RICERCA Presenza di una tracheomicosi causata da Fusarium oxysporum su Crassula ovata coltivata in Italia Domenico Bertetti - Pietro Pensa - Anna Po li - Maria Lodovica Gullino - Angelo Garibaldi Centro di Competenza per 1 'Innovazione in cameo agro- ambientale (AGROINNOVA), University degli Studi di Torino - Grugliasco (TO) della Liguria, dove, nella sola pianura di Albenga (SV), Riassunto Nel corso dell'estate 2010, numerose piante di Crassula la produzione annuale complessiva registrata negli ultimi ovata appartenenti alle cv Mini e Magical Tree, allevate in un'azienda floricola ligure, manifestavano sintomi di avvizzimento, in seguito ai quali morivano. It fungo agente delle alterazioni osservate veniva isolato dai tessuti infetti di entrambe le cultivar e classificato come Fusarium oxysporum, in base all'osservazione delle caratteristiche morfologiche del micelio cresciuto in vitro e con l'analisi della sequenza ITS (Internal Transcribed Spacer). In questa nota vengono descritti i sintomi osservati in campo e le osservazioni effettuate at microscopio ottico. Questa e la prima segnalazione di E oxysporum su C. ovata nel nostro Paese, cosi come nel mondo. Parole chiave: piante ornamentali; piante succulente; Crassula argentea; C. portulacacea; tracheofusariosi anni supera i 60 milioni di pezzi (Colla, 2005; C.C.I.A.A. di Savona, 2009). In tale ambito, la produzione di piante succulente, pur comportando oneri produttivi piuttosto elevati, consente di commercializzare una grande variety di specie e cultivar, in alcuni casi in contenitori di grandi dimensioni e, dunque, pin remunerative (Borsotto et al., 2008). Crassula ovata (sin.: C. argentea, C. portulacacea), famiglia Crassulaceae, e una pianta succulenta, perennante con foglie sempreverdi, a volte bordate da lievi sfumature rosse e fiori piccoli bianchi. In questa nota e descritta l'alterazione che nell'estate 2010 ha colpito numerose piante di C. ovata "Mini" e "Magical Tree", entrambe le cultivar allevate in un'azienda floricola localizzata a Bordighera (IM). Sintomi osservati C. ovata "Mini". Durante it mese di luglio, 10.000 piante Summary First report of a vascular wilt caused by Fusarium di circa 3 mesi di eta, moltiplicate per talea e quindi oxysporum on jade plant (Crassula ovata) cultivated trapiantate in vasi di plastica (diametro 10 cm) contenenti in Italy During the summer 2010, symptoms of a vascular wilt were observed on plants of Crassula ovata belonging to the cultivars Mini and Magical Tree, cultivated in a farm substrato di coltivazione torboso con scheletro (pH di maggiore i ntere s se della produzione orto-florovivai stic a di eta, acquistate dall'Olanda, venivano sistemate in 6,5; E.C. 500 [IS), erano allevate in ombraio (riduzione della Luce del 30% circa) ed irrigate manualmente per aspersione. La density colturale era di 100 piante per located in Bordighera (Imperia province, Northern Italy). metro quadrato. I primi sintomi comparivano in luglio The fungus causal agent of the disease was isolated from e consistevano in una lieve clorosi che accompagnava infected tissues of both the cultivars and it was identified la prematura caduta delle foglie ancora turgide. Con as Fusarium oxysporum with the morphological it progredire della malattia, i sintomi divenivano pin characteristics of mycelium growing in vitro and with the appariscenti: le foglie ingiallivano e avvizzivano prima ITS (Internal Transcribed Spacer) analysis. Symptoms della filloptosi, it fusto anche'esso avvizziva, si ripiegava observed on infected plants and characteristics of the vistosamente, a tratti marciva e, in seguito, disseccava, con pathogen on the microscope are reported. This is the first andamento acropeto (Fig. 1). In alcuni casi, it marciume report of F. oxysporum on C. ovata reported in Italy, as passava dal fusto alla parte basale delle foglie; altre volte, it fusto cedeva al peso della chioma e si spezzava. well as in the world. Key words: ornamental plants; cacti; C. argentea; C. Sezionando i fusti colpiti in senso sia longitudinale, sia trasversale, i vasi conduttori apparivano imbruniti (Fig. portulacacea; fitsarium wilt 2a). Era colpito circa it 65% delle piante coltivate. C. ovata "Magical Tree". Durante ii mese di luglio, Introduzione La coltivazione di piante in vaso costituisce uno dei settori 600 piante di C. ovata "Magical Tree" di circa 9 mesi 44 3-2011 serra, dove erano allevate in vasi di plastica (diametro 12 cm), contenenti lo stesso substrato di coltivazione precedentemente citato. La density colturale era di 68 piante per metro quadrato e l'irrigazione era effettuata 2006). La classificazione degli isolati ottenuti era confermata con l'analisi della sequenza ITS. II DNA dei ceppi isolati da entrambe le cultivar di C. ovata veniva tramite bagnatura manuale. La prima comparsa dei estratto utilizzando it Nucleospin Plant kit (Macherey Nagel). Sul DNA estratto veniva condotta una reazione di PCR, utilizzando i primer ITS1/ITS4 (White et al., da una pin intensa filloptosi anticipata (Fig. 2b). Era 1990) in grado di amplificare la regione intergenica tra colpito circa i15% delle piante coltivate. le sequenze codificanti per gli RNA ribosomali 28S e 18S che comprende at suo in-term la sequenza del Identificazione del patogeno rRNA 5S (Internal Transcribed Spacer). Il prodotto Alcuni campioni di entrambe le cultivar colpite, erano della amplificazione era sequenziato direttamente, trasferiti in laboratorio dove venivano effettuati gli ottenendo rispettivamente una sequenza di 515 paia di isolamenti. I fusti infetti erano disinfettati in una soluzione basi per C. ovata "Mini" (Gene Bank accession number di ipoclorito di sodio (1%) e poi abbondantemente HQ682196) ed una sequenza di 509 paia di basi per C. risciacquati in acqua sterile. Quindi, dal margine degli ovata "Magical Tree" (Gene Bank accession number imbrunimenti dei vasi conduttori alterati, erano prelevati HQ682197). Le sequenze, analizzate con l'algoritmo numerosi frammenti che venivano trasferiti in piastre BLASTn (Altschul et al., 1997) (E =0), identificavano Petri contenenti terreno di coltura selettivo per Fusaria come Fusarium oxysporum it fungo isolato da entrambe sintomi avveniva in agosto. I sintomi erano molto simili a quelli prima descritti per C. ovata "Mini" e caratterizzati (Komada, 1975). Per entrambe le cultivar, si sviluppavano le colonie di un fungo che, allevato in purezza su PDA, appariva costituito da micelio piuttosto soffice e copioso, di colore viola pallido (Summerell et al., 2003), generante pigmenti violacei nel substrato agarizzato e formante un feltro superficiale nelle vecchie colture. Successivamente, dagli stessi isolati erano ricavati ceppi monoconidici, poi conservati a 7°C, in provette sterili contenenti substrato SNA (KH,PO4 1g; KNO3 1g; MgSO4*7H20 0,5 g; KCI 0,5 g; Glucosio 0,2 g; Saccarosio 0,2g; Agar 20g; Acqua distillata 1 L) (Nirenberg, 1976). I ceppi monoconidici le cultivar colpite. Inoculazioni artificiali Per entrambe le cultivar considerate, 3 piante apparentemente sane di circa 5 mesi di eta, venivano inoculate artificialmente tramite l'immersione delle radici in una sospensione conidica degli isolati, ottenuta in substrato liquido a base di idrolizzato di caseina posto in agitazione (90 r.p.m.) per 10 giomi, alla temperatura di 24°C ± 1, in altemanza di Luce e buio (12/12h) e, successivamente, omogeneizzato e diluito. venivano utilizzati per effettuate le osservazioni di La concentrazione finale impiegata era di 1 x 106 CFU/ seguito descritte, coltivandoli in cella climatica, alla ml per entrambe gli isolati saggiati. Appena inoculate, temperatura di 25°C ± 1, in altemanza di luce e buio le piante erano trapiantate in vasi contenenti circa tre (12/12h). L'isolato ottenuto da C. ovata "Mini", litri di terriccio costituito da torba di sfagno, pomice, produceva macroconidi poco numerosi, lievemente corteccia di pino e argilla (50:20:20:10), precedentemente falcati, quasi diritti, 3-settati (talvolta con 4 setti), dotati di cellula basale a forma di piede e di cellula apicale ottusa, aventi le dimensioni di 30-46 x 4-5 (media: 36 x 5) pm. Le colonie producevano corte monofialidi che generavano microconidi unicellulari, di forma ovato- ellittica (talvolta reniforme), aventi le dimensioni di 5-13 x 3-4 (media: 8 x 3) Km. Le clamidospore erano disinfestato a vapore. Tre piante erano immerse in acqua sterile ed utilizzate in quality di testimoni. Tutte le piante venivano allevate in cella climatica, in alternanza di luce e buio (12/12h), alla temperatura di 25°C ± 1. Circa 13 giomi dopo l'inoculazione, i primi sintomi apparivano solamente sulle piante inoculate di entrambe le cultivar saggiate. Successivamente, si ripetevano gli stessi sintomi abbondanti, singole, terminali ed intercalari, costituite da parete ruvida e misuravano 6-8 pm. L'isolato ottenuto da C. ovata "Magical Tree", coltivato su SNA, produceva macroconidi poco numerosi, quasi diritti, con una cellula basale pin affusolata dei precedenti e una cellula osservati in campo e dalle piante di C. ovata "Mini" e "Magical Tree" era possibile reisolare to stesso fungo apicale ottusa, dotati in media di 3 setti (talvolta 4, 5) e aventi le dimensioni di 30-56 x 3-4 (media: 41 x 4) p.m. I microconidi, anche in questo caso prodotti da monofialidi, erano unicellulari, ovato-ellittici (talvolta In bibliografia scientifica sono riportate pochissime reniformi), e avevano le dimensioni di 5-13 x 2-4 (media: 9 x 3)p,m. Le clamidospore erano abbondanti, singole (a volte riunite in coppie), terminali ed intercalari, costituite da parete ruvida e misuravano 6-9 Km. Le caratteristiche (Pape, 1930); negli Stati Uniti, venue attribuita a Fusarium morfologiche descritte consentivano di identificare gli isolati ottenuti da entrambe le cultivar di C. ovata come appartenente al genere Fusarium (Leslie e Summerell, inoculato, soddisfacendo i postulati di Koch (Fig. 3). Conclusioni segnalazioni di fusariosi su piante del genere Crassula. In Germania, gli attacchi riscontrati su C. rubicunda, vennero attribuiti a Fusarium herbarum var. graminum sp. la presenza dei marciumi del fusto riscontrati su C. argentea (sin.: C. ovata) (Alfieri et al., 1984; Farr et al., 1989). Pertanto, riteniamo che questa sia la prima segnalazione di F oxysporum su C. ovata nel nostro Paese, cosi come nel resto del mondo. L' elevato numero di C. ovata colpite, in particolare 45 3-2011 Figura 1 - Avvizzimento e necrosi causati da Fusarium oxysporum su pianta di Crassula ovata "Mini" allevata in vaso. Figure 1 - Wilt and necrosis caused by Fusarium oxysporum on potted plant of Crassula ovata "Mini". Figura 2 - Imbrunimenti vascolari causati da Fusarium oxysporum su fusti di Crassula ovata "Mini" (2a) e C. ovata "Magical Tree" (2b). Figure 2 - Vascular browning caused by Fusarium oxysporum on stems of Crassula ovata "Mini" (2a) and C. ovata "Magical Tree" (2b). nella cv Mini, pone in evidenza i potenziali rischi che F oxysporum costituisce per la coltivazione di questa specie. Pertanto, e opportuno approfondire gli aspetti epidemiologici di questo parassita, isolato per la prima volta da Crassula e, dunque non ancora studiato, per confermare it probabile effetto positivo determinato sul microrganismo dalle temperature medio-elevate, come fa supporre la comparsa della malattia avvenuta nel periodo estivo. Ci6 implicherebbe maggiori facility it passaggio del parassita da un contenitore all'altro, tramite schizzi d' acqua provenienti da terriccio contaminato. La coltivazione in vaso di Crassula spp. offre la possibility di eradicare it parassita con maggior facility, eliminando it substrato infetto e disinfettando anche i teli pacciamanti su cui poggiano i vasi. Infine, per quanto concerne it ricorso a mezzi chimici di lotta, occorrera saggiare l'efficacia del tiram. difficolta nell'osservare la comparsa dei sintomi in aree di moltiplicazione soggette a climi piu freschi (ad esempio, quelli olandesi da cui provenivano le piante Ringraziamenti di C. ovata "Magical Tree" su cui sono comparse le alterazioni descritte), con it conseguente rischio di diffondere rapidamente materiale infetto, come gia accaduto proprio per alcune tracheofusariosi di specie ornamentali (Garibaldi et al., 2000). Tramite saggi in vivo e tecniche di biologia molecolare, occorrera valutare l'appartenenza dei ceppi isolati da C. ovata a dell'Ambiente e della Tutela del Territorio e del una nuova forma specialis di F oxysporum, in grado di colpire solamente piante afferenti al genere Crassula o ad esso vicine e di stabilire l'eventuale presenza di ospiti secondari, in grado di incrementare it potenziale di diffusione del parassita nelle locality di coltivazione. Prove di suscettibilita, condotte saggiando le numerose specie e cultivar di Crassula spp. diffuse sul mercato, potranno fornire indicazioni utili per valutare l'applicazione della resistenza genetica come mezzo di lotta. Un altro aspetto da chiarire riguarda l'origine delle infezioni e l'eventuale utilizzo di sementi o di materiale propagativo infetti: a questo riguardo, e assolutamente Lavori citati da evitare la moltiplicazione tramite talee prelevate da piante recanti sintomi che vanno invece eliminate quanto prima. L' eliminazione tempestiva degli ospiti infetti e tanto pia essenziale dove it sesto di impianto adottato e molto fitto e, pertanto, consente con maggior Lavoro svolto con it contributo del Ministero Mare, nell'ambito dell'accordo programmatico per la promozione dell'agricoltura sostenibile. Si ringrazia it Dott. Yari Rizzuto per la preziosa collaborazione svolta in questa attivita di ricerca. Alfieri S. A. Jr., Langdon K. R., Wehlburg C., Kimbrough J. W. (1984) - Index of plant diseases in Florida. Department of Agriculture and Consumer Services, Division of Plant Industry, Bulletin 11, Gainesville, Florida, 389 pp. Altschul S. F., Madden T. L., Schaffer A. A., Zhang Z., Miller W., Lipman D. J. (1997) - Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programme. Nucleic Acids Research, 25, 33893402. Borsotto P., Sturla A., Trione S. (2008) - La floricoltura ligure. Istituto Nazionale di Economia Agraria (I.N.E.A.) e Regione Liguria, Roma, 113 pp. C.C.I.A.A. di Savona (2009) - http://www.sv.camcom.it Colla L. (2005) - L'agricoltura nell'albenganese. 46 3-2011 Figura 3 - Avvizzimento di piante di Crassula ovata "Mini" artificialmente inoculate con Fusarium oxysporum. Figura 3 - Wilting of potted plants of Crassula ovata "Mini" artificially inoculated with Fusarium oxysporum. Ed. Camera di Commercio Industria Artigianato e A utilitarian approach to Fusarium identification. Plant Agricoltura di Savona - Collana Strumenti 6/2005, 54 Disease, 87, 117-128. pp. Komada H. (1975) - Development of a selective medium White T.J., Bruns T., Lee S., Taylor J.W. (1990) - Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: PCR for quantitative isolation of Fusarium oxysporum from natural soil. Rev. Plant Prot. Res. 8, 114-125. Protocols: a guide to methods and applications, Innis Farr D. F., Bills G. F., Chamuris G. P., Rossman A. M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J. e White T.J. Editors, Y. (1989) - Fungi on plants and plant products in the Academic Press, San Diego, California, USA, 315 United States. APS Press, St. Paul, Minnesota, Stati 322. Uniti, 1252 pp. Garibaldi A., Gullino M. L., Lisa V. (2000) - Malattie delle piante ornamentali. Calderini Edagricole, Bologna, 574 pp. Leslie J. F., Summerell B. A. (2006) - The Fusarium Laboratory Manual. Blackwell Professional, Ames, Iowa, USA, 388 pp. Nirenberg H. I. (1976) - Untersuchungen fiber die morphologische und biologische Differenzierung in der Fusarium Sektion Liseola. Mitteilungen aus der Biologischen Bundesanstalt Fur LandForstwirtschaft (Berlin-Dahlem), 169, 1-117. und Pape H. (1930) -A wilting of the shoots of Crassula rubicunda. Gartenwelt, 34, 691-692. Summerell B. A., Baharuddin S., Leslie J. F. (2003) 47 3-2011