DCM009i-0
Ed. 08/2012
Herpes Simplex Virus Type 1+2 IgM
per analisi di routine
Test immunoenzimatico per la determinazione qualitativa e semiquantitativa di anticorpi umani di classe
IgM diretti contro l'Herpes Simplex Virus di tipo 1+2 nel siero e plasma umano
LOT
IVD
Vedere etichetta esterna
DESTINAZIONE D’USO
Il kit ELISA Diametra Herpes Simplex Virus Type 1+2
IgM è un metodo immunoenzimatico per la
determinazione qualitativa e semiquantitativa di
anticorpi umani di classe IgM diretti control l'Herpes
Simplex Virus di tipo 1+2 nel siero e plasma umano.
Il kit Herpes Simplex Virus Type 1+2 IgM è destinato
al solo uso di laboratorio.
1. SIGNIFICATO CLINICO
L'Herpes simplex virus (HSV) è un virus a DNA con
capside (150-200 nm di diametro) appartenente alla
classe alphaherpesviridae.
Sulla base di considerazioni antigenicche, e di
differenze biochimiche e biologiche può essere diviso
in due sierotipi: HSV-1 e HSV-2.
L'uomo è il solo ospite conosciuto in natura e fonte
del virus. L'HSV di tipo 1 provoca in genere herpes
orale, mentre l'HSV di tipo 2 colpisce in genere la
zona genitale. Il più delle volte, HSV-1 e HSV-2 sono
inattivi, o "silenziosi", e non causano sintomi, ma
alcune persone infette hanno "focolai" di vesciche e
ulcere. Una volta infettati con HSV, le persone
rimangono infette per tutta la vita.
Gli Herpes Simplex Virus sono tra i più comuni agenti
infettivi dell'uomo, ed entrambi i tipi di HSV sembrano
capaci di infettare siti corporei simili. Una percentuale
elevata della popolazione adulta è sieropositiva (circa
il 90% di infezione HSV-1 è dipendente dalla
condizione socio-economica, il 10-30% è infetto da
HSV-2). L'infezione primaria da HSV-1 si verifica di
solito nella prima infanzia (da 6 a 18 mesi di età).
L'HSV-2 di solito produce sintomi lievi, e la maggior
parte delle persone non hanno sintomi riconosciuti.
2. PRINCIPIO DEL METODO
Il kit ELISA Diametra Herpes Simplex Virus Type 1+2
IgM è un metodo immunoenzimatico (ELISA).
I campioni dei pazienti sono diluiti con il diluente per
campioni e inoltre incubati con IgG-RF-Sorbent,
contenente anticorpi di classe IgG iper-immuni per
eliminare l'inibizione competitiva da IgG specifiche e
per eliminare i fattori reumatoidi. Questo pretrattamento evita risultati falsi negativi o falsi positivi. I
micropozzetti della fase solida sono rivestiti con
antigene HSV 1+2. I campioni diluiti dei pazienti e i
controlli pronti per l'uso sono pipettati in questi
Σ = 96 test
REF DKI009
pozzetti. Durante l'incubazione, gli anticorpi specifici
contro l'Herpes simplex virus di tipo 1+2 dei campioni
positivi e dei controlli si legano agli antigeni
immobilizzati.
Dopo la fase di lavaggio che rimuove il campione e il
materiale di controllo non legato, vengono dispensati
nei pozzetti anticorpi umani anti IgM coniugati a
perossidasi di rafano. Durante una seconda
incubazione questi anticorpi si legano specificamente
agli anticorpi IgM con conseguente formazione di
immunocomplessi enzimatici.
Dopo un secondo lavaggio per rimuovere il coniugato
non legato, gli immunocomplessi formati (in caso di
risultato positivo) vengono individuati mediante
incubazione con il substrato TMB e lo sviluppo di un
colore blu. Il colore blu si trasforma in giallo dopo
aver stoppato la reazione enzimatica con acido
solforico.
L'intensità di questo colore è direttamente
proporzionale alla quantità di anticorpi IgM specifici
per Herpes Simplex Virus di tipo 1+2 nel campione
del paziente. L'assorbanza a 450 nm viene letta con
un lettore di piastre ELISA.
3. REATTIVI, MATERIALI E STRUMENTAZIONE
3.1. Reattivi e materiali forniti nel kit
1. Controls (3 flaconi, 2 mL ciascuno, pronti all'uso)
Negative Control
REF DCE045/00901i-0
Positive Control
REF DCE045/00902i-0
Cut-Off Control
REF DCE045/00903i-0
2. Conjugate (1 flacone, 20 mL)
Anticorpi anti IgM coniugati con perossidasi
REF DCE002/00902i-0
3. Coated Microplate
(1 micropiastra breakable coattata con antigeni di
Herpes Simplex Virus 1+2)
REF DCE002/00903i-0
4. TMB Substrate (1 flacone, 14 mL)
H2O2-Tetrametilbenzidina (TMB) (evitare il contatto con la
pelle)
REF DCE004/00904i-0
5. Stop Solution (1 flacone, 14 mL)
Acido Solforico 0,2 mol/L (evitare il contatto con la pelle)
REF DCE005/00905i-0
6. 20X Conc Wash Solution (1 vial, 30 mL)
Contiene preservanti privi di mercurio
REF DCE007/00907i-0
7. Sample diluent (1 vial, 100 mL)
Soluzione tampone pH 7,2
REF DCE053/00953i-0
8. IgG-RF-Sorbent (1 flacone, 6,5 mL)
Contiene anticorpi anti IgG umane
REF DCE033/00933i-0
3.2. Reattivi necessari non forniti nel kit
Acqua distillata.
3.3. Materiale e strumentazione ausiliari
Dispensatori automatici.
Lettore per micropiastre (450 nm).
Note
Conservare tutti i reattivi a 2÷8°C, al riparo dalla
luce. Una volta aperto, il kit mantiene la sua
funzionalità per 2 mesi se conservato a 2-8°C.
Aprire la busta del Reattivo 3 (Coated Microplate)
solo dopo averla riportata a temperatura ambiente e
chiuderla subito dopo il prelievo delle strip da
utilizzare; una volta aperta è stabile fino alla data di
scadenza del kit.
4. AVVERTENZE
• Questo test kit è per uso in vitro, da eseguire da
parte di personale esperto. Non per uso interno o
esterno su esseri Umani o Animali.
• Usare i previsti dispositivi di protezione individuale
mentre si lavora con i reagenti forniti.
• Seguire le Buone Pratiche di Laboratorio (GLP)
per la manipolazione di prodotti derivati da
sangue.
• Tutti i reattivi di origine umana usati nella
preparazione dei reagenti sono stati testati e sono
risultati negativi per la presenza di anticorpi antiHTLV, TPHA (Sifilide), HIV 1&2, HBV e HCV.
Tuttavia nessun test offre la certezza completa
dell’assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti
infettivi. Pertanto, i reagenti devono essere
maneggiati come materiali potenzialmente infettivi.
• Alcuni reagenti contengono piccole quantità di
R
Sodio Azide (NaN3) o di Proclin 300 come
conservante. Evitare il contatto con la pelle e le
mucose.
• La Sodio Azide può essere tossica se ingerita o
assorbita attraverso la cute o gli occhi; inoltre, può
reagire con le tubature di piombo o rame
formando
azidi
metalliche
potenzialmente
esplosive. Se si usa un lavandino per eliminare i
reagenti, lasciar scorrere grandi quantità di acqua
per prevenire la formazione di azidi.
• Il TMB Substrato contiene un irritante, che può
essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito
attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare
l’inalazione, l’ingestione o il contatto con la cute e
con gli occhi.
• La Stop Solution è costituita da una soluzione di
acido solforico diluito. L’acido solforico è velenoso
e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per
•
prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il
contatto con la cute e con gli occhi.
Evitare l’esposizione del reagente TMB/H2O2 a
luce solare diretta, metalli o ossidanti. Non
congelare la soluzione.
5. PRECAUZIONI
• Si prega di attenersi rigorosamente alla sequenza
dei passaggi indicata in questo protocollo. I
risultati presentati qui sono stati ottenuti usando
specifici reagenti elencati in queste Istruzioni per
l’Uso.
• Tutti i reattivi devono essere conservati a
temperatura controllata di 2-8°C nei loro
contenitori originali. Eventuali eccezioni sono
chiaramente indicate. I reagenti sono stabili fino
alla data di scadenza se conservati e trattati
seguendo le istruzioni fornite.
• Prima dell’uso lasciare tutti i componenti dei kit e i
campioni a temperatura ambiente (22-28°C) e
mescolare accuratamente.
• Non scambiare componenti dei kit di lotti diversi.
Devono essere osservate le date di scadenza
riportate sulle etichette della scatola e di tutte le
fiale. Non utilizzare componenti oltre la data di
scadenza.
• Qualora si utilizzi strumentazione automatica, è
responsabilità dell’utilizzatore assicurarsi che il kit
sia stato opportunamente validato.
• Un lavaggio incompleto o non accurato dei
pozzetti può causare una scarsa precisione e/o
un’elevato background.
• Per la riproducibilità dei risultati, è importante che
il tempo di reazione di ogni pozzetto sia lo stesso.
Per evitare il time shifting durante la
dispensazione degli reagenti, il tempo di
dispensazione dei pozzetti non dovrebbe
estendersi oltre i 10 minuti. Se si protrae oltre, si
raccomanda di seguire lo stesso ordine di
dispensazione. Se si utilizza più di una piastra, si
raccomanda di ripetere la curva di calibrazione in
ogni piastra.
• L’addizione del TMB Substrato dà inizio ad una
reazione cinetica, la quale termina con l’addizione
della Stop Solution. L’addizione del TMB
Substrato e della Stop Solution deve avvenire
nella stessa sequenza per evitare tempi di
reazione differenti.
• Osservare le linee guida per l’esecuzione del
controllo di qualità nei laboratori clinici testando
controlli e/o pool di sieri.
• Osservare
la
massima
precisione
nella
ricostituzione e dispensazione dei reagenti.
• Non
usare
campioni
microbiologicamente
contaminati, altamente lipemici o emolizzati.
• I lettori di micropiastre leggono l’assorbanza
verticalmente. Non toccare il fondo dei pozzetti.
6. PROCEDIMENTO
6.1. Preparazione della Wash Solution
Diluire la soluzione di lavaggio concentrata 20X con
acqua distillata; ad esempio per preparare 600 mL di
soluzione di lavaggio diluita aggiungere 30 mL di
soluzione di lavaggio 20X a 570 mL di acqua
distillata. Se la " 20X Wash Solution" presenta i
cristalli, scioglierli scaldando il flacone in acqua calda
a 37°C prima dell'uso.
La soluzione di lavaggio diluita è stabile per 1 mese a
2-8°C.
6.2. Preparazione del Campione
Il kit ELISA Diametra Herpes Simplex Virus Type 1+2
IgM può essere utilizzato con siero o plasma
(eparina, EDTA, citrato) umano.
Prima di essere analizzato, ogni campione deve
essere
diluito
con
il
Sample
Diluent
e
successivamente incubato con IgG-RF-Sorbent per
l'assorbimento dei Fattori Reumatoidi, secondo la
seguente procedura:
1. Diluire ogni campione 1:51 con il Sample
Diluent e mescolare bene (per esempio,
aggiungere 10 µL di campione a 0,5 mL di
Sample Diluent).
2. Diluire il campione prediluito 1:2 con l'IgG-RFSorbent e mescolare bene (per esempio,
aggiungere 60 µL di campione prediluito a 60
µL di IgG-RF-Sorbent).
3. Lasciare riposare per almeno 15 minuti a
temperatura ambiente o per tutta la notte a
2-8°C e mescolare bene di nuovo.
4. Prelevare 100 µL di questo campione
pretrattato per il test.
I controlli sono pronti all'uso e non devono essere
pre-trattati!
Per ottenere il siero, raccogliere il sangue venoso, far
coagulare e separare il siero centrifugando a
temperatura ambiente. Non centrifugare prima che la
coagulazione sia completata. I pazienti trattati con
terapia anticoagulante possono richiedere un tempo
di coagulazione più lungo.
Per ottenere il plasma, il sangue intero deve essere
raccolto in provette contenenti anti-coagulante e
centrifugati subito dopo la raccolta.
Osservare le classiche precauzioni durante il prelievo
del sangue. Non usare campioni emolitici, itterici o
lipemici. Nota: i campioni contenenti Sodio Azide non
devono essere utilizzati nel saggio.
I campioni devono essere chiusi e possono essere
conservati per un massimo di 24 ore a 2-8°C prima di
essere analizzati. Per conservazioni più lunghe,
tenere i campioni congelati a -20°C prima del
dosaggio; congelare una sola volta. I campioni
scongelati devono essere miscelati bene prima della
prova.
•
•
•
•
6.3. Precauzioni prima di cominciare
Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente
(22-28°C).
Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere
rimesse immediatamente nella busta richiudibile
contenente il materiale essicante e conservate a
2-8°C.
Per evitare potenziali contaminazioni microbiche
e/o chimiche non rimettere i reagenti inutilizzati nei
flaconi originali.
Al fine di aumentare l’accuratezza dei risultati del
test è necessario operare in doppio, allestendo
due pozzetti per ogni Controllo, due per ogni
Campione ed uno per il Bianco.
6.4. Procedura
Reagente
Controlli
Controlli
(Neg, Pos,
Cut-Off)
100 µL
Campione
pre-trattato
Campione
Bianco
100 µL
Coprire la piastra con la pellicola adesiva. Incubare
per 1 ora a 37°C.
Rimuovere il contenuto da ogni pozzetto. Lavare i
pozzetti 5 volte con 300 µL di soluzione di lavaggio
diluita.
Rimuovere l'eccesso di soluzione sbattendo
delicatamente la piastra capovolta su carta
assorbente.
Nota importante: la sensibilità e la precisione di
questo kit sono fortemente influenzate dal corretto
svolgimento della procedura di lavaggio!
Conjugate
100 µL
100 µL
Incubare 30 minuti a temperatura ambiente (2228°C). Non esporre alla luce solare diretta.
Rimuovere il contenuto da ogni pozzetto. Lavare i
pozzetti 5 volte con 300 µL di soluzione di lavaggio
diluita.
Rimuovere l'eccesso di soluzione sbattendo
delicatamente la piastra capovolta su carta
assorbente.
TMB
Substrate
100 µL
100 µL
100 µL
Incubare 15 minuti al buio a temperature ambiente
(22-28°C).
Stop
Solution
100 µL
100 µL
100 µL
Agitare delicatamente la micropiastra. (Nota:
campioni altamente positivi possono causare
precipitati scuri del cromogeno!)
Leggere l'assorbanza (E) a 450 nm con una
lunghezza d'onda di riferimento di 620 nm o contro il
Bianco entro 30 minuti dopo l'aggiunta della Stop
Solution.
Misurazione:
Settare il lettore di micropiastra ELISA a zero usando
il bianco.
Se - per motivi tecnici - il lettore ELISA non può
essere regolato a zero usando il bianco, sottrarre il
valore di assorbanza del bianco a tutti i valori delle
altre assorbanze misurate in modo da ottenere
risultati attendibili!
Misurare l'assorbanza di tutti i pozzetti a 450 nm e
registrare tutti i valori di assorbanza di ogni controllo
e campione.
Si raccomanda una lettura a doppia lunghezza d'onda
utilizzando 620 nm come lunghezza di riferimento.
Laddove applicabile calcolare
assorbanze di tutti i duplicati.
la
media
delle
7. CONTROLLO QUALITA’
Si raccomanda di utilizzare i controlli secondo le
norme statali e federali. L'uso di controlli è consigliato
per assicurare la validità dei risultati durante i test.
Utilizzare controlli sia a livello normale che patologico.
Si raccomanda inoltre di utilizzare programmi per la
valutazione della qualità nazionali o internazionali, al
fine di assicurare l'accuratezza dei risultati.
Se i risultati del test non rientrano nei range di
accettazione dei controlli, i risultati devono essere
considerati non validi.
In questo caso, si prega di consultare i seguenti
parametri tecnici: pipettaggio e apparecchiature di
cronometraggio; fotometro, date di scadenza dei
reagenti, metodi di conservazione e condizioni di
incubazione, aspirazione e lavaggio.
Se dopo il controllo dei suddetti fattori non è rilevabile
alcun errore, contattare il proprio distributore o
Diametra direttamente.
8. RISULTATI
8.1. Validazione del dosaggio
Il dosaggio può essere considerato valido se sono
soddisfatti i seguenti criteri:
Assorbanza (OD)
Bianco
Controllo Negativo
Controllo Cut-off
Controllo Positivo
minore di 0,100
minore di 0,200
compresa tra 0,350 - 0,850
compresa tra 0,650 - 3,000
8.2. Calcolo dei risultati
Valore medio di assorbanza del Controllo Cut-off
(CO)
Calcolare il valore medio di assorbanza dei due valori
del controllo Cut-off ottenuti.
Esempio: (0,59 + 0,61): 2 = 0,60 = CO
8.3. Interpretazione dei risultati
POSITIVO
Assorbanza media del paziente oltre
il 10% al di sopra del CO
(Media OD paziente > 1.1 x CO)
ZONA INCERTA Assorbanza media del paziente
dal 10% sopra al 10% sotto il CO:
ripetere il test 2-4 settimane dopo
con un campione fresco del paziente
(0.9 x CO
≤ Media OD paziente
≤ 1.1 x CO)
Risultato nel second test ancora nella
zona incerta ⇒ NEGATIVO
NEGATIVO
Assorbanza media del paziente oltre
il 10% al di sotto del CO
(Media OD paziente < 0.9 x CO)
8.3.1. Risultati in unità arbitrarie
Assorbanza media del paziente x 10 = AU
CO
Esempio: 1.580 x 10
0.60
= 26 AU
Interpretazione dei risultati in AU
Valore di Cut-off
Zona Incerta
Negativo
Positivo
10 AU
9-11 AU
< 9 AU
> 11 AU
È importante tenere presente che la determinazione
di un range di valori attesi in un dato metodo per una
popolazione “normale” è dipendente da molteplici
fattori, quali la specificità e sensibilità del metodo in
uso, e la popolazione in esame. Perciò ogni
laboratorio dovrebbe considerare i range indicati dal
Fabbricante come un’indicazione generale e produrre
range di valori attesi propri basati sulla popolazione
indigena dove il laboratorio risiede.
9. PARAMETRI CARATTERISTICI
9.1. Specificità Diagnostica
La specificità diagnostica é definita come la
probabilità del test di fornire un risultato negativo in
assenza di anticorpi specifici. La specificità
diagnostica è 95%.
9.2. Sensibilità Diagnostica
La sensibilità diagnostica è definita come la
probabilità di fornire un risultato positivo in presenza
di anticorpi specifici. La sensibilità diagnostica è 96%.
9.3. Precision
9.3.1. Intra-assay
La precisione intra-assay del kit Diametra HSV 1+2
IgM ELISA è stata determinata con 20 replicati di 3
campioni positivi.
Campione
1
2
3
Media OD
0,79
1,18
1,44
CV %
6,69
4,36
3,98
n
20
20
20
9.3.2. Inter-assay
La precisione inter-assay del kit Diametra HSV 1+2
IgM ELISA è stata determinata con il Controllo CutOff, il Controllo Positivo e 3 campioni, con 2 kit diversi
e 10 dosaggi indipendenti.
Campione
1
2
3
Media OD
0,78
1,12
1,45
CV %
12,81
11,87
7,41
n
40
40
40
9.4. Sostanze interferenti
Emoglobina (fino a 4 mg/mL), Bilirubina (fino a 0,5
mg/mL) e Trigliceridi (fino a 30 mg/mL) non
influenzano i risultati del saggio.
10. LIMITAZIONI DEL SAGGIO
La contaminazione batterica o ripetuti cicli di
congelamento e scongelamento del campione
possono influenzare i valori di assorbanza.
Nei pazienti immunocompromessi e nei neonati i
valori sierologici hanno un valore limitato.
11. DISPOSIZIONI PER LO SMALTIMENTO
I reagenti devono essere smaltiti in accordo con le
leggi locali.
BIBLIOGRAFIA
1. Pass, R.F., R.J. Whitley, J.D. Whelchel, A.G.
Diethelm, D.W. Reynolds, and C.A. Alford. 1979.
Identification of Patients with Increased Risk of
Infection with HSV after Renal Transplantation.
J. Infect. Dis. 140:487-492.
2. Meyer, J.D., N. Fluornoy, and E.D. Thomas. 1980.
Infection with HSV and Cell Mediated Immunity
after Bone Marrow Transplant. J. Infect. Dis.
142:338-346
Ed. 08/2012
DCM009i-0
DiaMetra S.r.l. Headquater: Via Garibaldi, 18 –
20090 SEGRATE (MI) Italy
Tel. 0099-02-2139184 – 02-26921595
Fax 0099–02–2133354.
Manufactory: Via Pozzuolo 14, 06038 SPELLO (PG)
Italy
Tel. 0099-0742–24851
Fax 0099–0742–316197
E-mail: [email protected]
DCM009i-0
Ed. 08/2012
Herpes Simplex Virus Type 1+2 IgM
for routine analysis
Enzyme immunoassay for the qualitative and semiquantitative determination of human IgM antibodies to
Herpes Simplex Virus Type 1+2 in human serum and plasma.
IVD
LOT
See external label
INTENDED USE
Diametra Herpes Simplex Virus Type 1+2 IgM ELISA
assay is an immunoenzymatic method for the
qualitative and semiquantitative determination of
human IgM antibodies against Herpes Simplex Virus
Type 1+2 in human serum and plasma.
Herpes Simplex Virus Type 1+2 IgM kit is intended
for laboratory use only.
1. CLINICAL SIGNIFICANCE
Herpes simplex is an enveloped DNA virus (150-200
nm in diameter) belonging to the alphaherpesviridae.
Based on antigenic, biochemical and biological
differences it can be divided into two serotypes, HSV1 and HSV-2.
Man is the only known natural host and source of the
virus. HSV-type 1 typically causes oral herpes, while
HSV-type 2 typically affects the genital area. Most of
the time, HSV-1 and HSV-2 are inactive, or “silent”,
and cause no symptoms, but some infected people
have “outbreaks” of blisters and ulcers. Once infected
with HSV, people remain infected for life.
Herpes simplex viruses are among the most common
infectious agents of man, and either HSV type
appears to be capable of infecting similar body sites.
A high percentage of the adult population is
seropositive (approx. 90% HSV-1 is dependent on
socio-economic status, 10-30% HSV-2).
Primary HSV-1 infection usually occurs in early
childhood (6 to 18 months of age).
HSV-2 usually produces mild symptoms, and most
people have no recognized symptoms.
2. PRINCIPLE OF THE METHOD
Diametra Herpes Simplex Virus Type 1+2 IgM ELISA
Kit is a solid phase enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA).
Patient samples are diluted with Sample Diluent and
additionally
incubated
with
IgG-RF-Sorbent,
containing hyper-immune anti-human IgG-class
antibody to eliminate competitive inhibition from
specific IgG and to remove rheumatoid factors. This
pretreatment avoids false negative or false positive
results. Microtiter wells as a solid phase are coated
with Herpes Simplex Virus Type 1+2 antigen.
Σ = 96 tests
REF DKI009
Pretreated patient specimens and ready-for-use
controls are pipetted into these wells. During
incubation Herpes Simplex Virus Type 1 + 2-specific
antibodies of positive specimens and controls are
bound to the immobilized antigens.
After a washing step to remove unbound sample and
control material horseradish peroxidase conjugated
anti-human IgM antibodies are dispensed into the
wells. During a second incubation this anti-IgM
conjugate binds specifically to IgM antibodies
resulting in the formation of enzyme-linked immune
complexes.
After a second washing step to remove unbound
conjugate the immune complexes formed (in case of
positive results) are detected by incubation with TMB
substrate and development of a blue color. The blue
color turns into yellow by stopping the enzymatic
indicator reaction with sulfuric acid.
The intensity of this color is directly proportional to the
amount of Herpes Simplex Virus Type 1+2-specific
IgM antibody in the patient specimen. Absorbance at
450 nm is read using an ELISA microtiter plate
reader.
3. REAGENTS, MATERIALS AND INSTRUMENTATION
3.1. Reagents and materials supplied in the kit
1. Controls (3 vials, 2 mL each, ready to use)
Negative Control
REF DCE045/00901i-0
Positive Control
REF DCE045/00902i-0
Cut-Off Control
REF DCE045/00903i-0
2. Conjugate (1 vial, 20 mL)
Anti human IgM antibodies conjugated with peroxidase
REF DCE002/00902i-0
3. Coated Microplate
(1 breakable microplate coated with Herpes Simplex
Virus Type 1+2 antigen)
REF DCE002/00903i-0
4. TMB Substrate (1 vial, 14 mL)
H2O2-Tetramethylbenzidine (avoid any skin contact)
REF DCE004/00904i-0
5. Stop Solution (1 vial, 14 mL)
Sulphuric acid 0.2M (avoid any skin contact)
REF DCE005/00905i-0
6. 20X Conc. Wash Solution (1 vial, 30 mL)
Contain non-mercury preservative
REF DCE007/00907i-0
7. Sample Diluent (1 vial, 100 mL)
Buffered solution pH 7.2
REF DCE053/00953i-0
8. IgG-RF-Sorbent (1 vial, 6,5 mL)
Contains anti human IgG-class antibody
REF DCE033/00933i-0
3.2. Reagents necessary not supplied
Distilled water.
3.3. Auxiliary materials and instrumentation
Automatic dispenser.
Microplates reader (450 nm)
Notes
Store all reagents at 2÷8°C in the dark. Opened
kits retain activity for two months if stored as
described above.
Open the bag of reagent 3 (Coated Microplate) only
when it is at room temperature and close it
immediately after use.
4. WARNINGS
• This kit is intended for in vitro use by professional
persons only. Not for internal or external use in
Humans or Animals.
• Use appropriate personal protective equipment
while working with the reagents provided.
• Follow Good Laboratory Practice (GLP) for
handling blood products.
• All human source material used in the preparation
of the reagents has been tested and found
negative for antibody to HIV 1&2, HbsAg, and
HCV. No test method however can offer complete
assurance that HIV, HBV, HCV or other infectious
agents are absent. Therefore, the reagents should
be handled in the same manner as potentially
infectious material.
• Some reagents contain small amounts of Sodium
R
Azide or Proclin 300 as preservative. Avoid the
contact with skin or mucosa.
• Sodium Azide may be toxic if ingested or
absorbed through the skin or eyes; moreover it
may react with lead or copper plumbing to form
potentially explosive metal azides. If you use a
sink to remove the reagents, allow scroll through
large amounts of water to prevent azide build-up.
• The TMB Substrate contains an irritant, which may
be harmful if inhaled, ingested or absorbed
through the skin. To prevent injury, avoid
inhalation, ingestion or contact with skin and eyes.
• The Stop Solution consists of a diluted sulphuric
acid solution. Sulphuric acid is poisonous and
corrosive and can be toxic if ingested. To prevent
chemical burns, avoid contact with skin and eyes.
• Avoid the exposure of reagent TMB/H2O2 to
directed sunlight, metals or oxidants. Do not
freeze the solution.
5. PRECAUTIONS
• Please adhere strictly to the sequence of pipetting
steps provided in this protocol. The performance
data represented here were obtained using
specific reagents listed in this Instruction For Use.
• All reagents should be stored refrigerated at 2-8°C
in their original container. Any exceptions are
clearly indicated. The reagents are stable until the
expiry date when stored and handled as indicated.
• Allow all kit components and specimens to reach
room temperature (22-28°C) and mix well prior to
use.
• Do not interchange kit components from different
lots. The expiry date printed on box and vials
labels must be observed. Do not use any kit
component beyond their expiry date.
• If you use automated equipment, the user has the
responsibility to make sure that the kit has been
appropriately tested.
• The incomplete or inaccurate liquid removal from
the wells could influence the assay precision
and/or increase the background.
• It is important that the time of reaction in each well
is held constant for reproducible results. Pipetting
of samples should not extend beyond ten minutes
to avoid assay drift. If more than 10 minutes are
needed, follow the same order of dispensation. If
more than one plate is used, it is recommended to
repeat the dose response curve in each plate
• Addition of the TMB Substrate solution initiates a
kinetic reaction, which is terminated by the
addition of the Stop Solution. Therefore, the TMB
Substrate and the Stop Solution should be added
in the same sequence to eliminate any time
deviation during the reaction.
• Observe the guidelines for performing quality
control in medical laboratories by assaying
controls and/or pooled sera.
• Maximum precision is required for reconstitution
and dispensation of the reagents.
• Samples microbiologically contaminated, highly
lipemeic or haemolysed should not be used in the
assay.
• Plate readers measure vertically. Do not touch the
bottom of the wells.
6. PROCEDURE
6.1. Preparation of the Wash Solution
Dilute the "20X Conc. Wash Solution" 1:20 with
distilled water; for example to prepare 600 mL of
diluted Wash Solution add 30 mL of "20X Wash
Solution" to 570 mL of distilled water. If the "20X
Wash Solution" presents crystals, dissolve them by
warming up at 37°C in a water bath before use.
The diluted Wash Solution is stable for 1 month at 28°C.
6.2. Preparation of the Sample
Diametra Herpes Simplex Virus Type 1+2 IgM ELISA
can be used with human serum and plasma (EDTA-,
heparin- or citrate plasma).
Prior to assaying each patient specimen is first to be
diluted with Sample Diluent and then, for the
absorption of rheumatoid factor, these prediluted
samples have to be incubated with IgG-RF-Sorbent,
according to the following procedure:
1. Dilute each patient specimen 1:51 with the
Sample Diluent and mix well (for example, add
10 µL of sample to 0,5 mL of Sample Diluent)
2. Dilute this prediluted sample 1:2 with the IgGRF-Sorbent and mix well (for example, add 60
µL of prediluted sample to 60 µL of IgG-RFSorbent)
3. Let stand for at least 15 minutes at room
temperature or over night at 2-8°C and mix
well again.
4. Take 100 µL of this pretreated sample for the
ELISA.
The Controls are ready to use and must not be
pretreated!
To obtain the serum, collect blood by venipuncture,
allow to clot, and separate serum by centrifugation at
room temperature. Do not centrifuge before complete
clotting
has
occurred.
Patients
receiving
anticoagulant therapy may require increased clotting
time.
To obtain the plasma, whole blood should be
collected into centrifuge tubes containing anti
coagulant and centrifuged immediately after
collection.
The usual precautions for venipuncture should be
observed. Do not use hemolytic, icteric or lipemic
specimens. Please note: samples containing Sodium
Azide should not be used in the assay.
Specimens should be capped and may be stored for
up to 24 hours at 2-8°C prior to assaying. Specimens
held for a longer time should be frozen only once at –
20°C prior to assay. Thawed samples should be
inverted several times prior to testing.
•
•
•
•
6.3. Procedure
Allow all reagents to reach room temperature
(22-28°C).
Unused coated microwell strips should be
released securely in the foil pouch containing
desiccant and stored at 2-8°C.
To avoid potential microbial and/or chemical
contamination, unused reagents should never be
transferred into the original vials.
As it is necessary to perform the determination in
duplicate in order to improve accuracy of the test
results, prepare two wells for each Control, two for
each sample, one for Blank.
Reagent
Controls
Controls
(Neg, Pos,
Cut-Off)
100 µL
Pretreated
Sample
Sample
Blank
100 µL
Cover the plate with the adhesive foil. Incubate 1
hour at 37°C.
Remove the contents from each well. Wash the wells
5 times with 300 µL of diluted Wash Solution.
Remove excess solution by tapping the inverted plate
on a paper towel.
Important note: the sensitivity and precision of this
assay is markedly influenced by the correct
performance of the washing procedure!
Conjugate
100 µL
100 µL
Incubate 30 minutes at room temperature (22-28°C).
Do not expose to direct sunlight.
Remove the contents from each well. Wash the wells
5 times with 300 µL of diluted Wash Solution.
Remove excess solution by tapping the inverted plate
on a paper towel.
TMB
Substrate
100 µL
100 µL
100 µL
Incubate 15 minutes in the dark at room temperature
(22÷28°C).
Stop
Solution
100 µL
100 µL
100 µL
Shake the microplate gently. (Note: Highly positive
patient samples can cause dark precipitates of the
chromogen!)
Read the absorbance (E) at 450 nm with a reference
wavwlenght of 620 nm or against Blank within 30
minutes after adding the Stop Solution.
Measurement:
Adjust the ELISA microplate or microstrip reader to
zero using the substrate blank.
If - due to technical reasons - the ELISA reader
cannot be adjusted to zero using the substrate blank,
subtract the absorbance value of the blank from all
other absorbance values measured in order to obtain
reliable results!
Measure the absorbance of all wells at 450 nm and
record the absorbance values for each control and
patient sample.
Dual wavelength reading using 620 nm as reference
wavelength is recommended.
Where applicable calculate the mean absorbance
values of all duplicates.
7. QUALITY CONTROL
It is recommended to use control samples according
to state and federal regulations. The use of control
samples is advised to assure the day to day validity of
results. Use controls at both normal and pathological
levels.
It is also recommended to make use of national or
international Quality Assessment programs in order
to ensure the accuracy of the results.
If the results of the assay do not fit to the established
acceptable ranges of control materials patient results
should be considered invalid.
In this case, please check the following technical
areas: pipetting and timing devices; photometer,
expiration dates of reagents, storage and incubation
conditions, aspiration and washing methods.
After checking the above mentioned items without
finding any error contact your distributor or Diametra
directly.
8. RESULTS
8.1. Validation of the Test Run
The test run may be considered valid provided the
following criteria are met:
Blank
Negative Control
Cut-Off Control
Positive Control
Absorbance value (OD)
lower than 0,100
lower than 0,200
between 0,350 - 0,850
between 0,650 - 3,000
8.2. Calculation of Results
Mean absorbance value of Cut-off Control (CO)
Calculate the mean absorbance value of the two Cutoff Control determinations .
Example: (0,59 + 0,61) : 2 = 0,60 = CO
8.3. Interpretation of Results
POSITIVE
Patient (mean) absorbance values
more than 10% above CO
(Mean OD patient > 1.1 x CO)
GREY ZONE
Patient (mean) absorbance values
from 10% above to 10% below CO:
repeat test 2-4 weeks later with new
patient samples
(0.9 x CO ≤ Mean OD patient ≤
1.1 x CO)
Results in the second test again in
the grey zone ⇒ NEGATIVE
NEGATIVE
Patient (mean) absorbance values
more than 10% below CO
(Mean OD patient < 0.9 x CO)
8.3.1. Results in Arbitrary Units (AU)
Patient (mean) absorbance value x 10 = AU
CO
Example:
1.580 x 10
0.60
= 26 AU
Interpretation of Results in AU:
Cut-off value
Grey zone
Negative
Positive
10 AU
9-11 AU
< 9 AU
> 11 AU
Please pay attention to the fact that the determination
of a range of expected values for a “normal”
population in a given method is dependent on many
factors, such as specificity and sensitivity of the
method used and type of population under
investigation. Therefore each laboratory should
consider the range given by the Manufacurer as a
general indication and produce their own range of
expected values based on the indigenous population
where the laboratory works.
9. PERFORMANCE AND CHARACTERISTICS
9.1. Diagnostic Specificity
The diagnostic specificity is defined as the probability
of the assay of scoring negative in the absence of the
specific analyte. It is 95%.
9.2. Diagnostic Sensitivity
The diagnostic sensitivity is defined as the probability
of the assay of scoring positive in the presence of the
specific analyte. It is 96%.
9.3. Precision
9.3.1. Intra assay
The intra-assay (within-run) precision of Diametra
HSV 1+2 IgM ELISA was determined by 20x
measurements of 3 positive samples.
Sample
1
2
3
Mean OD
0,79
1,18
1,44
CV %
6,69
4,36
3,98
n
20
20
20
9.3.2. Inter assay
The inter-assay variation of Diametra HSV 1+2 IgM
ELISA was determined with cut-off control, positive
control, and 3 samples with 2 production kits in 10
independent runs with 2 replicates per run.
Sample
1
2
3
Mean OD
0,78
1,12
1,45
CV %
12,81
11,87
7,41
n
40
40
40
9.4. Interfering Substances
Haemoglobin (up to 4 mg/mL), Bilirubin (up to 0.5
mg/mL) and Triglyceride (up to 30 mg/mL) have no
influence on the assay results.
10. LIMITATIONS OF USE
Bacterial contamination or repeated freeze-thaw
cycles of the specimen may affect the absorbance
values.
In immunocompromised patients and newborns
serological data only have restricted value.
11. WASTE MANAGEMENT
Reagents must be disposed off in accordance with
local regulations.
BIBLIOGRAPHY
1. Pass, R.F., R.J. Whitley, J.D. Whelchel, A.G.
Diethelm, D.W. Reynolds, and C.A. Alford. 1979.
Identification of Patients with Increased Risk of
Infection with HSV after Renal Transplantation.
J. Infect. Dis. 140:487-492.
2. Meyer, J.D., N. Fluornoy, and E.D. Thomas. 1980.
Infection with HSV and Cell Mediated Immunity
after Bone Marrow Transplant. J. Infect. Dis.
142:338-346
Ed. 08/2012
DCM009i-0
DiaMetra S.r.l. Headquater: Via Garibaldi, 18 –
20090 SEGRATE (MI) Italy
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