Veterinaria, Anno 9, n. 1, Marzo 1995 Isolamento di un ceppo di “Canine distemper virus” (CDV) da cuccioli con sintomatologia nervosa post-vaccinale FULVIO MARSILIO PIETRO-GIORGIO TISCAR Istituto di Malattie Infettive degli Animali “M. Compagnucci” Università degli Studi di Teramo Loc. Piano d’Accio 64020 Nepezzano (TE) MARIA TEMPESTA PAOLA SAGAZIO CANIO BUONAVOGLIA Istituto di Malattie Infettive e Parassitarie degli Animali Università degli Studi di Bari C.P. 7 - 70042 Valenzano (BA) ENRICO BOLLO Dipartimento di Patologia Animale Università degli Studi di Torino Via Nizza, 52 -10126 Torino INTRODUZIONE Il cimurro è una malattia che colpisce numerose specie di carnivori ed in particolare il cane, clinicamente caratterizzata da sintomi respiratori, gastrointestinali e nervosi. È sostenuto da un virus, denominato Canine Distemper Virus (CDV), antigenicamente unico e classificato nella fam. Paramixoviridae gen. Morbillivirus1. La profilassi vaccinale nei confronti dell’infezione da CDV è attuata con stipiti attivi modificati. Frequentemente sono stati descritti episodi di encefalite acuta a decorso fatale come complicazione della vaccinazione. I motivi dell’insorgenza di tali forme nervose non sono perfettamente noti e le indagini specifiche risultano spesso di difficile esecuzione in quanto il virus si isola con molta difficoltà e non è quindi possibile effettuare le prove di caratterizzazione di stipite patogeno o vaccinale2. Nella presente nota si descrive l’isolamento e la caratterizzazione di un ceppo di CDV da cuccioli di cane con manifestazioni cliniche nervose comparse dopo la vaccinazione nei confronti di CDV. MATERIALI E METODI Caso clinico: in un allevamento di bracchi tedeschi sono stati introdotti quattro cuccioli della stessa razza, di 60 gg. di età e sieronegativi nei confronti di CPV (Canine Parvovirus), CDV (Canine Distemper Virus) e CAV-2 (Canine Adenovirus-2), provenienti da un allevamento situato a circa 300 km di distanza. Dopo 4 gg. dall’arrivo e prima di poter eseguire gli interventi vaccinali, il cucciolo contrassegnato con il n° 30 ha manifestato gastroenterite emorragica, vomito ed è morto dopo 24 ore. La prova di emoagglutinazione (EA) sulle feci con emazie di suino ha fornito esito positivo per CPV. Il dato è stato poi confermato dall’isolamento del virus su cellule A-72. Dopo 3 gg. gli altri 3 cuccioli (n° 27, 28, 31 ) sono stati vaccinati nei confronti di CPV con un vaccino attivo modificato, dopo aver escluso tramite l’EA sulle feci e la conta leucocitaria la possibile presenza dell’infezione da CPV. Quindici giorni dopo, valutata l’avvenuta sieroconversione verso CPV, i cuccioli sono stati sottoposti ad un nuovo intervento vaccinale con un prodotto trivalente CDV, CAV-2, Leptospira. 113 Isolamento di un ceppo di “Canine distemper virus” Dopo 7 gg. dalla vaccinazione i tre cuccioli hanno evidenziato i segni clinici di una forma iperacuta di cimurro con coinvolgimento neurologico e morte entro 48h. Test di Immunofluorescenza indiretta (IFI): strisci di cervello e cervelletto dei tre cuccioli sono stati sottoposti a prove di IFI con un pool di anticorpi monoclonali nei confronti di CDV. Colture cellulari: è stata utilizzata la linea cellulare Vero fatta sviluppare in terreno E-MEM con aggiunta di L-glutammina e di 10% di siero fetale bovino. Isolamento del virus: da uno dei cuccioli, subito dopo la morte, sono stati prelevati i macrofagi polmonari. Dopo tre lavaggi con terreno E-MEM senza siero effettuati a 2000 rpm x 10’, i macrofagi sono stati cocoltivati con cellule Vero non infette in rapporto 10:1. Le colture cellulari erano osservate a fresco quotidianamente per la eventuale presenza di effetto citopatico specifico (sincizi) e ogni 7 giorni erano sottoposte a colorazione con ematossilinaeosina, al test IFI con MoAbs per CDV e ad un passaggio effettuando sia una nuova cocoltura con cellule Vero non infette e sia l’infezione di monostrati di cellule Vero con il criolisato della cocoltura. Caratterizzazione dell’isolato: lo stipite isolato è stato caratterizzato in prove di IFI utilizzando n° 3 anticorpi monoclonali gentilmente forniti dal dr. Örvell (Karolinska Institute, Stoccolma). Detti anticorpi riconoscono rispettivamente la proteina NP (nucleofosfoproteina) (MoAb n° 4229) e la proteina H (emoagglutinina) (MoAb n° 1347 e MoAb n° 3775). Questi ultimi due riconoscono due diversi epitopi della proteina H. Il MoAb n° 3775 non riconosce la maggior parte degli stipiti patogeni CDV finora isolati3. Nelle prove è stato inserito anche lo stipite vaccinale Onderstepoort presente nel vaccino e coltivato su cellule Vero. Esami istologici: su sezioni di tessuto nervoso è stata eseguita la colorazione ematossilina-eosina, mentre altre sezioni sono state sottoposte ad una colorazione immunoistochimica mediante un anticorpo monoclonale diretto verso la proteina NP del virus del cimurro4, utilizzando la tecnica dell’avidina-biotina (Vectastain ABC kit Peroxidase Mouse - Vector, Burlingame, USA). FIGURA 1 - IFI positiva per CDV su striscio di cervelletto (20x). FIGURA 2 - IFI positiva per CDV su cocoltura macrofagi-cellule VERO (20x). RISULTATI Negli strisci di cervello e cervelletto di tutti e 3 i soggetti è stato evidenziato antigene CDV con le prove di IFI con anticorpi monoclonali (Fig. 1). Al 2° passaggio della cocoltura di macrofagi-cellule Vero, è stato evidenziato antigene CDV in prove di IFI (Fig. 2). Nei monostrati infetti colorati con ematossilinaeosina erano presenti pochi sincizi, tuttavia in molte cellule erano evidenti corpi inclusi eosinofilici intracitoplasmatici ed intranucleari (Fig. 3). È stato osservato, inoltre, che la capacità di dare sincizi e corpi inclusi intranucleari è scomparsa intorno al 7°-8° passaggio. Nei monostrati di cellule Vero inoculati con il criolisato delle cocolture, fino al 13° passaggio, non è stato invece evidenziato antigene CDV in prove di IFI né sincizi e né corpi inclusi. Dal 14° passaggio anche con il criolisato delle cocolture è stato possibile ottenere l’infezione dei monostrati di cellule Vero. 114 FIGURA 3 - Sincizio e corpi inclusi intracitoplasmatici ed intranucleari su cellule VERO (colorazione E.E., 40x). Le prove di IFI con il MoAb n° 4229 hanno evidenziato reattività con il virus isolato (Ba/67/92) e con lo stipite Onderstepoort. Il MoAb n° 1347 ha reagito solo con il ceppo Ba/67/92 mentre il MoAb n° 3775 solo con il ceppo vaccinale. L’esame istologico delle sezioni di SNC ha consentito di evidenziare la presenza di lievi fenomeni di gliosi associati ad iniziale demielinizzazione a sede prevalentemente cerebellare. Non erano evidenti, inoltre, fenomeni infiammatori quali manicotti perivascolari o infiltrazioni di cellule mononucleate o macrofagi. L’esame immunoistochimico Veterinaria, Anno 9, n. 1, Marzo 1995 ha evidenziato una marcata positività a carico delle cellule gliali particolarmente evidente nella sostanza bianca del cervelletto. L’Ag virale si presentava localizzato prevalentemente nel citoplasma, raramente nel nucleo, mentre non si rilevava positività in sede interstiziale. CONCLUSIONI Le sindromi nervose dei cuccioli di cane che conseguono talvolta alla vaccinazione con ceppi attenuati di CDV sono state descritte numerose volte2,5. I motivi non sono sempre chiari ma frequentemente è stata ipotizzata la presenza di varianti patogene CDV in un determinato lotto di vaccino2, oppure si è attribuito il fenomeno ad una situazione di immunodeficienza dei cuccioli vaccinati6, talvolta causata da una concomitante infezione da parvovirus 7. Spesso è stata ritenuta responsabile una infezione da CDV in incubazione8. Il caso clinico descritto farebbe escludere l’ipotesi di un vaccino contenente CDV patogeno in quanto lo stesso lotto era stato usato dallo stesso veterinario e nello stesso periodo in altri cuccioli senza osservare alcuna reazione anomala ed inoltre, lo stipite Onderstepoort è notoriamente più innocuo rispetto ad altri stipiti vaccinali9. Le difficoltà nell’isolamento del virus ed i risultati delle prove di caratterizzazione con i MoAbs fanno ritenere lo stipite isolato, almeno dal punto di vista antigenico, più simile agli stipiti patogeni che a quelli vaccinali. Anche i risultati degli esami istologici hanno confermato il quadro di una encefalopatia acuta molto frequente nelle forme acute fulminanti di infezione da CDV dei cuccioli ad esito letale. Le lesioni infiammatorie a carico del SNC sono risultate assenti o poco evidenti in quanto questo particolare quadro istologico consegue ad una infezione da CDV ad evoluzione molto rapida. SUMMARY Three 60-days-old puppies showed fatal nervous signs after 7 days from vaccination with CDV, CAV-2 and Leptospira antigens. CDV antigen was found in sections of brain, cerebellum and spinal cord by immunofluorescence and immunoperoxidase tests using monoclonal antibodies (MoAbs). Histological examination of CNS sections showed light gliosis and demyelination. By using VERO cells cocultivated with alveolar macrophages of one of the infected puppies a CDV strain was isolated. The preliminary characterization by MoAbs lets us consider the isolated CDV as probable wild strain. BIBLIOGRAFIA 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Francki R.I.B., Fauquet C.M., Knudson D.L., Brown F.: Classification and nomenclature of viruses. Arch. Virol., Suppl. 2, 1991. Cornwell H.J.C., Thompson H., McCandlish I.A.P., Macartney L., Nash A.S.: Encephalitis in dogs associated with a batch of canine distemper (Rockborn) vaccine. Vet. Rec., 122, 54, 1988. Alldinger S., Baumgärtner W., Örvell C.: Restricted expression of viral surface proteins in canine distemper encephalitis. Acta Neuropathol., 85, 635, 1993. Bollo E., Zurbriggen A., Vandevelde M., Fankhauser R.: Canine distemper virus clearance in chronic inflammatory demyelination. Acta Neuropathol., 72, 69, 1986. 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RIASSUNTO Tre cuccioli di cane di 60 gg. di età dopo sette giorni la vaccinazione con vaccino trivalente (CDV, CAV-2, Leptospira) hanno mostrato sintomi nervosi ad esito fatale. Prove di immunofluorescenza indiretta con un pool di anticorpi monoclonali (MoAbs) e di immunoperossidasi indiretta con un MoAb verso la proteina NP eseguite su cervello, cervelletto e midollo spinale hanno dato esito positivo per CDV. Gli esami istologici delle sezioni di sistema nervoso centrale hanno evidenziato lievi fenomeni di gliosi associati ad iniziale demielinizzazione a sede prevalentemente cerebellare. Mediante cocoltivazione dei macrofagi alveolari di uno dei cuccioli con cellule VERO è stato isolato uno stipite CDV. La caratterizzazione con MoAbs su sezioni di cervello e su cellule VERO infette ha permesso di considerare lo stipite isolato più simile antigenicamente agli stipiti patogeni che a`quelli vaccinali. 115