“MICROBIOLOGIA GENERALE” Prof. C. Mazzoni Corso di Laurea Triennale Biotecnologie Agro- Industriali Università di Roma “La Sapienza” in Appunti della lezione 11 Diapositive della lezione 11 Capitolo 6 1 Il ciclo cellulare nei batteri Il ciclo cellulare rappresenta il periodo di tempo in cui un nuovo batterio si allunga, replica il proprio DNA e si divide per generare due cellule figlie. La replicazione del DNA e gli eventi coinvolti nella formazione delle due cellule figlie vengono regolati sotto stretto controllo. Nella generazione di una nuova cellula esiste infatti un evento regolatore che dà l’avvio alla duplicazione del genoma batterico. Il tempo necessario per duplicare le 4,2X106 coppie di basi del DNA di batteri con un tempo di generazione tra i 20 e i 60 minuti è di 40 minuti; questa è la fase C (diap.2). Dopo il completamento della duplicazione del DNA, vi è un intervallo di circa 20 minuti prima che si verifichi la divisione; questa è la fase D (delay) durante la quale il DNA duplicato si separa verso le estremità opposte della cellula allungata. In che modo una specie che ha un tempo di generazione di 25 minuti quando la replicazione del DNA richiede almeno 40 minuti? La risposta è che una seconda replicazione inizia sulla porzione del DNA che si è già replicata prima che la fase C della prima replicazione sia giunta a compimento. Pertanto, ambedue le cellule figlie possono ricevere un genoma che possiede forcelle di replicazione in via di formazione. Effetto della concentrazione dei nutrienti sulla velocità di crescita. Il nutriente (substrato) viene aggiunto ai terreni di crescita come fonte di carbonio e di energia; in genere, la quantità che viene aggiunta è in eccedenza rispetto al livello necessario per ottenere la crescita massima. La velocità di crescita è più rapida con l’aumentare dei livelli del nutriente, ma si stabilizza oltre una data soglia di concentrazione del substrato. Quando il substrato viene aggiunto al di sotto del livello soglia, allora la velocità di crescita si riduce. Una riduzione della velocità di crescita in presenza di bassi livelli del nutriente deriva dalla incapacità di un organismo a trasportare il substrato con una velocità sufficiente a mantenere una crescita bilanciata. L’accumulo intracellulare degli intermedi essenziali è più basso di quanto non lo sia alla saturazione del substrato, e non tutti i precursori sono disponibili contemporaneamente per consentire una velocità massima di sintesi e riproduzione cellulare. La concentrazione dei nutrienti influisce anche sul numero di cellule prodotte complessivamente (diap. 29). Con l’aumentare del livello di nutrienti, cresce proporzionalmente anche la produzione delle cellule (resa cellulare); comunque, se la concentrazione di un nutriente nel terreno viene aumentata oltre una certa soglia, la produzione cellulare e la resa di crescita non aumenteranno. Quando la fonte di energia disponibile per un organismo è molto scarsa, allora la crescita cellulare si interrompe. Gli organismi richiedono una quantità stabilita di energia, detta energia di mantenimento, necessaria semplicemente per consentire loro di sopravvivere e svolgere le funzioni di base. L’energia di mantenimento viene utilizzata per la replicazione del DNA, l’accumulo del nutriente all’interno della cellula, la motilità, il turnover delle macromolecole, il mantenimento di un potenziale attraverso la membrana citoplasmatica etc.. Un aumento del numero di cellule può verificarsi solo quando l’energia disponibile supera le esigenze di mantenimento non correlate alla crescita. E’ opportuno sottolineare come la velocità di crescita, la crescita totale e la concentrazione del substrato necessaria a supportare la crescita siano tutti parametri diversi da specie a specie. Alcuni organismi non cresceranno in presenza di un’elevata densità microbica nella 2 sospensione, anche se in presenza del nutriente favorevole e di quelle che vengono ritenute le condizioni di crescita ottimali. Crescita sincrona delle cellule in coltura Non è possibile misurare in una singola cellula batterica gli eventi che si succedono durante il ciclo cellulare. Informazioni sulla sequenza degli eventi che si verificano durante un ciclo cellulare si possono ottenere con una certa precisione solo quando esaminiamo una popolazione in cui tutte le cellule si trovano nella stessa fase di divisione. Una coltura in cui ciascuna cellula sia nello stesso stadio di divisione è detta colture sincrona. I dati ottenuti dallo studio di tale popolazione possono essere applicati ad un’unica cellula. Dalla curva di crescita di una coltura sincrona (diap. 31) si evince che vi è una periodicità nel numero delle cellule rispetto al tempo; ciò significa che tutte le cellule presenti nella coltura si dividono allo stesso tempo. Sono state sviluppate diverse tecniche che consentono di ottenere una coltura sincrona (diap. 30). La divisione simultanea dei batteri non dura più di due o tre generazioni, per cui la sperimentazione che coinvolge le attività metaboliche che avvengono durante il ciclo cellulare deve essere eseguita con la prima o la seconda generazione. Efficienza della crescita: rese di crescita. L’efficienza di un microrganismo nel convertire un substrato in massa cellulare è detta efficienza della crescita (diap. 33). Tale parametro viene misurato confrontando i grammi di biomassa prodotti per mole di substrato utilizzato; il rapporto tra la massa cellulare ottenuta e il substrato consumato viene definito resa di crescita e calcolato mediante l’equazione ysub= xmax - x0 / moli di substrato utilizzate In questo caso xmax è la massa cellulare ottenuta, mentre x0 rappresenta la quantità di cellule inoculate; la resa di crescita sarà espressa come ymax o ysub (peso secco in grammi delle cellule /mole di substrato). Negli organismi di cui è nota la via catabolica per l’utilizzazione del substrato, può essere calcolata anche la resa di energia (ATP formato). La resa di crescita può essere Glucosio + 2ADP + 2P Pertanto è possibile determinare la massa delle cellule prodotte per mole di ATP generato in organismi come questi, dove il substrato viene utilizzato solo come fonte di energia. La resa di crescita yATP, è in genere un parametro costante fra i batteri; una mole di ATP favorirà la crescita di circa 10 grammi di massa cellulare (peso secco). Di conseguenza, la resa cellulare in un substrato utilizzato solamente come fonte di energia è una funzione diretta del numero delle molecole di ATP prodotte per mole di fonte di energia utilizzata (diap. 34). Questo sta a dimostrare che, nonostante la diversità microbica, il valore di yATP è costante e che le vie biosintetiche alimentate dall’ATP sono simili in tutte le specie. La diversità della espressa anche come yATP, che rappresenta il peso secco in grammi della biomassa per mole di ATP disponibile. I batteri anaerobi, come i batteri lattici, necessitano di un terreno di crescita molto complesso e, in genere utilizzano il glucosio unicamente come fonte di energia secondo la reazione 2 acido lattico + 2ATP vita microbica è pertanto determinata dai singoli mezzi con cui i microrganismi generano l’ATP necessario (ovvero, diversità delle vie cataboliche e dei substrati utilizzati). La resa di crescita di un batterio chemioeterotrofo che utilizza un substrato come sorgente sia di energia che di carbonio è molto più difficoltosa da valutare in termini di ATP generato. Gli organismi aerobi che utilizzano uno zucchero o altri substrati come fonte di carbonio ed energia differiscono nella loro efficienza. Alcuni esperimenti indicano che nei chemioeterotrofi, la capacità di conversione del substrato in biomassa varia dal 15% al 50%; nel caso di uno zucchero la conversione 3 massima in biomassa è di circa il 50% (per metà viene assimilato dalle cellule mentre per l’altra metà viene rilasciato come CO2 o come prodotto di rifiuto). Un microrganismo che cresce in presenza di metano (CH4), per cui viene aggiunta una mole di ossigeno atmosferico per mole di metano assimilato, può avere una resa cellulare pari fino al 70%. 4