LBF_2014_Lezione 6 - Ingegneria delle Nanotecnologie

SAPIENZA Università di Roma
Laurea magistrale in Ingegneria delle
Nanotecnologie
A.A. 2014-2015
Corso di Laboratorio di
Biofotonica
Prof. Francesco Michelotti
SAPIENZA Università di Roma
Facoltà di Ingegneria Civile e Industriale
[email protected]
Applicazioni dell’ottica e della fotonica
Tecniche Microscopiche (MSC)
• Fluorescenza convenzionale
• TIRF
• FLIM
• FRET, FRAP
• confocale
• a due fotoni
• di seconda armonica
• a super-risoluzione (SNOM, STED, PALM, STORM)
Tecniche Non Microscopiche
• Citofluorimetria
• ELISA
• DNA-Chip
• Cycle-sequencing
• SOLID
Altre Tecniche
Non
Microscopiche
• Southern
• Western
• Northern
Tecniche Non
Microscopiche
Label-free
•
•
•
•
Surface plasmon
Polaritons (SPP)
Photonic
crystals (PC)
Raman e CARS
Quantum dots
Utilizzano tutte
l’emissione di
marcatori (labels)
luminescenti
LEZIONE 6
Microscopie a super-risoluzione
(STEP, PALM, STORM)
Test ELISA
STED – STimulated Emission Depletion Microscopy
Nella microscopia STED il campione viene eccitato e la fluorescenza viene raccolta come in microscopia convenzionale
wide-field. Un secondo fascio causa la diseccitazione per
emissione stimolata dei fluorofori in una zona anulare intorno
all‟asse.
STED – STimulated Emission Depletion Microscopy
Se
t1
Sg
t2>t1
t
STED – STimulated Emission Depletion Microscopy
• La diffrazione limiterebbe la risoluzione anche in questo caso.
• Il vero meccanismo responsabile
dell‟aumento di risoluzione è la
saturazione della riduzione di
fluorescenza mediante emissione stimolata.
• La risoluzione è data da:
x 

2n sin  1 
I
I SAT
ISAT
STED – STimulated Emission Depletion Microscopy
STED – STimulated Emission Depletion Microscopy
• La diffrazione limiterebbe la risoluzione anche in questo caso.
• Il vero meccanismo responsabile
dell‟aumento di risoluzione è la
saturazione della riduzione di
fluorescenza mediante emissione stimolata.
• La risoluzione è data da:
x 

2n sin  1 
I
I SAT
ISAT
STED – STimulated Emission Depletion Microscopy
• La diffrazione limiterebbe la risoluzione anche in questo caso.
• Il vero meccanismo responsabile
dell‟aumento di risoluzione è la
saturazione della riduzione di
fluorescenza mediante emissione stimolata.
• La risoluzione è data da:
x 

2n sin  1 
I
I SAT
ISAT
STED – STimulated Emission Depletion Microscopy
• La diffrazione limiterebbe la risoluzione anche in questo caso.
• Il vero meccanismo responsabile
dell‟aumento di risoluzione è la
saturazione della riduzione di
fluorescenza mediante emissione stimolata.
• La risoluzione è data da:
x 

2n sin  1 
I
I SAT
ISAT
STED – STimulated Emission Depletion Microscopy
• La diffrazione limiterebbe la risoluzione anche in questo caso.
• Il vero meccanismo responsabile
dell‟aumento di risoluzione è la
saturazione della riduzione di
fluorescenza mediante emissione stimolata.
• La risoluzione è data da:
x 

2n sin  1 
I
I SAT
ISAT
STED – STimulated Emission Depletion Microscopy
• La diffrazione limiterebbe la risoluzione anche in questo caso.
• Il vero meccanismo responsabile
dell‟aumento di risoluzione è la
saturazione della riduzione di
fluorescenza mediante emissione stimolata.
• La risoluzione è data da:
x 

2n sin  1 
I
I SAT
ISAT
STED – STimulated Emission Depletion Microscopy
• La diffrazione limiterebbe la risoluzione anche in questo caso.
• Il vero meccanismo responsabile
dell‟aumento di risoluzione è la
saturazione della riduzione di
fluorescenza mediante emissione stimolata.
• La risoluzione è data da:
x 

2n sin  1 
I
I SAT
ISAT
STED – STimulated Emission Depletion Microscopy
ISAT
NOTA BENE
• Se non c‟è saturazione della
riduzione
di
fluorescenza
(ISAT=) la risoluzione è quella
data dalla formula di Abbe
ovvero
è
limitata
dalla
diffrazione.
x 

I
2n sin  1 
I SAT  


2n sin 
STED – STimulated Emission Depletion Microscopy
Dye name
(Manufacturer / Distributor)
Exc.
Exc.
Wavelengt Pulse
h
Length
STED
STED
Wavelengt Pulse
h
Length
Reported Spatial
Repetition Avg. STED Peak
Pulse
Resolution
Rate
Power
Irradiance Energy
(Direction)
ATTO 532 (ATTO-TEC GmbH)
Chromeo 488 (Actif Motif)
470 nm
488 nm
80 ps
140 ps
603 nm
602 nm
280 ps
~ 160 ps
250 kHz
250 kHz
DY-485XL (Dyomics GmbH)
488 nm
< 100 ps 647 nm
~ 200 ps
72 MHz
GFP
490 nm
100 ps
ATTO 565 (ATTO-TEC GmbH)
532 nm
~ 90 ps
MR 121 SE (Roche Diagnostics)
532 nm
10 ps
NK51 (ATTO-TEC GmbH)
532 nm
< 100 ps 647 nm
~ 200 ps
72 MHz
Sulfonated & rigidized
rhodamine derivatives (V.
Boyarskiy, NanoBiophotonics,
MPI Göttingen)
532 nm
100 ps
640 nm
~ 300 ps
80 MHz
554 nm
250 fs
760 nm
13 ps
76 MHz
554 nm
250 fs
ATTO 590 (ATTO-TEC GmbH)
570 nm
~ 90 ps
745 nm
13 ps
690 – 710
~ 90 ps
nm
ATTO 633 (ATTO-TEC GmbH)
630 nm
~ 90 ps
ATTO 647N (ATTO-TEC GmbH)
JA 26 (K.H. Drexhage, Siegen
University)
635 nm
cw
735 – 755
~ 90 ps
nm
750 nm
cw
635 nm
68 ps
775 nm
Pyridine 2 / LDS 722
(Exciton, Radiant Dyes GmbH)
RH 414 (Invitrogen Corp.)
575 nm
200 ps
640 – 660
~ 90 ps
nm
793 nm
107 ps
300 ps
80 MHz
0.5 mW
0.6 mW
(20 + 3)
mW
7.2 mW
2 nJ
40 – 45 nm (xyz)
~ 70 nm (xy)
1 – 2 MHz
76 MHz
76 MHz
<25 nm (xy)
< 30 nm (xy)
30 – 40 nm (xy)
10.4 mW
(20 + 3)
mW
~ 50 nm (z)
40 – 45 nm (xyz)
40
MW/cm2
< 90 nm (xy)
33 nm (z)
8.78 mW
30 nm (z)
1 – 2 MHz
30 – 40 nm (xy)
1 – 2 MHz
30 – 40 nm (xy)
cw
76 MHz
423 mW
~ 50 nm (xy)
800
MW/cm2
16 nm (x)
STED – STimulated Emission Depletion Microscopy
Operando sulla focalizzazione del fascio STED si può
ottenere una riduzione di fluorescenza 3D e migliorare anche
la risoluzione assiale
STED – STimulated Emission Depletion Microscopy
Visualizzazione di singole vescicole in una sinapsi. Più precisamente si
vede la proteina sinaptotagmina che è inglobata nella membrana delle
vescicole. Le vescicole hanno una dimensione media di 40nm e sono
riempite di neurotrasmettitori.
STED – STimulated Emission Depletion Microscopy
Immagine confocale e STED ottenuta mediante un microscopio Leica
STED – STimulated Emission Depletion Microscopy
PALM – Photo-Activated Localisation Microscopy
STORM - STochastic Optical Reconstruction Microscopy
La base di base di entrambe le tecniche è quella di:
• Marcare il campione da osservare con cromofori
• Portare medianti un impulso di luce i cromofori in uno stato
“dark” da cui possono essere fotoattivati in uno stato
fluorescente mediante un secondo impulso di luce;
• A causa della natura stocastica della fotoattivazione, solo
pochi e ben separati cromofori saranno “accesi”. La
probabilità che vengano attivati due cromofori vicini è
bassissima.
• L‟emissione di tali cromofori viene fittata mediante curve
gaussiane recuperando la coordinata dell‟emettitore;
• Al termine dell‟emissione le poche molecole attivate vengono
irportate nello stato “dark” e un altro impulso di luce di
fotoattivazione attiva altri cromofori random
• Il processo è ripetuto molte volte costruendo l‟immagine
molecola per molecola.
PALM – Photo-Activated Localisation Microscopy
STORM - STochastic Optical Reconstruction Microscopy
Sono due tecniche sostanzialmente identiche che fanno uso di una
massiccia analisi statistica dei dati di fluorescenza.
CCD
n’
La posizione di un fluoroforo viene determinata con alta precisione fittando
la figura di diffrazione che viene a crearsi su un dispositivo di rivelazione a
CCD.
PALM – Photo-Activated Localisation Microscopy
STORM - STochastic Optical Reconstruction Microscopy
Il campione viene illuminato con impulsi di luce che attivano
stocasticamente pochi fluorofori a volta. La probabilità che si attivino due
fluorofori contigui viene minimizzata. Le posizioni dei fluorofori vengono
fittate ad ogni impulso.
CCD
Non ci si trova mai in condizioni di sovrapposizione delle figure di diffrazione
sotto il criterio di Rayleigh. Il processo viene ripetuto fino a ricostruire
l‟immagine.
PALM – Photo-Activated Localisation Microscopy
STORM - STochastic Optical Reconstruction Microscopy
Confronto tra TIRF e PALM ottenuata mediante un microscopio Zeiss.
Marcatura mediante anticorpi di tubulina in cellule coltivate.
STED – STimulated Emission Depletion Microscopy
PALM – Photo-Activated Localisation Microscopy
STORM - STochastic Optical Reconstruction Microscopy
Riassunto delle tecniche
http://www.nature.com/nmeth/video/moy2008/index.html
Applicazioni dell’ottica e della fotonica
Tecniche Microscopiche (MSC)
• Fluorescenza convenzionale
• TIRF
• FLIM
• FRET, FRAP
• confocale
• a due fotoni
• di seconda armonica
• a super-risoluzione (SNOM, STED, PALM, STORM)
Tecniche Non Microscopiche
• Citofluorimetria
• ELISA
• DNA-Chip
• Cycle-sequencing
• SOLID
Altre Tecniche
Non
Microscopiche
• Southern
• Western
• Northern
Tecniche Non
Microscopiche
Label-free
•
•
•
•
Surface plasmon
Polaritons (SPP)
Photonic
crystals (PC)
Raman e CARS
Quantum dots
Utilizzano tutte
l’emissione di
marcatori (labels)
luminescenti
Tecniche non microscopiche
ELISA - Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
• ELISA è un metodo di analisi immunologica usato in
biochimica per rilevare la presenza di un dato antigene,
tipicamente appartenente a un microorganismo patogeno,
grazie all'uso di uno specifico anticorpo.
• Esistono due varianti del test ELISA: Elisa non Competitivo
ed Elisa Competitivo.
• Il test Elisa non competitivo può essere condotto secondo
due varianti: metodo diretto e metodo indiretto.
• I test sono colorimetrici e la lettura avviene mediante uno
spettrofotometro.
ELISA non Competitivo
http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/ELISA.html
ELISA non Competitivo
• Preparazione dei pozzetti di una
apposita piastra da saggio in polistirene mediante immissione di una
soluzione dell'anticorpo primario,
specifico per l'antigene da ricercare.
L'anticorpo aderisce al fondo dei
pozzetti per mezzo di gelatina di
pesce. L'eccesso viene lavato via.
• Aggiunta dei campioni umani nei quali bisogna saggiare la presenza
dell'antigene caratteristico dell‟organismo patogeno. Lavaggio con
soluzione tampone. L'antigene, se presente, si lega specificamente con
l'anticorpo. L‟eccesso viene lavato via.
• Aggiunta degli anticorpi secondari. Tali anticorpi sono coniugati con un
enzima, tipicamente perossidasi o fosfatasi alcalina.
ELISA non Competitivo
• Gli anticorpi secondari si legano
selettivamente all'antigene, se presente. L'eccesso viene lavato via. L‟assenza dell‟antigene specifico per l‟anticorpo comporta che l‟anticorpo secondario (e il relativo enzima ad esso coniugato), con il lavaggio, venga lavato.
• Aggiunta di p-nitrofenilfosfato, che
provoca una reazione con l„enzima coniugato all'anticorpo secondario producendo p-nitrofenolo di colore giallo.
• Aggiunta di idrossido di sodio per
bloccare la reazione tra enzima e pnitrofenilfosfato.
• Lettura del risultato mediante uno
spettrofotometro.
ELISA non Competitivo
ELISA Competitivo
• Anticorpi provenienti da un saggio non marcati sono incubati in
presenza dei loro antigeni.
• Tali complessi anticorpo/antigene sono immessi nei pozzetti di
una piastra funzionalizzati con gli stessi antigeni.
• La piastra viene sciacquata in modo da rimuovere gli anticorpi
non legati.
• Si immettono anticorpi secondari specifici per il primo anticorpo.
Gli anticorpi secondari sono accoppiati ad un enzima.
• Si aggiunge un substrato e gli enzimi rimanenti causano un
cambiamento cromatico.
Nel test ELISA competitivo, più alta è la concentrazione di
antigeni nel saggio e più debole è il segnale. Il vantaggio è di
poter utilizzare campioni impuri ed essere ancora in grado di
legare selettivamente qualsiasi antigene presente.
ELISA Competitivo
Tecniche non microscopiche
ELFA - Enzyme-Linked Fluorescence Assay
• ELFA è un‟evoluzione del
test ELISA.
• L‟enzima legato all‟anticorpo secondario converte il
substrato in un composto
luminescente
• La lettura avviene mediante
un fluorimetro
Figure 1: Fluorescence image of a 96-well platereader
plate filled with an ELISA. The red framed wells contain
known concentrations and the blue framed wells the
unknowns. The wells marked with other colours contain
control solutions.
Tecniche non microscopiche
ELFA - Enzyme-Linked Fluorescence Assay
Tecniche non microscopiche
ELFA - Enzyme-Linked Fluorescence Assay
Tecniche non microscopiche
Sequenziamento DNA – Introduzione al metodo Sanger
• Il metodo di Sanger permette di sequenziare il DNA
utilizzando delle tecniche
biochimiche associate all‟
utilizzo di marker radioattivi.
• Si avvale di reazioni di
polimerizzazione di sequenze di amminoacidi (Nobel
Chimica 1980) e della tecnica della corsa elettroforetica (Nobel Chimica 1958)
sangerseq.exe
Tecniche non microscopiche
Cycle sequencing – Evoluzione metodo Sanger
• Il metodo di Sanger permette di sequenziare il DNA
utilizzando delle tecniche
biochimiche associate all‟
utilizzo di marker radioattivi.
• Si avvale di reazioni di
polimerizzazione di sequenze di amminoacidi (Nobel
Chimica 1980) e della tecnica della corsa elettroforetica (Nobel Chimica 1958)
cycseq.exe
Tecniche non microscopiche
Cycle sequencing – Esempio
Tecniche non microscopiche
Cycle sequencing – Esempio
Tecniche non microscopiche
Cycle sequencing – SOLID - Ulteriore evoluzione
SOLID.wmv
Applicazioni dell’ottica e della fotonica
Tecniche Microscopiche (MSC)
• Fluorescenza convenzionale
• TIRF
• FLIM
• FRET, FRAP
• confocale
• a due fotoni
• di seconda armonica
• a super-risoluzione (SNOM, STED, PALM, STORM)
Tecniche Non Microscopiche
• Citofluorimetria
• ELISA
• DNA-Chip
• Cycle-sequencing
• SOLID
Altre Tecniche
Non
Microscopiche
• Southern
• Western
• Northern
Tecniche Non
Microscopiche
Label-free
•
•
•
•
Surface plasmon
Polaritons (SPP)
Photonic
crystals (PC)
Raman e CARS
Quantum dots
Utilizzano tutte
l’emissione di
marcatori (labels)
luminescenti