Progetto : BioInnovErbe
La coltivazione biologica delle erbe spontanee:
una nuova filiera produttiva di qualità a salvaguardia dell’ambiente
CONTENUTO DI SOSTANZE FENOLICHE ED ATTIVITA’ ANTIOSSIDANTE
DI PIANTE SPONTANEE DELL’AREA MONTANA
Lavinia Alexandru, Anna Liessi, Milena Marega, Lanfranco Conte
Dipartimento di Scienze degli Alimenti – Università degli Studi di Udine
CONVEGNO PROGETTO BIOINNOVERBE: “INNOVARE L’AGRICOLTURA NEL RISPETTO DELLA TRADIZIONE”
MERCOLEDÌ 25 FEBBRAIO 2009 Villa Chiozza – Loc. Scodovacca
1
Ia Fase della Ricerca
Messa a punto del metodo di estrazione
1. Determinazione del contenuto totale di sostanze fenoliche
2. Identificazione dei singoli componenti fenolici
3. Valutazione dell’attività antiossidante
IIa Fase della Ricerca
1. Determinazione del contenuto totale di sostanze fenoliche in funzione
di pratiche agronomiche
2. Valutazione del profilo fenolico (compositivo) in funzione di pratiche
agronomiche
3. Valutazione dell’attività antiossidante in funzione di pratiche
agronomiche
L. Alexandru, A. Liessi, M. Marega, L.Conte – “INNOVARE L’AGRICOLTURA NEL RISPETTO DELLA TRADIZIONE” Bioinnoverbe – Villa Chiozza, 25 Febbraio 2009
2
Prove preliminari:
Estrazione a freddo con alcole metilico per 2 tempi diversi ( 30 min; 4 ore)
Estrazione a caldo, a riflusso con alcole metilico per 2 tempi diversi (30 min;
4 ore)
Estrazione assistita da microonde (MAE) con alcole metilico per 20 min. a 2
diverse temperature (40°C; 80°C)
Valutazione preliminare della efficienza di estrazione
determinazione colorimetrica delle sostanze fenoliche
mediante
Valutazione preliminare della selettività di estrazione mediante
determinazione del rapporto di estinzione max di fenoli (λ 327 – 272) e
clorofille (λ 663 – 466)
L. Alexandru, A. Liessi, M. Marega, L.Conte – “INNOVARE L’AGRICOLTURA NEL RISPETTO DELLA TRADIZIONE” Bioinnoverbe – Villa Chiozza, 25 Febbraio 2009
3
Campione
Resa
estrazione %
Barba di Capra Pedrosa
2,3
B.Enrico
1,2
Levistico
1,7
Silene
1,8
Valerianella
2,0
L. Alexandru, A. Liessi, M. Marega, L.Conte – “INNOVARE L’AGRICOLTURA NEL RISPETTO DELLA TRADIZIONE” Bioinnoverbe – Villa Chiozza, 25 Febbraio 2009
4
Abs clorofila (nm)
663
466
Abs fenoli (nm)
327
272
Abs
fenoli/Abs
clorofila
Bianco
0,0615
0,0423
0,0913
0,15
3,55
B. Enrico Costa Robbia
0,1219
0,1511
0,5269
0,6288
4,16
B. Enrico Venzonassa
0,0778
0,0635
0,2497
0,4936
7,77
Radicchio di m. Collina
B. Enrico Cabia
Radicchio di m. Sauris
Radicchio di m. Ampezzo
0,0901
0,0862
0,0729
0,0748
0,0906
0,0715
0,0607
0,0727
0,8264
0,7292
0,2028
0,2834
0,7126
0,6144
0,3993
0,6389
7,86
8,59
6,58
8,79
B. Enrico Prato C.
0,0614
0,0534
0,4794
0,4363
8,17
Radicchio di m. Jelma
0,0654
0,056
0,2033
0,4693
8,38
Barba di Capra Pedrosa
0,0651
0,0409
0,7856
0,393
9,61
Barba di Capra Brazzacco
Levistico Tarcento
Silene Pradamano
Valerianella Colugna
0,0702
0,0458
0,0289
0,0234
0,0515
0,0611
0,0618
0,1122
0,9716
0,7124
0,6287
0,6545
0,5155
0,692
0,555
0,6755
10,01
11,32
8,98
6,02
L. Alexandru, A. Liessi, M. Marega, L.Conte – “INNOVARE L’AGRICOLTURA NEL RISPETTO DELLA TRADIZIONE” Bioinnoverbe – Villa Chiozza, 25 Febbraio 2009
5
Valerianella Colugna
Silene Pradamano
Radicchio di m. Sauris
Radicchio di m. Jelma
Radicchio di m. Collina
Radicchio di m. Ampezzo
Levistico Tarcento
B. Enrico Venzonassa
B. Enrico Prato C.
B. Enrico Cabia
B. Enrico Costa Robbia
Barba di capra Pedrosa
Barba di capra Brazzacco
Polifenoli mg ac. caffeico/g pianta (peso fresco)
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
L. Alexandru, A. Liessi, M. Marega, L.Conte – “INNOVARE L’AGRICOLTURA NEL RISPETTO DELLA TRADIZIONE” Bioinnoverbe – Villa Chiozza, 25 Febbraio 2009
6
DETERMINAZIONE DELLA ATTIVITA’ ANTIOSSIDANTE
Sono stati applicati 2 metodi:
DPPH
Viene valutata l’attività di radical scavenging dei composti fenolici nei confronti del
radicale stabile 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH•). Viene valutato il calo di
assorbanza a 515 nm; il risultato è valutato come percentuale di DPPH• residuo
dopo 30 minuti, e graficato rispetto alla concentrazione di estratto (mg/L). Dalla retta
così ottenuta è possibile calcolare la concentrazione IC50, ovvero la concentrazione
di estratto (espressa come mg/L) che riduce del 50% la concentrazione iniziale di
DPPH.
TEAC (Trolox equivalence antioxidant capacity)
Questo test valuta la capacità di radical scavenging di un composto nei confronti del
radicale catione 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS•+).
Viene valutata spettrofotometricamente (λ =734 nm) la diminuzione di assorbanza
della soluzione di radicale e campione. Il risultato è espresso come trolox-equivalenti
(µmoli di trolox aventi attività antiossidante pari ad 1 mg di estratto).
L. Alexandru, A. Liessi, M. Marega, L.Conte – “INNOVARE L’AGRICOLTURA NEL RISPETTO DELLA TRADIZIONE” Bioinnoverbe – Villa Chiozza, 25 Febbraio 2009
7
FENOLI TOTALI
IC50
TEAC
(mg ac. Gallico/g estratto)
(mg estratto/L)
(µmoli/mg estratto)
BUON ENRICO
60,1
±
0,4
222
±
3
0,38
±
0,01
BARBA DI CAPRA
56,9
±
0,3
22,7
±
0,2
0,46
±
0,03
LEVISTICO
42,4
±
0,8
83
±
2
0,26
±
0,01
VALERIANELLA
75,3
±
0,4
58
±
2
0,156
±
0,008
SILENE
39,6
±
0,8
80,4
±
0,4
0,242
±
0,005
L. Alexandru, A. Liessi, M. Marega, L.Conte – “INNOVARE L’AGRICOLTURA NEL RISPETTO DELLA TRADIZIONE” Bioinnoverbe – Villa Chiozza, 25 Febbraio 2009
8
SEPARAZIONE ED IDENTIFICAZIONE DEI COMPOSTI FENOLICI
Per la separazione dei composti fenolici si
è utilizzata la strumentazione HPLC-MS del C.R.I.T.A.
Si è utilizzata una colonna SPHERISORB
C18 (250 x 2mm, 5µm), con una fase mobile
costituita da un gradiente di acqua con
lo 0,3% di acido formico (A) e metanolo (B);
Flusso 0.19 ml/min. Per l’analisi LC-MS
gli estratti sono stati opportunamente
diluiti con una soluzione metanolo:acqua
(50:50) acidificata con acido formico (0,2%).
L. Alexandru, A. Liessi, M. Marega, L.Conte – “INNOVARE L’AGRICOLTURA NEL RISPETTO DELLA TRADIZIONE” Bioinnoverbe – Villa Chiozza, 25 Febbraio 2009
9
Correlazione tra i dati di attività antiossidante e la concentrazione in fenoli totali
0,5
0,5
T EA C (m g /u M o li)
1/IC 50 (1/(m g /L ))
0,1
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
y = 0,0002x + 0,0098
R2 = 0,0202
0,0
0,0
0,0
0,4
0,4
0,3
0,3
0,2
0,2
0,1
0,1
y = -0,001x + 0,3536
R2 = 0,014
0,0
0,0
0,0
20,0
40,0
FT (mg/L)
60,0
80,0
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
FT (mg/L)
L. Alexandru, A. Liessi, M. Marega, L.Conte – “INNOVARE L’AGRICOLTURA NEL RISPETTO DELLA TRADIZIONE” Bioinnoverbe – Villa Chiozza, 25 Febbraio 2009
10
[M-H]447
Composto
Luteolin-glycoside
449
Eriodictyol-glycoside
593
Luteolin-rhamnoglycoside
537
Acido litospermico
179
Acido caffeico*
Composti fenolici identificati
nell’estratto di Barba di capra
[M-H]-
Composti fenolici identificati
nell’estratto di Valerianella
Composto
593
Luteolin-rhamnoglycoside
447
Luteolin-glycoside
577
apigenin-rhamnoglycoside
607
Diosmetin-rhamnoglycoside
609
Hesperetin-rhamnoglycoside
537
Acido litospermico
595
Eriodictyol-rhamnoglycoside
L. Alexandru, A. Liessi, M. Marega, L.Conte – “INNOVARE L’AGRICOLTURA NEL RISPETTO DELLA TRADIZIONE” Bioinnoverbe – Villa Chiozza, 25 Febbraio 2009
11
OH
HO
O
OH
O
HO
O
O
OH
Eriodyctiolo
OH
Luteolina
OH
OH
HO
OH
O
O
Diosmetina
O
OH
CH3
L. Alexandru, A. Liessi, M. Marega, L.Conte – “INNOVARE L’AGRICOLTURA NEL RISPETTO DELLA TRADIZIONE” Bioinnoverbe – Villa Chiozza, 25 Febbraio 2009
12
OH
Diosmetina
HO
O
O
O
Diosmetina: La Diosmetina, il metabolita attivo della Diosmina, viene assorbita a livello intestinale e, una
volta in circolo, svolge le note attività di diminuzione sulla permeabilità capillare, di aumento sul tono
venoso e sulla portata linfatica. Inoltre, incrementa la pressione oncotica ed è efficace nel ridurre
l’essudato connesso ad esempio agli edemi post-traumatici degli arti. Studi in vitro ed in vivo hanno
evidenziato che Diosmina è in grado di proteggere le LDL dall'ossidazione, per attività sinergica agli
antiossidanti presenti normalmente nelle LDL, quali vitamina A ed E. L'effetto antiedemigeno di
Diosmetina si esplica mediante una riduzione della permeabilità e della fragilità capillare ed un aumento
del drenaggio linfatico (attività linfagoga).
Diosmetina migliora la microcircolazione in quanto:
- diminuisce l’iperpermeabilità capillare che è la causa principale dell'edema idiopatico ciclico.
- diminuisce la fragilità e aumenta la resistenza capillare in quanto, appartenendo al gruppo della
vitamina P, ha una attività capillaroprotettrice che si esplica con la diminuzione dei fenomeni emorragici
cutaneo-mucosi quali porpora, ecchimosi
OH
Luteolina
HO
OH
CH3
O
O
OH
Diosmetina e luteolina sono in grado di inibire sensibilmente e con meccanismo competitivo la
biotrasformazione epatica del diclofenac in 4’OH-diclofenac, reazione nota per essere mediata dall’enzima
CYP2C9 (Yuan, 2002). Entrambi i flavonoidi sono pertanto potenzialmente in grado di interferire in vivo con
l’attività dell’enzima CYP2C9, e di modificare quindi l’eliminazione di farmaci metabolizzati da tale enzima,
come suggerito da un recente studio di interazione in vivo tra diosmina e diclofenac.
La luteolina e' un flavonoide, potente antiossidante conosciuto da tempo per le sue proprieta'
antinfiammatorie e per essere in grado di inibire la liberazione di istamina in risposta a stimoli antigenici.
L. Alexandru, A. Liessi, M. Marega, L.Conte – “INNOVARE L’AGRICOLTURA NEL RISPETTO DELLA TRADIZIONE” Bioinnoverbe – Villa Chiozza, 25 Febbraio 2009
OH
13
CONCLUSIONI
I risultati del primi anno di ricerca hanno messo in evidenza quanto segue:
• In generale le piante studiate presentano interessanti e diversificati
contenuti di sostanze fenoliche ed una attività antiossidante non così elevata
come quella di altre famiglie botaniche ben conosciute per questo aspetto
(Labiatae), ma paragonabile ad altre piante commestibili
• Tra le sostanze fenoliche isolate ed identificate ne compaiono almeno un paio
note per le proprie attività biologiche positive: dalla prevenzione della fragilità
capillare (diosmetina) ad attività antiossidante ed ipo istaminizzante in
manifestazioni allergiche (luteolina)
L. Alexandru, A. Liessi, M. Marega, L.Conte – “INNOVARE L’AGRICOLTURA NEL RISPETTO DELLA TRADIZIONE” Bioinnoverbe – Villa Chiozza, 25 Febbraio 2009
14
GRAZIE PER L’ATTENZIONE
Gruppo di Chimica degli Alimenti
Università degli Studi di Udine
Renzo Bortolomeazzi
Lanfranco Conte
Sabrina Moret
Lavinia Alexandru
Anna Liessi
Milena Marega
Lorena Pizzale
Giorgia Purcaro
Jessica Vidusso
15
