Università degli studi di Pisa
Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
Corso di laurea in scienze biologiche (BIO-L)
Relazione prova finale
Metabolismo e funzione delle citochinine nelle piante
sottoposte a stress ambientali
Candidato:
Andrea Neri
Matricola 452673
Relatore:
Dott.ssa Debora Fontanini
Introduzione
Nel 1937 K. Thimann diede la prima definizione (Thimann et al., 1937) di ormone vegetale (o
regolatore di crescita) descrivendolo come una molecola dalle proprietà di messaggero chimico che
coordina l’attività di certi organi con quella di altri.
I fitormoni sono sostanze di piccolo peso molecolare in grado di indurre uno specifico processo
fisiologico a concentrazioni molto basse (10-9 – 10-6 M). Possono agire su cellule vicine a quelle in
cui è avvenuta la loro sintesi (ormoni paracrini) o essere trasportati attraverso la pianta ed agire su
tessuti distanti (ormoni endocrini). Un ormone può essere sintetizzato a seguito di uno stimolo
ambientale e esplicare immediatamente la sua funzione o venire coniugato ad una molecola per
inattivarlo reversibilmente e facilitarne il trasporto e/o l’accumulo. Il trasporto è affidato ai sistemi
conduttori della pianta che mobilitano l’ormone portandolo nel tessuto target dove interagirà con i
propri recettori innescando la trasduzione del segnale all’interno della cellula. La risposta al legame
di un ormone con il proprio recettore può essere la modificazione della trascrizione genica o
l’attivazione di canali ionici.
Gli ormoni sono in grado di controllare le attività cellulari di divisione, distensione e
differenziazione, ma anche processi come la determinazione del sesso, l’organogenesi e le risposte a
stress; per questa ultima loro proprietà, molti ormoni vengono utilizzati in agricoltura per migliorare
il rendimento di una pianta. Nelle varie fasi della vita di una pianta, il loro ruolo è talmente
Figura 1. Principali fitormoni.
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importante che l’eliminazione, o la modificazione del pattern di espressione di un determinato
ormone può essere causa di gravi deficit morfologici e funzionali o determinare la mancata
germinazione della plantula. Gli ormoni vegetali possono influenzare uno stadio di sviluppo della
pianta singolarmente, oppure agire in sinergia con ormoni appartenenti a classi diverse.
I principali fitormoni sono le auxine, le gibberelline, le citochinine, l’etilene, l’acido abscissico e i
brassinosteroidi (Fig. 1). Altre molecole che giocano ruoli importanti nelle piante come messaggeri
chimici sono l’acido giasmonico (implicato nello sviluppo del polline, dei semi e nella difesa contro
stress fisici, chimici e biotici), l’acido salicilico (la sua produzione è stimolata da NO e perossido
d’idrogeno ed ha come effetto l’induzione della resistenza acquisita sistemicamente oltra a fungere,
nella forma metilata, da segnale chimico per altre piante) e il polipeptide sistemina (induce le difese
sistemiche a seguito di un danno da erbivoro).
I principali fitormoni
L’auxina, la cui forma più comune è l’acido indol-3-acetico (IAA), è stato il primo ormone scoperto
nelle piante. La sua funzione è quella di promuovere l’accrescimento per allungamento in maniera
differenziale da organo ad organo. Gli studi effettuati sul ruolo di questo ormone, hanno rivelato la
sua capacità di indurre l’accrescimento differenziale responsabile delle risposte delle piante agli
stimoli direzionali (fototropismo e gravitropismo). Lo IAA è inoltre un regolatore della dominanza
apicale, della formazione delle radici laterali, dell’abscissione fogliare, della formazione delle
gemme fiorali e dello sviluppo dei frutti.
Il precursore dell’auxina è l’amminoacido triptofano che segue vie di biosintesi differenti a seconda
della famiglia di appartenenza della pianta. L’IAA è sintetizzato principalmente negli apici del
germoglio e della radice ed è trasportato polarmente lontano dai siti di sintesi. Si ritiene che il
trasporto polare avvenga principalmente nelle cellule parenchimatiche associate al tessuto vascolare
della radice e del fusto; un altro flusso basipeto è stato osservato a livello dei tessuti epidermici
radicali. L’auxina, legando i recettori ABPs (auxin-binding proteins) presenti sul reticolo
endoplasmatico, determina sia il traporto di vescicole contenenti H+-ATPasi da quest’organello alla
membrana plasmatica, sia l’aumento della velocità di sintesi di questi trasportatori. Questo
incremento di H+-ATPasi nella membrana determina l’aumento di protoni estrusi che, causando
l’acidificazione della parete, promuovono l’attivazione di enzimi (espansine) responsabili
dell’indebolimento dei legami presenti fra le molecole saccaridiche e determinano così
l’allentamento della parete e la crescita della cellula per allungamento.
Le gibberelline (GAs) hanno effetto sull’accrescimento e sullo sviluppo della pianta e sono ben note
per i loro drastici effetti sull’allungamento degli internodi nelle graminacee, nelle specie nane e a
rosetta, tanto che gli inibitori della biosintesi delle GAs sono utilizzati come agenti nanizzanti. Altri
effetti sono legati al loro ruolo generale nei processi legati allo sviluppo, tra cui la promozione della
dormienza e la germinazione del seme, la determinazione del sesso fiorale e l’accrescimento del
frutto. Le GA sono necessarie per l’espansione dei primordi fogliari e per la normale espansione
della foglia ma sono escluse dai meristemi dell’apice affinché questi tessuti mantengano le
caratteristiche di cellule “embrionali”. A conferma del fatto che gli ormoni vegetali operano in
network, in alcune specie il metabolismo delle GA è regolato dalle auxine e dall’acido abscissico
(ABA).
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Le gibberelline sono composti diterpenici tetraciclici formati da quattro unità isopreniche. La loro
biosintesi inizia nel plastidio, dove 4 molecole di isopentenil fosfato vengono condensate in geranil
geranil difosfato che viene convertito in ent-kaurene; questo entra nel reticolo endoplasmatico dove
viene trasformato in GA12 (la gibberellina precursore di tutte le altre) e termina nel citosol, dove
vengono prodotte diverse forme di GA tramite enzimi quali la GA20 ossidasi e la GA3 ossidasi. Le
GA conosciute sono più di un centinaio ma quelle attive biologicamente sono la GA1, la GA3, la
GA4 e la GA7, mentre le altre sono precursori inattivi o metaboliti disattivati. Questi ormoni sono
sintetizzati in molte parti della pianta, compresi gli embrioni germinanti, i tessuti delle giovani
piantule e gli apici del germoglio. Le GA bioattive regolano la propria produzione agendo a livello
della trascrizione degli enzimi coinvolti nella loro biosintesi, nel catabolismo o nell’inattivazione.
Fattori ambientali, quali il fotoperiodo o la temperatura, possono modulare la biosintesi delle GA
attraverso la modificazione dei livelli trascrizionali degli enzimi biosintetici.
L’etilene è un ormone gassoso che si forma in molti organi delle piante superiori, il cui precursore è
l’amminoacido metionina. La biosintesi dell’etilene è indotta da vari processi di sviluppo, da stress
ambientali e dalle auxine. Questo ormone regola l’espressione di vari geni correlati alla patogenesi
e alla maturazione, e i tessuti senescenti o i frutti in maturazione producono molto più etilene di
quanto non facciano i tessuti giovani o maturi. Uno dei suoi ruoli è effettivamente legato al
processo di maturazione dei frutti dove determina la sintesi di carotenoidi, la parziale degradazione
della parete cellulare, la sintesi di composti aromatici volatili e la conversione dell’amido in
zuccheri solubili. In seno alle sue funzioni legate all’invecchiamento, questo ormone causa il
processo di senescenza programmato nelle foglie e nei fiori. Interessante è il suo ruolo nel
fenomeno dell’epinastia (foglie pendenti verso il suolo) che si verifica a seguito di stress dovuta ad
anossia radicale, la quale induce la sintesi di etilene che provoca un abbassamento delle foglie
dovuto alla crescita differenziale del picciolo; questo a sua volta, determinerà un abbassamento dei
livelli fotosintetici, dovuto alla minore irradiazione delle foglie e quindi al rallentamento del
trasporto degli elettroni attraverso i fotosistemi. Tra gli altri effetti dell’etilene, legati al suo
coinvolgimento nella risposta a stress da mancanza di ossigeno, vi è quello indotto in piante in
seguito ad inondazioni in cui provoca la morte delle cellule della corteccia della radice; questa viene
sostituita da un parenchima aerifero che facilita il passaggio di ossigeno. L’etilene inoltre induce la
formazione dell’uncino nell’apice di specie dicotiledoni che durante la germinazione incontrano un
ostacolo al percorso verso la superficie. Infine, un suo ruolo nella difesa della pianta è stato
ipotizzato a seguito della dimostrazione che piante insensibili a questo ormone presentano gravi
deficienze nella difesa contro organismi patogeni.
L’acido abscissico (ABA) gioca ruoli importanti sia nella dormienza del seme e delle gemme, che
nelle risposte della pianta allo stress idrico. L’ABA è un terpenoide a 15 atomi di carbonio ed è
normalmente presente a livelli molto bassi in tutti i tessuti della pianta. Durante lo stress idrico la
concentrazione di ABA della foglia può aumentare di circa 50 volte. Infatti per combattere la
perdita d’acqua, l’ABA induce sia la chiusura degli stomi che l’aumenta della conduttività idraulica
e, a bassi potenziali idrici, aumenta il rapporto radice/germoglio in modo di agevolare
l’assorbimento di acqua. Durante lo sviluppo del seme stimola la produzione di chaperonine,
proteasi, canali ionici ed acquaporine allo scopo di evitare danni a proteine e membrane dovuti a
stress.
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Le funzioni dell’ABA sono spesso antagoniste a quelle delle gibberelline; tali effetti sono ottenuti
attraverso la soppressione dell’espressione genica indotta dalla GA da parte dell’acido abscissico,
che così promuove la dormienza (piante non sintetizzanti o insensibili all’ABA possono presentare
germinazione precoce e viviparia dei semi), inibisce la fioritura e anche la formazione di radici
laterali.
I brassinosteroidi sono ormoni i cui studi sono iniziati intorno agli anni ’70 del secolo scorso. Sono
in grado di provocare una vasta gamma di risposte di sviluppo, quali l’aumento della velocità di
accrescimento dei fusti e del tubetto pollinico, la morfogenesi delle foglie, l’inibizione
dell’allungamento delle radici e il differenziamento del tessuto vascolare (Hopkins et al., 2008).
Le citochinine (CKs) sono delle amminuporine N6-sostituite e sono caratterizzate principalmente
dalla capacità di stimolare la proliferazione cellulare in molte cellule vegetali, quando sono coltivate
in terreni contenenti auxina. Questi ormoni sono risultati essere coinvolti nelle divisioni cellulari,
nella morfogenesi dei germogli e delle radici, nella maturazione dei cloroplasti, nell’espansione
cellulare e nella senescenza. Le citochinine sono concentrate nelle cellule giovani e in via di
divisione rapida dei meristemi apicali del germoglio e della radice. Le forme di questi ormoni attive
biologicamente sono quelle libere, mentre quelle coniugate sono inattive ed hanno funzione di
riserva e di segnale (Taiz et al., 2009).
Nel paragrafo successivo tratteremo in dettaglio le caratteristiche di questo ormone.
Le citochinine
Le citochinine furono scoperte grazie a
ricerche atte a trovare una sostanza che
permettesse la coltura in vitro di tessuti
vegetali
isolati
dalla
pianta
(micropropagazione). Le prime sostanze
scoperte in grado di stimolare la
moltiplicazione cellulare furono il latte di
cocco e lo sperma di aringa autoclavato.
Quest’ultimo fu sperimentato da Folke
Skoog intorno al 1950 che capì che la
Figura 2. Chinetina (Taiz et al., 2009).
molecola stimolante la crescita era la base
adenina derivata dalla degradazione del DNA. Miller et al. (1955), isolarono la prima citochinina, la
6-furfuril amminopurina (chinetina) (Fig. 2). Nonostante non sia naturalmente presente nelle piante,
questa molecola somministrata alle cellule insieme ad auxina, ne stimola la divisione. Quasi tutti i
composti contenenti amminopurine sostituite in N6 sono attivi come citochinine.
La principale citochinina (CK) fu scoperta da Letham nel 1973 e venne denominata zeatina (da Zea
mays, la pianta in cui fu scoperta). Questa esiste in due forme isomeriche di cui la trans-zeatina (tZ)
è la più attiva biologicamente; recentemente è però emerso che in monocotiledoni sotto limitate
condizioni di crescita anche la cis-Zeatina può avere un’attività biologica sebbene bassa. Altre
citochinine naturali che differiscono dalla principale per il sostituente in N6 sono: la diidrozeatina
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(DZ) e l’N6-(∆2-Isopentenil)-adenina (iP). Le citochinine possono essere presenti nella pianta come
ribosidi (in cui il ribosio è legato all’azoto in posizione 9 dell’anello purinico), come ribotidi (in cui
il ribosio contiene un gruppo fosfato) o come glucosidi (in cui lo zucchero è legato ad uno degli
atomi di azoto purinici o alla catena laterale). E’ interessante il fatto che le citochinine si possano
trovare anche legate a tRNA; questo legame ha la funzione di fungere da riserva di CK o da segnali
citoplasmatici una volta degradato l’RNA transfer.
La scoperta del recettore delle citochinine CRE1 ha messo in luce il fatto che solo le forme libere
possono legarsi a questa proteina. Il fatto che solo questo tipo di CK possono stimolare l’attività
chinasica dei recettori ha fatto capire che le forme biologicamente attive sono quelle non coniugate,
mentre quelle coniugate sono inattive ed hanno la funzione di facilitarne il trasporto lungo gli
elementi vascolari.
Alcuni batteri, insetti e funghi hanno la capacità di secernere citochinine libere e così interferire con
il normale sviluppo della pianta. Alcuni esempi di questi organismi sono rappresentati da insetti
della famiglia dei Cinipidi che inducono la formazione di galle (tumori) in seguito al rilascio di
citochinine nei tessuti della pianta, batteri come il Corynebacterium fascians il quale induce
formazioni dell’apparato vegetativo note con il nome di “scopa di strega” a causa del rilascio della
dominanza apicale indotto dalla CK sintetizzata da parte del batterio, e l’Agrobacterium
tumefaciens, il quale induce la formazione di galle del colletto inducendo un’eccessiva produzione
di CK da parte della pianta. La particolarità di quest’ultimo organismo, divenuto fondamentale nello
sviluppo delle biotecnologie agrarie, è quella di inserire un porzione del plasmide Ti (il T-DNA)
contenente geni che promuovono la sintesi di auxine, citochinine e opine, all’interno del genoma
della pianta infettata. E’ stato compreso che la causa di questo processo era un plasmide contenente
i geni codificanti enzimi per la biosintesi di CK e di IAA grazie al fatto che le galle sterilizzate
possono esser coltivate indefinitamente come tessuti indifferenziati in terreni privi di auxina e
citochinina. Come già accennato, la concentrazione relativa di questi due ormoni è importante per
l’induzione e il mantenimento delle colture cellulari, poiché a seconda del rapporto di
concentrazioni in cui vengono somministrati alle cellule, si può promuovere la formazione di radici,
fusti oppure calli (Fig. 3).
Figura 3. Coltura cellulare in cui è presente un gradiente
di concentrazione da sinistra a destra di IAA e dal basso
verso l’alto di CK. L’esperimento mostra gli effetti delle
interazioni di questi due ormoni. Un'elevata
concentrazione
di
citochinine
determina
il
differenziamento
in
fusto,
mentre
un'elevata
concentrazione di auxina promuove la formazione delle
radici. Da notare che una concentrazione proporzionale
dei due ormoni non determina alcun differenziamento ma
solo la moltiplicazione cellulare (formazione di un callo)
(Taiz et al., 2009) .
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La biosintesi delle citochinine (Fig. 4) inizia dalla reazione promossa dall’isopentenil transferasi
(IPT) che catalizza la reazione limitante della via biosintetica, in cui la catena laterale isopentenilica
del dimetilallil difosfato, derivante dalla sintesi plastidiale del metilerirtriolo fosfato (MEP) per la
formazione di isopentenil fosfato (IPP), viene aggiunta su un’adenosina con produzione di
isopentenil-adenisina DP/TP. Quindi la via biosintetica si biforca e da un lato si forma iP mentre
dall’altro si forma trans-Zeatina (tZ) a seguito di un’idrossilazione sulla catena laterale
isopentenilica da parte del citocromo P450 monoossigenasi, la quale potrà esser convertita da
un’isomerasi in cis-zeatina. Il sito principale per la sintesi di questo ormone è il meristema apicale
della radice, dal quale viene immesso nello xilema che lo trasporta al germoglio.
Figura 4. Via biosintetica delle citochinine. La prima via è quella svolta dall'IPT batterica che utilizza AMP. La seconda è quella
seguita dall'IPT dei vegetali che invece utilizza come nucleotide ADP/ATP. Di seguito è rappresentata la glucosilazione (Taiz et al.,
2009).
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La degradazione della CK avviene
ad opera della citochinina ossidasi
(CKX) che scinde la base
nucleotidica dalla catena laterale
(Fig. 5). Come vedremo in seguito,
questo enzima è molto importate
per la creazione di mutanti in cui è
controllata
la
concentrazione
dell’ormone (Fig. 6).
Figura 5. Degradazione dell'isopentenil-zeatina ad opera della CKX (Taiz
Studi effettuati su piante hanno et al., 2009).
dimostrato che, in seguito ad un
aumento dell’assorbimento di composti azotati, aumenta la sintesi di CK a livello radicale; di
conseguenza la loro concentrazione a livello del germoglio
aumenta determinando la crescita dello stesso e aumentando
così anche la capacità fotosintetica della pianta. Questi
aumenti di concentrazione delle citochinine, determinati dalla
disponibilità di nutrienti, possono essere riportati a livelli
normali tramite la coniugazione o la degradazione delle CK.
Successivamente alla sintesi, le CK potranno essere legate a
zuccheri da glucosidasi e così inattivate, per mantenere
l’omeostasi ormonale. Le citochinine, come già detto sopra,
vengono sintetizzate in tutti i tessuti che presentano un’elevata
divisione cellulare perché quest’ormone è un regolatore del
ciclo di divisione. Nella mitosi sono coinvolte anche le auxine
e le gibberelline che, insieme alle citochinine, regolano
l’attività delle proteine-chinasi dipendenti da cicline (CDK)
permettendo il corretto svolgimento di questo delicatissimo
processo. Infatti, in esperimenti condotti su piante di tabacco
sovraesprimenti i geni per la citochinina ossidasi, erano
misurati livelli inferiori di citochinina e in concomitanza si
Figura 6. Piante di tabacco esprimenti
mutazioni della CKX. Sulla sinistra una verificava un ritardo dello sviluppo del germoglio dovuto al
pianta di tabacco wild-type. Sulla destra due
piante di tabacco sovraesprimenti un costrutto rallentamento delle divisioni cellulari (Werner et al., 2001).
per due diverse citochinina ossidasi di Studi sulle citochinine effettuati su A. thaliana hanno
Arabidopsis. Nelle piante transgeniche è
permesso il collegamento di questo fitormone con
diminuito l'accrescimento del germoglio ma è
aumentato quello del palco radicale (Taiz et
l’attivazione di una fosfatasi simile a Cdc25 il cui ruolo è
al., 2009).
quello di rimuovere un fosfato dalla Cds2, una chinasi
importante per il passaggio dalla fase G2 alla fase M durante
la mitosi; inoltre la CK è risultata coinvolta nell’aumento dell’espressione di CYCD3 che codifica
per una ciclina di tipo D (Riou-Khamlichiet al., 1999). La via di biosintesi delle CK nelle gemme
ascellari è controllata dall’auxina che sopprime la trascrizione del gene codificante l’enzima IPT;
così facendo non vengono prodotte CK e la gemma rimane dormiente mantenendo la dominanza
apicale. In caso di decapitazione dell’apice, il mancato apporto di auxina determinerà la produzione
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di citochinine a livello della gemma che si svilupperà ed inizierà a produrre a sua volta auxine che
instaureranno la dominanza apicale sulle gemme inferiori.
Le citochinine sono anche coinvolte nel processo programmato d’invecchiamento delle foglie. E’
stato dimostrato che un aumentato afflusso di citochinine dallo xilema o di derivazione esogena,
determina un ritardo nel processo di senescenza e un mantenimento di elevati livelli fotosintetici.
Infatti questo fitormone insieme ad altri fattori promuove la differenziazione degli ezioplasti in
cloroplasti. Esperimenti condotti su piante in cui era stata soppressa l’espressione delle CK ha
dimostrato il ruolo cruciale di quest’ormone nella differenziazione del floema.
Le citochinine sono anche coinvolte nel fenomeno della mobilizzazione dei nutrienti, per cui la
maggior concentrazione di quest’ormone nelle foglie altera il rapporto sorgente/pozzo stimolando il
metabolismo fogliare e quindi causando il movimento dei nutrienti. Questo permette a sua volta una
maggiore sintesi di CK che inibisce la crescita radicale; questo sistema a feedback negativo
permette alla pianta una maggiore efficienza nell’utilizzo dei nutrienti poiché controlla l’espansione
del palco radicale permettendone la crescita in caso di carenze nutritive. Un altro effetto sortito da
questo ormone in dicotiledoni con cotiledoni fogliosi, è l’aumento dell’espansione cellulare, non
accompagnato da divisioni, dovuto all’allentamento della parete non indotto da estrusione protonica
(meccanismo attuato dall’auxina) (Taiz et al., 2009).
Nel signaling delle citochinine (Fig. 7) sono coinvolti un recettore con attività chinasica (HK),
Figura 7. Signaling della citochinina. Purino permeasi (PUPs) e trasportatori equilibrativi dei nucleosidi (ENT) permettono il
passaggio delle CK nel citosol. Alcune verranno accumulate nel vacuolo mentre altre andranno a legarsi ai recettori (AHK) presenti
sulla membrana del reticolo endoplasmatico. Una volta autosfosforilati, i recettori cedono il fosfato alle istidina fosfotransferasi
(AHP). Queste possono fosforilare regolatori di risposta inibitori come l’ARR22 - che è un regolatore di tipo C - oppure entrare nel
nucleo e fosforilare un regolatore positivo appartenente al gruppo dei ARR di tipo B o un regolatore negativo appartenente ai ARR
di tipo A, inibendo la risposta (Ha et al., 2012).
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un’istidina fosfotransferasi (hpt) e degli elementi regolatori della risposta (RR), in grado di attivare
la trascrizione di geni di risposta delle citochinine.
I recettori per le citochinine sono dei recettori istidina chinasi ibridi ancorati alla membrana del
reticolo endoplasmatico, simili ai sistemi batterici di segnale fosforelay a due componenti; nelle
piante questo è però composto da un dominio chase legante l’ormone e un dominio istidina-chinasi
ibrido che contiene sia il residuo di L-istidina che funge da trasmettitore, che quello ricevente di Laspartato, fusi nella stessa proteina. Una fosfotrasferasi fungerà da ponte trasferendo fosfato dal
citoplasma al nucleo andando a fosforilare i regolatori di risposta (RR). Questi ultimi esistono in tre
forme: regolatori di tipo A, B e C. I primi non contengono domini output, quindi una volta
fosforilati non interagiranno con il DNA e svolgeranno la loro funzione inibitrice competendo per i
fosfati trasferiti nel nucleo dalle hpt; i secondi, possedendo un dominio output di contatto con il
DNA possono legarsi a questo e fungere da regolatori positivi che attivano la trascrizione di geni di
risposta, fra i quali è compreso quello per gli RR di tipo A. I regolatori di tipo C sono
probabilmente dei controllori del livello del pool dei fosfati all’interno del nucleo (Ha et al., 2012).
Il meccanismo di signaling è stato particolarmente studiato in Arabidopsis dove è emerso che le
singole proteine della via di trasduzione sono codificati da famiglie multigeniche. Questo è stato
scoperto osservando che la mutazione di un singolo gene non produceva effetti rilevanti sulla
pianta, mentre mutanti di ordine superiore presentavano livelli crescenti di riduzione dello sviluppo
(Fig. 8).
Figura 8. Morfologia di piante di A. thaliana di 5 settimane mutanti per il recettore istidina chinasico delle citochinine. Da
sinistra: le prima coppia mutanti per ahk2 e ahk4, le seconda coppia per ahk3 e ahk4, la quarta pianta per ahk2 e ahk 3; l'ultima è
triplo mutante per ahk2, ahk3, ahk4. La barra= 10 cm. (Nishimura et al., (2004).
Funzione delle citochinine nell’adattamento a stress ambientali
Le citochinine svolgono un importante ruolo nella regolazione delle risposte a stress ambientali
attraverso l’interazione con un ormone antagonista, l’acido abscissico (ABA). Effetti causati da
stress come la siccità e l’elevata salinità del suolo, dalla diminuzione della produzione di CK e del
loro trasporto dalle radici, possono essere evitati tramite l’applicazione di CK esogene. Questo
favorirebbe l’apertura stomatica, la traspirazione ed un più alto tasso fotosintetico. Negli
esperimenti in cui si mira a influenzare i livelli di CK endogene viene attuato un controllo sulla
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biosintesi, sfruttando l’enzima della tappa limitante la sintesi di quest’ormone (IPT), o sul
catabolismo, tramite la CKX.
Un aspetto peculiare per il mantenimento dell’omeostasi delle CK è la trasmissione di segnali
riguardanti i livelli di CK negli organi della pianta. Questo tipo d’informazione deriva dal fatto che
diverse citochinine sono trasportate in maniera differente negli elementi vascolari; infatti la tZ viene
trasportata acropetamente nello xilema mentre l’iP si sposta basipetamente nel floema (Ha et al.,
2012).
Il metabolismo delle CK è regolato in maniera altamente dinamica in piante sottoposte a condizioni
di stress. Brevi periodi di stress termici possono essere associati ad un aumento transiente dei livelli
delle CK, mentre stress idrici prolungati o l’esposizione ad elevati livelli salini, causano una minore
espressione di CK attive. La ridotta espressione di CK attive permette l’avvio della trascrizione di
proteine coinvolte nell’aumento della tolleranza a fattori ambientali non ottimali (come chaperonine
e proteine coinvolte nello scavenging delle ROS).
La diminuzione della sintesi di CK tramite l’inattivazione dell’IPT o la sovraespressione della
CKX, induce nelle piante tolleranza a situazioni di siccità e di elevata salinità del suolo. Questo è
dovuto al fatto che, la minor concentrazione di CK nelle piante, rallenta la crescita di fusto e foglie
ed inoltre, induce la sintesi di ABA. Questa condizione farà si che la pianta richieda una minor
richiesta energetica data l’inferiore crescita dell’organismo. Quindi, nelle piante sottoposte a stress,
si verifica una diminuzione dei livelli di CK e un concomitante aumento dei livelli di ABA affinché
vengano attivati meccanismi coinvolti nel mantenimento dell’integrità della membrana cellulare,
delle proteine e del corredo genetico.
In piante che si accrescono in condizioni avverse e in cui viene indotta l’espressione dei geni della
risposta allo stress, sono determinanti la sintesi e l’aumentata sensibilità all’ABA. Recentemente è
stato scoperto che il recettore AHK1, localizzato sulla membrana plasmatica, è un regolatore
positivo nella via di signaling dello stress osmotico; infatti il mutante ahk1, maggiormente sensibile
agli stress osmotici, presenta una ridotta sensibilià all’ABA e un’espressione ridotta dei geni di
risposta a questo ormone.
La capacità di regolare artificialmente i livelli di citochinine può essere utilizzata come strumento
per incrementare la tolleranza a stress abiotici in piante coltivate come il mais (Zea mays), il riso
(Oryza sativa) e la soia (Glycine max) per le quali sono note le sequenze nucleotidiche dei geni
codificanti gli enzimi coinvolti nel metabolismo delle citochinine. La sovraespressione dei geni
coinvolti nella degradazione delle CK, causa nella pianta uno sviluppo stentato del germoglio e lo
sviluppo di un più ampio sistema radicale. Questa differente risposta degli organi della pianta alla
CK ha guidato i ricercatori verso la sperimentazione di piante transgeniche che presentassero un
diverso pattern di espressione genica nella radice rispetto al germoglio e viceversa. In esperimenti
su piante transgeniche di A. thaliana e Nicotiana tabacum, sono stati ottenuti fenotipi con
aumentata degradazione delle citochinine a livello della radice (Werner et al., 2010) e quindi aventi
un maggiore sviluppo dell’apparato radicale rispetto al wilde-type (circa il 60% in biomassa), ma un
normale sviluppo del germoglio (Fig. 9). In particolare, la trasformazione di tessuti di piante di
tabacco con A. tumefaciens ha permesso l’inserimento del costrutto 35S:CKX2 nel genoma della
pianta. Il costrutto 35S:CKX2 contiene un promotore per l’espressione costitutiva appartenente al
virus del mosaico del cavolfiore (35S) accoppiato ad una citochinina ossidasi attiva solo a livello
radicale. L’uso della CKX2 ha permesso di modificare l’azione paracrina di quest’ormone lasciando
invariato il trasporto a lunga distanza. La pianta di tabacco transgenico è risultata più resistente a
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periodi di siccità. In queste piante è stato inoltre misurato un aumentato accumulo di vari nutrienti
quali S, P, Mn, Mg, Zn e Cd a livello
radicale, da cui si è concluso che questo
tipo di trasformazione conferisce alle
piante non solo una maggiore resistenza
alla siccità ma permette anche un
maggior accumulo di nutrienti. D’altro
canto, esperimenti svolti esprimendo
costitutivamente l’IPT hanno mostrato
una riduzione della crescita delle radici
e una maggiore sensibilità a stress idrici
(Smigocki et al., 1989), confermando
l’importanza di quest’ormone nella
risposta a condizioni di stress.
Sono stati effettuati studi (Rivero et al.,
2010) in cui la biosintesi di citochinine
era stimolata da promotori indotti dalla
senescenza, in modo da ottenere un
ritardo dell’invecchiamento fogliare
stress indotto, un aumento di enzimi
degradanti ROS (reactive oxygen
species) e il mantenimento dell’attività
fotosintetica in condizioni di stress.
Uno di questi promotori indotti da
senescenza è PSARK; questo controlla
l’espressione di un recettore chinasico
Figura 9. Innesti reciproci di piante transgeniche 35S:CKX2 e wild type (wt)
associato a senescenza, infatti la sua di tabacco. (A) La prima coppia a sinistra sono innesti di germogli wt su
espressione è favorita in condizioni radici wt mentre la coppia a destra sono germogli wt innestati su un apparato
radicale 35S:CKX2 transgenico. (B) A sinitra l’innesto di controllo
stress. Un vantaggio dell’utilizzo di (germoglio wt su radice wt) e a destra l’innesto di un germoglio 35S:CKX2
radice wt. (C) A sinistra l’innesto wt su wt e a destra l’innesto con
costrutti PSARK:IPT è quello di su
germoglio wild type e radice 35S:CKX2 (Smigocki et al., 1989).
contrastare effetti fisiologici avversi
dovuti alla manipolazione delle citochinine; un ulteriore vantaggio dovuto all’uso di questi
promotori è la possibilità di aumentare i livelli di citochinine endogene e consentire una normale
crescita anche in piante esposte a temperature sovraottimali. Questo permette agli organismi
transgenici di svilupparsi normalmente anche in condizioni di stress ambientali al contrario dei
wild-type che saranno molto meno resistenti. Analisi effettuate, hanno mostrato che piante
contenenti il costrutto PSAG-12-IPT (controllato dal promotore SAG12, indotto dalla senescenza)
sottoposte a 14 giorni di stress indotto da calore un aumentato sviluppo delle radici (65-85%),
rispetto i wt. Analisi proteomiche (2DS e MS) (Xu et al., 2009) sono state effettuate su su piante di
Agrostis stolonifera contenenti il costrutto PSAG-12-IPT per identificare cambiamenti
nell’espressione proteica nelle foglie e nelle radici in risposta all’espressione di IPT in condizioni di
stress termico. La trasformazione con PSAG-12-IPT è risultata in cambiamenti dell’espressione nelle
foglie e nelle radici di proteine coinvolte in numerose funzioni, in particolare nel metabolismo
energetico, nel deposito e nella destinazione proteica, nella difesa e nella tolleranza a stress. In
11
particolare sono stati rilevati incrementi nell’espressione di sei proteine nella foglia (enolasi,
oxygen-evolving enhancer protein 2, complesso di oxygen-evolving, la subunità piccola della
Rubisco, Hsp90 e la glicolato ossidasi), mentre i livelli di nove proteine nella radice (Fd-GOGAT,
deidratasi zucchero-nucleotidica, isocitrato deidrogenasi NAD-dipendente, il precursore della
ferredossina-NADP reduttasi, ribonucleoproteina A2, ascorbato perossidasi, dDTP-glucosio 4-6deidratasi e due proteine sconosciute) si sono mantenuti costanti o sono in condizioni di stress
termico, aumentati in almeno una su sei delle linee transgeniche (Xu et al., 2010).
In uno degli studi che hanno impiegato costrutti PSARK:IPT (Rivero et al., 2009) sono stati
investigati gli effetti dell’espressione di PSARK:IPT e della produzione di citochinine su diversi
aspetti della fotosintesi, in piante di tabacco transgenico (Nicotiana tabacum cvSR1) cresciute in
regimi idrici ottimali e limitanti (30% del fabbisogno ottimale). E’ stata evidenziata una
significativa riduzione della velocità massima del trasporto degli elettroni e dell’utilizzo dei trioso
fosfati solo nelle piante wt durante la crescita in condizioni idriche limitanti, indicando un controllo
biochimico della fotosintesi durante la crescita sotto stress idrico. In queste condizioni, le piante
transgeniche hanno dimostrato un incremento della concentrazione della catalasi nei perossisomi ed
un aumento del punto di compensazione della CO2, suggerendo fotorespirazione citochininomediata nelle piante transgeniche. Il contributo della fotorespirazione alla tolleranza delle piante
transgeniche in condizioni limitanti di acqua, è anche supportata dall’incremento in trascritti
codificanti enzimi coinvolti nella conversione del glicolato in ribulosio-1,5-bisfosfato. Oltretutto
l’aumento dei trascritti di geni codificanti proteine coinvolte nella fotorespirazione, ha indicato
l’importanza di questo meccanismo nella protezione dei processi fotosintetici durante stress idrico.
Maggiore luce sugli effetti dello stress idrico in piante transgeniche PSARK:IPT è stata fatta da uno
studio sulla degradazione delle proteine dell’apparato fotosintetico in condizioni di siccità (Rivero
et al., 2010). In questo studio, per identificare eventuali geni associati con l’aumentata tolleranza
allo stress idrico citochinino-indotta, è stato analizzato il trascrittoma di piante di tabacco wild-type
e transgeniche esprimenti PSARK:IPT, sottoposte a livelli d’irrigazione ottimali o condizioni di
prolungato deficit d’acqua usando un Genechip® di pomodoro. Durante lo stress idrico,
l’espressione di geni codificanti componenti della via di biosintesi dell’ABA a partire dai
carotenoidi è risultata accresciuta nei wild-type, ma repressa nelle piante transgeniche. D’altra
parte, piante transgeniche hanno mostrato un abbondanza di trascritti dei geni coinvolti nella via di
biosintesi dei brassinosteroidi. Diversi geni codificanti per le proteine associate alla sintesi delle
clorofille, alle reazioni alla luce, al ciclo di Calvin ed alla fotorespirazione sono stati indotti nelle
piante transgeniche. In particolare, nelle piante PSARK:IPT, utilizzando PCR quantitativa, è stata
riscontrata un’incrementata abbondanza dei trascritti dei geni associati al PSII, al complesso cytb6f,
al PSI, alla NADH ossidoreduttasi e al complesso ATPasi. Mediante Western-blot è stato
confermato l’aumento dei livelli di proteine corrispondenti ai trascritti. I risultati hanno indicato che
mentre nelle piante wild-type l’apparato fotosintetico veniva stato degradato, la fotosintesi nelle
piante transgeniche non era influenzata e le proteine fotosintetiche non venivano state degradate.
Durante lo stress idrico, piante wild-type, a differenza di piante PSARK:IPT, hanno mostrato una
significativa riduzione del flusso del trasporto degli elettroni (come è stato visto in studi precedenti)
e dei meccanismi d’inibizione fotochimici, con un marcato incremento dell’inibizione non
fotochimica, suggerendo una diminuzione nel trasferimento dell’energia al core del complesso PSII
ed un incremento nelle reazioni del trasferimento ciclico degli elettroni.
12
Altri esperimenti sulla pianta di tabacco che hanno utilizzato il costrutto PSARK:IPT (Rivero et al.,
2007), hanno dimostrato che piante sovraesprimenti citochinine presentano un ritardo della
senescenza fogliare ed acquisiscono una maggiore tolleranza a stress idrici. Questi studi hanno
focalizzato la loro attenzione sull’effetto negativo causato dalla siccità sulla resa agricola. La
soppressione della senescenza fogliare indotta dalla siccità è risultata in un’elevata tolleranza dei
mutanti alle condizioni di stress idrico; tale tolleranza era dimostrata dalla crescita vigorosa a
seguito di un lungo periodo di siccità che invece aveva ucciso i gruppi di controllo. Nelle piante
transgeniche, accanto al mantenimento alti i livelli di acqua nei vacuoli e d’attività fotosintetica in
condizioni di siccità, era stata osservata solo una minima perdita della resa. Questo fatto può
suggerire delle applicazioni di mercato di queste specie OGM nell’assicurare la produzione di cibo
in regioni del mondo in cui l’acqua rappresenta una risorsa limitante. Alla luce dell’effetto limitante
sulla resa agricola della siccità a livello mondiale, di notevole interesse è risultata l’applicazione di
questo tipo di ricerche su piante di maggiore e rilevante importanza nel campo agro-alimentare.
Infatti, studi effettuati su piante di riso (Oryza Sativa) contenenti il costrutto PSARK:IPT ed
esprimenti l’enzima IPT (Fig. 10), hanno confermato la minor influenza sulla resa di piante
transgeniche sottoposte a condizioni di stress idrico (Zvi Peleg et al., 2011).
Figura 10. Effetti dello stress idrico su piante di riso. Wild-type cresciute sotto condizioni di regolare irrigazione e piante wild-type e
transgeniche, esprimenti PSARK:IPT, soggette a stress idrici.
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Discussione
L’uomo ha da sempre cercato di dare spiegazioni a fenomeni osservati nella realtà che lo circonda.
La natura è stata fonte d’ispirazione per l’umanità, che ha sfruttato il sapere per promuovere
innovazioni e permettere l’evoluzione di nuove tecniche e teorie. L’uomo ancora oggi prende
esempio da comportamenti, studia metabolismi e materiali presenti in natura per decodificarne le
proprietà che li rendono così perfetti. Queste, setacciate da milioni di anni di selezione naturale,
presentano una grande varietà di risposte alle differenti necessità adattative. L’uomo però non si è
limitato a prendere spunto da questo serbatoio d’idee ma ha sfruttato questa conoscenza per
plasmare la natura a suo volere. Effettuando incroci fra varietà di piante della stessa specie, si è
cominciato un processo di selezione artificiale che ha portato alla produzione di varietà di maggior
qualità, maggior resa e più resistenti a condizioni avverse. Sebbene la necessità di coltivazioni
vegetali che rispondessero meglio alle esigenze alimentari e alle necessità produttive delle società
umane, abbia guidato per secoli questo processo di miglioramento delle piante, il loro sviluppo si è
arreso ai limiti imposti dalle metodologie a disposizione degli scienziati. Solo l’evoluzione delle
tecniche di biologia molecolare ha permesso lo sviluppo di organismi vegetali che rispondessero a
requisiti sempre più stringenti. E’ infatti attraverso la modificazione dell’espressione di geni
appartenenti all’organismo stesso o al trasferimento di geni da una specie all’altra, che oggi è
possibile ottenere organismi geneticamente modificati (OGM). E’ anche grazie all’opportunità di
creare OGM che, se in passato certi studi venivano condotti attraverso l’osservazione dei mutanti
naturalmente presenti, individuati mediante le differenze dal fenotipo wild-type, oggi si
ingegnerizzano individui che presentano alterazioni dello sviluppo e della crescita tali da permettere
allo sperimentatore di identificare gli effetti e l’importanza di questi nell’organismo transgenico.
Questo tipo di approccio sperimentale ha reso possibili molti progressi nel campo degli studi sugli
ormoni vegetali, permettendo l’approfondimento della comprensione delle loro funzioni e
importanza nelle piante.
Come già accennato, l’ingegneria genetica non è stata solo utilizzata come strumento per la ricerca
scientifica ma ha trovato diverse applicazioni anche nel campo dell’agricoltura, permettendo la
creazione di piante resistenti a regimi di bassa irrigazione, agli erbicidi, piante con una maggior resa
annuale, piante con una maggior produzione di biomassa e biofortificate. Piante con queste
caratteristiche sono derivate da studi condotti su OGM mutati nel metabolismo ormonale e
nell’espressione genica. La produzione di questi mutanti è stata possibile grazie alle conoscenze
raggiunte sulla biochimica e la fisiologia delle piante. Ricerche mirate alla comprensione del
metabolismo delle citochinine, hanno portato alla scoperta che un eccesso di citochinine determina
nella pianta un aumenta resistenza allo stress idrico, termico e salino. Questa aumentata tolleranza è
dovuta al fatto che la CK modifica l’espressione genica andando ad interferire con i processi di
senescenza programmata della pianta. Come riesce una pianta sovraesprimente CK a resistere
meglio agli stress ambientali? I motivi sono diversi:
− La CK attiva la trascrizione di enzimi coinvolti nella difesa della pianta contro danni causati
da ROS. Infatti in condizioni di stress ambientali aumenta la quantità di radicali liberi a cui
la pianta deve far fronte.
− La CK ritarda la senescenza fogliare inibendo la sintesi di carotenoidi indotta da ABA.
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− La CK attiva la trascrizione di proteine coinvolte nel processo fotosintetico e
fotorespiratorio, permettendo alla pianta di mantenere normali livelli fotosintetici anche in
condizioni subottimali.
− La produzione di mutanti sovraesprimenti o sottoesprimenti determinate isoforme di enzimi
coinvolti nel metabolismo delle CK, determina variazioni di concentrazione ormonale a
livello di un certo organo senza alterare i livelli dello stesso ormone in un altro tessuto della
pianta. Questo permette ai ricercatori di abbassare i livelli delle CK nella radice,
aumentando lo sviluppo di questa, e lasciare invariati quelli del germoglio consentendone un
normale sviluppo.
Quali sono quindi le possibili applicazioni di piante transgeniche per il metabolismo delle
citochinine? Nel campo della fitodepurazione potrebbe essere utile un mutante che presenti un
ridotto livello di CK nella radice, e conseguentemente un palco radicale più ampio. L’aumentato
sviluppo dell’apparato radicale è dovuto al fatto che una carenza di nutrienti determina una
riduzione dei livelli di CK e conseguentemente stimola l’accrescimento della radice. Questo
maggiore sviluppo è infine associato ad un maggior assorbimento di nutrienti e minerali, per cui
terreni che presentano inquinamento da metalli pesanti possono esser decontaminati grazie
all’utilizzo di queste piante. Un ovvio limite a questo tipo di applicazione è dato dalla capacità
dell’organismo stesso di sopportare elevate concentrazione di metalli pesanti; a questo proposito
sono in corso studi (Czakó et al., 2006; Lang et al., 2004; Bizily et al., 1999) mirati alla selezione di
piante che si sviluppano anche a concentrazioni tossiche di questi elementi, permettendone un più
ampio utilizzo.
La crescita della popolazione mondiale, in particolare nei paesi in via di sviluppo e con economie
emergenti, è un dato di fatto che presenta conseguenze importanti in termini di utilizzo delle risorse
del pianeta: l’aumentata richiesta di prodotti alimentari necessita un incremento della resa agricola,
sia in termini di piante che di terreni coltivati. Purtroppo, le aree favorevoli all’agricoltura sono
prossime all’esaurimento e la creazione di nuovi areali coltivabili è possibile solo tramite la
deforestazione. Data l’importanza delle foreste nella biosfera in un mondo sempre più influenzato
dall’impatto antropico, nasce la necessità di sfruttare territori già disponibili ma che non sono adatti
alla coltivazione. La produzione di piante OGM per il metabolismo delle citochinine può avere un
ruolo di rilievo in questa problematica. Infatti, piante OGM, modificate per sovraesprimere il gene
IPT, presentano diversi vantaggi rispetto alle wild-type, primo tra tutti il fatto che piante
transgeniche sottoposte a stress idrico e/o termico hanno una resa maggiore rispetto a piante wt
sottoposte ad uguali condizioni. In questo caso la resa di per sé non varia molto rispetto a quella
delle piante wild-type normalmente irrigate, ma è significativo il fatto che essa rimanga quasi
invariata nonostante gli organismi transgenici siano stati sottoposti a periodi di stress idrico e
termico. Dato l’aumento della temperatura media mondiale i ricercatori stanno spingendo la ricerca
verso piante che si adattino meglio a climi caldi. Queste permetterebbero l’incremento delle aree
geografiche coltivate, consentendo l’utilizzo di territori che presentano climi aridi o che sono
soggetti ad elevate temperature. Lo sviluppo di piante adatte a queste condizioni consentirebbe
l’aumento della produzione agricola, soddisfacendo le richieste della popolazione mondiale.
L’eccessivo sfruttamento dei territori può provocare, in piante coltivate in determinate aree del
mondo in cui il suolo è povero di nutrienti, una diminuzione delle qualità nutrizionali. Anche questo
problema potrebbe essere affrontato mediante l’utilizzo di piante transgeniche che presentano una
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modificata espressione delle citochinine; infatti il maggior sviluppo delle radici permette alla pianta
un maggior assorbimento di nutrienti che possono essere accumulati in diversi organi della pianta.
Questo processo, per certi versi paragonabile alla biofortificazione, è importante soprattutto in
colture destinate a popolazioni che presentano un’alimentazione poco varia, come quella asiatica, la
cui dieta consiste per il 30% in riso (FAO, 2004). Questo contribuirebbe alla soluzione di certi
problemi legati alla malnutrizione senza dover modificare le abitudini alimentari degli individui. Un
punto a sfavore di una eventuale trasformazione delle piante in questo senso, è che, essendo queste
piante capaci di assorbire ed accumulare più sostanze dal suolo (composti organici e metalli
pesanti), una concentrazione troppo elevata di minerali potrebbe portare ad un loro eccessivo
accumulo nei tessuti della pianta, i quali una volta ingeriti risulterebbero tossici per l’uomo. Questo
aspetto limita la coltivazione di specie modificate per l’assorbimento, ad aree non inquinate o che
non presentano elevate concentrazioni di metalli nel suolo. Oltre ad effetti restrittivi particolari, un
fattore limitante la diffusione in genere di organismi transgenici è il quesito che si pone buona parte
della società: è giusto creare piante OGM? Indubbiamente questi organismi hanno un elevatissimo
potenziale di utilizzo che però va adeguatamente controllato e vagliato. Probabilmente le specie
vegetali OGM ricopriranno un ruolo predominante nell’agricoltura del futuro, dove si auspica siano
affiancate da specie coltivate da agricoltori di nicchia che cureranno la produzione varietà autoctone
grazie all’aiuto di incentivi da parte delle istituzioni.
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