allegato

Veterinaria, Anno 9, n. 1, Marzo 1995
Isolamento di un ceppo di “Canine distemper virus”
(CDV) da cuccioli
con sintomatologia nervosa post-vaccinale
FULVIO MARSILIO
PIETRO-GIORGIO TISCAR
Istituto di Malattie Infettive degli Animali
“M. Compagnucci”
Università degli Studi di Teramo
Loc. Piano d’Accio
64020 Nepezzano (TE)
MARIA TEMPESTA
PAOLA SAGAZIO
CANIO BUONAVOGLIA
Istituto di Malattie Infettive e Parassitarie
degli Animali
Università degli Studi di Bari
C.P. 7 - 70042 Valenzano (BA)
ENRICO BOLLO
Dipartimento di Patologia Animale
Università degli Studi di Torino
Via Nizza, 52 -10126 Torino
INTRODUZIONE
Il cimurro è una malattia che colpisce numerose specie
di carnivori ed in particolare il cane, clinicamente caratterizzata da sintomi respiratori, gastrointestinali e nervosi.
È sostenuto da un virus, denominato Canine Distemper
Virus (CDV), antigenicamente unico e classificato nella
fam. Paramixoviridae gen. Morbillivirus1.
La profilassi vaccinale nei confronti dell’infezione da
CDV è attuata con stipiti attivi modificati.
Frequentemente sono stati descritti episodi di encefalite
acuta a decorso fatale come complicazione della vaccinazione. I motivi dell’insorgenza di tali forme nervose non
sono perfettamente noti e le indagini specifiche risultano
spesso di difficile esecuzione in quanto il virus si isola con
molta difficoltà e non è quindi possibile effettuare le prove
di caratterizzazione di stipite patogeno o vaccinale2.
Nella presente nota si descrive l’isolamento e la caratterizzazione di un ceppo di CDV da cuccioli di cane con
manifestazioni cliniche nervose comparse dopo la vaccinazione nei confronti di CDV.
MATERIALI E METODI
Caso clinico: in un allevamento di bracchi tedeschi sono
stati introdotti quattro cuccioli della stessa razza, di 60 gg.
di età e sieronegativi nei confronti di CPV (Canine
Parvovirus), CDV (Canine Distemper Virus) e CAV-2
(Canine Adenovirus-2), provenienti da un allevamento
situato a circa 300 km di distanza. Dopo 4 gg. dall’arrivo e
prima di poter eseguire gli interventi vaccinali, il cucciolo
contrassegnato con il n° 30 ha manifestato gastroenterite
emorragica, vomito ed è morto dopo 24 ore. La prova di
emoagglutinazione (EA) sulle feci con emazie di suino ha
fornito esito positivo per CPV. Il dato è stato poi confermato dall’isolamento del virus su cellule A-72.
Dopo 3 gg. gli altri 3 cuccioli (n° 27, 28, 31 ) sono stati
vaccinati nei confronti di CPV con un vaccino attivo
modificato, dopo aver escluso tramite l’EA sulle feci e la
conta leucocitaria la possibile presenza dell’infezione da
CPV.
Quindici giorni dopo, valutata l’avvenuta sieroconversione verso CPV, i cuccioli sono stati sottoposti ad un
nuovo intervento vaccinale con un prodotto trivalente
CDV, CAV-2, Leptospira.
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Isolamento di un ceppo di “Canine distemper virus”
Dopo 7 gg. dalla vaccinazione i tre cuccioli hanno evidenziato i segni clinici di una forma iperacuta di cimurro
con coinvolgimento neurologico e morte entro 48h.
Test di Immunofluorescenza indiretta (IFI): strisci di
cervello e cervelletto dei tre cuccioli sono stati sottoposti a
prove di IFI con un pool di anticorpi monoclonali nei
confronti di CDV.
Colture cellulari: è stata utilizzata la linea cellulare Vero
fatta sviluppare in terreno E-MEM con aggiunta di L-glutammina e di 10% di siero fetale bovino.
Isolamento del virus: da uno dei cuccioli, subito dopo
la morte, sono stati prelevati i macrofagi polmonari. Dopo
tre lavaggi con terreno E-MEM senza siero effettuati a
2000 rpm x 10’, i macrofagi sono stati cocoltivati con cellule Vero non infette in rapporto 10:1. Le colture cellulari
erano osservate a fresco quotidianamente per la eventuale
presenza di effetto citopatico specifico (sincizi) e ogni 7
giorni erano sottoposte a colorazione con ematossilinaeosina, al test IFI con MoAbs per CDV e ad un passaggio
effettuando sia una nuova cocoltura con cellule Vero non
infette e sia l’infezione di monostrati di cellule Vero con il
criolisato della cocoltura.
Caratterizzazione dell’isolato: lo stipite isolato è stato
caratterizzato in prove di IFI utilizzando n° 3 anticorpi
monoclonali gentilmente forniti dal dr. Örvell (Karolinska
Institute, Stoccolma).
Detti anticorpi riconoscono rispettivamente la proteina
NP (nucleofosfoproteina) (MoAb n° 4229) e la proteina H
(emoagglutinina) (MoAb n° 1347 e MoAb n° 3775).
Questi ultimi due riconoscono due diversi epitopi della
proteina H. Il MoAb n° 3775 non riconosce la maggior
parte degli stipiti patogeni CDV finora isolati3. Nelle
prove è stato inserito anche lo stipite vaccinale
Onderstepoort presente nel vaccino e coltivato su cellule
Vero.
Esami istologici: su sezioni di tessuto nervoso è stata
eseguita la colorazione ematossilina-eosina, mentre altre
sezioni sono state sottoposte ad una colorazione immunoistochimica mediante un anticorpo monoclonale diretto
verso la proteina NP del virus del cimurro4, utilizzando la
tecnica dell’avidina-biotina (Vectastain ABC kit
Peroxidase Mouse - Vector, Burlingame, USA).
FIGURA 1 - IFI positiva per CDV su striscio di cervelletto (20x).
FIGURA 2 - IFI positiva per CDV su cocoltura macrofagi-cellule VERO
(20x).
RISULTATI
Negli strisci di cervello e cervelletto di tutti e 3 i soggetti
è stato evidenziato antigene CDV con le prove di IFI con
anticorpi monoclonali (Fig. 1).
Al 2° passaggio della cocoltura di macrofagi-cellule
Vero, è stato evidenziato antigene CDV in prove di IFI
(Fig. 2). Nei monostrati infetti colorati con ematossilinaeosina erano presenti pochi sincizi, tuttavia in molte cellule erano evidenti corpi inclusi eosinofilici intracitoplasmatici ed intranucleari (Fig. 3). È stato osservato, inoltre, che
la capacità di dare sincizi e corpi inclusi intranucleari è
scomparsa intorno al 7°-8° passaggio.
Nei monostrati di cellule Vero inoculati con il criolisato
delle cocolture, fino al 13° passaggio, non è stato invece
evidenziato antigene CDV in prove di IFI né sincizi e né
corpi inclusi. Dal 14° passaggio anche con il criolisato
delle cocolture è stato possibile ottenere l’infezione dei
monostrati di cellule Vero.
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FIGURA 3 - Sincizio e corpi inclusi intracitoplasmatici ed intranucleari
su cellule VERO (colorazione E.E., 40x).
Le prove di IFI con il MoAb n° 4229 hanno evidenziato
reattività con il virus isolato (Ba/67/92) e con lo stipite
Onderstepoort. Il MoAb n° 1347 ha reagito solo con il
ceppo Ba/67/92 mentre il MoAb n° 3775 solo con il
ceppo vaccinale.
L’esame istologico delle sezioni di SNC ha consentito di
evidenziare la presenza di lievi fenomeni di gliosi associati
ad iniziale demielinizzazione a sede prevalentemente cerebellare. Non erano evidenti, inoltre, fenomeni infiammatori quali manicotti perivascolari o infiltrazioni di cellule
mononucleate o macrofagi. L’esame immunoistochimico
Veterinaria, Anno 9, n. 1, Marzo 1995
ha evidenziato una marcata positività a carico delle cellule
gliali particolarmente evidente nella sostanza bianca del
cervelletto. L’Ag virale si presentava localizzato prevalentemente nel citoplasma, raramente nel nucleo, mentre
non si rilevava positività in sede interstiziale.
CONCLUSIONI
Le sindromi nervose dei cuccioli di cane che conseguono talvolta alla vaccinazione con ceppi attenuati di CDV
sono state descritte numerose volte2,5. I motivi non sono
sempre chiari ma frequentemente è stata ipotizzata la presenza di varianti patogene CDV in un determinato lotto di
vaccino2, oppure si è attribuito il fenomeno ad una situazione di immunodeficienza dei cuccioli vaccinati6, talvolta
causata da una concomitante infezione da parvovirus 7.
Spesso è stata ritenuta responsabile una infezione da CDV
in incubazione8.
Il caso clinico descritto farebbe escludere l’ipotesi di un
vaccino contenente CDV patogeno in quanto lo stesso
lotto era stato usato dallo stesso veterinario e nello stesso
periodo in altri cuccioli senza osservare alcuna reazione
anomala ed inoltre, lo stipite Onderstepoort è notoriamente più innocuo rispetto ad altri stipiti vaccinali9.
Le difficoltà nell’isolamento del virus ed i risultati delle
prove di caratterizzazione con i MoAbs fanno ritenere lo
stipite isolato, almeno dal punto di vista antigenico, più
simile agli stipiti patogeni che a quelli vaccinali. Anche i
risultati degli esami istologici hanno confermato il quadro
di una encefalopatia acuta molto frequente nelle forme
acute fulminanti di infezione da CDV dei cuccioli ad esito
letale. Le lesioni infiammatorie a carico del SNC sono
risultate assenti o poco evidenti in quanto questo particolare quadro istologico consegue ad una infezione da CDV
ad evoluzione molto rapida.
SUMMARY
Three 60-days-old puppies showed fatal nervous signs
after 7 days from vaccination with CDV, CAV-2 and
Leptospira antigens. CDV antigen was found in sections of
brain, cerebellum and spinal cord by immunofluorescence
and immunoperoxidase tests using monoclonal antibodies
(MoAbs). Histological examination of CNS sections showed
light gliosis and demyelination. By using VERO cells cocultivated with alveolar macrophages of one of the infected
puppies a CDV strain was isolated. The preliminary characterization by MoAbs lets us consider the isolated CDV as
probable wild strain.
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Parole chiave
Cane, CDV, isolamento
Key words
Dog, CDV, isolation.
RIASSUNTO
Tre cuccioli di cane di 60 gg. di età dopo sette giorni la
vaccinazione con vaccino trivalente (CDV, CAV-2,
Leptospira) hanno mostrato sintomi nervosi ad esito fatale.
Prove di immunofluorescenza indiretta con un pool di anticorpi monoclonali (MoAbs) e di immunoperossidasi indiretta con un MoAb verso la proteina NP eseguite su cervello,
cervelletto e midollo spinale hanno dato esito positivo per
CDV. Gli esami istologici delle sezioni di sistema nervoso
centrale hanno evidenziato lievi fenomeni di gliosi associati
ad iniziale demielinizzazione a sede prevalentemente cerebellare. Mediante cocoltivazione dei macrofagi alveolari di
uno dei cuccioli con cellule VERO è stato isolato uno stipite
CDV. La caratterizzazione con MoAbs su sezioni di cervello
e su cellule VERO infette ha permesso di considerare lo stipite isolato più simile antigenicamente agli stipiti patogeni
che a`quelli vaccinali.
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