OGM:
APPROCCIO ANALITICO MULTI-STEP
Enzo Cortini
SC1 Analisi del Rischio e Sorveglianza in Sanità Pubblica
Laboratorio Biofood
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OBIETTIVI DELL’ INTERVENTO:
1) ASPETTI E PECULIARITA' DEGLI OGM
2) ANALISI E INTERPRETAZIONE DEI DATI DI LABORATORIO
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DEFINIZIONE DI OGM:
“...un organismo diverso da un essere umano, il cui materiale
genetico è stato modificato in modo diverso da quanto avviene
in natura con l'accoppiamento e/o la ricombinazione genetica
naturale....
(Art.2 Direttiva 2001/18/ CE del 12/03/2001)
Queste modificazioni prendono il nome di Trasformazioni o
Transegenesi
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L'INGEGNERIA GENETICA:
Le tecniche di ingegneria genetica consentono di produrre
OGM introducendo geni estranei provenienti da altri
organismi viventi:
- Microrganismi (procarioti ed eucarioti)
• - Animali
• - Vegetali
Il DNA cosi ottenuto è definito DNA ricombinante
L'obbiettivo è in genere quello di conferire caratteristiche utili
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PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM):
Le PGM sono piante nelle quali è stato inserito un gene
proveniente da un organismo “donatore” che può appartenere
alla stessa specie della pianta “ricevente”, oppure a specie
diverse, o addirittura a regni diversi
PGM di Prima Generazione: destinate al miglioramento delle
caratteristiche agronomiche
• - Aumento della resistenza agli insetti
• - Tolleranza agli erbicidi
• - Aumento della resistenza alle malattie
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COME OTTENGO UNA PGM?
1°Step Preparazione del Costrutto di DNA da impiegare nella Trasformazione
1) Scelta della/e sequenza/e di DNA e taglio con un enzima di restrizione
2) Taglio del plasmide con lo stesso enzima di restrizione
per generare estremità compatibili
3) Inserimento di una o più “cassette geniche”
(sequenza genica di interesse + promotore + terminatore)
I) resistenza ad alcuni insetti
II) resistenza ad un antibiotico attivo sui batteri
III) resistenza ad un secondo antibiotico per la selezione
delle cellule vegetali
4) Ligazione
Costrutto = Plasmide + cassetta genica
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2° Step: Clonaggio e selezione della popolazione delle
cellule batteriche trasformate
Creato il Costrutto Genico occorre produrne un numero elevato
numero di copie inserendolo in batteri capaci di “amplificarlo”
Solo i batteri “modificati” sopravvivono alla selezione (e si
moltiplicano) grazie alla cassetta genica per la resistenza
all'antibiotico (II)
La popolazione batterica non “modificata” è invece sensibile
all'antibiotico
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3 Step: Trasformazione
L’inserzione di un tratto di DNA estraneo (costrutto genico), nel
genoma «ospite» di una cellula vegetale
Tecniche di Trasformazione maggiormente utilizzate:
1) Vettori plasmidici es…Agrobaterium Tumefaciens
2) Tecnica “biolistica”
3) Elettroporazione
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Fonte: BATS (Center for Biosafety Assesment Technology and Sustainability), Swittzerland
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4° step: Selezione assistita delle nuove piante “Evento di
trasformazione” mediante appostiti marcatori
es. - resistenza ad un antibiotico
- sistema G.U.S. (beta-glucoronidasi)
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Un esempio di pianta transgenica il Mais BT11
Nel genoma della pianta sono state inserite 6 copie del gene Cry I Ab
(resistenza agli insetti) e del gene bla (resistenza alle penicelline) ed almeno
2 copie del gene bar (tolleranza al glufosinato)
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COLTIVAZIONI OGM NEL MONDO
Le colture GM maggiormente diffuse sono:
•soia
•mais
•cotone
•colza
Le principali modificazioni riguardano la resistenza agli erbicidi e
la resistenza ad insetti.
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Stato delle autorizzazioni degli alimenti e dei mangimi GM in EU:
12 eventi soia (di cui 1 stacked)
(+7 in corso di autorizzazione)
39 eventi mais (di cui 26 stacked)
(+9 in corso di autorizzazione)
7 eventi colza (di cui 3 stacked)
(+2 in corso di autorizzazione)
10 eventi cotone (di cui 3 stacked)
71 eventi autorizzati
+
19 eventi che ricadono
Reg.(UE) 619/2011
(+1 in corso di autorizzazione)
1 evento barbabietola da zucchero
2 Microorganismi GM
Aggiornamento 17/06/2015
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QUADRO NORMATIVO OGM
Direttiva 2001/18/CE
Reg.(CE) n. 1829/2003
Reg.(CE) n. 1830/2003
Reg.(CE) n. 65/2004
Reg.(CE) n. 834/2007
Reg.(UE) n. 619/2011
Reg.(UE) n. 691/2013 del 19 Luglio 2013
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LIMITI DI LEGGE Reg.(CE) n. 1829/2003
OGM autorizzati : obbligo di etichettatura > 0.9% di un singolo
ingrediente alimentare o al singolo componente di un mangime
OGM autorizzati : non sussiste obbligo di etichettatura ≤ 0.9%
di un singolo ingrediente alimentare o al singolo componente
alimentare purché la presenza sia accidentale o tecnicamente
inevitabile
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CONTROLLO UFFICIALE OGM IN ITALIA
Piano Nazionale di
controllo mangimi
GM 2015-2017
Piano Nazionale di
controllo alimenti GM
2015-2018
Piani Regionali
EMERGENZE - RASFF
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FLUSSO ANALITICO DEI CAMPIONI PER RICERCA DI OGM
a) PREPARAZIONE DEL CAMPIONE DI LABORATORIO
b) ESTRAZIONE DEL DNA
c) ANALISI IN REAL TIME PCR
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MATRICI OGGETTO DI RICERCA OGM
GRANELLE:
gli OGM sono considerati sostanze distribuite in modo NON OMOGENEO nel prodotto
1 solo chicco può essere GM
Per ovviare al problema occorre rendere OMOGENEO il campione in analisi all’atto
del campionamento attraverso la macinazione
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ARRIVO DEL CAMPIONE IN LABORATORIO
N.B:
Il campione deve essere miscelato il più possibile e ciò si
ottiene attraverso l'uso di un frullatore a lame o nel caso di materie
prime in grani attraverso un mulino
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a) PREPARAZIONE DEL CAMPIONE DI LABORATORIO
Miscelazione manuale
Formazione del campione analitico
250 g di campione
Il campione deve essere miscelato il più possibile e ciò si
ottiene attraverso l'uso di un frullatore a lame o nel caso di materie
prime in grani attraverso un mulino
Pesata del campione
2 g (5 g per riso e mangimi)
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b) ESTRAZIONE DEL DNA
Due replicati di estrazione di DNA per ciascun campione analitico
A
B
Da ricordare sempre
L'obiettivo di un metodo di estrazione è quello di
ottenere un «DNA»:
In quantità adeguata
Non degradato
Puro e privo di sostanze inibenti
Con un metodo che sia veloce ed economico
nella sua esecuzione
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METODO CON COLONNINE IN SILICE
Membrana di
silice
Proteinasi K
+ Campione
+ Lysis /
Binding
Buffer
NB: Per
rimuov
ere
impurit
à.
Eluente (Eluition
Buffer o H2O) a
bassa
concentrazione
salina
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METODO CTAB
Lisi del campione in buffer acquoso CTAB (hexadecyl-trimetyl ammoniumbromide)
Necessario a solubulizzare la membrana plasmatica delle cellule da cui si ottiene una
miscela di componenti intracellulari (DNA, RNA, proteine e carboidrati).
l'EDTA presente nel tampone di lisi elimina i cationi bivalenti e inibisce l'azione
delle DNAsi.
Aggiunta di Rnase A e Proteinase K e incubazione a 65°C x 30'
Separazione mediante centrifugazione della parte solida di estrazione
Solubilizzazione della contaminante proteica con Cloroformio
Precipitazione del DNA con Isopropanolo
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QUANTIFICAZIONE DEL DNA
Lettura spettrofotometrica basata sull'Assorbanza del DNA a 260nm
rapporto di Assorbanza 260/280
> 1.8
In base alla concentrazione del DNA ottenuta si proseguirà nelle analisi in
Real Time PCR, per ciascun replicato di estrazione in doppia replica
come segue:
Monitor run
HMG-LECTINA-GSPLD
DNA> 40ng/uL
Analisi:
DNA a 40ng/uL e
10ng/uL
Monitor run
HMG-LECTINA-GSPLD
Monitor run
SAD
Monitor run
SAD
DNA < 20ng/uL
DNA > 20ng/uL
DNA < 40ng/uL
Analisi:
DNA Tal quale e dil
1:4
Analisi:
DNA Tal quale e dil
1:4
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Analisi:
DNA a 20ng/uL e
5ng/uL
APPROCCIO MULTI STEP ALL’ANALISI OGM
1) Screening specie vegetale dichiarata in etichetta
(geni endogeni di specie)
2) Screening costrutti genici
3) Ricerca evento transgenico specifico
4) Quantificazione evento transgenico rilevato
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HMG
LECTINA
Reg. (CE) n. 1829/2003
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1) Screening specie vegetali dichiarate in etichetta
POS
Presenza di DNA di Soia…
E
S
T
R
A
NEG
DNA di specie assente
o non amplificabile
La “monitor PCR” specie-specifica, detta
anche “Inhibition run” fornisce evidenza della
presenza , nel campione, di DNA amplificabile
appartenente alla specie vegetale dichiarata in
etichetta o nel documento commerciale
Valutazione del ∆Ct tra le curve a differente
concentrazione
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1) Screening specie vegetale dichiarata in etichetta (geni endogeni di specie)
MAIS
SOIA
RISO
HMG: sequenza che codifica per la proteina High
Mobility group
LECTINA: sequenza che codifica per la
Lectina
PLD: sequenza che codifica per la proteina
Fosfolipasi D
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1) Screening specie vegetale dichiarata in etichetta (geni endogeni di specie)
Barbabietola
da
zucchero
LINO
PATATA
GS: seqenza che codifica per la proteina
Glutamine Synthetase
SAD: sequenza che codifica per la proteina stearoylacyl carrier desaturase
UPGase: sequenza che codifica per la proteina
UDP-glucose pyrophosphorilase
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1) Screening specie vegetale dichiarata in etichetta (geni endogeni di specie)
COLZA
COTONE
CruA promotore del gene cruciferina A
Acp1 sequenza che codifica per Acyl carrier protein
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2) Screening costrutti genici
Promotore 35S: sequenza promotore 35S del Virus del mosaico del cavolfiore
Terminatore NOS: gene Nopalina sintetasi di Agrobacterium tumefacies
PAT: gene fosfotricin acetiltransferasi di Streptomyces viridocrhromogenes
NPTII: gene per neomicin fosfotransferasi II di Escherichia coli
CP4-EPSPS: derivato dal ceppo CP4 di Agrobacterium tumefacies
Costrutto CTP-CP4-EPSPS: derivato dalla congiunzione della sequenza
codificante per CTP da Arabidopsis thaliana
e la sequenza EPSPS dal ceppo CP4
di Agrobacterium tumefacies
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1) Screening specie vegetale dichiarate in etichetta
NEG
POS
Assenza gene/costrutto
ESISTONO ECCEZIONI
2) Screening costrutti genici
POS
Presenza gene/costrutto
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Specie vegetale
Evento GM
p35S
MON1445
cotone
MON15985
cotone
MON531
cotone
LL25
cotone
NPTII
PAT
CP4EPSPS
(IT)
VERIFI
VERIFI ATTE VERIFI ATTE VERIFI ATTE VERIFICA
ATTESO CATO ATTESO CATO SO
CATO SO
CATO SO** TO
7
cotone
Tnos
CTPCP4EPSP
S (IT)
VERIFICA
TO
A
-4
-
A
-4
-
-
A
-4
A
A
-
-
P
A
+3;4
+
A
-
-
A
-4
A
-
P
-
+
A
-3
-
A
-
A
-
-
P
+3
A
-
A
-
A
-
-
P
+3
+
A
-
P
+
A
-
-
A
-4
A
-
A
-
P
+
A
-
-
-3;4
A
-4
+
A
-
A
-
P
+
A
-
-
-4
A
-4
-
P
+
A
-
A
-
A
-
-
-3;4
A
-4
-
3
A
3
P
+
P
+
P
+
A
-
P
-
+
P
+
P
+
P
+
A
-
A
-
P
+
P
+
P
+
A
-
A
GHB614
P
A
+
-
P
A
+
-
A
A
-
A
A
-
cotone
3006-210-23 x 281-24-236
A
-
A
-
A
-
P
cotone
MON88913
P1
+
A
-
A2
+
cotone
GHB119
P
+
P
+
A
cotone
T304-40
P
+
P
+
mais
Bt11
P
+
P
mais
DAS1507
P
+
mais
DAS59122
P
mais
GA21
A
mais
8
7
8
A
MIR162
CTP2BAR
CP4EPSP
S
(DE/ISO)
VERIFICA
VERIFI
TO
ATTESO CATO
-
P
+
A
-
A
-
A
-
+3
+3
-
mais
MIR604
A
-
P
+
A
-
A
-
A
-
-
-
A
-4
mais
MON810
P
+
A
-
A
-
A
-
A
-
-
-3;4
A
-4
mais
MON863
P
+
P
+
P
+
A
-
A
-
-
A
-4
mais
MON88017
P
+
P
+
A
-
A
-
P
+
-
+3;4
A
-4
mais
NK603
P
+
P
+
A
-
A
-
P
+
-
+3;4
A
-4
mais
T25
A
P
+
A
A
-
P
A
+
-
A
A
-
-
A
A
-4
MON89034
+
+
-4
mais
P
P
mais
3272
P
A
+
-
A
A
-
A
A
-
A
A
-
-
A
A
-3;4
98140
+
-4
mais
A
P
mais
DAS40278-9
mais
MON87460
A
P
+
A
P
+
A
P
+
A
A
-
A
A
-
-
-
A
A
-3
-
mais
Bt176 (b)
P
+
A
-
A
-
A
-
A
-
-
-4
P
+3;4
mais
LY038
A
A
-
A
A
-
A
P
+
A
A
-
-
A
A
-3
DAS59132-8 (Event 32 or E-32)
+
-3
mais
A
P
colza
MS8/RF3
A
-
P
+
A
-
A
-
A
-
-
-4
P
+3;4
6
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1) Screening specie vegetale dichiarate in etichetta
POS
2) Screening costrutti genici
POS
3) Ricerca evento specifico
POS
Rilevato DNA di Soia RRS…
NEG
Contaminzaione botanica?
Contaminazione in tracce?
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1) Screening specie vegetale dichiarate in etichetta
POS
2) Screening costrutti genici
POS
3) Ricerca evento specifico
POS
4) Quantificazione evento transgenico rilevato
Valore riscontrato in %
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4) Quantificazione evento transgenico rilevato
Il metodo che utilizziamo è la
Quantificazione Relativa è basato sulla valutazione del Ct:
Ct dell' evento transgenico che si sta cercando
(es. RRS Round up Ready Soy evento MON 40-3-2)
VS
Il Ct del gene specifico di specie (es. Lectina)
Per fare questo si costruisce una curva standard utilizzando
Materiale certificato (CRM) a concentrazione nota di materiale GM
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Algoritmo di calcolo quantificazione relativa
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PER CONCLUDERE (1):
Se si tratta di OGM autorizzati
> 0.9% dichiarato in etichetta: CAMPIONE CONFORME
< 0.9% NON dichiarato in etichetta: CAMPIONE CONFORME
> 0.9% NON dichiarato in etichetta: CAMPIONE NON CONFORME
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PER CONCLUDERE (2):
Il crescente numero a livello Europeo di eventi di trasfromazione che vengono
autorizzati rende, dal punto di vista analitico, sempre più difficile per i laboratori
rimanere al passo.
A tal riguardo lo sviluppo tecnologico sarà un valido supporto????
SI
– Sviluppo di metododi di screening usando multiplex real time PCR
– DDPCR (Digital Droplet PCR)
– NGS Next Generetion Sequencing
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Grazie per l'attenzione
[email protected]
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