La raccolta di campioni per la ricerca di HCV

La raccolta di campioni per la ricerca di HCV-RNA
su plasma da avviare al frazionamento industriale:
studio di fattibilità
Claudio Velati1, Mauro Girotto2, Mario Piani3, Francesco Picardi4, Guido
Scudeller5, Umberto Bodini6 Gianfranco Erba7, Piero Borzini8, Raffaele
Borsotti9, Maria Orlando10
Servizi di Immunoematologia e Trasfusione di: Sondrio1, Ivrea2, Ancona23, Urbino34, Bergamo5, Cremona6,
Lecco6, Casale Monferrato8, Domodossola9, Laboratorio Biochimica Clinica dell’Istituto Superiore di Sanità10
The European Committee for Proprietary Medicinal
Products (CPMP) recommended, in March 1998, the
introduction of nucleic acid amplification technology
(NAT) for detection of HCV RNA in plasma pools for
the batch release of plasma-derived products.
The Istituto Superiore di Sanità (ISS), the
competent authority in Italy for the batch release of
plasma-derivatives, proposed a feasibility study to
verify the possibility of the manufacturer's pre-testing
on mini-pools of samples, representative of single
blood or plasma donation, to avoid the loss of a
complete manufacturing batch of plasma and to allow
the identification of the donor in case of a positive
NAT test result.
The study has been performed in nine
Transfusional Services of three different Regions
(Lombardia, Piemonte, Marche), where two different
sampling strategies have been tried: first, blood
sample collection in a specific tube and, second,
preparation of a fragment of the blood or plasma
collection bag. 13,931 units of plasma (derived from
whole blood separation or from plasmapheresis
procedures) were collected following these methods
and all the organisational procedures to allow NAT
testing of mini-pools of plasma and single positive
donor identification.
The study showed that only specific and dedicated
blood sample collection could permit an accurate minipool testing by the manufacturer, but demonstrated
also that, at present, it seems impossible to extend
this sampling method, or any other, at a national level,
because of the high number of sites where blood is
collected and manufactured and the insufficient level
of technological support (i.e. barcode sample
identification). The implementation of a departmental
model for the Italian blood transfusion system is
Ricevuto: 18 settembre 1999 – Accettato: 22 ottobre 1999
Corrispondenza:
Dott. Claudio Velati
Servizio di Immunoematologia e Trasfusione
Ospedale di Sondrio
Via Stelvio, 25
23100 SONDRIO
essential in order to take advantage of the latest
developments in advanced technology and fullyengineered procedures as well as ensuring the highest
levels of safety in transfusion therapy.
Parole chiave: tecniche di amplificazione genica (NAT),
HCV-RNA, mini-pool
Key Words: nucleic acid amplification technology (NAT),
HCV-RNA, mini-pools
Introduzione
La sicurezza trasfusionale é assicurata da differenti misure: la selezione accurata di donatori volontari, periodici e non remunerati, l'esecuzione di test di
laboratorio di elevata sensibilità su tutte le unità prelevate, l'utilizzo di materiale e di condizioni operative
idonee, la messa in atto di misure atte a garantire il
riconoscimento univoco del paziente e delle unità, la
rimozione selettiva e la inattivazione virale degli
emocomponenti, nonché una corretta politica di buon
uso del sangue.
In riferimento alla trasmissione di malattie virali
con la trasfusione di emocomponenti o plasmaderivati,
il rischio è, attualmente, legato alla possibilità di prelevare donatori che non presentino ancora marcatori
sierologici di infezione a causa di un contatto molto
recente (periodo finestra), oppure soggetti portatori
del virus che non sieroconvertono o infettati da varianti virali che portano alla produzione di anticorpi
non riconosciuti dai test sierologici oggi disponibili1-4.
La applicazione alla ricerca virale di tecniche di
amplificazione degli acidi nucleici (NAT) consente di
individuare direttamente l'organismo responsabile del-
LA TRASFUSIONE DEL SANGUE vol. 45- num. 2 marzo-aprile 2000 (89-95)
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C. Velati et al.
l'infezione, anche con cariche virali molto limitate, e
porta ad una riduzione del periodo finestra e, quindi,
ad una ulteriore riduzione del rischio trasfusionale.
Tale riduzione appare particolarmente rilevante per
il virus dell'epatite C (HCV) il cui periodo finestra
verrebbe ridotto, con l'utilizzo di NAT, da circa 80 a
21 giorni, mentre per il virus B e per l'HIV tale riduzione é meno significativa (rispettivamente, da 56 a
25 giorni e da 22 a 11 giorni)5,6.
Le tecniche NAT non sono, a tutt'oggi, disponibili
con gli stessi requisiti di standardizzazione, automazione e costo delle tecniche immunoenzimatiche7, ma
da alcuni anni sono in corso in numerosi Paesi
sperimentazioni per la valutazione della applicabilità
di tecniche NAT alla selezione dei donatori di sangue
ed emocomponenti, mentre le case produttrici di
diagnostici hanno accelerato la ricerca per rendere
disponibili sistemi affidabili in tale settore8-10. Nel marzo
1998 il Committee for Proprietary Medicinal Products
(CPMP)11 ha raccomandato che i prodotti plasmaderivati
immessi sul mercato a partire dal 1 luglio 1999 debbano
essere ottenuti da plasma risultato negativo a test per la
ricerca di HCV-RNA effettuati con tecniche di amplificazione degli acidi nucleici. La stessa raccomandazione suggerisce, inoltre, che, al fine di evitare l'eliminazione di grandi quantità di plasma e di consentire l'individuazione del
donatore in caso di riscontro positivo, le ditte produttrici
di farmaci plasmaderivati sviluppino strategie di ricerca di
HCV-RNA su mini-pools di plasmi, o di campioni di plasma corrispondenti alle singole unità. Il Ministero della
Sanità ha recepito la raccomandazione nel marzo del 199912.
La raccolta di campioni pilota di plasma da accompagnare ad ogni unità costituisce, al momento, un problema
di peso rilevante per le strutture trasfusionali a causa delle
conseguenti necessità di ulteriori spazi per il congelamento,
per l'aggravio in operatività per il personale e per le scarse
garanzie di affidabilità, ai fini della ricerca di RNA virale,
dovute alla manipolazione dei campioni, se vengono utilizzate provette tradizionali. A livello comunitario, l'Istituto Superiore di Sanità (ISS) é tra gli organismi indicati come
responsabile del rilascio dei singoli lotti di farmaci
plasmaderivati (controllo di Stato) immessi sul mercato
europeo. L'ISS, in accordo con i rappresentanti delle Regioni e con l'industria italiana attualmente convenzionata
con le Regioni per la produzione di farmaci plasmaderivati,
ha proposto uno studio avente gli obiettivi specifici di:
1) valutare le diverse modalità di campionamento, in termini sia di adeguatezza sia di fattibilità presso le strutture trasfusionali;
2) indicare sulla base dei risultati ottenuti i requisiti operativi standard a livello nazionale.
90
Metodologia e casistica
Centri partecipanti
Presso l'Istituto Superiore di Sanità é stata concordata
una fase pilota nella quale attivare un numero limitato di
Servizi Trasfusionali di tre Regioni: Lombardia, Marche e
Piemonte.
Per la Regione Lombardia i Servizi di Immunoematologia
e Trasfusione di Sondrio, di Cremona, di Bergamo e di Lecco, per la Regione Marche i Servizi di Immunoematologia e
Trasfusione di Ancona e di Urbino, per la regione Piemonte
i Servizi di Immunoematologia e Trasfusione di Ivrea, di
Casale Monferrato e di Domodossola.
È stata chiamata a partecipare all'elaborazione del progetto la ditta produttrice Farma-Biagini (Castelveccio Pascoli, Lucca). Le funzioni di coordinamento sono state svolte
dal Centro Regionale Emoderivati (CRE) della Lombardia.
Disegno dello studio
Valutare - sia presso i Servizi Trasfusionali, sia presso
la Farma-Biagini - le condizioni operative determinate da
due diverse modalità di campionamento del plasma da inviare al frazionamento:
A) campionamento attraverso saldatura del tubo in plastica di deflusso del plasma alla sacca di raccolta;
B) campionamento attraverso riempimento di 2 provette
da inviare insieme con la sacca di raccolta di plasma.
Caratteristiche generali del protocollo operativo:
a) applicazione routinaria delle procedure previste a tutte
le unità di plasma da avviare al frazionamento;
b) invio per ogni unità (plasma da separazione e plasma da
aferesi) di due campioni di plasma con quantità ottimale
di 1-1,5 mL e minima di 0,7 mL cadauno;
c) raccolta dei campioni con garanzie di sterilità;
d) congelamento dei campioni secondo le medesime modalità e tempistica dell'unità di plasma (entro 6 ore dalla
raccolta);
e) identificazione di tutti i campioni mediante codice a barre uguale a quello riportato sulla sacca e sulla bleeding
list: per le sacche non provviste di campione o con campione insufficiente era prevista l'esclusione dallo studio e l'avvio, presso la Farma-Biagini, alle partite di plasma non sottoposte a NAT.
NAT per HCV su mini-pool di plasma
Caratteristiche specifiche del protocollo operativo:
A - campionatura con tubo di deflusso alla sacca di raccolta
1. Raccolta di 2 segmenti del tubo di plastica di deflusso
del plasma, saldatura senza separazione degli stessi
dalla sacca, congelamento, conservazione e invio insieme con la sacca.
2. Su ciascun segmento applicazione di una etichetta con codice a barre come sopra indicato - disposta in
senso longitudinale per consentirne la lettura con uno
scanner.
B - campionatura con provette
1. Raccolta di 2 campioni di sangue in provette sterili e
sotto vuoto con sistema "chiuso": tali provette non
devono in nessun momento essere aperte.
Per la sperimentazione sono state utilizzate provette Vacutainer PPT con EDTA, approvate dall' FDA
per ricerche NAT, che consentono la separazione del
sangue e il congelamento senza alcuna manipolazione. Le provette sono state gentilmente fornite dalla
Ditta Becton Dickinson Italia SpA (Milano).
2. Apposizione su ogni provetta di etichette - con codice
a barre come sopra indicato - disposte in senso
longitudinale per consentirne la lettura con uno scanner.
3. Centrifugazione delle provette secondo le indicazioni
del produttore (preferibilmente entro 2 ore dal prelievo,
a 18-25 °C, in centrifuga con cestello basculante, a 1100
g per 10 minuti) e congelamento secondo le medesime
tempistiche del plasma.
4. Confezionamento delle provette separatamente
dalle unità, ma con identificazione che permetta
l'immediato collegamento del contenitore delle provette con quello contenente le relative unità di plasma.
Per i SIT delle Marche e del Piemonte é stata prevista la campionatura con provette. In Lombardia, per i SIT
di Sondrio e di Cremona é stata prevista la campionatura
con tubo di deflusso, mentre per i centri di Bergamo e di
Lecco é stato previsto un utilizzo per il 50% della campionatura con provette e per il restante 50% la campionatura
con tubo di deflusso. La Farma-Biagini prevedeva la ricerca di HCV-RNA su pool di campioni di plasma (segmenti/
provette) secondo il seguente schema di pooling:
pool primitivo: 30 campioni corrispondenti ad altrettante sacche di plasma
pool secondario: 14 campioni di pool primitivo (un pool
secondario è costituito da campioni provenienti da 420 unità
di plasma).
In caso di esito positivo del test, la Farma-Biagini avreb-
be dovuto procedere alla identificazione della unità di plasma positiva e comunicarne l'esito al SIT interessato.
Per la ricerca di HCV-RNA sono stati utilizzati i reagenti
della ditta Roche Diagnostici (Macherio, MI) (Cobas
Amplicor Hepatitis C Virus test) con modifiche validate
dall'Istituto Superiore di Sanità.
Durata dello studio
È stata prevista una durata di 60 giorni presso ogni
centro a partire da una data definita.
Valutazione dei risultati
Sono stati concordati i seguenti criteri di valutazione
dei risultati:
- idoneità del campionamento attraverso le due modalità
(segmento-provetta) e in riferimento alle diverse
tipologie di sacca di raccolta;
- fattibilità presso le strutture trasfusionali delle due
modalità di campionamento;
- fattibilità e affidabilità della ricerca di HCV-RNA presso
la Farma-Biagini in riferimento ai due diversi
campionamenti, alla identificazione del campione e alla
automazione della procedura;
- valutazione delle risorse umane e tecnologiche da impiegare;
- valutazione dei flussi operativi e informativi strutture
trasfusionali/Farma-Biagini.
Risultati
Lo studio é stato concluso in tutti i centri coinvolti
entro il mese di febbraio 1999.
Sono state raccolte nel periodo convenuto complessivamente 13.931 unità di plasma: 6.692 con campionatura
con provette e 7.239 con segmenti.
La tabella I riporta il numero di unità di plasma raccolte
suddiviso per tipologia di campionamento e per tipologia
di plasma (da separazione e da aferesi).
La tabella II riporta gli stessi dati per la Lombardia e la
tabella III riporta i dati del Piemonte e delle Marche dove é
stata effettuata la sola campionatura con provette.
Presso il SIT di Sondrio, che ha utilizzato esclusivamente il campionamento con segmenti del tubo di raccolta,
é stata effettuata anche una valutazione della qualità del
campionamento.
Si possono, infatti, incontrare difficoltà nella
predisposizione di un sufficiente quantitativo di plasma in
funzione del tipo di sacca utilizzata (tripla, quadrupla, da
aferesi) e della tipologia di emocomponenti preparati (solo
emazie concentrate e plasma, asportazione del buffy coat,
91
C. Velati et al.
Tabella I: numero di unità di plasma, da aferesi e da separazione, raccolte nelle tre Regioni ai fini dello studio e
suddivise per modalità di campionatura (con provette o
con segmenti del tubo di raccolta)
Tabella II: numero di unità di plasma, da aferesi e da separazione, raccolte in Lombardia ai fini dello studio e suddivise per modalità di campionatura (con provette o con
segmenti del tubo di raccolta)
n unità n unità totali campionamento
plasma da aferesi
1.258
plasma da separazione 5.434
6.692
plasma da aferesi
2.762
plasma da separazione 4.477
7.239
Totale unità
n unità n unità totali campionamento
provette
plasma da aferesi
660
plasma da separazione 3.112
3.772
provette
segmenti
plasma da aferesi
2.762
plasma da separazione 4.477
7.239
segmenti
13.931
Totale unità
Tabella III: numero di unità di plasma, da aferesi e da
separazione, raccolte in Piemonte e nelle Marche ai fini
dello studio. In queste regioni é stata effettuata la sola
campionatura con provette
11.011
Tabella IV: distribuzione in valore percentuale del numero di unità, da aferesi e da separazione, dotate di un
campionamento completo (2 segmenti del tubo di raccolta),
incompleto (1 solo segmento) o assente (nessun segmento).
unità con
unità con unità senza
2 segmenti 1 segmento segmenti
%
%
%
n unità
Piemonte
Marche
Plasma da aferesi
239
359
plasma da aferesi
96
2
2
Plasma da separazione
1397
925
plasma da separazione
68
28
4
Totale unità
1636
1284
Totali (medie)
79
18
3
avrebpreparazione anche di concentrati piastrinici): la lunghezza del segmento di tubo di connessione utilizzabile
risulta, infatti, molto diversa. È stato considerato idoneo il
campionamento con due segmenti, incompleto se l'unità di
plasma era dotata di un solo segmento, insufficiente se
priva di segmenti. La tabella IV riporta la percentuale di
unità risultate con campionamento idoneo, incompleto,
assente. In merito ai criteri concordati per la valutazione
dello studio, il parere dei diversi SIT partecipanti allo studio può essere sintetizzato come segue.
Idoneità del campione
- Il campionamento effettuato con segmenti del tubo di
deflusso della sacca presenta il vantaggio della
univocità del campione di plasma, in quanto in continuità fisica con la unità raccolta.
Si presentano, invece, difficoltà nel dotare ogni unità
di un adeguata campionatura: le sacche multiple attualmente in uso, se destinate alla preparazione di concentrati piastrinici, non consentono di raccogliere un campione idoneo, in quanto il segmento di tubo che rimane
disponibile è troppo esiguo, come dimostrato dalla valutazione effettuata a Sondrio. Nelle fasi di manipolazione delle unità, successive al congelamento, si sono
osservate difficoltà nel conservare l'integrità del segmento, in quanto molto fragile, e una facilità allo
scongelamento parziale favorito dalla sua sottigliezza
92
-
rispetto alla maggiore massa della sacca.
Il campionamento effettuato con provette é standardizzato, può essere effettuato per ogni tipo di donazione
e, utilizzando la provetta PPT, consente di mantenere la
sterilità del prelievo.
Sono state segnalate difficoltà nella standardizzazione delle procedure di centrifugazione, specie se
la raccolta di emocomponenti viene effettuata in
sedi periferiche non dotate di laboratorio.
Fattibilità presso le strutture trasfusionali delle due
modalità di campionamento
La preparazione di segmenti comporta un aumento dei tempi operativi sia in sala prelievi sia nella fase
della separazione degli emocomponenti, ma una indubbia economicità.
L'utilizzo di provette é sicuramente più agevole dal
punto di vista operativo, mentre viene segnalata qualche difficoltà di stoccaggio per necessità di maggiori
spazi. È, inoltre, da segnalare il maggior costo.
Fattibilità e affidabilità della ricerca di HCV-RNA
presso la Farma-Biagini in riferimento ai due diversi campionamenti, alla identificazione del campione e alla automazione della procedura
La Farma Biagini non ha ritenuto di procedere
all'espletamento della ricerca di HCV-RNA sui campioni di plasma inviati, in primo luogo per una mani-
NAT per HCV su mini-pool di plasma
festa impossibilità di automatizzare la fase del pooling sui
segmenti e, in secondo luogo, per la mancanza, al momento, di una strutturazione capace di garantire il ritorno tempestivo delle informazioni ai Servizi Trasfusionali.
Valutazione delle risorse umane e tecnologiche da
impiegare
Presso i Servizi Trasfusionali é stato necessario
adeguare i sistemi di accettazione e di produzione di
etichette con codici a barre e riconsiderare i flussi
operativi nella fase della raccolta e della manipolazione delle unità con entrambe le modalità di
campionamento: tali maggiori impegni appaiono in
prevalenza legati ad una fase iniziale di riordino e
riassorbibili con le procedure a regime.
Per il campionamento con provette resta la necessità di una adeguata, se pur semplice, dotazione di
laboratorio (centrifuga con cestello basculante
debitamente tarata e controllata) o, più opportunamente, di una centralizzazione delle procedure.
Non é stato, invece, valutato l'impatto delle procedure più direttamente legate alla ricerca di HCV-RNA per i
motivi suddetti.
Valutazione dei flussi operativi e informativi strutture trasfusionali/Farma-Biagini
La fornitura di unità di plasma accompagnate da
campioni, secondo le modalità concordate, dai Servizi Trasfusionali alla Farma-Biagini non ha presentato
inconvenienti, fatta eccezione per la non completa
dotazione delle unità predisposte con campionatura
con segmenti. La possibilità del riconoscimento univoco campioni-sacche era assicurata dalla preselezione dei
centri partecipanti sulla base dell'utilizzo di codici a barre.
Non è, invece, stata valutata l'efficienza del flusso informativo di ritorno dalla ditta ai Servizi Trasfusionali, a causa
della mancata esecuzione dei test da parte dell'industria
produttrice.
Discussione
Il concetto di sicurezza trasfusionale, in considerazione delle vicende che hanno caratterizzato gli ultimi due
decenni di storia della Medicina Trasfusionale, viene spesso
identificato con la prevenzione del rischio di trasmissione
di malattie virali: deve essere sempre ricordato, invece, che
questo é solo uno degli aspetti che la sostanziano, insieme
con la rigorosa selezione del donatore periodico, volontario e non remunerato, con la predisposizione di adeguate
misure di separazione, rimozione selettiva e di inattivazione
virale degli emocomponenti e dei plasmaderivati e con l'applicazione di tutte le linee guida che derivano da una corretta politica di buon uso del sangue.
Il rischio residuo di trasmissione di malattie virali
con la trasfusione si é, in effetti, di molto ridotto5,6
con l'introduzione di test di screening sempre più sensibili e specifici, ma esiste una particolare attenzione
sia da parte dell'opinione pubblica, in particolare delle associazioni degli emopatici e dei politrasfusi, sia
da parte degli operatori del settore trasfusionale, a
utilizzare ogni misura che possa ridurre ulteriormente tale limite di rischio.
La applicazione di tecniche di amplificazione
genica alla diagnostica virale ha suscitato grande interesse: la ricerca diretta del materiale genico del virus consente, infatti, una diagnosi più precoce perché
non si deve attendere la risposta del sistema
immunitario del soggetto esaminato e a causa della
superiore sensibilità del metodo.
L'introduzione di tali metodiche nello screening dei
donatori di sangue necessita, però, di caratteristiche
di standardizzazione, di automazione e di un rapporto
costo/beneficio equiparabile a quello degli attuali test
immunoenzimatici e che non sono ancora raggiunte
dai sistemi al momento disponibili sul mercato.
A tali stimoli non sono insensibili le industrie produttrici di diagnostici che stanno operando per rendere disponibili, in tempi relativamente brevi, kit e
apparecchiature che garantiscano l'utilizzo di tecniche NAT in automazione completa, dall'estrazione del
DNA o RNA virale al risultato finale: questo sembra,
infatti, costituire il futuro approccio nell'ambito dello
screening delle singole donazioni di sangue ed
emocomponenti.
La raccomandazione CPMP del marzo 1998 introduce l'obbligo di utilizzare tecnologie NAT solo per
il batch release dei farmaci plasmaderivati ed esclusivamente in riferimento al virus dell'epatite C. Tali
aspetti trovano spiegazione nel fatto che tali farmaci
risultano dalla concentrazione di un elevato numero
di unità e che è, quindi, più probabile il riscontro di
una unità positiva che può inquinare un intero lotto,
nel fatto che il CPMP, che é un organismo dell'Unione Europea di valutazione farmacologica, risponde
anche ad esigenze di standardizzazione internazionale del mercato dei farmaci e nel fatto che la diagnosi
di infezione da HCV risente in misura sicuramente
più significativa dell'utilizzo della tecnologia NAT a
causa della maggiore entità della riduzione del periodo finestra rispetto ad altri virus.
Recentemente, in diversi Paesi, si è valutato l'utilizzo di
93
C. Velati et al.
metodiche NAT non solo finalizzate al batch release, ma
allo screening dei donatori alla fonte: in Germania, Svizzera, Austria e Olanda lo screening è già stato adottato, in
altri si prevede di introdurlo nel 2000 (Francia, Gran
Bretagna).
Il confronto su tale tematica é ancora ampio e risente delle diverse tradizioni e della specifica organizzazione del sistema trasfusionale nelle differenti
nazioni13,14.
L'Istituto Superiore di Sanità, nell'ambito dei suoi
compiti istituzionali e in collaborazione con i rappresentanti delle Regioni, ha promosso un primo studio
pilota per valutare l'impatto organizzativo che la raccomandazione CPMP poteva comportare nell'attuale
modello organizzativo del Servizio Trasfusionale in
Italia, caratterizzato da una grande numero di centri e
servizi, anche di piccole dimensioni, e dalla mancanza, spesso, di un momento solido di centralizzazione
regionale e nazionale15.
I risultati dello studio preliminare condotto nei nove
SIT italiani ha evidenziato che il sistema della campionatura attraverso segmenti non é utilizzabile ai fini
della ricerca di HCV RNA né da parte dell'industria
attraverso mini-pool di plasma, né da parte delle strutture trasfusionali per indagini di screening: la campionatura non é, infatti, effettuabile rigorosamente su
tutte le unità, non consente procedure in automazione
e pone problemi di appropriatezza delle procedure al
momento dello scongelamento e del taglio dei segmenti
(rotture, inquinamento, trasferimento del plasma in
contenitori appropriati per effettuare il saggio).
La predisposizione di una provetta dedicata alla ricerca
di RNA virale si é posta, pertanto, come preferibile, a condizione che tale provetta possieda le caratteristiche di quella
utilizzata nello studio: sterile, sotto vuoto, con gel di separazione tra plasma e parte corpuscolata del sangue che
permetta la conservazione del campione congelato senza
ulteriori manipolazioni.
L'adozione di tale provetta ha comportato, presso i SIT
partecipanti allo studio e nel breve periodo della
sperimentazione, qualche problema organizzativo in
merito alla predisposizione di adeguati spazi freddi, allo
stoccaggio e alla conservazione in modo da consentire
sempre la corrispondenza con le unità di plasma.
L'estensione immediata di tale procedura a tutte le
strutture trasfusionali avrebbe enfatizzato tali aspetti
e comportato problemi non irrilevanti di costi per le
singole Aziende Sanitarie, ma, soprattutto, avrebbe
contrastato in modo insanabile con le attuali modalità
operative della raccolta di sangue in una parte rilevante delle strutture trasfusionali italiane: il campione di
94
sangue, per essere idoneo alla ricerca di HCV-RNA deve,
infatti, essere tempestivamente centrifugato e congelato
entro sei ore e ciò risulta palesemente non effettuabile in
tutte le raccolte eseguite fuori da strutture trasfusionali
attrezzate o in giorni festivi nei quali la struttura trasfusionale
non é predisposta per la validazione biologica delle unità.
Ciò ha reso, di fatto, non applicabile nemmeno tale procedura in tempi rapidi e ha determinato l'adozione, da parte
della ditta produttrice di farmaci plasmaderivati, di strategie alternative che non consentono la possibilità di minipool e, quindi, comportano la eliminazione, in caso di riscontri positivi del test NAT, dell'intero batch di lavorazione (2.000-5.000 litri).
L'effettuazione dello studio ha, inoltre, evidenziato un
altro aspetto rilevante: la selezione dei Servizi Trasfusionali
coinvolti nel progetto pilota é stata effettuata anche sul
prerequisito che presso tali strutture fosse disponibile un
sistema organizzativo e informatico in grado di fornire unità di plasma, campioni e bleeding list identificabili in maniera univoca attraverso codici a barre. Secondo quanto
risulta dalle attuali modalità della consegna del plasma destinato al frazionamento industriale, meno del 50% del plasma - a livello nazionale - possiede tali requisiti e non permette, pertanto, procedure di pooling e di riconoscimento
della unità eventualmente positiva.
Lo studio di fattibilità condotto ha pertanto
evidenziato che, prima ancora dei problemi legati alla
esecuzione della metodica NAT in sé, il sistema
trasfusionale in Italia deve affrontare quelli legati alla non
adeguatezza della sua attuale organizzazione: si pone, infatti, con urgenza la necessità di un riordino che preveda,
per le attività legate alla raccolta e alla validazione biologica del sangue, degli emocomponenti e dei plasmaderivati,
una capacità operativa su scala più grande, su base territoriale ampia e con potenzialità tecnologiche adeguate.
Le indicazioni già formulate in passato e contenute nel
Piano Sanitario Nazionale 1998-2000 e nella bozza del 2°
Piano Sangue e Plasma Nazionale di un riordino delle strutture trasfusionali secondo un modello di tipo dipartimentale sembrano rispondere a tali necessità.
Tale adeguamento é oggi la premessa necessaria al
recepimento da parte del Servizio Trasfusionale in Italia di
qualunque innovazione tecnologica di avanguardia e alla
possibilità di operare in condizioni che garantiscano la
qualità e la sicurezza trasfusionale.
Riassunto
La raccomandazione del marzo 1998 del
Committee for Proprietary Medicinal Products europeo
NAT per HCV su mini-pool di plasma
(CPMP) prevede l'introduzione di tecniche di amplificazione genica (NAT) per la ricerca di HCV-RNA per il
batch release dei farmaci derivati da plasma umano.
L'Istituto Superiore di Sanità, responsabile del controllo di Stato su tali farmaci, ha promosso uno studio di
fattibilità per consentire l'utilizzo di strategie di
minipooling da parte della ditta produttrice.
Lo studio è stato condotto in nove Servizi Trasfusionali
di tre Regioni (Lombardia, Piemonte e Marche) e si è
basato sulla raccolta di campioni di plasma secondo diverse modalità (campione di sangue in provette dedicate
e raccolta di campioni di plasma nei segmenti del tubo
della sacca di raccolta).
Sono state raccolte secondo tali modalità 13.931 unità
di plasma (9.911 ottenuto da separazione da sangue intero e 4.020 da aferesi) e sono state predisposte tutte le
misure organizzative atte a consentire la ricerca di HCVRNA su minipool e la identificazione del donatore, fonte
dell'eventuale esito positivo del test. Lo studio ha
evidenziato che la campionatura con segmenti del tubo
di raccolta non è idonea ai fini della ricerca sistematica
di HCV-RNA su mini-pool di plasmi e che è necessario
disporre di un campione raccolto in modo specifico e in
apposita provetta.
È, però, anche emerso che, al momento, nessuna delle
due soluzioni è comunque adottabile su scala nazionale
per motivi correlati alla attuale organizzazione del Servizio Trasfusionale in Italia e, in particolare, alla sua
dispersione e alla insufficiente informatizzazione.
È auspicabile un riordino delle attività produttive
del sistema trasfusionale italiano che consenta una capacità operativa su scala territoriale ampia e dotazioni
tecnologiche adeguate, come è possibile in un modello di
tipo dipartimentale.
Ringraziamenti
Si ringrazia la Becton Dickinson per la generosa fornitura
delle provette Vacutainer PPT utilizzate nel progetto, le
Dottoresse S. Arrighi e C. Intaschi della Farma-Biagini per
la disponibilità dimostrata nella fase di predisposizione del
progetto e la Signora Graziella Zecca, del SIT di Sondrio,
per la revisione del testo.
Bibliografia
1) Lee HH, Allain JP: Genomic screening for blood-borne viruses
in transfusion settings Vox Sang, 74 (Suppl.2), 119,1998.
2) Vrielink H, van der Poel CL, Reesink HW et al.: Transmission
of hepatitis C virus by anti-HCV-negative blood transfusion.
Vox Sang, 68, 55, 1995.
3) Nubling CM, Seitz R, Lower J: Application of nucleic acid
amplification techniques for blood donation screening.
Infusionsther Transfusionsther, 25, 86, 1998.
4) Loussert-Ajaka I, Ly TD, Chaix ML et al.: HIV-1/HIV-2
seronegativity in HIV-1 subtype O infected patients. Lancet,
343, 1393,1994.
5) Schreiber GB, Busch MP, Kleinman SH, Korelitz JJ: The risk
of transfusion-transmitted viral infections. N Engl J Med, 334,
1685, 1996.
6) Kleinman SH, Busch MP, Korelitz JJ, Schreiber GB: The
incidence/window period model and its use to assess the
risk of transfusion-transmitted human immunodeficiency virus and hepatitis C virus infection. Trans Med Rew, 11,
155,1997.
7) Lelie PN, Cuypers HTM, van Drimmelen AAJ, Quint WGV:
Quality assessment of hepatitis C virus nucleic acid
amplification methods. Infusionsther Transfusionsther, 25,
102, 1998.
8) Cardoso MS, Koerner K, Kubanek B: Mini-pool screening by
nucleic acid testing for hepatitis B virus, hepatitis C virus and
HIV: preliminary results. Transfusion, 38, 905, 1998.
9) Yerly S, Pedrocchi M, Perrin L: The use of polymerase chain
reaction in plasma pools for the concomitant detection of
hepatitis C virus and HIV type 1 RNA. Transfusion, 38, 908,
1998.
10) Lefrère JJ, Coste J, Defer C et al.: Screening blood donation
for viral genomes: multicenter study of rel-time simulation
using pooled samples on the model of hepatitis C virus RNA
detection. Transfusion, 38, 915, 1998.
11) Committee for Proprietary Medicinal Products (CPMP): The
introduction of Nucliec Acid Amplification Technology (NAT)
for the detection of hepatitis C virus RNA in plasma pools
(CPMP/BWP/390/97). London, 24 March, 1998.
12) Decreto 29 marzo 1999 del Ministero della Sanità: Introduzione della ricerca di acido nucleico del virus dell'epatite C
mediante la tecnica di amplificazione genica nei pool di plasma umano utilizzati per la produzione di emoderivati. Gazz
Uff Repubb Ital, 15 aprile 1999.
13) Roth WK, Weber M, Seifried E: Feasibility and efficacy of
routine PCR screening of blood donations for hepatitis C
virus, hepatitis B virus and HIV-1 in a blood-bank setting.
Lancet, 353, 359,1999.
14) Reesink HW, Engelfriet CP: Consequences of nucleic acid
amplification testing for blood transfusion centres. Vox San,
74, 263, 1998.
15) Piccinini V, Paolizzi MG, Orlando M: Mappa delle strutture
trasfusionali esistenti sul territorio nazionale (aggiornamento
1997). Strumenti di riferimento 11, Istituto Superiore di Sanità,
1998.
95