La metodologia C.E.D.I.A.:
affidabilità, precisione,
robustezza
Nella Cattai
Laboratorio di Sanità Pubblica
ASL Lecco
Lecco 12 novembre 2010
Metodologia immunoenzimatica in fase omogenea CEDIA ®
C loned
E nzyme
D onor
I mmuno
A ssay
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Metodologia immunoenzimatica in fase omogenea CEDIA ®
I dosaggi CEDIA utilizzano la tecnologia del DNA ricombinante per
produrre un sistema di immunodosaggio altamente specifico
Il metodo si basa sul frazionamento dell’enzima batterico ß-galattosidasi,
in due frammenti inattivi chiamati Enzima Accettore (EA) ed Enzima
Donatore (ED)
Enzima Accettore
DNA ricombinante
Riassociazione
Enzima Donatore
Enzima Attivo
Ricombinato
ß-Galattosidasi
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Frammenti Inattivi
Metodologia immunoenzimatica in fase omogenea CEDIA ®
Enzima donatore ED
Enzima accettore EA
Enzima Attivo
Ricombinato
I due frammenti (enzima accettore ed enzima donatore) si riassociano
spontaneamente per formare un enzima attivo in grado di scindere un
substrato, dando così luogo ad una reazione colorimetrica misurabile
spettrofotometricamente
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Metodologia immunoenzimatica in fase omogenea CEDIA ®
I reagenti utilizzati per il dosaggio delle droghe d’abuso con metodo
CEDIA sono composti da :
Reagente 1 contenente l’enzima accettore
la sostanza da ricercare
e l’anticorpo specifico per
Reagente 2 contenente l’enzima donatore
da ricercare ed il composto colorante
(rosso di clorofenolo-b-D-galattopiranoside)
coniugato alla sostanza
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Metodologia immunoenzimatica in fase omogenea CEDIA ®
Nella miscela di reazione si verranno a trovare quindi i seguenti
componenti
R1
Sostanza da ricercare nel materiale biologico
R2
Reazione negativa : ΔA basso
Reazione positiva : ΔA alto
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SISTEMA CEDIA ®
Vantaggi metodologici
I vantaggi della linea CEDIA oltre agli aspetti operativi quali il
consolidamento su analizzatori multiparametrici di routine, riguardano
anche la qualità del risultato
I test CEDIA presentano infatti una maggiore separazione tra il calibratore
negativo, il cut-off e gli altri calibratori in termini di Δ di assorbanza rispetto
a tutti gli altri metodi ed in particolare nei confronti dei metodi EMIT ed al
lattice
Ciò permette una maggiore precisione nella valutazione dei risultati a
prescindere dalla variabilità strumentale
Campioni con valori vicini al limite di cut-off sono quindi maggiormente
discriminabili ed il rischio di falsi negativi o falsi positivi viene minimizzato
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SISTEMA CEDIA ®
Esempio di curva di taratura
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SISTEMA CEDIA ®
Menu Droghe d’Abuso
•
•
•
•
•
•
Barbiturati
Benzodiazepine HS
Buprenorfina
Cocaina
Metaboliti Metadone (EDDP)
Metadone
•
•
•
•
•
•
•
Oppiacei
Fenilciclidina
Propossifene
Cannabinoidi
6-AM
Amfetamine/ Ecstasy
Sample Check
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SISTEMA CEDIA ®
Due livelli di cut off disponibili
Le applicazioni per entrambi i valori di cut off sono validate
Sono disponibili due livelli di cut off per i seguenti test
–
–
–
–
–
–
Cutoff Primario
(ng/ml)
Cutoff Secondario
(ng/ml)
Amf/Ecstasy
Barbiturici
Benzodiazepine
Cocaina
Oppiacei
THC
1000
300
300
300
2000
50
–
–
–
–
–
–
500
200
200
150
300
25
Amf/Ecstasy
Barbiturici
Benzodiazepine
Cocaina
Oppiacei
THC
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SISTEMA CEDIA ®
COMPARAZIONE
RANGE DI LINEARITA’
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SISTEMA CEDIA ®
PRECISIONE Intra-Serie
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SISTEMA CEDIA ®
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SISTEMA CEDIA ®
• BENZODIAZEPINE HS
Altissima sensibilità e rilevazione dei metaboliti glucuronidati
• EDDP
Nessuna cross-reattività con metadone
• COCAINA
Alta sensibilità per cocaina e cocaetilene
• OPPIACEI
Alta sensibilità per i metaboliti glucuronidati
• TEST ANTIADULTERAZIONE
Ottima specificità per i dosaggi CEDIA su sostanze adulteranti
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SISTEMA CEDIA ®
Benzodiazepina HS
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SISTEMA CEDIA ®
Benzodiazepina HS
Aggiungere una determinata quantità dell’enzima
β-glucuronidasi al reagente R1
Porre nello strumento e
procedere all’analisi
normalmente con la metodica
delle Benzodiazepine
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SISTEMA CEDIA ®
Misurato come 7-NH2-Clonazepam
In rosso valori < 200 ng/mL
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SISTEMA CEDIA ®
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SISTEMA CEDIA ®
• Metabolita primario del metadone
• La ratio metadone/EDDP nelle urine dei
pazienti è tipicamente 1:1 o 2:1
• Identifica i “Fast metabolizers”
• Identifica gli “adulteratori”
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SISTEMA CEDIA ®
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SISTEMA CEDIA ®
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SISTEMA CEDIA ®
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SISTEMA CEDIA ®
1. Il problema: i test per il dosaggio degli oppiacei attualmente in
commercio non sono specifici per l’abuso di eroina
2. Essi rilevano:
farmaci sedativi per la tosse (codeina,idrocodone)
Morfina da semi di papavero
3. Soluzione SAMHSA
Alzare il cut-off a 2.000 ng/mL
Confermare tutti i campioni positivi al test degli oppiacei con il 6-AM
4. Soluzione CEDIA
sviluppare un test specifico per il 6-monoacetil morfina (6-AM) ad alta
sensibilità (10 ng/mL)
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SISTEMA CEDIA ®
Risultati su screening* di ottanta campioni :
74 campioni positivi per 6-AM con la GC/MS (20 ng/ mL)
®
sono risultati positivi per 6-AM con CEDIA
6 campioni negativi per 6-AM con la GC/MS sono risultati
®
negativi per 6-AM con CEDIA
3 dei campioni negativi con la GC/MS sono risultati positivi
con il 6-AM CEDIA ma sono risultati inferiori al cutoff
* Fonte Polizia Americana
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SISTEMA CEDIA ®
Following heroin administration, 6-AM was excreted rapidly with an average half-life of 0.6 h.
This resulted in a very short detection time for 6-AM with a range of 2-8 h at the most sensitive cutoff limit.
This short detection time limits the usefulness of 6-AM as a marker for identification of heroin abusers to a period
immediately after drug use. In contrast, free morphine and total morphine were detectable up to approximately
24 h after heroin administration. The average half-life for free morphine was 3.6 h and for total morphine was 7.9
h. After morphine and codeine administration, no 6-AM was detected by GC/MS above the 0.81-ng/mL detection
limit of the assay. It is concluded that the presence of 6-AM in urine can be interpreted with confidence to mean
that heroin, or 6-AM, was administered within 24 h of specimen collection and that the presence of 6-AM in urine
is not caused by morphine or codeine administration
Forensic drug testing for opiates: I. Detection of 6-acetylmorphine in urine as an indicator of
recent heroin exposure; drug and assay considerations and detection times.
Cone EJ, Welch P, Mitchell JM, Paul BD.
HO
O
N
CH 3
O
H
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3C
O
SISTEMA CEDIA ®
Identifica solamente i campioni positivi per l’abuso di eroina e non
quelli influenzati da alte concentrazioni di altri oppiacei
Limitato range di linearità - 20 ng/ml
Può non rilevare alte concentrazioni degli altri oppiacei che, comunque
sono evidenziabili con il kit specifico
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SISTEMA CEDIA ®
• Oppioide semisintetico derivante dalla Tebaina
• Agonista e antagonista
• Attività farmacologica inferiore a quella della morfina
• Blocca i recettori così che altre droghe non possano essere ulteriormente attive
Metabolismo
• NON viene assorbita dal tratto gastrointestinale
• Elevata liposolubilità / lunga durata d’azione
• Forte legame con le proteine tissutali / lunga durata d’azione
Programma
• Dosaggio semplice
• Assunzione ogni 2 / 3 giorni
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SISTEMA CEDIA ®
Vantaggi
• Buona sensibilità a cut off 5 ng/ml
• Buona precisione intra day
• Limite di rilevabilità a 1,77 ng/ml
• Ripetibilità dei dati di calibrazione
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SISTEMA CEDIA ®
Il test Anti Adulterazione è un test con metodologia CEDIA con un
coniugato sensibile che è in grado di rilevare sostanze che :
• Interferiscono con la reazione di complementazione
• Interferiscono con la reazione del substrato
• Distruggono i componenti del kit (EA, coniugato, substrato)
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SISTEMA CEDIA ®
• Innovazione tecnologica (tecnica del DNA ricombinante)
• Alta sensibilità analitica
• Ampi range di curva di taratura
• Elevata stabilità dei reagenti
(mediamente 60 gg. dopo ricostituzione)
• Differenti possibilità di scelta dei calibratori e definizione del cut-off
• Ripetibilità dei risultati tra lotti differenti
• Minima % di cross reattività
• Possibilità di scelta tra il dosaggio qualitativo e semiquantitativo
• Applicazioni e prestazioni consolidate su strumentazione Beckman
Coulter serie AU
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SISTEMA CEDIA ®
Reagenti da ricostituire
Rgt 1= reagente liofilo R1 (EA&Ab)
Rgt 1a = tampone di ricostituzione R1
Rgt 2 = reagente liofilo R2 (ED & CPRG)
Rgt 2a = tampone di ricostituzione R2
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PERCHE’ CEDIA ® e Beckman Coulter AU
• AFFIDABILITA’ STRUMENTALE
• PRECISIONE
• FLESSIBILITA’
• CUVETTE DI LETTURA IN VETRO OTTICO
• SISTEMA DI LAVAGGIO EFFICIENTE
• LINEARITA’ FOTOMETRICA
• MICROVOLUMI DI ANALISI
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Conclusioni
La tecnologia CEDIA rappresenta oggi la più solida ed affidabile
soluzione integrata per il dosaggio delle droghe d’abuso in “random
access”
I vantaggi del sistema CEDIA uniti all’alta tecnologia proposta dalla
piattaforma analitica Beckman Coulter serie AU, garantiscono la
soluzione ottimale per lo screening delle Droghe d’Abuso di primo
livello
La proposta attuale comprensiva di dosaggi esclusivi ed il continuo
sviluppo di nuovi prodotti garantiscono continuità nel campo dei
dosaggi delle Droghe d’Abuso in funzione delle continue evoluzioni
determinate dall’introduzione di nuove sostanze
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