Dosaggio di cotinina DRI®
Per uso diagnostico in vitro
0394 (Kit da 100 mL)
0395 (Kit da 500 mL)
Uso previsto
Il dosaggio di cotinina DRI® è un dispositivo medico diagnostico in vitro previsto per la
determinazione qualitativa e semiquantitativa di cotinina nell’urina umana ad un valore limite di
500 ng/mL. Tale dosaggio serve a facilitare il rilevamento di cotinina dopo l’uso o l’esposizione
a prodotti del tabacco.
Sommario e spiegazione del metodo
Il fumo di tabacco o l’inalazione passiva di fumo di tabacco provocano l’assorbimento di
nicotina attraverso i polmoni e le mucose della bocca. Quando la nicotina viene assorbita, essa
viene subito metabolizzata nel suo principale metabolita: la cotinina.1,2,3 La cotinina può essere
rilevata nell’urina di fumatori anche parecchi giorni dopo l’interruzione del fumo.
Per determinare lo stato di fumo di un soggetto, è possibile usare svariati metodi, fra cui la
misurazione del tiocianato, del monossido di carbonio e della cotinina.4,5,6 La misurazione del
monossido di carbonio e del tiocianato può fornire una indicazione falsa dell’uso di tabacco, in
quanto essi possono provenire da altre fonti ambientali.7 D’altra parte, la cotinina può derivare
soltanto dal metabolismo di nicotina e costituisce, pertanto, il migliore indicatore dello stato
di fumo.8
Il dosaggio di cotinina DRI è un immunodosaggio enzimatico omogeneo liquido pronto per
l’uso. L’analisi si basa sulla competizione della cotinina marcata con enzima glucosio-6-fosfato
deidrogenasi (G6PDH) con la cotinina libera contenuta nel campione per un numero fisso di siti
di legame anticorpale specifico della cotinina. L’attività dell’enzima G6PDH viene determinata
spettrofotometricamente a 340 nm misurando la sua capacità di convertire la nicotinamide
adenina dinucleotide (NAD) in NADH.
Preparazione e conservazione dei reagenti
I reagenti sono pronti per l’uso, e pertanto non richiedono alcuna preparazione. Tutti i
componenti del dosaggio, quando conservati in frigorifero, sono stabili fino alla data di
scadenza indicata sull’etichetta.
Raccolta e trattamento del campione
Raccogliere i campioni di urina in recipienti di vetro o plastica. Si consiglia di analizzare
campioni di urina freschi.
Microgenics raccomanda di usare campioni di urina freschi. Se i campioni non vengono
analizzati inizialmente entro 7 giorni, devono essere conservati congelati.
I campioni con un range di pH compreso fra 4 e 9 sono adatti per l’analisi con questo dosaggio.
Fare attenzione a mantenere i campioni pipettati privi di residui macroscopici; prima dell’analisi,
si raccomanda di centrifugare i campioni che presentano torbidità elevata. L’adulterazione dei
campioni di urina può dare luogo a risultati errati. Se si sospetta adulterazione, ottenere un altro
campione e inviare entrambi i campioni al laboratorio per l’analisi.
Manipolare tutti i campioni di urina come se fossero potenzialmente infettivi.
Procedura di analisi
Ai fini del presente dosaggio è possibile utilizzare gli analizzatori in grado di mantenere una
temperatura costante, pipettare i campioni, miscelare i reagenti, misurare i tassi enzimatici a
340 nm e regolare con precisione i tempi di reazione.
Prima di eseguire l’analisi, consultare le istruzioni applicative specifiche dell’analizzatore in
dotazione per ottenere i parametri chimici.
Controllo di qualità e calibrazione
Reagenti
Reagente anticorpo/substrato:
contiene anticorpo monoclonale di topo anti-cotinina, glucosio-6-fosfato (G6P) e nicotinamide
adenina dinucleotide (NAD) in tampone Tris con azoturo di sodio come conservante.
Reagente coniugato enzimatico:
contiene cotinina marcata con glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PDH) in tampone Tris con
azoturo di sodio come conservante.
Ulteriori materiali necessari (venduti separatamente):
0404 0460 0470 Descrizione del kit
Kit calibratore cotinina DRI, 6 x 5 mL
Controllo basso cotinina DRI, 5 mL
Controllo alto cotinina DRI, 5 mL
Avvertenze e precauzioni
Il presente dosaggio è esclusivamente per uso diagnostico in vitro. I reagenti sono nocivi se
ingeriti.
I reagenti del dosaggio contengono < 0,09% azoturo di sodio. Evitarne il contatto con la pelle e le
mucose. In caso di contatto, sciacquare le aree interessate con abbondanti quantità di acqua.
Se i reagenti vengono ingeriti o vengono a contatto con gli occhi, rivolgersi immediatamente ad
un medico. Il sodio azide può reagire con il rame o il piombo delle tubature di scarico generando
azidi metalliche potenzialmente esplosive. Quando si gettano via tali reagenti, sciacquare
sempre con abbondanti quantità di acqua per impedire l’accumulo di azidi. Pulire le superfici
metalliche esposte con una soluzione di idrossido di sodio al 10%.
Non usare i reagenti scaduti.
Analisi qualitativa
Per l’analisi qualitativa dei campioni, usare il calibratore da 500 ng/mL come livello limite. Il
calibratore di cotinina DRI, contenente 500 ng/mL di cotinina, viene usato come valore limite di
riferimento per la distinzione tra i campioni positivi e i campioni negativi.
Analisi semiquantitativa
Per l’analisi semiquantitativa, usare tutti i calibratori.
Una buona prassi di laboratorio prevede l’analisi di campioni di controllo allo scopo di garantire
le corrette prestazioni del dosaggio. Per convalidare la calibrazione, usare controlli vicini al
calibratore sovrapponibile al valore limite. I risultati di controllo devono ricadere entro i range
prestabiliti determinati dal laboratorio di appartenenza. In caso contrario, i risultati del dosaggio
non sono validi. Tutti i requisiti di controllo della qualità vanno soddisfatti in conformità alle
normative vigenti o ai requisiti per l’accreditamento.
Risultati e valori attesi
Risultati qualitativi
Il calibratore da 500 ng/mL viene usato come valore limite di riferimento per la distinzione tra
i campioni positivi e i campioni negativi. Un campione che mostra una variazione nel valore di
assorbanza (∆A) uguale o maggiore rispetto al valore ottenuto mediante il calibratore per valore
limite è considerato positivo. Un campione che mostra una variazione nel valore di assorbanza
(∆A) minore rispetto a quello ottenuto mediante il calibratore per valore limite è considerato
negativo.
Risultati dell’analisi semiquantitativa
Per ottenere una stima approssimativa della concentrazione di sostanza nei campioni, tracciare
una curva standard con tutti i calibratori e quantificare i campioni che ricadono al di fuori della
curva standard. È possibile usare questo metodo per la conferma o il controllo di qualità delle
diluizioni. Quando la concentrazione stimata dei campioni è superiore al calibratore più alto,
il campione può essere diluito in calibratore negativo e analizzato nuovamente. Il range del
dosaggio è compreso tra 300 ng/mL e 2000 ng/mL.
Limitazioni
1. Un risultato di analisi positivo indica solo la presenza di cotinina e non si correla
necessariamente all’intensità degli effetti fisiologici e psicologici.
2. Un risultato di analisi positivo ottenuto mediante il presente dosaggio va confermato
mediante un altro metodo di tipo non immunologico, come la GC o la GC/MS.
3. Il dosaggio è previsto per essere eseguito unicamente su urina umana.
4. È possibile che altre sostanze e/o fattori, ad es. problemi tecnico-procedurali o altri
composti simili alla cotinina differenti da quelli sottoposti ad esame nello studio
specifico, possano interferire con l’analisi e causare risultati falsi.
Caratteristiche di rendimento del test tipiche
Le caratteristiche di rendimento del test tipiche ottenibili mediante l’analizzatore Hitachi 717
sono riportate qui di seguito.10 I valori ottenuti nei diversi laboratori possono essere differenti
da quelli riportati in questa sede.
I composti che non hanno alcuna correlazione strutturale con la cotinina hanno prodotto
risultati negativi alle concentrazioni elencate di seguito.
Precisione
Il controllo negativo, il controllo positivo e il calibratore per il valore limite sono stati analizzati
utilizzando un protocollo NCCLS modificato. L’analisi è stata eseguita in modo qualitativo e
semiquantitativo esaminando tutti i tre livelli in 6 replicati, due volte al giorno per 10 giorni.
Composto
d-Metamfetamina
Qualitativo (mA/min):
Calibratore/
Controllo
Intra-analisi
Tra analisi
Mean
SD
%CV
Mean
SD
%CV
404
2,2
0,5
404
2,7
0,7
300 ng/mL
500 ng/mL
421
2,3
0,5
421
2,9
0,7
700 ng/mL
437
2,6
0,6
437
3,5
0,8
Calibratore/
Controllo
100
Acetamminofene
1.000
Acido acetilsalicilico
1.000
Acido valproico
Amfetamina
Amitriptyline
Benzoilecgonina
Intra-analisi
Tra analisi
100
Mean
SD
%CV
300 ng/mL
333
20,0
6,0
333
32,0
9,4
500 ng/mL
510
27,9
5,5
510
38,6
7,6
Ephedrine
700 ng/mL
716
36,4
5,1
716
50,4
7,0
Fenciclidina
Diazepam
100
Doxylamine
500
Accuratezza
Sono stati analizzati centonovantaquattro campioni con il dosaggio di cotinina DRI e EIA
cotinina OTI AUTO-LYTE® usando 500 ng/mL di cotinina come calibratore per il valore limite.
Tutti i campioni sono stati confermati mediante GC/MS. I risultati ottenuti mediante metodica
qualitativa e semiquantitativa sono riportati di seguito:
Fenitoina
Qualitativa
Dei 194 campioni, 112 sono risultati positivi e 60 negativi mediante entrambi gli immunodosaggi.
Nortriptyline
AUTO-LYTE®
Cotinina EIA
-
+
112
21*
-
1*
60
GC/MS
Fenobarbitale
Ibuprofene
Morphina
Oxazepam
Pheniramine
Primidone
+
-
Propoxyphene
+
110
0
Quinidine
-
3**
81
Ranitidina
Secobarbitale
* I risultati ottenuti mediante il dosaggio di cotinina DRI sono stati confermati dalla GC/MS.
** Due su tre campioni discordanti sono risultati al limite della positività.
Semiquantitativa
Dei 194 campioni, 114 sono risultati positivi e 63 negativi mediante entrambi gli immunodosaggi.
Dosaggio di
cotinina DRI
AUTO-LYTE®
Cotinina EIA
+
-
+
-
114
17*
0
63
+
-
0
Acetamminofene
80
Negativo
Nicotine
500
Negativo
Nicotinic Acid
500
Negativo
Nicotinic Acid N-Oxide
500
Negativo
500
1.000
100 μg/mL
1.250 mg/dL
100 mg/mL
Albumina sierica umana
500 mg/dL
Aspirin
100 μg/mL
Caffeina
100 μg/mL
0,5 g/dL
Creatinina
500 mg/dL
Emoglobina
300 mg/dL
-globulina
Glucosio
1 g/dL
10 mg/dL
500 mg/dL
3.000 mg/dL
Ibuprofen
100 μg/mL
Riboflavina
7,5 mg/dL
Urea
pH range
2
Concentrazione
Acido ossalico
Galattosio
Positivo
200
Acido ascorbico
Etanolo
500
50
1.000
1.000 mg/dL
Risultato
12,5
50
Acetone
Cloruro di sodio
Specificità
I composti correlati strutturalmente alla cotinina sono stati analizzati alla ricerca di reattività
crociata. I risultati sono elencati di seguito.
Niacinamide
50
500
50
110
3-Hydroxy-Cotinine
500
1.000
10
Composto
Sensibilità
La sensibilità, definita come la concentrazione più bassa differenziabile dal calibratore negativo
per l’urina con una confidenza del 95%, è di 34 ng/mL.
Concentrazione (μg/mL)
40
1.000
11-Nor-Δ9-THC-9-COOH
-
* I risultati ottenuti mediante il dosaggio di cotinina DRI sono stati confermati dalla GC/MS.
** Due su quattro campioni discordanti sono risultati al limite della positività.
Composto
500
Teofeillina
+
4*
1.000
Interferenza
Sono state esaminate sostanze endogene ed esogene alla ricerca di potenziali interferenze
con il dosaggio di cotinina. Non è stata osservata interferenza nei campioni di urina contenenti
i composti alle concentrazioni elencate di seguito. È stato esaminato anche il pH dell’urina alla
ricerca di possibili interferenze.
Dosaggio di
cotinina DRI
GC/MS
50
1.000
1.000
%CV
+
150
1.000
Codeina
SD
Dosaggio di
cotinina DRI
200
Caffeina
Mean
Dosaggio di
cotinina DRI
100
l-Metamfetamina
Acido urico
Semiquantitativo (ng/mL):
Concentrazione (μg/mL)
0,8 g/dL
4-9
Bibliografia
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Book Medical Publishers Inc. 1989, pp 591-595.
2. Fitzpatrick J. Urinary cotinine, Clin. Chem. News, 11 (1991).
3. Gritz ER et al. Plasma nicotine and cotinine concentrations in habitual smokeless
tobacco users. Clin. Pharmacol. Ther., 30, 201 (1981).
4.Langone JJ, Gjika HB and H Van Vunakis. Nicotine and its metabolites.
Radioimmunoassays for nicotine and cotinine. Biochemistry, 12, 5025 (1973).
5. Jarvis MJ, Tunstall-Pedoe H, Feyerabend C and C Vesey. Comparison of tests used to
distinguish smokers from nonsmokers. Am. J. Public Health, 77, 1435 (1987).
6.Pojer R, Whitfield JB, Poulos V, Eckhard IF, Richmond R and WJ Hensley.
Carboxyhemoglobin, Cotinine, and thiocyanate assay compared for distinguishing
smokers from nonsmokers. Clin. Chem., 30, 1377 (1984).
7. Matsukura, S., etal., Effects of Environmental Tobacco Smoke on Urinary Cotinine
Excretion in Non-Smokers. New England J. Med., 1984, 311: 828-832.
8. Haley NJ, Axelrad CM and KA Tilton. Validation of self-reported smoking behavior:
Biochemical analyses of cotinine and thiocyanate. Am. J. Public Health, 73, 1204 (1983).
9. Dati sulla tracciabilità sono disponibili presso la Microgenics Corporation, che fa parte
della Thermo Fisher Scientific.
10.Dati in archivio presso Microgenics, che fa parte della Thermo Fisher Scientific.
Microgenics Corporation
46360 Fremont Blvd.
Fremont, CA 94538-6406 USA
Assistenza tecnica e assistenza
alla clientela negli USA:
1-800-232-3342
Per gli aggiornamenti del foglietto illustrativo, visitare:
www.thermoscientific.com
Altri Paesi:
Consultare il rappresentante Thermo Fisher Scientific di zona.
0228-3
2011 01
3
Microgenics GmbH
Spitalhofstrasse 94
D-94032 Passau Germany
Tel: +49 (0) 851-88 68 90
Fax: +49 (0) 851-88 68 910
