocianato di guanidina, entri in contatto con la soluzione di ipoclorito di sodio (candeggina). L'eventuale miscela di queste soluzioni può produrre gas fortemente tossici. N. Per assicurare il corretto svolgimento del test, attenersi scrupolosamente alle procedure e alle linee guida fornite. Qualunque deviazione dalle procedure e dalle linee guida approvate potrebbe compromettere la performance del test. O. L'uso di campioni eccessivamente emolizzati da donatori viventi dovrebbe essere evitato. P. La contaminazione dei campioni di plasma con globuli rossi (> 5%) potrebbe inibire il funzionamento del test cobas® TaqScreen West Nile Virus. Q. Non utilizzare mai, in nessuna fase del test, componenti con etichette dei codici a barre danneggiate. R. Nei test dei campioni cadaverici, i colori tra il giallo paglierino e il rosa sono classificati come moderatamente emolizzati (Moderately Hemolyzed, MH), mentre i colori tra il rosso, il rosso scuro e il marrone sono classificati come altamente emolizzati (Highly Hemolyzed, HM). PREPARAZIONE DEI REAGENTI A. Prima dell'uso, equilibrare i reagenti e i controlli cobas® TaqScreen WNV a temperatura ambiente per 30 minuti. RACCOLTA, CONSERVAZIONE E CREAZIONE DI POOL DI CAMPIONI Nota: manipolare tutti i campioni come se fossero agenti infettivi. Campioni di donatori viventi A. È possibile utilizzare campioni di plasma raccolti in EDTA, CPD, CPDA1, CP2D, ACDA e citrato di sodio al 4% con il test cobas® TaqScreen West Nile Virus. Attenersi alle istruzioni fornite dal produttore delle provette. La stabilità dei campioni risente delle temperature elevate. B. Per conservare il sangue raccolto con gli anticoagulanti K2 EDTA e K3 EDTA sono disponibili due alternative. Alternativa n°1: prima della plasmaferesi, è possibile conservare il sangue fino a 24 ore a 2-30°C, poi per altre 24 ore a 2-25°C e infine per altre 72 ore a 2-8°C. Per conservare il campione per più di cinque giorni, procedere alla separazione del plasma dai globuli rossi mediante centrifugazione a 800-1.600 x g per 20 minuti. Dopo la separazione, il plasma può essere conservato a 2-8°C per sette giorni, quindi per altri 30 giorni a ≤ -20°C. Anticoagulante EDTA – Condizione n°1 30°C Temperatura (°C) 30 25°C 20 2-8°C 10 Sangue intero Plasma 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Giorni post-prelievo 05462975001-03IT 12 Doc Rev. 3.0 Alternativa n°2: prima della plasmaferesi, è possibile conservare il sangue fino a 72 ore a 2-25°C, poi per altre 48 ore a 2-8°C. Per conservare il campione per più di cinque giorni, procedere alla separazione del plasma dai globuli rossi mediante centrifugazione a 800-1.600 x g per 20 minuti. Dopo la separazione, il plasma può essere conservato a 2-8°C per sette giorni, quindi per altri 30 giorni a ≤ -20°C. Il plasma conservato in K2 EDTA e K3 EDTA può essere congelato e scongelato per tre (3) volte al massimo Anticoagulante EDTA – Condizione n°2 Temperatura (°C) 30 25°C 20 2-8°C 10 Sangue intero Plasma 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Giorni post-prelievo C. Il sangue raccolto con gli anticoagulanti CPD, CPDA1 e CP2D può essere conservato fino a 24 ore a 2-30°C prima della plasmaferesi. Per conservare il campione per più di un giorno, procedere alla separazione del plasma dai globuli rossi mediante centrifugazione a 800-1.600 x g per 20 minuti. Dopo la separazione, il plasma può essere conservato a 2-8°C per sette giorni, quindi per altri 30 giorni a ≤ -20°C. Per periodi di conservazione più lunghi, è possibile conservare il plasma separato dai globuli rossi a ≤ -70°C per un massimo di 30 mesi. Il plasma con CPD, CPDA1 e CP2D può essere congelato e scongelato per tre (3) volte al massimo. Anticoagulanti CPD, CPDA1, CP2D 30 °C Temperatura (°C) 30 20 10 2- 8°C Whole Sangue Blood intero Pla s ma 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Giorni post-prelievo D. Il plasma in aferesi con gli anticoagulanti ACDA o citrato di sodio al 4% può essere conservato per 24 ore a 2-30°C dopo il prelievo. Il plasma in aferesi può essere conservato fino a 30 giorni a ≤ -20°C. Il plasma in aferesi con ACDA o citrato di sodio al 4% può essere congelato e scongelato per tre (3) volte al massimo. 05462975001-03IT 13 Doc Rev. 3.0 E. Le seguenti linee guida relative ai volumi di plasma si basano sul pipettamento da provette di plastica o vetro da 13 x 100 mm, eseguito con lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor. I volumi indicati, che si riferiscono al plasma oltre ai globuli rossi stratificati, dovranno essere utilizzati per l'analisi cobas® TaqScreen West Nile Virus Test. Tipo di pool Volume minimo di plasma Pool primario di 6 * 3 ml Pool primario di 1 * 3 ml Pool ripetuto da provetta 1,5 ml Pool di risoluzione da provetta 2 ml *Include la creazione di una piastra a pozzetti profondi F. Non congelare il sangue intero. G. È dimostrato che l'eparina inibisce la PCR. Si sconsiglia di utilizzare campioni eparinizzati. H. Le piastre a pozzetti profondi con la loro copertura possono essere conservate a 2-8°C per sette giorni a partire dalla data della plasmaferesi. In alternativa, le piastre a pozzetti profondi con la loro copertura possono essere conservate a ≤ -18°C per periodi più lunghi. I. Non sono stati osservati effetti negativi sulla performance del test quando i campioni di plasma sono stati sottoposti a tre (3) cicli di congelamento/scongelamento. J. Prima dell'uso, equilibrare a temperatura ambiente i campioni individuali o i pool di campioni dei donatori. K. Se i campioni devono essere trasportati, impacchettare ed etichettare le provette nel rispetto delle normative nazionali e internazionali per il trasporto di campioni e agenti eziologici.10 L. Potrebbero essere generati risultati falsi positivi se non si previene adeguatamente la contaminazione crociata durante la manipolazione e l'analisi dei campioni. Campioni cadaverici A. Con il test cobas® TaqScreen WNV è possibile utilizzare campioni cadaverici di sangue raccolti in provette con anticoagulante EDTA o in provette per siero. Attenersi alle istruzioni fornite dal produttore delle provette. La stabilità dei campioni risente delle temperature elevate. B. Il sangue cadaverico raccolto in anticoagulante EDTA può essere conservato fino a 24 ore a 2-25°C prima della plasmaferesi. Per conservare il campione per più di un giorno, procedere alla separazione del plasma dai globuli rossi mediante centrifugazione a 800-1.600 x g per 20 minuti. Dopo la separazione, il plasma può essere conservato a 2-8°C per altri sette giorni, quindi altri 30 giorni a ≤-18°C. Il plasma cadaverico in EDTA può essere congelato e scongelato per tre (3) volte al massimo. C. Il sangue cadaverico raccolto sotto forma di siero può essere conservato fino a 24 ore a 2-8°C (e di queste, 4 ore possono essere a 2-25°C) prima della plasmaferesi. Per conservare il campione per più di un giorno, procedere alla separazione del siero dal coagulo mediante centrifugazione a 800-1.600 x g per 20 minuti. Dopo la separazione, il campione di siero può essere conservato a 2-8°C fino a tre giorni. In alternativa, qualora il siero sia separato dal coagulo, i campioni cadaverici di siero moderatamente emolizzati possono essere conservati a ≤ -18°C fino a 15 giorni, mentre i campioni cadaverici di siero altamente emolizzati possono essere conservati a ≤ -18°C fino a 8 giorni. I campioni cadaverici di siero possono essere congelati e scongelati per tre (3) volte al massimo. D. I campioni cadaverici diluiti con rapporto 1:5 nel diluente cobas® TaqScreen per campioni cadaverici possono essere conservati fino a 7 giorni a 2-8°C e, dopo la rimiscelazione (pipettando su e giù quattro (4) volte in ogni provetta), possono essere analizzati con il test cobas® TaqScreen WNV. E. Per l'eventuale trasporto, impacchettare ed etichettare i campioni nel rispetto delle normative nazionali e internazionali per il trasporto dei campioni e degli agenti eziologici. 10 F. Potrebbero essere generati risultati falsi positivi se non si previene adeguatamente la contaminazione crociata durante la manipolazione e il trattamento dei campioni. 05462975001-03IT 14 Doc Rev. 3.0 CREAZIONE DI POOL E PIPETTAMENTO DEI CAMPIONI 1. Il sistema cobas s 201 utilizza lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor per le attività di pipettamento e creazione di pool dei campioni. Lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor acquisisce i codici a barre dei campioni e crea i poll utilizzando aliquote dei campioni di identico volume. 2. Se vengono individuati pool reattivi dal test cobas® TaqScreen West Nile Virus, lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor viene utilizzato per pipettare i singoli campioni dalle piastre a pozzetti profondi o dalle provette con i campioni di origine ed eseguire i test di risoluzione. NOTE SULLA PROCEDURA A. Attrezzatura 1. Preparare il sistema cobas s 201 seguendo le istruzioni contenute nel Manuale operativo del sistema cobas s 201. 2. Eseguire tutti gli interventi di manutenzione consigliati per garantire il corretto funzionamento degli strumenti. B. Reagenti 1. Prima dell'uso, equilibrare per 30 minuti a temperatura ambiente i reagenti del test cobas® TaqScreen West Nile Virus, il kit di controlli cobas® TaqScreen West Nile Virus e il reagente di lavaggio cobas® TaqScreen. Per informazioni sulle condizioni di conservazione dei reagenti, vedere la sezione Requisiti per la manipolazione e la conservazione. 2. Ogni kit cobas® TaqScreen West Nile Virus Test contiene materiale sufficiente per eseguire 96 test, preferibilmente suddivisi in batch da 24 test ciascuno per ogni rack SK24. Con ogni batch o rack SK24 è necessario analizzare anche un replicato del controllo negativo [WNV (–) C] e un replicato del controllo positivo [WNV (+) C]. 3. Ogni kit di diluenti cobas® TaqScreen per campioni cadaverici contiene materiale sufficiente per un totale di 96 test, preferibilmente suddivisi in sedute in batch fino a 24 test per ogni rack SK24. Con ogni batch o rack SK24 è necessario analizzare anche un replicato del controllo negativo [WNV (–) C] e un replicato del controllo positivo [WNV (+) C]. Con il test cobas® TaqScreen WNV il trattamento dei controlli è lo stesso, sia con i campioni di donatori viventi, sia con i campioni cadaverici. 4. Tutti i controlli sono monouso. 5. Il sistema impedirà l'uso di eventuali reagenti rimasti sullo strumento COBAS® AmpliPrep per un numero di ore superiore al consentito (più di 40 ore cumulative e 30 giorni dopo il primo utilizzo), di eventuali reagenti scaduti o di eventuali cassette miste, appartenenti a un set di quattro cassette già utilizzate nel sistema. C. Trattamento dei campioni 1. Evitare di contaminare i guanti durante la manipolazione dei campioni e dei controlli. 2. Fare attenzione ad evitare la contaminazione dei campioni e del controllo negativo [WNV (–) C] con i controlli positivi. 05462975001-03IT 15 Doc Rev. 3.0 ISTRUZIONI PER L'USO Il sistema cobas s 201 si basa su quattro procedure principali: pipettamento di campioni e controlli con lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor; preparazione dei campioni con lo strumento COBAS® AmpliPrep e il test cobas® TaqScreen WNV; amplificazione/rilevazione con l’analizzatore COBAS® TaqMan®; gestione dei dati. In base alla configurazione del sistema cobas s 201, è possibile utilizzare fino a sei strumenti Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor, cinque stazioni di lavoro Data Manager e dieci stazioni dati AMPLILINK. Ogni stazione dati AMPLILINK supporta fino a tre strumenti COBAS® AmpliPrep e due analizzatori COBAS® TaqMan®. Per informazioni più dettagliate sul sistema cobas s 201, fare riferimento al Manuale operativo del sistema cobas s 201. Ogni kit cobas® TaqScreen West Nile Virus Test contiene otto cassette: due cassette di reagente WNV CS1 con particelle di vetro magnetiche (Magnetic Glass Particles, MGP); due cassette di reagente WNV CS2 con il Reagente di lisi; due cassette di reagente WNV CS3 con la Proteasi e il Tampone di eluizione; due cassette di reagente WNV CS4 con controllo interno (IC), Master Mix (MMX) e soluzione di manganese. Questo kit di analisi è destinato all'uso con il kit di controlli cobas® TaqScreen WNV e con il reagente di lavaggio cobas® TaqScreen, mentre per l'analisi dei campioni cadaverici è necessario utilizzare il kit di diluenti cobas® TaqScreen per campioni cadaverici. Nota: non aprire le cassette. Nota: non unire reagenti di lotti diversi o flaconi diversi dello stesso lotto. Nota: non mescolare reagenti (incluse le cassette) provenienti da kit diversi. Non caricare lotti di reagenti misti sullo strumento COBAS® AmpliPrep. Nota: non separare le provette di controllo dai rispettivi adattatori (portaprovette in plastica). Nota: il software PDM verifica che un batch venga eseguito su un solo strumento COBAS® AmpliPrep e un solo analizzatore COBAS® TaqMan® collegati alla stessa stazione dati AMPLILINK. Nota: non suddividere i batch tra più strumenti COBAS® AmpliPrep o analizzatori COBAS® TaqMan®. Eseguire tutti gli interventi di manutenzione consigliati, come descritto nel Manuale operativo del sistema cobas s 201. Per istruzioni dettagliate per l'uso, fare riferimento al Manuale operativo del sistema cobas s 201. È importante che l'utente segua attentamente le istruzioni fornite nel Manuale operativo del sistema cobas s 201. A. Pipettamento di controlli e campioni con lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor Nota: evitare di contaminare i guanti durante la preparazione dei campioni e dei controlli. Nota: miscelare i controlli per inversione almeno 3 volte, evitando la formazione di bolle d'aria (come descritto più avanti). • Miscelare per inversione significa capovolgere il controllo a testa in giù e riportarlo a testa in su ogni volta. • Durante ogni inversione mantenere il controllo in ognuna delle posizioni per almeno 2 secondi: in altre parole, capovolgere il controllo a testa in giù e mantenerlo in questa posizione per 2 secondi, quindi riportare il controllo a testa in su e mantenerlo in questa posizione per 2 secondi. Nota: per l'esecuzione del test sui campioni cadaverici, l'uso delle piastre a pozzetti profondi è disattivato al momento dell'installazione del sistema cobas s 201. A1. Eseguire le procedure di avvio dello strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor, quindi avviare la procedura guidata Roche PDM Pooling Wizard e attenersi alle istruzioni visualizzate. A2. Fare attenzione a non danneggiare il codice a barre sulle provette campione e sugli adattatori delle provette di controllo. Se il codice a barre è danneggiato, il sistema non riconosce i campioni e i controlli. 05462975001-03IT 16 Doc Rev. 3.0 A3. Rimuovere il tappo dalle provette di controllo e caricare i campioni, i materiali di consumo e i controlli sul pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD. Dopo che i campioni, il materiale di consumo e i controlli sono stati caricati, lo strumento trasferisce i controlli e i campioni nelle provette campione. I campioni e i controlli sono stabili per 5 ore al massimo nelle provette aperte e per altre 5 ore nelle provette campione. A4. Nel caso di campioni cadaverici individuali, pipettare 2000 μl di diluente CADV SPEC DIL in provette da 13 x 100 mm debitamente etichettate, aggiungere 500 μl di campione cadaverico in ogni singola provetta, quindi miscelare i campioni uno ad uno pipettandoli su e giù per quattro (4) volte. A questo punto è possibile caricare i campioni cadaverici diluiti, il materiale di consumo e i controlli sul pipettatore Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD. Dopo che i campioni cadaverici diluiti, i materiali di consumo e i controlli sono stati caricati, lo strumento trasferisce i controlli e i campioni diluiti nelle provette campione. I campioni cadaverici diluiti e i controlli WNV sono stabili fino a 5 ore nelle provette aperte. Nota: per ottenere una diluizione 1:10 del reagente [WNV (+) C], è necessario caricare due provette di controllo [WNV (–) C] per ogni provetta di controllo [WNV (+) C] utilizzata. A5. Al termine della seduta di pipettamento, visualizzare gli allarmi e stampare i report dei pool. Ispezionare i pool e i pozzetti della piastra a pozzetti profondi. Invalidare i pool e/o i pozzetti se si osserva la contaminazione con globuli rossi o se i volumi non sono uniformi. A6. Tappare le provette campione e trasferire i rack SK24 sullo strumento COBAS® AmpliPrep per l'estrazione degli acidi nucleici. Dopo il trasferimento sullo strumento COBAS® AmpliPrep, tutti i target virali e i controlli sono stabili per 5 ore nelle provette campione. A7. Tappare e riporre le piastre a pozzetti profondi (se sono state create durante la sessione di pipettamento). Le piastre a pozzetti profondi possono essere conservate fino a 7 giorni a 2-8°C o a ≤ -18°C per periodi più lunghi. A8. Rimuovere e conservare le provette dei donatori. Per informazioni sulle condizioni di conservazione, vedere la sezione "Raccolta, conservazione e creazione di pool di campioni". A9. Rimuovere e gettare via le provette di controllo (le provette di controllo sono monouso). B. Preparazione e caricamento dei reagenti del test cobas® TaqScreen West Nile Virus Nota: fare attenzione a non danneggiare le etichette delle cassette. Il lettore di codici a barre dello strumento COBAS® AmpliPrep acquisisce automaticamente il codice a barre di ogni cassetta mentre vengono caricati i rack per reagenti. B1. Equilibrare i reagenti a temperatura ambiente per almeno 30 minuti prima di trattare il primo campione. Non è necessario preparare i reagenti in altro modo. B2. Prima di iniziare, provvedere a caricare un numero di cassette sufficiente per il trattamento ininterrotto di tutti i campioni inclusi nella seduta sullo strumento COBAS® AmpliPrep. Ogni cassetta contiene reagenti sufficienti per 48 test. Per informazioni su come caricare un numero di reagenti sufficiente per evitare di interrompere la seduta, fare riferimento al Manuale operativo del sistema cobas s 201. B3. Inserire la cassetta WNV CS1 in un rack per reagenti, verificando che il codice a barre della cassetta sia allineato al codice a barre del rack, sul lato destro del rack. Le cassette WNV CS1 devono essere caricate tutte insieme in un rack per reagenti diverso da quello delle altre cassette. B4. Caricare il rack per reagenti contenente la cassetta WNV CS1 nella posizione per rack A, farlo scorrere fino al perno di arresto sullo strumento COBAS® AmpliPrep, quindi attendere che il LED del rack per reagenti diventi verde prima di spingere il rack verso la parte posteriore dello strumento, nella posizione finale. Non caricare lotti di reagenti misti sullo strumento. B5. Per ogni cassetta WNV CS1 inserire un set di cassette WNV CS2, WNV CS3 e WNV CS4 in un rack per reagenti, verificando che i codici a barre delle cassette siano allineati al codice a barre del rack, sul lato destro del rack. B6. Caricare il rack per reagenti nella posizione per rack B, C, D o E, farlo scorrere fino al perno di arresto sullo strumento COBAS® AmpliPrep, quindi attendere che il LED del rack per reagenti diventi verde prima di spingere il rack verso la parte posteriore dello strumento, nella posizione finale. 05462975001-03IT 17 Doc Rev. 3.0 B7. I LED sulla barra di stato dello strumento COBAS® AmpliPrep diventeranno verdi quando tutti i componenti del kit necessari saranno stati caricati e riconosciuti dal sistema. C. Estrazione degli acidi nucleici da campioni e controlli pipettati Nota: eseguire questa procedura su una superficie di lavoro pulita. C1. Rimuovere il rivestimento dall'involucro delle unità SPU, lasciando intatto il nastro e la copertura in plastica. C2. Dopo aver rivolto il bordo più largo del rack per SPU verso l’operatore, inserire l'involucro con le unità SPU facendo attenzione che sia a livello con il lato destro del rack per SPU. C3. Rimuovere il nastro e il coperchio di plastica dalle unità SPU, dopo averle inserite nel rack. Assicurarsi che tutte le unità SPU siano perfettamente inserite dentro il rack e siano a livello. Se vi sono unità SPU sollevate, lo strumento potrebbe smettere di funzionare. Non esercitare pressioni sull'ago per campioni nell'unità SPU. C4. Spingere i rack per SPU caricati nelle posizioni J, K o L dello strumento COBAS® AmpliPrep finché il rack non sarà perfettamente inserito e identificato. Lo strumento può ospitare un massimo di 72 unità SPU alla volta. Caricare almeno le unità SPU necessarie per completare la seduta, o eventualmente un numero maggiore. C5. Rimuovere il rivestimento in cellophane dalle confezioni originali dei rack per provette K e per puntali K, facendo attenzione a non rovesciare i rack. Controllare che siano tutti inseriti perfettamente. C6. Spingere il numero necessario di rack per provette K e per puntali K nelle posizioni M, N, O o P dello strumento COBAS® AmpliPrep. C7. Nelle posizioni F, G o H dello strumento COBAS® AmpliPrep caricare i rack SK24 contenenti i campioni e i controlli pipettati con lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor. Spingere finché i rack non si bloccano. Controllare lo stato del sistema nella finestra Sample, verificando che siano stati identificati tutti i campioni in ogni rack. C8. Nel software AMPLILINK verificare che sia stato caricato un numero sufficiente di reagenti e materiali di consumo per la preparazione dei campioni desiderati. C9. Sulla stazione di lavoro con il software AMPLILINK premere Start, in modo da avviare la procedura di preparazione dei campioni sullo strumento COBAS® AmpliPrep. C10. Tutti i puntali K e le provette K inutilizzati potranno essere monitorati sullo strumento COBAS® AmpliPrep ed eventualmente utilizzati per la seduta successiva, se non verranno rimossi. D. Amplificazione e rilevazione Nota: la soluzione di lavoro Master Mix con i campioni trattati contenuti nel rack SK24 hanno una stabilità limitata. L'analizzatore COBAS® TaqMan® deve essere pronto ad accettare i campioni trattati non appena lo strumento COBAS® AmpliPrep avrà completato la preparazione dei campioni. D1. Trasferire il rack SK24, contenente i campioni trattati, sull'analizzatore COBAS® TaqMan®. L'analizzatore COBAS® TaqMan® avvierà automaticamente l'amplificazione e la rilevazione. La seduta dell'analizzatore COBAS® TaqMan® deve essere avviata entro 1 ora dal completamento della preparazione dei campioni per il rack SK24. I rack SK24 semipieni che non vengono trasferiti entro 1 ora potrebbero ancora assicurare un batch valido. Il software AMPLILINK tiene traccia del tempo trascorso tra l'aggiunta del reagente Master Mix e l'inizio dell'amplificazione/rilevazione per ogni campione, pertanto considera non valido l'intero rack se il primo campione trattato supera il limite temporale. D2. Al termine dell'amplificazione e della rilevazione con l'analizzatore COBAS® TaqMan®, i campioni vengono espulsi automaticamente nel contenitore dei rifiuti. D3. I risultati sulla workstation che esegue il software AMPLILINK vengono accettati automaticamente. D4. I risultati vengono inviati automaticamente al software PDM. 05462975001-03IT 18 Doc Rev. 3.0 E. Revisione e approvazione dei risultati E1. Avviare la stazione di lavoro Roche PDM. E2. Nella stazione di lavoro Data Manager procedere al recupero dei batch non ancora valutati (opzione "Unevaluated Batches" della scheda "Review Batches"). E3. Per rivedere gli allarmi, evidenziare un batch e quindi fare clic su "Next". E4. Rivedere i risultati dei controlli nella scheda "Controls Review". Per una descrizione dei criteri di validità dei controlli, vedere la sezione "Controllo di qualità". E5. Rivedere i risultati dei pool nella scheda "Pools Review" relativa al batch selezionato. I pool non reattivi possono essere invalidati manualmente dall'utente, se necessario. I campioni dei donatori in un pool non valido devono essere analizzati di nuovo. E6. Rivedere e approvare i donatori nella scheda "Donor Review" relativa al batch selezionato. E7. Stampare i report e, se necessario, inviarli al sistema LIS (Laboratory Information System). CONTROLLO DI QUALITÀ 1. Con ogni batch è necessario analizzare un replicato del controllo negativo [WNV (–) C] e un replicato del controllo positivo [WNV (+) C]. 2. Stato del batch: lo stato del batch diventa "Complete, Valid" quando i controlli del batch sono validi. Se i controlli del batch non sono validi, l'intero batch non è valido. Il software PDM invalida automaticamente i risultati sulla base degli errori dei controlli. a. Controllo negativo Il controllo negativo [WNV (–) C] è valido solo se l'interpretazione del risultato è "non reattivo" e il Controllo Interno associato è valido. Se il controllo interno non è valido, il risultato del controllo negativo viene considerato non valido. Se il risultato del controllo negativo è considerato non valido, l'intero batch sarà non valido e il test dovrà essere ripetuto. b. Controllo positivo Affinché il controllo positivo [WNV (+) C] possa essere considerato valido, il risultato deve essere interpretato come reattivo e il controllo interno associato deve essere valido. Se il controllo interno non è valido, il risultato del controllo positivo è considerato non valido. Se il risultato del controllo positivo è considerato non valido, l'intero batch sarà non valido e il test dovrà essere ripetuto. 3. Controllo interno per i campioni dei donatori a. Affinché al campione di un donatore possa essere associato un risultato non reattivo valido (-), il controllo interno associato deve essere valido; in caso contrario, il risultato non reattivo non sarà valido e il test dovrà essere ripetuto. b. Affinché al campione di un donatore possa essere associato un risultato reattivo valido, il controllo interno associato può essere valido o non valido. 05462975001-03IT 19 Doc Rev. 3.0 RISULTATI 1. I risultati dei campioni sono validi solo se il batch che li contiene è valido. Per informazioni sui criteri di validità, vedere la sezione Controllo di qualità. Per ogni campione vengono misurati due parametri, uno per il target WNV e un altro per il controllo interno. 2. I risultati finali del donatore al test cobas® TaqScreen West Nile Virus sono indicati in un report generato dal software PDM nel modo seguente: Stato Significato Completed Non-Reactive Il donatore non è reattivo al virus WNV. Completed Reactive Il donatore è reattivo al virus WNV. Il limite di vitalità è stato superato prima che uno stato (reattivo o non reattivo) potesse essere assegnato al donatore. Non è possibile eseguire altri test sul Completed Unresolved sistema per questo donatore. Per una descrizione del limite di vitalità, vedere il Manuale operativo del sistema cobas s 201. Creazione di pool secondari Per le provette donatori con stato individuale o con stato del pool di appartenenza "invalid" è richiesta la ripetizione del test. Quando un pool di campioni viene segnalato come reattivo dal sistema cobas s 201, viene generata una richiesta di creazione di pool secondari con i campioni dei donatori associati a tale pool e viene utilizzato lo strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor per pipettare i singoli campioni dalle piastre a pozzetti profondi o dalle provette contenenti i campioni originali. Il test cobas® TaqScreen West Nile Virus consente di identificare i singoli campioni reattivi utilizzando gli stessi metodi (test in singolo) applicati ai campioni in pool. Se un pool contiene uno o più campioni reattivi, questi campioni vengono segnalati come "Completed Reactive", mentre i restanti campioni negativi del pool che inizialmente era risultato positivo vengono segnalati come "Completed, Non-reactive". Se tutti i campioni individuali contenuti nel pool generano risultati negativi, i campioni del pool vengono tutti segnalati come "Completed, Non-reactive". 05462975001-03IT 20 Doc Rev. 3.0 LIMITI DELLA PROCEDURA 1. L'uso del test cobas® TaqScreen West Nile Virus è stato valutato esclusivamente con il kit di controlli cobas® TaqScreen West Nile Virus, con il reagente di lavaggio cobas® TaqScreen e con il sistema cobas s 201. 2. Per l'esecuzione del test sui campioni cadaverici è stato valutato esclusivamente l'uso del test cobas® TaqScreen WNV contestualmente al kit di diluenti cobas® TaqScreen per campioni cadaverici, al kit di controlli cobas® TaqScreen WNV, al reagente di lavaggio cobas® TaqScreen e al sistema cobas s 201. 3. È dimostrato che l'eparina inibisce la PCR. Non utilizzare plasma eparinizzato con questa procedura. 4. L'affidabilità dei risultati dipende dall'adeguatezza delle procedure seguite per la raccolta e il trasporto dei campioni. 5. L'identificazione dell’RNA di WNV dipende dal numero di particelle virali presenti nel campione e può essere influenzata dai metodi di raccolta del campione, da fattori legati al paziente (come l'età e la presenza di sintomi), nonché dallo stadio dell'infezione e dalle dimensioni del pool. 6. Per la preparazione automatizzata dei pool di plasma è stato validato soltanto l'uso dello strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor con il test cobas® TaqScreen West Nile Virus. Attenersi alle istruzioni hardware e alle precauzioni per la sicurezza descritte nel Manuale operativo del sistema cobas s 201 e nel manuale utente dello strumento Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Pipettor. 7. Anche gli altri virus del gruppo dell'encefalite giapponese (encefalite giapponese, encefalite della Murray Valley, encefalite di Saint Louis e Kunjin) potrebbero risultare reattivi al test cobas® TaqScreen West Nile Virus. 8. Anche se rare, le mutazioni della regione altamente conservata del genoma virale coperta dai primer e/o dalla sonda del test cobas® TaqScreen West Nile Virus possono dare luogo alla mancata identificazione del virus. 9. A causa delle differenze intrinseche tra le tecnologie, è consigliabile che gli utenti, prima di passare da una tecnologia a un'altra, svolgano studi sulla correlazione tra i metodi nei propri laboratori alla scopo di qualificare tali differenze. Si consiglia agli utenti di seguire le proprie strategie e procedure interne. CARATTERISTICHE DELLA PERFORMANCE CAMPIONI DI DONATORI VIVENTI Riproducibilità La riproducibilità del test cobas® TaqScreen WNV con il sistema cobas s 201 è stata valutata analizzando alla cieca un pannello di 21 componenti randomizzati, così costituiti: sei campioni di plasma negativi, sei campioni di plasma positivi con una concentrazione pari a 0,49 volte il limite di sensibilità del test cobas® TaqScreen WNV e tre campioni di plasma positivi, ciascuno con concentrazioni 2,5 volte, 5 volte e 10 volte il limite di sensibilità. I test sono stati eseguiti presso 3 laboratori e da 1 operatore in ogni laboratorio con 3 lotti del test cobas® TaqScreen West Nile Virus e 1 sistema cobas s 201. In ciascun laboratorio sono stati analizzati 4 pannelli con i controlli positivi e negativi associati, tutti i giorni per 5 giorni, per un totale di 180 test per ogni componente del pannello. Tutti i dati validi sulla riproducibilità sono stati valutati calcolando la percentuale di risultati reattivi ai test per ogni livello del pannello. I dati sono stati analizzati in base ai diversi parametri: lotto del kit, laboratorio/operatore, giorno/seduta e generale (Tabella 1). Lo studio dimostra la coerenza della performance del test cobas® TaqScreen West Nile Virus tra lotti di kit, laboratori/operatori e giorni/sedute. 05462975001-03IT 21 Doc Rev. 3.0 Tabella 1 Test cobas® TaqScreen WNV - Dati di riproducibilità Concentrazione Lotto del kit A B Negativi C Concentrazione Lotto del kit 0,49 x limite di sensibilità A B C 2,5 x limite di sensibilità A B C 5,0 x limite di sensibilità A B C 10,0 x limite di sensibilità A B C * * % risultati negativi per lotto del kit Tra lotti 100,0 (359/359) 100,0 (359/359) 100,0 (359/359) % risultati reattivi per lotto del kit Tra lotti 73,9 (264/357) 72,2 (260/360) 74,2 (267/360) 99,4 (179/180) 100,0 (179/179) 100,0 (180/180) 99,4 (178/179) 100,0 (179/179) 100,0 (180/180) 100,0 (179/179) 100,0 (180/180) 100,0 (180/180) Labora% risultati negativi torio/ per laboratorio/ Operaoperatore tore Tra laboratori Giorno/ Seduta* % risultati negativi per giorno/seduta Tra saggi 1 100,0 (360/360) 1 100,0 (209/209) 2 100,0 (359/359) 2 100,0 (198/198) 3 100,0 (358/358) 3 100,0 (209/209) 4 5 6 100,0 (192/192) 100,0 (203/203) 100,0 (66/66) Giorno/ Seduta* % risultati reattivi per giorno/seduta Labora% risultati reattivi torio/ per laboratorio/ Operaoperatore tore Tra laboratori Tra saggi 1 75,5 (271/359) 1 71,5 (148/207) 2 74,7 (269/360) 2 68,2 (135/198) 3 70,1 (251/358) 3 74,6 (156/209) 4 5 6 78,1 (150/192) 74,6 (153/205) 74,2 (49/66) 100,0 (105/105) 1 100,0 (180/180) 1 2 100,0 (179/179) 2 100,0 (98/98) 3 99,4 (179/180) 3 100,0 (105/105) 4 5 6 100,0 (96/96) 99,0 (101/102) 100,0 (33/33) 99,0 (103/104) 1 100,0 (180/180) 1 2 100,0 (179/179) 2 100,0 (99/99) 3 99,4 (178/179) 3 100,0 (104/104) 4 5 6 100,0 (96/96) 100,0 (102/102) 100,0 (33/33) 100,0 (105/105) 1 100,0 (180/180) 1 2 100,0 (179/179) 2 100,0 (98/98) 3 100,0 (180/180) 3 100,0 (105/105) 4 5 6 100,0 (96/96) 100,0 (102/102) 100,0 (33/33) % generale (IC 95%)** Totale 100,0 (1077/1077) (99,7, 100,0) % generale (IC 95%)** Totale 73,4 (791/1077) (70,7, 76,1) 99,8 (538/539) (99,0, 100,0) 99,8 (537/538) (99,0, 100,0) 100,0 (539/539) (99,3, 100,0) Si è reso necessario un Giorno 6 per ripetere i test sui batch che erano risultati non validi nei Giorni 1-5. IC 95% = intervallo di confidenza al 95% esatto, in base alla distribuzione binomiale. 05462975001-03IT 22 Doc Rev. 3.0 Sensibilità analitica - Health Canada Standard - Lineage 1 Il limite di sensibilità del test cobas® TaqScreen WNV è stato valutato utilizzando lo standard di riferimento Health Canada West Nile Virus Reference Standard11 (Infectious Diseases, Canadian Blood Services, 1800 Alta Vista, Ottawa, Ontario, K1G 4J5). Sono stati preparati dei pannelli diluendo lo standard in plasma umano normale, negativo al virus. Ogni diluizione è stata analizzata utilizzando tre diversi lotti del test cobas® TaqScreen West Nile Virus. In totale sono stati analizzati 30 replicati per ogni lotto del kit, per un totale di 90 replicati per ogni concentrazione. I dati combinati di tutti i replicati analizzati sono serviti per determinare il limite di sensibilità in base al tasso di positività, considerando il limite inferiore di confidenza al 95% come per il calcolo mediante Analisi PROBIT per stimare il limite della sensibilità al 95% ed entambi gli intervalli di confidenza al 95% del pannello (Tabella 2). Il limite di sensibilità al 95% stimato utilizzando lo standard di riferimento Health Canada Standard - Lineage 1 è di 40,3 copie/ml. Tabella 2 Riepilogo della sensibilità analitica - Health Canada West Nile Virus Standard Input nominale Numero di reattivi (copie/ml) Numero di test individuali 0 5 10 20 25 30 35 50 0 10 43 70 74 76 85 89 89* 90 90 90 90 90 90 90 Analisi PROBIT Tasso di sensibilità (%) Concentrazione (copie/ml) 95 40,3 % di reattivi 0 11,1 47,8 77,8 82,2 84,4 94,4 98,9 Limite inferiore di confidenza al 95% (copie/ml) 35,1 Limite inferiore di confidenza al 95% (unilaterale) NA 6,2% 38,7% 69,4% 74,3% 76,8% 88,7% 94,8% Limite superiore di confidenza al 95% (copie/ml) 47,8 * Un replicato non valido 05462975001-03IT 23 Doc Rev. 3.0 Sensibilità analitica - Roche WNV Secondary Standard - Lineage 1 Il limite di sensibilità del test cobas® TaqScreen West Nile Virus è stato valutato utilizzando Roche WNV Secondary Standard (Zeptometrix West Nile Virus Stock, NY 2001-6263, lotto numero 302142, calibrato in base allo standard di riferimento Health Canada West Nile Virus Reference Standard). Sono stati preparati dei pannelli diluendo lo standard in plasma umano normale, negativo al virus. Ogni diluizione è stata analizzata utilizzando tre diversi lotti del test cobas® TaqScreen West Nile Virus. In totale sono stati analizzati 64 replicati per ogni lotto del kit, per un totale di 192 replicati per ogni concentrazione. Utilizzando i dati combinati di tutti i replicati analizzati, è stato possibile determinare il limite di sensibilità in base al tasso di positività con il limite inferiore di confidenza al 95% (monolaterale), nonché eseguire calcoli mediante Analisi PROBIT per stimare il limite di sensibilità al 95% e gli intervalli di confidenza al 95% (bilaterali) per il pannello (Tabella 3). Il limite di sensibilità al 95% stimato utilizzando Roche WNV Secondary Standard - Lineage 1 è di 36,9 copie/ml. Tabella 3 Riepilogo della sensibilità analitica - Roche WNV Secondary Standard Input nominale Numero di reattivi (copie/ml) Numero di test individuali 0 5 10 20 25 30 35 50 0 68 110 153 173 182 183 187 192 192 191* 192 192 192 192 192 Analisi PROBIT Tasso di sensibilità (%) Concentrazione (copie/ml) 95 36,9 % di reattivi 0 35,4 57,6 79,7 90,1 94,8 95,3 97,4 Limite inferiore di confidenza al 95% (copie/ml) 32,7 Limite inferiore di confidenza al 95% (unilaterale) NA 29,7% 51,4% 74,3% 85,8% 91,3% 92,0% 94,6% Limite superiore di confidenza al 95% (copie/ml) 42,6 * Un replicato non valido 05462975001-03IT 24 Doc Rev. 3.0 Sensibilità analitica - CBER/FDA West Nile Virus Panel - Lineage 1 Il limite di sensibilità del test cobas® TaqScreen West Nile Virus è stato valutato utilizzando il pannello CBER/FDA West Nile Virus Panel. Il pannello è costituito da 14 componenti derivati da un virus WNV isolato da uomo, Lineage 1 (Hu2002), e da un virus WNV isolato da fenicottero, Lineage 1 (NY99) (prodotti per CBER da BBI Diagnostics, 375 West Street, West Bridgewater MA, 02379). Ogni componente del pannello è stato analizzato in duplicato con tre diversi lotti del test cobas® TaqScreen West Nile Virus (Tabella 4). Tabella 4 Riepilogo della sensibilità analitica - CBER/FDA West Nile Virus Panel ID componente Input nominale (copie/ml) 0 0 5 5 10 10 50 50 100 100 500 500 1000 1000 Isolato Lineage 1 CBER/FDA – 03 CBER/FDA – 05 CBER/FDA – 09 CBER/FDA – 10 CBER/FDA – 12 CBER/FDA – 02 CBER/FDA – 04 CBER/FDA – 13 CBER/FDA – 07 CBER/FDA – 01 CBER/FDA – 14 CBER/FDA – 11 CBER/FDA – 08 CBER/FDA – 06 * Un replicato non valido Hu2002 NY99 Hu2002 NY99 Hu2002 NY99 Hu2002 NY99 Hu2002 NY99 Hu2002 NY99 Hu2002 NY99 % di reattivi 0% (0/6) 0% (0/6) 50% (3/6) 83% (5/6) 50% (3/6) 33% (2/6) 100% (6/6) 100% (6/6) 100% (6/6) 100% (5/5)* 100% (6/6) 100% (6/6) 100% (6/6) 100% (6/6) Sensibilità analitica - West Nile Virus RNA Qualification Panel QWN701 - Lineage 2 Il limite di sensibilità del test cobas® TaqScreen WNV è stato valutato utilizzando il pannello West Nile Virus RNA Qualification Panel QWN701 (West Nile Virus Stock, Lineage 212,13, Uganda - BBI Diagnostics, 375 West Street, West Bridgewater MA, 02379). Lo stock di virus è stato calibrato dal fornitore utilizzando un saggio PCR real-time basato sull'analizzatore TaqMan®14. Sono stati preparati dei pannelli diluendo gli standard in plasma umano normale, negativo al virus. Ogni diluizione è stata analizzata utilizzando tre diversi lotti del test cobas® TaqScreen West Nile Virus. In totale sono stati analizzati 30 replicati per ogni lotto del kit, per un totale di 90 replicati per ogni concentrazione. Utilizzando i dati combinati di tutti i replicati analizzati, è stato possibile determinare il limite di sensibilità in base al tasso di positività con il limite inferiore di confidenza al 95% (monolaterale), nonché eseguire calcoli mediante Analisi PROBIT per stimare il limite di sensibilità al 95% e gli intervalli di confidenza al 95% (bilaterali) per il pannello (Tabella 5). Il limite di sensibilità al 95% stimato utilizzando il pannello West Nile Virus RNA Qualification Panel QWN701 - Lineage 2 è di 3,8 copie/ml. Tabella 5 Riepilogo della sensibilità analitica - West Nile Virus RNA Qualification Panel QWN701 – Lineage 2 Input nominale Numero di reattivi (copie/ml) Numero di test individuali 0,00 0,25 0,50 1,00 1,50 3,00 5,00 0 22 29 48 68 85 90 90 90 90 90 90 90 90 Analisi PROBIT Tasso di sensibilità (%) Concentrazione (copie/ml) 95 3,8 05462975001-03IT 25 % di reattivi 0 24 32 53 76 94 100 Limite inferiore di confidenza al 95% (copie/ml) 2,3 Limite inferiore di confidenza al 95% (unilaterale) NA 17,2% 24,1% 44,1% 67,0% 88,7% 96,7% Limite superiore di confidenza al 95% (copie/ml) 11,1 Doc Rev. 3.0 Specificità analitica – Microrganismi potenzialmente interferenti e reattività crociata La specificità analitica del test cobas® TaqScreen West Nile Virus è stata valutata analizzando un pannello di 52 microrganismi così costituito: 47 isolati virali, 4 ceppi batterici e 1 isolato da lievito (Tabella 6). Dopo avere arricchito con i microrganismi il plasma umano normale, negativo al virus, è stata eseguita l'analisi dei campioni con e senza l'aggiunta del virus WNV, a una concentrazione pari a 3 volte il limite di sensibilità del test cobas® TaqScreen West Nile Virus. Fatta eccezione per i 4 isolati della famiglia dei virus dell'encefalite giapponese (encefalite giapponese, encefalite della Murray Valley, encefalite di Saint Louis e virus Kunjin), il test cobas® TaqScreen West Nile Virus ha generato risultati non reattivi per tutti i campioni con microrganismi senza l'aggiunta del virus WNV e risultati reattivi per tutti i campioni con microrganismi contenenti il virus WNV. I 4 isolati della famiglia dei virus dell'encefalite giapponese sono risultati reattivi in tutti e 8 i replicati. Tali risultati erano attesi, in quanto esiste un'omologia fra la sequenza nucleotidica di questi virus, la sequenza nucleotidica del virus WNV, dei primer e delle sonde del test cobas® TaqScreen West Nile Virus. Tabella 6 Microrganismi analizzati Adenovirus tipo 2 Adenovirus tipo 3 Adenovirus tipo 7 Candida albicans Cytomegalovirus Davis Cytomegalovirus Towne Virus di Epstein-Barr RAJI Virus di Epstein Barr P3 Virus dell'epatite A (PA 21) Virus dell'epatite B, genotipo A Virus dell'epatite B, genotipo B Virus dell'epatite C, genotipo 1a Virus dell'epatite C, genotipo 1b Virus dell'epatite C, genotipo 2a Virus dell'epatite C, genotipo 2b Virus dell'epatite C, genotipo 6 MJ (G11), cellule che producono HTLV-I MJ (C5), cellule che producono HTLV-I (MoT) cellule che producono HTLV-II (DeltaH6H11) HTLV-II a lunghezza completa Herpes simplex tipo I, F Herpes simplex tipo I, HF Herpes simplex tipo I, MacIntyre Herpes simplex tipo II, G Herpes simplex tipo II, MS Virus del papilloma umano, tipo 11 Virus del papilloma umano, tipo 18 Virus del papilloma umano, tipo 6B Virus dell'influenza A (A/New Jersey/8/76) Virus dell'influenza B (B/Hong Kong/5/72) Virus dell'epatite C, genotipo 3 Virus Varicella-Zoster Ellen Virus dell'epatite C, genotipo 4 Virus dell'epatite C, genotipo 5 Virus Varicella-Zoster Oka HIV-1 sottotipo A HIV-1 sottotipo B HIV-1 sottotipo C HIV-1 sottotipo D HIV-1 sottotipo E HIV-1 sottotipo F HIV-1 sottotipo G HIV-1 sottotipo H HIV-2 Pneumocystis carinii D&D Propionibacterium acnes Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Virus dell'encefalite giapponese Virus dell'encefalite della Murray Valley Virus dell'encefalite di Saint Louis Virus Kunjin Specificità analitica - Altre condizioni patologiche Per ogni patologia esaminata (infezione da Cytomegalovirus, infezione da virus dell'epatite A, infezione da virus dell'epatite B, infezione da virus dell'epatite C, virus dell'immunodeficienza umana (HIV-1), infezione da virus di Epstein Barr) sono stati analizzati tra 10 e 20 campioni di pazienti, con e senza l'aggiunta del virus WNV a una concentrazione pari a 3 volte il limite di sensibilità del test cobas® TaqScreen West Nile Virus. Il test cobas® TaqScreen West Nile Virus ha generato risultati non reattivi per tutti i campioni nelle condizioni patologiche indicate e privi del virus WNV, mentre ha generato risultati reattivi per tutti i campioni nelle condizioni patologiche indicate e ai quali era stato aggiunto il virus WNV. Le patologie prese in esame non hanno interferito con la sensibilità e la specificità del test cobas® TaqScreen West Nile Virus. 05462975001-03IT 26 Doc Rev. 3.0 Sostanze potenzialmente interferenti Sostanze interferenti di tipo endogeno Sono stati analizzati campioni di plasma con livelli eccezionalmente elevati di trigliceridi (fino a 2487 mg/dl), emoglobina (fino a 516 mg/dl), bilirubina (fino a 23,5 mg/dl) o albumina (fino a 6900 mg/dl), con e senza l'aggiunta del virus WNV, a una concentrazione pari a 3 volte il limite di sensibilità del test cobas® TaqScreen West Nile Virus. Le sostanze endogene prese in esame non hanno interferito con la sensibilità e la specificità del test cobas® TaqScreen West Nile Virus. Sono stati analizzati campioni di plasma con condizioni/patologie autoimmuni confermate (positivi all'anticorpo antinucleare, al fattore reumatoide e al lupus eritematoso sistemico), con e senza l'aggiunta del virus WNV, a una concentrazione pari a 3 volte il limite di sensibilità del test cobas® TaqScreen West Nile Virus. Le sostanze endogene prese in esame non hanno interferito con la sensibilità e la specificità del test cobas® TaqScreen West Nile Virus. Sono stati analizzati campioni di plasma arricchiti con livelli eccezionalmente elevati di globuli rossi (fino al 10% v/v), con e senza l'aggiunta del virus WNV, a una concentrazione pari a 3 volte il limite di sensibilità del test cobas® TaqScreen West Nile Virus. L'aggiunta di globuli rossi al plasma a un livello del 10% (v/v) ha effettivamente interferito con la sensibilità e la specificità del test cobas® TaqScreen West Nile Virus. Sostanze interferenti di tipo esogeno Sono stati analizzati campioni di plasma contenenti concentrazioni eccezionalmente elevate di acetaminofene (1324 μmol/l), acido acetilsalicilico (3,62 μmol/l), atorvastatina (600 Eq/l), fluoxetina (11,2 μmol/l), loratadina (0,78 μmol/l), nadololo (3,88 μmol/l), naprossene (2170 μmol/l), paroxetina (3,04 μmol/l), sertralina (1,96 μmol/l), acido ascorbico (284 μmol/l), ibuprofene (2425 μmol/l) e fenilefrina HCl (327,5 μmol/l), con e senza l'aggiunta del virus WNV, a una concentrazione pari a 3 volte il limite di sensibilità del test cobas® TaqScreen West Nile Virus. Le sostanze esogene prese in esame non hanno interferito con la sensibilità e la specificità del test cobas® TaqScreen West Nile Virus. 05462975001-03IT 27 Doc Rev. 3.0 CAMPIONI CADAVERICI Riproducibilità Venti campioni di plasma in EDTA da donatori viventi e 20 campioni individuali di plasma in EDTA da donatori cadaverici sono stati arricchiti con target virale WNV utilizzando Roche WNV Secondary Standard a una concentrazione finale tre volte superiore al limite di sensibilità, in base al livello di emolisi presente in ogni campione. I campioni cadaverici sono stati diluiti manualmente con rapporto 1:5 con il diluente cobas® TaqScreen per campioni cadaverici e sono stati sottoposti alla procedura prevista per i test dei campioni cadaverici. Ognuno dei 20 campioni di donatori viventi e campioni cadaverici è stato analizzato da 2 operatori, i quali hanno utilizzato tre diversi lotti del test cobas® TaqScreen WNV. Ogni operatore è stato abbinato ad un sistema cobas s 201 per creare due coppie operatore-strumento. Tutti i dati di riproducibilità validi sono stati analizzati confrontando i tassi di reattività al target virale WNV aggiunto ai campioni dei donatori viventi e ai campioni cadaverici rispetto ai tre lotti del kit (Tabella 7) e rispetto alle due coppie operatore-strumento (Tabella 8). La valutazione dei risultati si è basata sul metodo esatto di Fisher (test a 1 coda), con il quale è stato possibile determinare se le differenze tra i tassi di reattività dei campioni dei donatori viventi e dei campioni cadaverici sono o meno significative. Tabella 7 Riepilogo dei dati di riproducibilità per campioni cadaverici e campioni di donatori viventi Risultati in base al lotto del kit Target virale Tipo di donatore Lotto n. 1 Lotto n. 2 Lotto n. 3 valore p Campioni di donatori viventi / Campioni cadaverici Post-mortem 40 / 40 (100%) 39 / 39* (100%) 40 / 40 (100%) 1,0 Vivente 39 / 39* (100%) 39 / 39* (100%) 40 / 40 (100%) Valore p a 1 coda Campioni di donatori 1,0 1,0 1,0 viventi/cadaverici in base al lotto reagente * Un replicato non valido Nota: per il test esatto di Fisher, i valori p maggiori di 0,05 non sono rilevanti dal punto di vista statistico WNV Tabella 8 Riepilogo dei dati di riproducibilità per campioni cadaverici e campioni di donatori viventi Risultati in base alla coppia operatore-strumento Target virale Tipo di donatore OperatoreStrumento n. 1 OperatoreStrumento n. 2 valore p Campioni di donatori viventi / Campioni cadaverici 60 / 60 (100%) 59 / 59* (100%) Post-mortem 1,0 59 / 59* (100%) 59 / 59* (100%) Vivente Valore p a 1 coda Campioni di donatori 1,0 1,0 viventi/cadaverici in base alla coppia operatore-strumento * Un replicato non valido Nota: per il test esatto di Fisher, i valori p maggiori di 0,05 non sono rilevanti dal punto di vista statistico WNV 05462975001-03IT 28 Doc Rev. 3.0 Specificità Settanta campioni individuali di plasma in EDTA appartenenti a donatori viventi e settantuno campioni cadaverici individuali di plasma in EDTA precedentemente risultati negativi all'RNA di WNV sono stati suddivisi in tre gruppi, quindi ogni gruppo è stato analizzato utilizzando tre lotti del test cobas® TaqScreen West Nile Virus. I campioni cadaverici di plasma in EDTA sono stati suddivisi in tre gruppi da 25, 21 e 25, diluiti manualmente con rapporto 1:5 con il diluente cobas® TaqScreen per campioni cadaverici, infine sottoposti alla procedura prevista per i test dei campioni cadaverici. I campioni di plasma in EDTA dei donatori viventi sono stati suddivisi in tre gruppi da 25, 20 e 25, quindi sono stati diluiti manualmente con rapporto 1:6 con un pool di campioni di plasma in EDTA risultati negativi all'RNA di WNV prima del test, in modo da simulare la procedura consigliata per l'esecuzione del test cobas® TaqScreen West Nile Virus su pool costituiti da sei campioni. Per quanto riguarda i campioni cadaverici, i risultati validi ottenuti con tre lotti del kit sono stati in totale sessantanove, tutti di non reattività all'RNA di WNV, per una specificità del 100%. Per quanto riguarda i campioni dei donatori viventi, i risultati validi ottenuti con gli stessi tre lotti del kit sono stati in totale settanta. Un campione inizialmente reattivo al test è invece risultato non reattivo all'RNA di WNV dopo la ripetizione del test in duplicato. I risultati del test di specificità sono riassunti nella Tabella 9. Tabella 9 Riepilogo dei risultati del test cobas® TaqScreen WNV in materia di specificità dei campioni cadaverici e dei campioni di donatori viventi Campioni di donatori viventi (diluizione 1:6) Campioni cadaverici Lotto reagente Numero di Numero di Numero di Numero di risultati di risultati di risultati di risultati validi non reattività reattività non reattività Lotto n. 1 23 23 0 25 25 Lotto n. 2 21 21 0 20 20 Lotto n. 3 25 25 0 25 24 Totale 69* 69 0 70 69 Specificità 100% 98,6% *Esclusi i risultati iniziali non validi ** Risultati di non reattività con ripetizione del test in duplicato Numero di risultati validi Numero di risultati di reattività 0 0 1** 1 Sensibilità analitica nei campioni cadaverici con Roche WNV Secondary Standard Il limite di sensibilità del test cobas® TaqScreen West Nile Virus nei campioni cadaverici di plasma in EDTA è stato valutato utilizzando Roche WNV Secondary Standard (Zeptometrix West Nile Virus Stock, NY 2001-6263, Lotto n. 302142, calibrato in base allo standard di riferimento Health Canada West Nile Virus Reference Standard). I pannelli moderatamente emolizzati sono stati preparati diluendo lo standard in un pool di campioni cadaverici di plasma in EDTA negativi al virus, costituiti da campioni cadaverici individuali per i quali era stata precedentemente verificata l'appartenenza alla categoria dei campioni moderatamente emolizzati (colore tra il giallo paglierino e il rosa). La matrice dei campioni altamente emolizzati era di tipo artificiale ed era costituita da sangue intero prelevato in precedenza e quindi lisato, miscelato con plasma in EDTA, quindi rappresentativo di un campione clinico altamente emolizzato (colore dal rosso al rosso scuro o il marrone). Prima della preparazione dei pannelli di diluizione era stata verificata la negatività della matrice dei campioni altamente emolizzati all'RNA di WNV. Sono stati utilizzati due lotti del test cobas® TaqScreen WNV per analizzare i pannelli moderatamente emolizzati e un lotto del test cobas® TaqScreen WNV per analizzare i pannelli altamente emolizzati. Utilizzando i dati combinati di tutti i replicati analizzati per ogni matrice, è stato possibile determinare il limite di sensibilità in base al tasso di positività con il limite inferiore di confidenza al 95% (monolaterale), nonché eseguire calcoli mediante Analisi PROBIT per stimare il limite di sensibilità al 95% e gli intervalli di confidenza al 95% (bilaterali) per il pannello (Tabella 10 e Tabella 11). Il limite di sensibilità al 95% stimato mediante Analisi PROBIT e utilizzando Roche WNV Secondary Standard è risultato essere di 117,4 copie/ml nei campioni cadaverici moderatamente emolizzati e di 365,1 copie/ml nella matrice di campioni altamente emolizzati. 05462975001-03IT 29 Doc Rev. 3.0 Tabella 10 Riepilogo della sensibilità analitica con Roche WNV Secondary Standard in campioni cadaverici moderatamente emolizzati Input nominale (copie/ml) Numero di reattivi Numero di test individuali 40 90 120 140 160 200 28 38 64 64 65 65 43 44 66 66 66 66 Analisi PROBIT Tasso di sensibilità (%) Concentrazione (copie/ml) 95 117,4 % Reattivi Limite inferiore di confidenza al 95% (monolaterale) 65,1 86,4 97,0 97,0 98,5 98,5 Limite inferiore di confidenza al 95% (copie/ml) 97,8 51,5% 74,9% 90,8% 90,8% 93,0% 93,0% Limite superiore di confidenza al 95% (copie/ml) 150,7 Tabella 11 Riepilogo della sensibilità analitica con Roche WNV Secondary Standard in una matrice di campioni altamente emolizzati Input nominale (copie/ml) Numero di reattivi Numero di test individuali 200 330 400 425 450 525 39 43 43 43 43 43 44 44 44 43* 44 44 Analisi PROBIT Tasso di sensibilità (%) Concentrazione (copie/ml) 95 365,1 % Reattivi Limite inferiore di confidenza al 95% (monolaterale) 88,6 97,7 97,7 100,0 97,7 97,7 Limite inferiore di confidenza al 95% (copie/ml) 285,6 77,6% 89,7% 89,7% 93,3% 89,7% 89,7% Limite superiore di confidenza al 95% (copie/ml) 873,0 * Un replicato non valido Sensibilità Sessanta campioni cadaverici di plasma in EDTA, selezionati in modo random, non reattivi all'RNA di WNV e classificati in base al livello di emolisi [campione moderatamente emolizzato (colore dal giallo paglierino al rosa) o campione altamente emolizzato (colore dal rosso al rosso scuro o il marrone)] sono stati suddivisi equamente in 5 gruppi di 12 campioni ciascuno. I campioni di ogni gruppo sono stati arricchiti con il target virale di WNV utilizzando un isolato clinico diverso per gruppo e raggiungendo così una concentrazione finale di circa 570 copie/ml (3 x 190 copie/ml) per i campioni cadaverici moderatamente emolizzati e di circa 990 copie/ml (3 x 330 copie/ml) per i campioni cadaverici altamente emolizzati. Questi campioni arricchiti con l'RNA di WNV sono stati analizzati subito dopo l'aggiunta del target virale e ad un mese di distanza, dopo essere stati conservati a ≤ -80°C. In tutti i casi, prima di eseguire il test i singoli campioni sono stati diluiti manualmente con rapporto 1:5 con il diluente cobas® TaqScreen per campioni cadaverici. Quattro campioni dei dodici che costituivano ogni gruppo sono stati analizzati con un lotto del kit di reagenti. Nello studio sono stati utilizzati tre lotti del kit di reagenti, quindi complessivamente sono stati analizzati 20 campioni per ogni lotto del kit di reagenti. Il tasso di reattività al test cobas® TaqScreen West Nile Virus è risultato essere del 100% [IC 95%: 94 - 100%] per tutti i campioni cadaverici che sono stati analizzati in questo studio. I risultati del test di sensibilità sono riassunti nella Tabella 12. 05462975001-03IT 30 Doc Rev. 3.0 Tabella 12 Riepilogo dei dati di sensibilità per il virus WNV con campioni cadaverici moderatamente emolizzati (MH) e con campioni cadaverici altamente emolizzati (HH) Lotto del kit Tipo di campione cadaverico WNV MH HH MH HH MH HH MH + HH 14/14 6/6 13/13 7/7 16/16 4/4 60/60 Lotto n. 1 Lotto n. 2 Lotto n. 3 Totale 100% [IC 95% 94,0 - 100%] Sensibilità PERFORMANCE CLINICA - CAMPIONI DI DONATORI VIVENTI Sensibilità clinica - Analisi di campioni confermati positivi al virus del Nilo occidentale La sensibilità clinica del test cobas® TaqScreen West Nile Virus è stata valutata analizzando individualmente 315 campioni clinici positivi al virus del Nilo occidentale. La positività all'RNA del virus WNV era stata accertata in precedenza eseguendo un test degli acidi nucleici sui campioni, in base a uno dei tre metodi disponibili. Lo studio si è svolto in 3 laboratori di analisi. In ogni laboratorio sono stati analizzati approssimativamente 100 campioni, sia non diluiti che diluiti con rapporto 1:6, utilizzando tre diversi lotti del test cobas® TaqScreen West Nile Virus. Lo studio ha rivelato che la sensibilità del test cobas® TaqScreen West Nile Virus è del 100% (IC 95%: 98,8-100,0) per i campioni non diluiti e del 97,5% (IC 95%: 95,1-98,9) per i campioni diluiti con rapporto 1:6 (Tabella 13). Gli otto (8) campioni non reattivi, diluiti con rapporto 1:6, sono stati ottenuti da campioni non diluiti con cariche virali inferiori a 100 copie/ml, determinate mediante il saggio PCR del National Genetics Institute per la determinazione quantitativa del virus WNV. Tabella 13 Sensibilità clinica di campioni confermati positivi al virus del Nilo occidentale Numero di campioni analizzati Numero di campioni reattivi Numero di campioni non reattivi Sensibilità (%) Non diluito 314* 314 0 Diluito 1:6 315 307 8 Sensibilità (limite confidenza 95%) Limite inferiore Limite superiore 100 98,8 100,0 97,5 95,1 98,9 * Un campione non diluito non valido 05462975001-03IT 31 Doc Rev. 3.0 Specificità clinica La specificità clinica del test cobas® TaqScreen West Nile Virus è stata valutata analizzando donazioni di sangue intero selezionate in modo random presso sei laboratori esterni. Sono stati analizzati campioni singoli e pool di sei campioni. Nello studio sono stati utilizzati tre diversi lotti del test cobas® TaqScreen West Nile Virus. La specificità clinica del test cobas® TaqScreen West Nile Virus è stata calcolata come percentuale (intervallo di confidenza binomiale bilaterale esatto al 95% [IC]) di donatori negativi al virus WNV che avevano espresso risultati non reattivi al kit cobas® TaqScreen West Nile Virus Test. I donatori valutabili erano 86.935 per i test in pool e 10.375 per i test individuali. Risultati dei test in pool Nella Tabella 14 è illustrato il calcolo della specificità clinica del test cobas® TaqScreen West Nile Virus per gli 86.935 donatori valutabili dai test in pool. In questo studio, la specificità clinica del test cobas® TaqScreen WNV per i test in pool è stata del 100% (86.935 su 86.935; IC 95% = 99,996% -100,000%). Tabella 14 Specificità clinica del test cobas® TaqScreen WNV - Test in pool Punto finale WNV* Positivi Reattivi a WNV 0 (n/a) Non reattivi a WNV 0 (n/a) Totale Specificità clinica (Limite di confidenza al 95%) 0 Stato donatore WNV** Presunti Negativi positivi*** 0 0 (n/a) (0,000%) 86.935 0 (n/a) (100,000%) 0 86.935 100,000% (99,996%, 100,000%) Sconosciuti**** Totale 0 (n/a) 0 0 (n/a) 86.935 0 86.935 ® * Il punto finale WNV è stato derivato dal risultato valido del test cobas TaqScreen West Nile Virus, ottenuto analizzando la prima donazione mediante l'algoritmo dei test in pool. ** Lo stato del donatore WNV è stato assegnato automaticamente in base agli schemi di reattività al test in occasione della prima donazione e, qualora disponibili, anche nelle donazioni successive. *** Lo stato di presunta positività doveva essere assegnato automaticamente ai donatori WNV che non avessero donazioni di ® follow-up per lo studio ma che avessero ottenuto un risultato di reattività al test cobas TaqScreen West Nile Virus in occasione della prima donazione e almeno 1 risultato di reattività/positività nella prima donazione in relazione a saggi di fonti di plasma alternative, saggi NAT (amplificazione degli acidi nucleici) alternativi o saggi IgM. **** Coloro che sono stati classificati con lo stato "donatore WNV ignoto" avevano un numero insufficiente di risultati dei test per poter conseguire lo stato di donatore WNV. La specificità dei pool del test cobas® TaqScreen West Nile Virus per le prime donazioni è del 99,986% (14.387 su 14.389; IC 95% = 99,950% - 99,998%). Due pool di 6 campioni sono risultati reattivi al test cobas® TaqScreen West Nile Virus, ma dalla scomposizione dei pool si è verificato che entrambi contenevano campioni individualmente non reattivi al test cobas® TaqScreen West Nile Virus. La percentuale di risultati non validi è del 2,3% ed è imputabile ad errori strumentali o inerenti ai controlli interni per i campioni in pool. 05462975001-03IT 32 Doc Rev. 3.0 Risultati dei test sui campioni individuali Nella Tabella 15 è illustrato il calcolo della specificità clinica del test cobas® TaqScreen West Nile Virus per i 10.375 donatori che sono stati analizzati da test individuali. Lo studio ha rivelato che la specificità clinica del test cobas® TaqScreen West Nile Virus per i test sui campioni individuali è del 100% (10.375 su 10.375; IC 95% = 99,964% -100,000%). La percentuale di risultati non validi è dell'1,1% ed è imputabile ad errori strumentali o inerenti i controlli interni per i campioni individuali. Tabella 15 Specificità clinica del test cobas® TaqScreen WNV - Test di campioni individuali Punto finale WNV* Positivi Reattivi a WNV 0 (n/a) Non reattivi a WNV 0 (n/a) Totale Specificità clinica (Limite di confidenza al 95%) 0 Stato donatore WNV** Presunti Negativi positivi*** 0 0 (n/a) (0,000%) 10.375 0 (n/a) (100,000%) 0 10.375 100,000% (99,964%, 100,000%) Sconosciuti**** 0 (n/a) Totale 0 0 (n/a) 10.375 0 10.375 ® * Il punto finale WNV è stato derivato dal risultato valido del test cobas TaqScreen West Nile Virus, ottenuto analizzando la prima donazione mediante l'algoritmo dei test in pool. ** Lo stato del donatore WNV è stato assegnato automaticamente in base agli schemi di reattività al test in occasione della prima donazione e, qualora disponibili, anche nelle donazioni successive. *** Lo stato di presunta positività doveva essere assegnato automaticamente ai donatori WNV che non avessero donazioni di ® follow-up per lo studio ma che avessero ottenuto un risultato di reattività al test cobas TaqScreen West Nile Virus in occasione della prima donazione e almeno 1 risultato di reattività/positività nella prima donazione in relazione a saggi di fonti di plasma alternative, saggi NAT (amplificazione degli acidi nucleici) alternativi o saggi IgM. **** Coloro che sono stati classificati con lo stato "donatore WNV ignoto" avevano un numero insufficiente di risultati dei test per poter conseguire lo stato di donatore WNV. 05462975001-03IT 33 Doc Rev. 3.0 RIFERIMENTI 1. Petersen L.R., Marfin, A.A. A primer for the clinician, Ann Intern Med 2002; 137:173-179. 2. Kramer, L.D., Bernard, K.A. West Nile Virus in the western hemisphere, Curr Opin Infect Dis 2001; 14(5):519-525. 3. Longo, M.C., Berninger, M.S., Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene 93:125-128. 4. Savva, R., McAuley-Hecht, K., Brown, T., Pearl, L. 1995. The structural basis of specific base-excision repair by uracil-DNA glycosylase. Nature 373:487-493. 5. Mol, C. D., Arvai, A. S., Slupphaug, G., Kavli, B., Alseth, I., Krokan, H. E., Tainer, J. A. 1995. Crystal structure and mutational analysis of human uracil-DNA glycosylase: structural basis for specificity and catalysis. Cell 80:869-878 6. Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S., Griffith, R. 1992. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology (N Y). 10:413-417. 7. Heid, C.A., Stevens, J., Livak, J.K., Williams, P.M. 1996. Real time quantitative PCR. Genome Research 6:986-994. 8. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. (eds.). 1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories HHS Publication Number (CDC) 93-8395. 9. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections. Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29-A3 Wayne, PA:CLSI, 2005. 10. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition. 2000. 704 pp. 11. Saldanha, J., Shead, S., Heath, A., Drebot, M., and the West Nile Virus Collaborative Group. 2005. Collaborative study to evaluate a working reagent for West Nile virus RNA detection by nucleic acid testing. Transfusion 45:97-102. 12. Briese, T., Rambaut, A., Pathmajeyan, M., Bishara, J., Weinberger, M., Pitlik, S., Lipkin, W.I. 2002. Phylogenetic analysis of human isolate from the 2000 Israel West Nile virus epidemic. Emererging Infectious Diseases 8(5):528-531. 13. Hayes, C.G., West Nile Virus: Uganda, 1937, to New York City, 1999. Annals of the New York Academy of Sciences, 951:25-37. 14. Ji, J., Chen, X., Manak, M., 2001. TaqMan® Probe Assay for the Detection of West Nile Virus, 16th Annual San Diego Conference New Technologies for Molecular Diagnostics. Clinical Chem. 2001; 47:2078-2085. (Poster 11). 05462975001-03IT 34 Doc Rev. 3.0 Revisione del documento Doc Rev. 3.0 01/2013 La Sezione A delle ISTRUZIONI PER L'USO è stata modificata e ora riporta le seguenti istruzioni: Miscelare i controlli per inversione almeno 3 volte, evitando la formazione di bolle d'aria (come descritto più avanti). • Miscelare per inversione significa capovolgere il controllo a testa in giù e riportarlo a testa in su ogni volta. • Durante ogni inversione mantenere il controllo in ognuna delle posizioni per almeno 2 secondi: in altre parole, capovolgere il controllo a testa in giù e mantenerlo in questa posizione per 2 secondi, quindi riportare il controllo a testa in su e mantenerlo in questa posizione per 2 secondi. Alla sezione "Strumentazione e software per il sistema cobas s 201" sono state apportate le seguenti modifiche: • Rimossa la configurazione del sistema • Rimossa la versione del software AMPLILINK • Rimosse le versioni del software PDM • Aggiunto riferimento al file TDF WNV per il test cobas® TaqScreen West Nile Virus • Rimosso il paragrafo "Elenco dei problemi noti per il sistema cobas s 201 Configurazione C o Configurazione C (MR1)" • Aggiornata la configurazione per il Manuale operativo del sistema Aggiornato il paragrafo "Pipettamento e creazione di pool di campioni": • Procedura per la creazione di pool secondari • Creazione automatica degli ordini • Rimosso il riferimento alla richiesta "Repeat Needed" Aggiornati gli indirizzi del Fabbricante e del Mandatario. Aggiornate le descrizioni della pagina dei simboli armonizzati al termine del foglio illustrativo. Aumentate le dimensioni dei simboli di pericolo. Per ulteriori domande e chiarimenti, è possibile rivolgersi al rappresentante Roche locale. 05462975001-03IT 35 Doc Rev. 3.0 Roche Molecular Systems, Inc. 1080 US Highway 202 South Branchburg, NJ 08876 USA Licenza USA n°1636 Roche Diagnostics (Schweiz) AG Industriestrasse 7 6343 Rotkreuz, Switzerland Roche Diagnostics 2, Avenue du Vercors 38240 Meylan, France Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Straße 116 68305 Mannheim, Germany Distributore in Italia: Roche Diagnostics S.p.A. Viale G. B. Stucchi 110 20052 Monza, Milano, Italy Distributed by Roche Diagnostics, SL Avda. Generalitat, 171-173 E-08174 Sant Cugat del Vallès Barcelona, Spain Distribuidor em Portugal: Roche Sistemas de Diagnósticos Lda. Estrada Nacional, 249-1 2720-413 Amadora, Portugal Roche Diagnostica Brasil Ltda. Av. Engenheiro Billings, 1729 Jaguaré, Building 10 05321-010 São Paulo, SP Brazil COBAS, COBAS S, TAQMAN, TAQSCREEN, AMPLILINK, AMPERASE e AMPLIPREP sono marchi di Roche. MICROLAB è un marchio di Hamilton Company. ARMORED RNA è una tecnologia brevettata sviluppata da Ambion, Inc. e da Cenetron Diagnostics LLC. Brevetti USA #5,677,124, #5,919,625 e #5,939,262 e brevetti in corso di registrazione. ARMORED RNA è un marchio di Ambion e Cenetron. PROCLIN è un marchio di Rohm and Haas Company. MICROCIDE SQ è un marchio di Global Biotechnologies, Inc. I coloranti cianino di questo prodotto sono coperti da brevetto di proprietà di GE Healthcare Bio-Sciences Corp. e Carnegie Mellon University. Sono stati concessi in licenza a Roche esclusivamente per l'uso nei componenti dei kit di ricerca e di diagnostica in vitro. Qualsiasi impiego di questi kit per scopi diversi dalla ricerca o dalla diagnostica in vitro dovrà essere approvato tramite il rilascio di licenze secondarie da parte di GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, New Jersey (U.S.A.) e di Carnegie Mellon University, Pittsburgh, Pennsylvania (U.S.A.). Copyright 2013 Roche Molecular Systems, Inc. Tutti i diritti riservati. 01/2013 05462975001-03 Doc Rev. 3.0 05462975001-03IT 36 Doc Rev. 3.0 I seguenti simboli appaiono su tutte le confezioni di prodotti diagnostici PCR di Roche. Software ausiliario Dispositivo medico-diagnostico in vitro Mandatario nella Comunità Europea Limite inferiore dell'intervallo assegnato Foglio di dati del codice a barre Fabbricante Codice del lotto Conservare al buio Rischio biologico Sufficiente per Numero di catalogo Limiti di temperatura SW Consultare le istruzioni per l'uso File di definizione del test TDF Contenuto del kit Limite superiore dell'intervallo assegnato Distribuito da Utilizzare entro Solo per valutazione delle prestazioni IVD Questo prodotto è conforme ai requisiti della Direttiva Europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro. 05462975001-03IT 37 Doc Rev. 3.0
