Diapositiva 1
La diagnosi genetica della talassemia
Dott.ssa L.Pagano
Unità Operativa Microcitemia
Dipartimento di Onco-Ematologia
A.O.R.N. A. Cardarelli Napoli
2 Dicembre 2005
Castel dell’Ovo Sala Virgilio
Napoli
Diapositiva 2
Diapositiva 3
CHE COS’E’ IL DNA
DNA
9
La molecola di DNA è un
lungo polimero costituito da
quattro unità monomeriche
chiamate nucleotidi.
9
Il singolo filamento di DNA
è costitutito da una catena
di nucleotidi uniti da legami
fosfodiesterici, nei quali un
gruppo fosfato forma un
ponte tra gruppi –OH di
due residui adiacenti di
zucchero.
9
Infine le singole catene
sono stabilizzate da legami
idrogeno che si formano tra
i nucleotidi complementari.
Diapositiva 4
Localizzazione dei geni globinici sui cromosomi 11 e 16
Diapositiva 5
L’ Emoglobina (Hb)
Struttura quaternaria
Proteina contenuta nei globuli rossi che ha la
funzione di trasportare l’ossigeno alle cellule
del corpo e di eliminare l’anidride carbonica
Emoglobine nell’adulto
Hb A:
α2 β2
Hb A2: α2 δ2
Hb F:
α2 γ2
(>96%)
(<3.4%)
(<1%)
Diapositiva 6
Emoglobine normali
γ2
α2
β2
δ2 α2
α2
Diapositiva 7
Emoglobinopatie
(Difetti dell’emoglobina)
Difetti di:
Sintesi
Struttura
Talassemie
Varianti Hb
Varianti con fenotipo talassemico
Diapositiva 8
β Talassemia
La BETA TALASSEMIA consiste in una ridotta
o assente sintesi della catena beta globinica
causata
da
mutazioni
tiformi
all’interno
del
prevalentemente
gene:
pun-
microdelezioni,
difetti di trascrizione e traduzione, difetti di
maturazione
del
compromettono
globinica
trascritto
la
stabilità
e
difetti
della
che
catena
Diapositiva 9
β
Sintesi bilanciata: si
ha nel soggetto normale e in presenza
della maggior parte di
varianti Hb
α
(nonα)
β °
β +
Beta Talassemie:
α / non α > 1
Diapositiva 10
Localizzazione dei difetti talassemici
sul gene β
promoter
1
1
2
3
IVSI
4
6
5
2
IVSII
3
7
1- nel promoter: ( β+ )
2- microdelezione CD6 (-A): codon non-senso ( β° )
3- segnale di stop: codon non-senso CD39 (C→T) ( β° )
4- abolita giunzione di splicing: ( β° )
5- sequenza di consenso alterata: ( β+ )
6- attivazione sito criptico: ( β+ )
7- delezione di 600 basi, inizio in IVS2 ( β° )
Diapositiva 11
INCIDENZA DELLA BETA TALASSEMIA IN ITALIA
2.4%
4.5%
12%
3%
2%
5%
2.5%
3.5%
8%
6%
13%
7%
7%
Diapositiva 12
Frequenza dei difetti β Tal.
nelle zone a maggior incidenza
Cod 39
IVSI 110
Diapositiva 13
Frequenza delle mutazioni β-talassemiche in
261 coppie a rischio di origine campana (n=522)
CD 39 39,0%
IVS I 110 19,0%
IVS I 1 10,5%
IVS I 6 8,6%
IVSII 1 5,4%
IVS II 745 5,0%
Hb Lepore 3,8%
HbS 2,5%
-87 1,7%
Hb Neapolis 1,5%
-COD 6 1,3%
Delta Beta 0,6%
-101 0,4%
Non identificate 0,7%
Diapositiva 14
α Talassemia
L’ALFA TALASSEMIA consiste in una ridotta
o assente sintesi delle catene α globiniche: è
causata da disordini ereditari caratterizzati
prevalentemente da delezione dei geni alfa
globinici α1 e/o α2 o più raramente
mutazioni puntiformi o microdelezioni.
da
Diapositiva 15
Normale
β
α
Alfa Talassemie:
α / non α < 1
α°
α+
Diapositiva 16
Struttura dei geni α globinici
S.A.Liebhaber, 1989
Diapositiva 17
X
tratto α+ (α-talassemico tipo 2)
portatore sano
tratto α°
(talassemico tipo 1)
portatore sano
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
malattia da HbH
idrope fetale
Diapositiva 18
Delezioni nel cluster α
che danno origine ad α° Talassemia
Diapositiva 19
α−Thalassemia nel Mediterraneo
Difetti
Frequenza(%)
Del -3.7 Kb
61.1%
Del - 4.2 Kb
2.0%
Del - 17.5 Kb (--Med)
7.4%
Del - 20.5 Kb
4.5%
NCO-I
11.5%
HpH-I
4.5%
Altre
9.0%
Diapositiva 20
Emoglobinopatie
(Difetti dell’emoglobina)
Difetti di:
Sintesi
Struttura
Talassemie
Varianti Hb
Varianti con fenotipo talassemico
Diapositiva 21
Distribuzione delle più frequenti Hb varianti in Italia
Diapositiva 22
Hb variants
1.Hb Lepore
2.HbA2 Yialausa
3.Hb S
Amino acid substitution
δ87/β116
δ27(B9) Ala→Leu
β6(A3)Glu→Val
Campania
Campania
Campania (Costa D’Avorio)
4.Hb D Los –Angeles
5.Hb Neapolis
6.Hb G-San Josè
7.Hb C
β121(GH4)Glu→Gln
β126(H4)Val→Gly
β7(A4) Glu→Gly
β6(A3)Glu→Lys
Campania
Campania
Campania
Campania (extracomunitari)
8.Hb E
β26(B8)Glu→Lys
Campania (extracomunitari)
9.Hb Koln
10.Hb O-Arab
β98(FG5)Val→Met
β121(GH4)Glu→Lys
Campania
Campania (extracomunitari)
11.Hb Rainier
β145(HC2)Tyr→Cys
12.Hb Peterborough
β111(G13)Val→Phe
13.Hb Villejuif
β123(H1)Thr→Ile
14.Hb Leiden
β6(A3) or β7(A4)Glu→0
15.Hb Cardarelli
β86(B3)Ala→Pro
16 Hb City of Hope
β69(E13)Gly→Ser
17 Hb Copenaghen
β47(CD6)Asp→Asn
18.Hb Indianapolis
β112(G13)Cys→Arg
19.Hb Vila Real
β36(C2)Pro→His
20.Hb M-Hyde Park
β92(F8)His→Tyr
21.Hb J-Bangkok
β56 (D7)Gly→Asp
22.Hb Tende
β124(H2)Pro→Leu
23.Hb J-Oxford
α15(A13)Gly→Asp
24.Hb Shimonoseki
α54(E3)Gln→Asp
* nuove varianti identificate
Origin
Campania
Campania
Campania
Campania
Campania
Campania
Campania
Campania
Campania
Campania
Campania
Campania
Campania
Campania
Diapositiva 23
Hb Neapolis β126(H4) val→gly
Diapositiva 24
Hb Neapolis β126(H4) val→gly
Hb (g/dL)
-
MCV (fL)
75.8
MCH (pg)
25.1
HbA2 (%)
3.5
HPLC delle emoglobine
Hb Neapolis
Spettro di massa della catena beta variante
HPLC delle catene globiniche
Diapositiva 25
ARMS Neapolis
GTG→GGG
633 bp
287 bp
Linea 1, 3 e 5 : soggetti eterozigoti per l’Hb Neapolis
Linea 2 e 6 :soggetti normali
Diapositiva 26
Hb Cardarelli β86(F2) Ala→Pro
Diapositiva 27
• 2.900.000 Stranieri che soggiornano
legalmente in Italia
• 130.000 nuovi arrivi nell’ultimo anno di
cui 88.000 per ricongiungersi
ai familiari
• 40.000 nati nell’ultimo anno
da genitori entrambi stranieri
Dal Dossier Statistico
Immigrazioni 2005 della
Caritas Italiana e dati del
Ministero dell’Interno
Diapositiva 28
Indagini di 1° livello per Talassemie e/o Varianti Hb
Anamnesi e
Prelievo
Esame della
morfologia
eritrocitaria
Separazione cromatografica
delle diverse componenti
emoglobiniche mediante
HPLC
Valutazione del Ferro
Elettroforesi Hb
(alcalina e/o
acida)
“Diagnosi presuntiva”
Diapositiva 29
Altre indagini a supporto del 1°
1° livello
Dal 1°
livello
Test di Sickling
Hb S
Conteggio reticolociti
Ricerca inclusioni
endoeritrocitarie
Test di stabilità
“in vitro” dell’Hb
Analisi affinità per l’O2: P50
Separazione cromatografica delle catene
globiniche mediante
HPLC
Diapositiva 30
Quando proseguire con le
indagini di 2° livello:
Il 1° livello non riesce ad escludere o
accertare la presenza di difetti Hb
(talassemie o varianti).
Si sospetta la presenza di più difetti Hb.
caratterizzazione
dei
difetti,
La
mostrati dal 1°livello, può essere di
supporto alla valutazione del rischio
genetico o all’approccio terapeutico.
Occorre conoscere i difetti molecolari
per consentire la diagnosi prenatale.
Diapositiva 31
Diapositiva 32
FAMILY PEDIGREE D.L.
I
N
1
2
N
II
1
N
2
3
N
4
5
IIIIII N
1
2
3
4
CD 39
α2 HphII
5
6
-α 3.7
IVSI-6
6
Diapositiva 33
COSA DEVE FARE UNA “COPPIA A
RISCHIO?
z
z
z
Se due portatori di beta talassemia
decidono di avere un figlio, devono
sottoporsi alle indagini di 2° livello:
Estrazione del DNA (91.36.5)
Analisi delle mutazioni del DNA (91.30.1)
Diapositiva 34
Tecniche di biologia molecolare applicate alla diagnostica
ESTRAZIONE DEL DNA O RNA
CAMPIONI BIOLOGICI
conservazione a -20°
20° C
PCR
IDENTIFICAZIONE DELL’
DELL’AMPLIFICATO
analisi di un gene e delle sue mutazioni
DGGE
ASO
REVERSE DOT BLOT
MICROPIASTRA
SEQUENZIAMENTO DEL DNA
ARMS
Diapositiva 35
Indagini di 2°
2° livello
Analisi molecolare per
la ricerca di eventuali
difetti talassemici
HPLC dei peptidi triptici e analisi della
sequenza aminoacidica
Spettrometria di massa
Analisi della sequenza nucleotidica
• Valutazione del possibile fenotipo clinico in
rapporto al genotipo noto
• Consultazione banche-dati
• Diagnosi conclusiva
Diapositiva 36
Valutazione del possibile fenotipo clinico in
rapporto al genotipo noto
Consultazione banche-dati
Diagnosi conclusiva
Consulenza genetica
in relazione alle mutazioni identificate,
Valutazioni del rischio
ed eventuale indicazione alla diagnosi prenatale
Diapositiva 37
Diagnosi Prenatale
z
z
La diagnosi prenatale della talassemia e
delle emoglobinopatie attualmente viene
eseguita, quasi esclusivamente, mediante analisi molecolare del DNA da un
prelievo di villi coriali (Villocentesi).
L’approccio diagnostico deve essere tale
da permettere la caratterizzazione dei
genitori e ridurre il più possibile il
rischio di diagnosi non-informative
Diapositiva 38
VILLOCENTESI
La villocentesi consiste nel prelievo di tessuto
placentare ,villi coriali, si esegue tra la 10-12 settimana
di gestazione.
L’esame consiste in una puntura dell’addome materno
sotto guida ecografica e comporta un rischio di aborto
inferiore all’1%.
Dai villi coriali si estrae il DNA FETALE e con le tecniche di biologia
molecolare si ricercano le mutazioni identificate nei genitori.
Diapositiva 39
INFORMAZIONE
SCREENING
Distribuzione di materiale
informativo alle coppie che
richiedono documenti agli
uffici comunali
Corsi di formazione
per medici di base
e dei consultori familiari,
ginecologi
Informazione presso i corsi
Prematrimoniali
Popolazione target: coppie
a rischio in età fertile
Esami di I livello: emocromo,
dosaggio HbA2, Dosaggio HbF
Resistenze osmotiche, sideremia,
ferritina
PREVENZIONE
Identificazione delle coppie
a rischio
Divulgazione agli studenti
degli Istituti Superiori
Esami di II livello:
Studio del DNA
Spot pubblicitari su
TG regionale e/o
televisioni private
Diagnosi prenatale:
tra la 10 alla 12 sett
di geastazione
Diapositiva 40
Unità Operativa Microcitemia
Dipartimento di Onco-Ematologia
A.O.R.N. A. Cardarelli Napoli
Dirigente medico Dott. L. Prossomariti
Dirigente biologo Dott.ssa L.Pagano
Dirigente biologo Dott.ssa C. Placida
Tecnici di laboratorio A. Salamandra C.Zito
Biologo volontario Dott.M.Ammirabile
