- L’obiettivo principale della ricerca biomedica consiste nel tentativo
di comprendere, a livello molecolare, processi biologici complessi
al fine di migliorare la salute ed il benessere dell’uomo.
- Uno dei meccanismi biologici più importanti è connesso al controllo
della divisione e proliferazione cellulare.
- Infatti, alterazioni in questo meccanismo sono alla base di molte
malattie dell’uomo, in particolare dell’insorgenza di tumori.
- Tuttavia, e non solo per evidenti motivi etici, l’uomo spesso non è
l’organismo più idoneo per la sperimentazione biologica.
ORGANISMI MODELLO
ORGANISMI MODELLO
- Il loro utilizzo deve essere economico;
- Devono poter essere tenuti in condizioni controllate di laboratorio
occupando il minor spazio possibile;
- Devono avere un ciclo di riproduzione rapido;
- Devono originare una progenie numerosa;
- La sequenza del loro genoma deve essere nota;
- Devono avere caratteristiche che permettano l’applicazione delle
più moderne tecnologie genetiche e molecolari.
conservazione evolutiva
il batterio Escherichia coli
il lievito Saccharomyces cerevisiae
il moscerino della frutta
Drosophila melanogaster
il pesce Dania rerio (zebrafish)
il topo Mus musculus
il nematode Caenorhabditis elegans
la pianta erbacea infestante Arabidopsis thaliana
LIEVITO
mammifero onorario
a
?
“mammifero onorario ”
Università degli Studi di Milano
Settore Didattico, via Celoria 20, Milano
Laboratorio 105
GRUPPO DI LAVORO
A cura di:
Prof.ssa Cinzia Grazioli, insegnante di Scienze delle scuole secondarie di
secondo grado, distaccata presso il Cus-Mi-Bio
Prof.ssa Maria Grazia Fiorin, IIS “P.Levi”, Bollate
Prof.ssa Cristina Gritti, Liceo Statale “G.Galilei”, Caravaggio
Prof.ssa Maria Teresa Oliveira, IPSIA “Fiocchi”, Lecco
Prof.ssa Olga Pecorari, ITSOS “M.Curie”, Cernusco sul Naviglio
Prof.ssa Maria Rosaria Quarta, IIS “Schiapparelli”, Milano
Prof.ssa Giovanna Tabita, IIS “Leonardo da Vinci”, Cologno Monzese
Supervisione di: Prof. Paolo Plevani, Dipartimento di Biologia e
Biotecnologie, Università degli Studi di Milano.
Vantaggi generali del lievito Saccharomyces cerevisiae
per studi di Genetica
• E’ un eucariote unicellulare che può essere cresciuto facilmente
in terreni liquidi o solidi definiti fornendo un completo controllo
dei parametri ambientali;
• Può esistere stabilmente sia come organismo aploide che diploide:
in tal modo, mutazioni recessive possono facilmente essere isolate ed
analizzate in ceppi aploidi, mentre analisi di complementazione
possono essere fatte in ceppi diploidi.
• I prodotti della meiosi possono essere facilmente analizzati
• Importanza di tali caratteristiche per screening genetici
Il ciclo vitale del lievito Saccharomyces cereviae
e la sua importanza per l’analisi genetica
Sporulazione e
divisione meiotica
spore
Un asco che contiene le 4 spore
aploidi prodotte durante il processo
meiotico.
asco
Il ciclo vitale del lievito Saccharomyces cerevisiae. I due ceppi aploidi (a e
alfa) possono accoppiarsi e formare il ceppo diploide a/alfa che, in condizioni
limitanti di nutrienti, va incontro a sporificazione rigenerando nel processo
meiotico spore aploidi.
Un
microscopio
con
micromanipolatore utilizzato per
la dissezione degli aschi.
Argomento di oggi:
Il controllo del ciclo cellulare Perché il lievito è stato e continua ad essere
il modello biologico più importante per lo studio di questo
essenziale processo
Il ciclo cellulare
Il ciclo cellulare è una sequenza ordinata di eventi che possono
essere eseguiti solo quando l’evento precedente è stato
correttamente completato.
Fase S (una solo volta per ciclo) e completata prima di M.
I checkpoints “intrinseci” controllano la
successione degli eventi in condizioni fisiologiche
Cromosomi non ancorati
alle fibre del fuso mitotico
Genome
segregation
Mitosi non finita
Genome
duplication
Replicazione del DNA incompleta
iDS
Checkpoints “estrinseci” si aggiungono a quelli “intrinseci” in
condizioni patologiche (ad es. danni al DNA)
danni al DNA
cromosomi non ancorati
alle fibre del fuso mitotico
Genome
segregation
mitosi non finita
Genome
duplication
iDS
danni al DNA
danni al DNA
replicazione del DNA incompleta
Il ciclo cellulare come integrazione fra
eventi continui e discontinui
• Processi continui: crescita cellulare, sintesi proteica, ribosomi, mitocondri,
membrane etc.
• Processi discontinui: replicazione dei cromosomi, segregazione dei
cromosomi L’organismo modello per lo studio dell’integrazione degli eventi del
ciclo cellulare è stato il lievito S.cerevisiae
- Il lievito S.cerevisiae si divide per gemmazione
- Importanza del coordinamento tra aumento della
massa e ciclo cromosomico
Il lievito per lo studio del ciclo cellulare
G1
S
G2
M
S.cerevisiae si divide per gemmazione.
La posizione delle cellule durante il ciclo può essere
Stabilita osservando vari parametri :
– – – – – Morfologia cellulare
Contenuto del DNA
Morfologia del nucleo
Il centro di organizzazione
dei microtuboli
La morfologia delle fibre del fuso 15
Il lievito per lo studio del ciclo
• Le cellule possono essere bloccate:
– – – – • G1 con alpha-factor
S con HU
M con nocodazolo
Temperatura utilizzando mutanti cdc
Colture sincrone possono essere ottenute mediante:
- - Blocco e rilascio (alpha factor, HU, Nocodazole, temperatura)
Possono essere analizzate mediante citofluorimetria a flusso Avendo a disposizione cellule sincrone
si possono fare molte osservazioni morfologiche e molecolari,
per es. valutare il livello di specifiche proteine
Lee Hartwell , premio Nobel 2001, per la scoperta
dei mutanti “cell division cycle” (cdc)
Geni che controllano il ciclo cellulare devono essere essenziali per la vitalità cellulare.
a) Come si possono trovare mutazioni in geni essenziali per la vita
della cellula?
b) Come si possono individuare (tra le mutazioni che aboliscono
la vitalità di una cellula) le mutazioni che bloccano specifiche funzioni richieste per il controllo del ciclo cellulare ?
a) Come si possono trovare mutazioni in geni essenziali per la vita
della cellula ?
Ricerca di mutazioni letali-condizionali; ad es. temperatura-sensibili
ts
La tecnica del replica-plating per individuare mutazioni temperatura-sensibili in lievito (vedi testo per i
dettagli). La stessa tecnica è utilizzata per individuare analoghe mutazioni anche nei batteri.
Individuazione di mutanti cdc in lievito
Combinando più mutazioni cdc che informazioni possiamo ottenere ?
Mutanti cdc bloccati in diverse fasi del ciclo
cellulare. Il gene CDC28 codifica per una
funzione richiesta per il passaggio dalla fase G1
alla fase S. Infatti, tutte le cellule cdc28 mutanti
si bloccano con la morfologia tipica di cellule
in G1 (senza gemma) dopo trasferimento alla
temperatura non-permissiva. Il gene CDC7
codifica una funzione richiesta per la fase S.
Infatti, tutte le cellule mutanti cdc7 hanno la
stessa morfologia (una gemma più piccola della
cellula madre, tipica di cellule in fase S).
Cellule che portano entrambe le mutazioni si
bloccano con la morfologia tipica dei mutanti
cdc28 e non di mutanti cdc7, indicando che il
gene CDC28 agisce temporalmente prima del
gene CDC7.
Il gene CDC28 agisce prima del gene CDC7
A
G1
1st cycle
M
S
G1
M
S
B
G2
G2
G1
2nd cycle M
S
M
S
B
G2
A
G1
G2
Vantaggi generali del lievito Saccharomyces cerevisiae
per studi di clonaggio e di Biologia Molecolare
Il lievito è facilmente trasformabile. Esistono una varietà di vettori di
clonaggio che possono essere introdotti in lievito ed usati per esprimere
geni omologhi o eterologhi;
Tali vettori possono mantenersi come elementi extracromosomici o essere indotti ad integrarsi in specifiche posizioni nel genoma di lievito;
In tal caso, l’integrazione nel genoma avviene per lo più tramite
ricombinazione omologa;
Facilità di esperimenti 1) di Knock-out; 2) Knock-in; 3) mutagenesi
GENOMICA FUNZIONALE: “REVERSE GENETICS”
Clonaggio di tutti i geni CDC mediante complementazione
funzionale
Cosa vuole dire ????
Costruzione di una libreria di DNA in
un
vettore
plasmidico.
Diversi
frammenti di DNA di un organismo
(colori diversi) sono inseriti nello
stesso vettore di clonaggio, ed i
plasmidi
ricombinanti
vengono
utilizzati per trasformare cellule di
E.coli o lievito. Nella popolazione di
plasmidi ricombinanti è rappresentato
tutto il genoma dell’organismo
utilizzato per la preparazione della
libreria.
Cosa succede se in una cellula
di lievito porta una mutazione
recessiva in una gene cdc ed in
tale cellula si fa entrare un
plasmide che porta il gene
selvatico ?
La sviluppo di vettori per il clonaggio in lievito ha portato a scoperte
estremamente importanti per l’individuazione e studio di regioni
di DNA essenziali per la stabilità del genoma:
- Origini di replicazione del DNA
- Centromeri
- Telomeri
Vettori:
YIp (Yeast Integrative plasmid)
YRp (Yeast Replicative plasmid)
YCp (Yeast Centromeric plasmid)
YAC (Yeast Artificial Chromosome)
Un paziente può essere l’equivalente di un mutante di lievito
La stabilità del genoma: il problema
•
•
46 cromosomi; 6.5 miliardi di nucleotidi da replicare e segregare
Il DNA deve essere riparato
Il DNA è l’unica molecola che la cellula si prende la
fatica di riparare
Centinaia di lesioni diverse causate da:
a) Metabolismo cellulare
b) Agenti chimico-fisici Il numero di lesioni endogene/cellula/24 ore è molto elevato:
sistemi di riparazione devono essere altamente efficienti
ssDNA breaks
interstrand crosslinks
dsDNA breaks
50000
10
10
Una singola mutazione in un gene che codifica per
una funzione richiesta per la riparazione del DNA
può causare instabilità genomica
Cellula normale
Mutazione in Instabilità
un gene della genomica
riparazione del
DNA
Cellula
tumorale
Fenotipo mutatore
Instabilità genomica in cellule
tumorali
Rotture
Delezioni
Traslocazioni
Inversioni
Duplicazioni
Amplificazioni
La risposta della cellula a danni al DNA è
molto complessa
Riparazione
Danni al DNA
DNA damage checkpoints
Apoptosi
Ciclo cellulare
Replicazione del DNA
Trascrizione
•Meccanismi conservati dal lievito all’uomo
•Mutazioni nei geni dei checkpoints causano instabilità genomica
