LAFFORT-INFO INFO Dai lavori di Aline LONVAUD, Vincent RENOUF, Marie-Laure MURAT NUMERO 79 - Ottobre 2011 L'utilizzo enologico dei batteri lattici: lo stato dell'arte. Anche per questo 2011 la vendemmia nel nostro emisfero sta volgendo al termine, ed assieme alle chiusure delle fermentazioni alcoliche è, in tutte le cantine, all'ordine del giorno la gestione delle malolattiche. Negli ultimi anni è stato possibile, utilizzando innovative metodiche di analisi biochimica e genetica, caratterizzare sempre più precisamente i differenti ceppi di batteri lattici di interesse enologico e, più in generale, le varie componenti la microflora del vino, individuando con finezza sempre crescente i legami tra comportamenti metabolici, i corredi cromosomici ed i pool enzimatici, questi ultimi diretta espressione del patrimonio genetico. Nuove conoscenze, nuovi strumenti, metodiche innovative a disposizione dei tecnici nella pratica di cantina, dunque: vediamone in breve una rassegna. I lavori di caratterizzazione genetica e metabolica dei batteri lattici: principali risultati, loro rilevanza nella pratica di cantina. Il DNA è la struttura nella quale sono memorizzate le informazioni genetiche di tutti gli esseri viventi (salvo alcuni virus che utilizzano per questa funzione l'RNA). Le sequenze del DNA formano i geni, e l'insieme dei geni di un organismo vivente rappresenta il suo genoma. Nei batteri il genoma è essenzialmente costituito da un unico cromosoma circolare che può essere eventualmente completato da strutture extracromosomiche: i plasmidi. I plasmidi. Il termine plasmide sta ad indicare una molecola di DNA distinta dal DNA cromosomico batterico, e capace di replicarsi in maniera autonoma. I plasmidi presentano generalmente forma circolare, la loro taglia può variare da alcune centinaia di basi a diverse migliaia. Si replicano in maniera autonoma rispetto al cromosoma del batterio, e possono essere portatori di geni indispensabili ad alcune specifiche qualità di un ceppo batterico. I plasmidi possono essere persi spontaneamente nel corso della divisione cellulare, in particolar modo nel corso dei trapianti in condizioni di laboratorio. In Oenococcus oeni alcune proprietà specifiche di taluni ceppi sono associate alla presenza di determinati plasmidi. A volte si tratta di plasmidi interessanti, portatori ad esempio di geni di resistenza a taluni stress; altre volte possono avere un ruolo pregiudizievole, come quello scoperto da Patrick Lucas, presso l'ISVV di Bordeaux: questo plasmide è infatti portatore dei geni implicati nella sintesi dell'istamina, la principale ammina biogena contenuta nel vino. www.laffort.com I plasmidi (veri e propri partners genetici del batterio lattico) ne mantengono integrità ed identità garantendone l'espressione dei diversi caratteri metabolici. LAFFORT lavora in collaborazione con Patrick Lucas presso la Facoltà di Enologia di Bordeaux riguardo a queste problematiche, con l'obiettivo di predisporre idonei strumenti di selezione in grado di operare adeguatamente a questo livello di finezza, in modo da garantire la stabilità dei ceppi batterici destinati a produrre gli inoculi selezionati (nel corso dei cicli di produzione industriale i plasmidi di interesse non devono essere perduti). La struttura del genoma batterico. Il cromosoma di Oenococcus oeni, il principale batterio lattico della FML nel vino, possiede una dimensione di 1,9 milioni di coppie di basi, che costituiscono circa 1700 geni; questo numero può variare leggermente a seconda del ceppo. A titolo comparativo i lieviti possiedono circa 4.000 geni, l'uomo 25.000. Ad oggi è stato completamente sequenziato il genoma di tre ceppi di Oenococcus oeni (USA - Francia - Australia), ed i principali geni sono stati descritti. Numerosi altri lavori di sequenziamento sono attualmente in corso, particolarmente presso i laboratori di Bordeaux. Sequenziare completamente un genoma è fonte di innumerevoli informazioni sul patrimonio genetico ed il "funzionamento" del batterio. Oenococcus oeni: l'attività fermentativa malolattica e le altre possibili. I batteri lattici sono batteri capaci di metabolizzare sia gli acidi che gli zuccheri. Si ritrovano frequentemente in natura; nell'essere umano sono ad esempio presenti, fra l'altro, sulla pelle e nell'apparato digerente, ove esplicano numerose funzioni, contribuendo fondamentalmente a creare un ambiente ostile allo sviluppo di patogeni (ambiente acido grazie appunto alla produzione di acido lattico). Figura 1: colonia di Oenococcus oeni (cort. A. Lonvaud) NUMERO 79 - Ottobre 2011 LAFFORT-INFO Figura 2: analisi genetica per elettroforesi in campo pulsato. Differenti profili genetici di diversi ceppi batterici vengono evidenziati, distinti e resi confrontabili mediante amplificazione, separazione e fissazione su gel delle immagini ("bande") corrispondenti ciascuna ad uno specifico gene o gruppo di geni. Nella filiera agro-alimentare, tra le numerose applicazioni, vengono utilizzati nella fermentazione dei prodotti lattiero-caseari, che rendono maggiormente digeribili aumentando la biodisponibilità di vitamine e minerali. In enologia i batteri lattici sono i protagonisti della fermentazione malolattica: la trasformazione cioè dell'acido L-malico in acido Llattico, con sviluppo di CO2. Fin dai primi studi effettuati a riguardo è apparso evidente come il processo malolattico fosse benefico per la crescita batterica; è peraltro noto come la reazione non fornisca direttamente né ATP né NADH+ + H+, che costituiscono le due fonti principali dell'energia cellulare. L’energia apportata alla cellula in effetti è generata a livello della membrana dalla traslocazione delle molecole di malato (ingresso del reagente secondo il proprio gradiente di concentrazione) e di lattato (uscita del prodotto di reazione sempre secondo gradiente di concentrazione). La decarbossilazione dell'acido malico provoca poi anche un'alcalinizzazione del citoplasma. Tale differenza di pH tra l'interno e l'esterno della cellula genera una forza motrice di natura protonica, utilizzata come motore per la sintesi di ATP. La reazione appena descritta (vedi fig. 3) è catalizzata dall'enzima malolattico, situato all'interno della cellula. Per il decorso della reazione sono indispensabili, quali co-fattori, gli ioni magnesio (Mg ++) e manganese (Mn ++) ma anche un pH di 5,8. Quest'ultima condizione costringe i batteri lattici che si sviluppano nel vino, ambiente ad acidità maggiore, ad uno sforzo continuo di regolazione del loro pH intracellulare, e ne determina fortemente le inclinazioni metaboliche in questo specifico ambiente. Nell'intervallo di pH caratteristico dell'ambiente vino (2,9 - 4,2) Oenococcus oeni, per le ragioni metaboliche e biochimiche che abbia- mo appena evidenziato, trae indubbiamente vantaggio dalla trasformazione dell'acido malico (un di-acido) in acido lattico (unica funzione carbossilica): così facendo, infatti, riduce l'acidità del mezzo (il vino), diminuendo il lavoro di deprotonazione del citoplasma necessario per mantenerne il pH al valore ottimale. Normalmente - per i medesimi motivi - il batterio lattico presenta nel vino, pur avendone la possibilità, scarsa propensione ad attaccare gli zuccheri (privi di funzione acida) per produrre acidi (acetico e lattico): ciò consente, utilizzando ceppi accuratamente selezionati, di poter procedere all'inoculo malolattico anche in presenza di zuccheri (coinoculo precoce o tardivo). Chiaramente massima cautela va posta nell'adottare la strategia di inoculo nei vini ai limiti di pH più elevati: non dimentichiamo che la scala del pH ha un andamento logaritmico, per cui anche una variazione di un decimo di punto presenta un "peso" notevole; in tutti i casi in tali condizioni è sempre consigliabile procedere all'inoculo malolattico sì precocemente, in maniera da sfruttare le condizioni ambientali più clementi e minimizzare il periodo di vuoto microbiologico favorevole allo sviluppo di microflora opportunista indesiderata (es. Brettanomyces), ma comunque successivamente all'avvenuto completo consumo degli zuccheri da parte dei lieviti (inoculo sequenziale precoce). FA e FML: sequenza e correlazioni. Nelle logiche dell'enologia classica le due fermentazioni erano distinte e separate da un intervallo di tempo che poteva essere anche notevole (spesso la FML spontanea si avviava in primavera, al ritorno di condizioni termiche meno proibitive, con conseguente dilatarsi dei tempi di preparazione dei vini per i quali era imprescindibile). Controllata e più facilmente gestita in un passato anche non recentissimo la prima, lasciata all'alea per mancanza sostanziale di conoscenze approfondite e di adeguati strumenti biotecnologici fin quasi ai giorni nostri la seconda. Le due fermentazioni - come peraltro ogni snodo del processo di vinificazione - sono comunque strettamente interconnesse ed il netto e deciso svolgersi della FA è prerequisito essenziale per un ottimale decorso della FML, nonché per la possibilità stessa di condurla nelle condizioni più favorevoli e clementi. Come è ormai universalmente noto una FA stentata induce nei lieviti la produzione di metaboliti (principalmente acidi grassi C6-C8-C10) che si comportano da vere e proprie tossine non solo per i lieviti, con possibile rallentamento od addirittura blocco dell'attività fermentativa, ma anche e soprattutto per i batteri lattici, inibiti da dosi di C6-C8-C10 anche inferiori a 20 mg/L. In più, in presenza di una FA languente non è mai consigliabile procedere ad alcuna forma di coinoculo né precoce né tardivo. Questo a prescindere da qualsiasi altra condizione, anche favorevole, ad evitare la possibilità, tutt'altro che remota, di un arresto fermentativo - da riavviare - in presenza di una popolaFigura 3: schematizzazione della cinetica della FML a livello cellulare. zione lattica già attiva ed in assenza di dominanza della nicchia ecologica da parte di S. cerevisiae. 2 NUMERO 79 - Ottobre 2011 LAFFORT-INFO In tali evenienze infatti le problematiche sono molteplici e di onerosissima risoluzione, mai comunque coronata dal mantenimento dell'integrità qualitativa del prodotto. I prerequisiti di inoculo: gestire la FA. Una FA regolare, con chiusura netta e decisa è la conditio sine qua non per poter gestire con sicurezza e successo la totalità delle opzioni possibili di inoculo malolattico. Ecco allora alcuni suggerimenti validi in linea generale per tutte le FA: - Utilizzare un ceppo di LSA vigoroso, buon fermentatore, adatto agli obiettivi enologici prefissati (Gamma Laffort Actiflore / Zymaflore); - Utilizzo di un preparatore per lieviti nella fase di reidratazione, che apporti in maniera mirata steroli ed acidi grassi essenziali per la fluidità delle membrane nella fasi critiche di chiusura FA (Superstart nell'acqua di reidratazione dei lieviti, almeno 20 g/hL); - Gestire la nutrizione dei lieviti in maniera proporzionale all'APA presente nel Figura 4: le possibili opzioni temporali per l'effettuazione dell'inoculo malolattico, mosto, alle specifiche condizioni vendemmiali in riferimento allo svolgersi della FA. ed al grado alcolico potenziale (tenere presente che le esigenze di APA variano da un minimo di 150 mg/L per - in linea di principio non è mai consigliabile ritardare ulteriorun 11% vol potenziale a 350-400 mg/L per 16,5-17% vol potenzia- mente l'inoculo in quanto: li); • più ci si allontana dall'inizio della FA più l'ambiente diviene - Garantire la regolarità fermentativa con un accurato ed ostile, povero in elementi nutritivi e ricco in tossine, metaefficace controllo della temperatura e, a seconda delle condizioni, boliti, alcol; con opportuno trattamento ad azione detossificante e stimolante • più si procede maggiore è lo sviluppo della flora microbica (Bioactiv, Biocell). opportunista, che, insediandosi, occupa la nicchia ecologica depauperandola ulteriormente di risorse e producendo meA ciascun vino il suo inoculo. taboliti tossici per i batteri (C6-C8-C10) ed organoletticaCon la tranquillità derivante da una FA ben gestita, con decorso previmente problematici (etil e vinil fenoli). sto regolare netto e completo è possibile allora prendere in considerazione, in funzione delle condizioni del mosto (pH, acidità, alcol poten- Quindi, salvo rari casi molto particolari, la letteratura più aggiornata in ziale), del progetto enologico (vino novello, da consumarsi giovane, materia concorda sul fatto che non sembra vi siano ragioni tecnicadestinato ad un lungo affinamento) e delle specifiche scelte dell'eno- mente fondate che possano spingere ad optare per un inoculo tardivo. logo, l'intero ventaglio delle possibilità di inoculo malolattico: - in situazioni di pH tendenzialmente basso, per vini novelli o da consumarsi giovani (a rapida rotazione) è possibile prevedere un Metabolismo citrico e problematiche collegate: geco-inoculo precoce, da eseguirsi nelle 24-48 ore successive all'inocu- stire il fine malolattica. lo dei lieviti, avendo cura di NON arieggiare il mosto nelle 12-18 ore L’acido L-malico non è in effetti l'unico substrato idoneo ai batteri successive, in modo che l'anossia serva da ulteriore stimolo all'avvio lattici del vino. del metabolismo lattico che desideriamo i batteri avviino; normal- Sebbene presenti una concentrazione nettamente inferiore a quella mente la FML inizia a FA non ancora terminata, e termina pochi dell'acido malico, l'acido citrico è ugualmente un importante substrato per i batteri del vino. giorni dopo la fine della stessa; - per pH intermedi, in caso di vini a rapida e media rotazione L’acido citrico è consumato in maniera continua nel corso della FML, si può optare per un co-inoculo sequenziale, da prevedersi attorno ai ma ad una velocità nettamente inferiore di quella alla quale viene 1000 - 1010 punti di densità, avendo sempre cura di evitare arieg- utilizzato l'acido malico, cosicché, al termine della FML, i vini ne congiamenti al mosto-vino nelle 12-18 ore successive l'inoculo, sempre tengono ancora fino a 100–200 mg/L, ovvero dal 30 al 60 % della per stimolare il corretto instradamento del metabolismo batterico; concentrazione iniziale. normalmente la FML inizia a fine FA, e termina 1 - 2 settimane Ciononostante l'acido citrico si rivela essere un substrato importante per i batteri lattici, poiché all'inizio della loro fase di crescita essi lo dopo; - in situazioni di pH elevato, o per vini destinati ad un lungo degradano necessariamente per la sintesi dei lipidi. affinamento si può ritenere preferibile ricorrere all'inoculo sequenziale E' importante ricordare che al momento attuale nessun lavoro di ricerprecoce, da effettuarsi a cavallo della svinatura, o comunque a zuc- ca genetica ha potuto dimostrare l'assenza dei geni che presiedono al cheri esauriti: sempre valida l'accortezza di non arieggiare durante le metabolismo dell'acido citrico nei batteri lattici. ore a cavallo dell'inoculo malolattico; sfruttando il calore residuo I rari ceppi "citrato-negativi" sono stati ottenuti in laboratorio per mudella FA ed intervenendo in fase di latenza prima che avvenga lo svi- tagenesi. Ma se la degradazione dell'acido malico è, come si è visto luppo di flora opportunista a seguito del vuoto microbiologico deter- precedentemente, positiva per la qualità del vino, quella dell'acido minatosi a seguito del declino di S. cerevisiae, la FML termina entro 2 citrico ha una posizione ambivalente. La degradazione citrica può sfociare nella produzione di acidità volatile, in quella di composti acetoi- 3 settimane dall'inoculo; nici (diacetile, acetoino, butandiolo) o anche nella formazione di lipidi. 3 NUMERO 79 - Ottobre 2011 LAFFORT-INFO Se le condizioni di crescita sono favorevoli i batteri vanno incontro ad uno sviluppo rapido, necessitano di un considerevole approvvigionamento in lipidi e conseguentemente la degradazione dell'acido citrico è utilizzata principalmente a questo scopo. Al contrario, in situazioni di crescita stentata, i batteri sono stimolati ad utilizzare l'acido citrico per la produzione di composti acetoinici tra i quali il più noto, il diacetile, è responsabile nei vini degli aromi di tipo "burroso". Dunque, più la malolattica è stentata più elevata è la formazione di diacetile. Dopo la FML la concentrazione di questo composto è molto variabile, dai 2 ai 10 mg/L, talvolta di più. Si considera normalmente che il tenore in diacetile non debba superare, nei vini, i 5 - 6 mg/L. Al di sotto di questi valori, infatti, si è constatato come questa molecola partecipi positivamente alla complessità organolettica, mentre livelli eccessivi esprimono note burroso rancide pregiudizievoli alla qualità. Un ulteriore momento di possibile produzione di note devianti legate alla malolattica può rivelarsi la fase di fine FML, quando Oenococcus oeni, esaurite le scorte di acido malico, si rivolge ad altri substrati - tra i quali il citrico residuo - nel tentativo estremo di sopravvivere. E' per questo opportuno optare per un intervento solfitante di arresto-fine malolattica quando il livello del malico residuo si avvicina agli 0,2 g/L, quantitativo che generalmente viene consumato per inerzia durante la progressiva inattivazione della popolazione batterica, senza peraltro dar tempo alla stessa di rivolgersi ad altri substrati.. Inoltre, essendo i batteri selezionati maggiormente sensibili alla solforosa rispetto alla flora indigena, già sopravvissuta (selezionata) alla solfitazione eseguita sulle uve, le operazioni di chiusura avvengono più rapidamente, facilmente e con minore utilizzo di SO2. Appare a questo punto evidente - per una molteplicità di ragioni - come l'utilizzo mirato di un inoculo malolattico selezionato sia il mezzo più efficace per contenere l'eccessiva produzione di diacetile, sia perché i ceppi selezionati ne producono intrinsecamente poco, sia perché una cinetica malolattica decisa e regolare dall'inizio alla fine, garantita da un valido inoculo, ne limita ulteriormente la produzione. Ammine biogene ed alterazioni: una realtà spesso nascosta (e scomoda). Purtroppo molti dei metabolismi specifici ritrovati su ceppi indigeni di Oenococcus oeni sono pregiudizievoli alla qualità. Alcuni ceppi indigeni sono in grado di produrre ammine biogene per decarbossilazione di amminoacidi, o contribuire pesantemente ad aumentare l'acidità volatile. I ceppi selezionati di batteri malolattici sono privi di queste possibilità metaboliche dannose in quanto sono stati sottoposti a rigorosi test genetici preliminari alla selezione, che ne hanno verificato l'assenza. Sebbene agiscano da mascheratori d'aromi le ammine biogene non sono organoletticamente rilevabili come tali (a differenza di altri metaboliti di alterazione come ad esempio i vinil-fenoli). Numerosi paesi e gruppi di acquisto hanno posto precisi limiti alla loro presenza, e pare assodato da recenti studi che molte delle reazioni avverse al vino generalmente attribuite ad eccesivi livelli di solforosa siano invece da attribuire alla azione allergizzante delle ammine biogene, in particolare dell'istamina. Anche senza giungere sovente ad alterazioni così pesanti, i differenti ceppi di Oenococcus indigeni non presentano comunque le medesime attitudini fermentative e può pertanto accadere che ceppi scarsamente attivi siano all'origine di decorsi malolattici stentati, in situazioni nelle quali l'utilizzo corretto di un inoculo selezionato e vigoroso avrebbe permesso di ridurre considerevolmente i tempi necessari alla realizzazione della FML; senza contare che le FML stentate lasciano le porte aperte ai più svariati fenomeni di alterazione, tra i quali la produzione di fenoli volatili da parte di Brettanomyces. BATTERI GAMMA LAFFORT Inoculo con preadattamento Inoculo tradizionale Lactoenos 450 PreAc Lactoenos B16 Ceppo di batteri ad inoculo dopo breve preadattamento in presenza di Energizer®. Economico ed efficace anche ad elevato grado alcolico. In condizioni normali è il più veloce in quanto dotato di elevata attività malolattica. Si adatta particolarmente bene al co-inoculo. Ceppo di batteri ad inoculo tradizionale con la tecnica del pied de cuve. Adatto ad essere impiegato in condizioni critiche, anche in inoculo tardivo di soccorso, su tutti i tipi di vino. Inoculo diretto Lactoenos B28 PreAc Lactoenos SB3 Ceppo di batteri ad inoculo dopo breve preadattamento in presenza di Energizer®. Adatto ad essere impiegato in condizioni abbastanza difficili di basso pH, sia su vini rossi che bianchi, ottimo in co-inoculo sia precoce che tardivo. Ceppo di batteri ad inoculo rapido. Attivo e resistente anche in condizioni difficili. Si adatta particolarmente bene al co-inoculo precoce. Attivante Lactoenos 350 PreAc Malostart Ceppo di batteri ad inoculo dopo breve preadattamento in presenza di Energizer®. Adatto ad essere impiegato in condizioni particolarmente difficili di pH basso ed in presenza di concentrazioni elevate di acidi grassi (C8 - C10) forti inibitori dell’attività batterica, sia su vini rossi che bianchi, perfetto per l’inoculo sequenziale. Attivatore della FML sviluppato specificamente per i batteri lattici. Composto da elementi nutritivi indispensabili al metabolismo dei batteri in forma immediatamente assimilabile, ne accelera significativamente l’attività. Ricco in principi detossificanti, non contiene precursori di ammine biogene. Parametri limite per ogni ceppo di Lactoenos (N.B. questi fattori agiscono spesso in sinergia) SO2 Tot. pH C8 + C10 Alcol Temp. SB3® Instant Fino a 30 mg/L A partire da 3,5 < 25 mg/L Fino a 15 % vol A partire da 16°C B16 Standard Fino a 60 mg/L A partire da 2,9 < 40 mg/L Fino a 16 % vol A partire da 16°C 450 PreAc® Fino a 80 mg/L A partire da 3,5 < 25 mg/L Fino a 17 % vol A partire da 16°C B28 PreAc® Fino a 60 mg/L 350 PreAc® Fino a 60 mg/L ceppo 4 A partire da 3,3 A partire da 2,9 25 – 50 mg/L 50 – 60 mg/L Fino a 16 % vol Fino a 16 % vol A partire da 16°C A partire da 15°C NUMERO 79 - Ottobre 2011