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Comitato Telethon Fondazione Onlus
XVI Convention Scientifica
7-9 marzo 2011
Riva del Garda - Palazzo dei Congressi
Provincia
Autonoma di Trento
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Comitato Telethon Fondazione Onlus
XVI CONVENTION SCIENTIFICA
7-9 marzo 2011
Palazzo dei Congressi
RIVA DEL GARDA (TN)
PROVINCIA
AUTONOMA
DI TRENTO
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Immagini di copertina: “Frammenti di DNA dinamico di X e Y”
Realizzate da Sergio Barlati – Sezione di Biologia e Genetica – DSBB – Università di Brescia
Le immagini riportate sono state generate con il software “Symbol Color” ideato dall’autore. Il software trasforma
le sequenze di DNA in immagini a colori con la sostituzione di un colore specifico, scelto dall’autore, per ciascuna
delle basi A,T,C,G della sequenza prescelta. Frammenti delle sequenze genomiche (riferimento alla sequenza
umana - NCBI built 36.1) derivate da porzioni del Cromosoma X, dal nucleotide 61.613.951 al 61.636.662
(copertina - fronte), e dei Cromosomi X e Y, sequenza PAR1 dal nucleotide 123.815 al 155.700 (copertina- retro),
hanno generato le immagini riportate. Ogni base è rappresentata da un quadrato di 4x4 pixels ed inizia dalla
prima base (in alto a sinistra) sino all’ ultimo quadrato (ultima linea) della sequenza indicata. Il trasferimento di
questo tipo di immagini su di un supporto solido è stato brevettato dall’Università di Brescia (n°:
BS2005A000087) che ha autorizzato la donazione a Telethon delle immagini realizzate per il loro inserimento nelle
copertine del volume del Convegno Scientifico del 2011. Le immagini riportate corrispondono sequenze ripetitive e
variabili del DNA umano che possono essere coinvolte nei processi di ricombinazione del DNA: “Le ALI del DNA”.
Sei immagini di questo tipo, trasferite su vetrate e definite “Vetri Parlanti”, decorano l’ascensore di fronte all’Aula
Magna della Facoltà di Medicina e Chirurgia dell’Università di Brescia. Queste immagini contengono informazioni di
DNA (4 colori), proteine (20 colori) o testi (oltre 25 colori) trasformate in immagini, ciascuna con associata una
specifica informazione in forma criptica.
Realizzazione: Pinelli Printing S.r.l., Via E. Fermi, 8 - 20096 Seggiano di Pioltello (MI)
Stampa: Stabilimento Tipolitografico UGO QUINTILY S.p.A., Viale Enrico Ortolani 149/155, 00125 ROMA,
www.quintily.it
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XVI Convention Scientifica
RINGRAZIAMENTI
Il Comitato Telethon Fondazione Onlus desidera esprimere la propria gratitudine a coloro che,
con la loro generosità, hanno contribuito a rendere possibile la
XVI Convention Scientifica Telethon:
Provincia Autonoma di Trento
BIO-RAD LABORATORIES S.r.l.
Charles River Laboratories Italia S.p.A.
DBA Italia S.r.l.
Ephoran Multi Imaging Solutions S.r.l.
EPPENDORF S.r.l.
EUROCLONE S.p.A.
Genechron Laboratory - Ylichron S.r.l.
GILSON Italia S.r.l.
HAMILTON Italia S.r.l.
Illumina Inc.
INTERNATIONAL PBI S.p.A.
LIFE TECHNOLOGIES - APPLIED BIOSYSTEMS ITALIA
MILLIPORE S.p.A.
M-MEDICAL S.r.l.
PERKIN ELMER Italia
QIAGEN S.p.A.
RESNOVA S.r.l.
ROCHE DIAGNOSTIC S.p.A.
SARSTEDT S.r.l.
SIGMA ALDRICH S.r.l.
SPA - Società Prodotti Antibiotici S.p.a. Div. BIOSPA
Tebu-bio S.r.l.
Tema Ricerca S.r.l.
VISUALSONICS INC.
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PROGRAMMA
Monday, 7th March 2011
10.00 – 14.00
Registration and poster setting up
14.00 – 14.15
Welcome
14.15 – 14.45
14.45 – 15.30
Opening address
Luca Cordero di Montezemolo (Telethon President)
Telethon today and tomorrow: achievements and challenges
Lucia Monaco (Telethon Chief Scientific Officer) (Talk 1)
followed by greetings from Fulvio Bruno (Head of Telethon Fundraising)
15.30 - 16.00
Coffee break
16.00 – 18.00
PLENARY SESSION 1 – Autophagy and genetic diseases
Chairpersons: Andrea Ballabio (Naples, Italy), Francesco Cecconi (Rome, Italy)
TFEB links autophagy to lysosomal biogenesis
Andrea Ballabio (Naples, Italy) (Talk 2)
Physiological and pathological regulation of the pro-autophagic factor Ambra1
Francesco Cecconi (Rome, Italy) (Talk 3)
Autophagy involvement in the control of muscle mass
Marco Sandri (Padua, Italy) (Talk 4)
Autophagy thwarts collagen VI muscular dystrophies
Paolo Bonaldo (Padua, Italy) (Talk 5)
HspB8 enhances autophagic degradation of mutant misfolded proteins responsible
for motorneuron diseases
Angelo Poletti (Milan, Italy) (Talk 6)
18.00 – 18.30
SPECIAL LECTURE
Introduction
Marco Piazza (Head of Telethon Institutional Communication)
Ricerca è … partecipazione - Per mantenere la promessa della cura
Giulio Giorello (Prof. Philosophy of Science, Milan, Italy)
18.30 - 20.00
POSTER SESSION 1
20.00 - 21.00
Welcome cocktail
Tuesday, 8th March 2011
8.00 – 8.30
Registration and poster setting up
8.30 – 10.30
PLENARY SESSION 2 – RNA, DNA, and Chromatin in Development and Disease
Chairpersons: Stephen Tapscott (Seattle, WA, USA), Valerio Orlando (Rome, Italy)
Facioscapulohumeral dystrophy: incomplete epigenetic suppression of a
retrotransposed gene
Stephen Tapscott (Seattle, WA, USA) (Talk 7)
Repetitive elements contribute to human skeletal muscle differentiation and
Duchenne muscular dystrophy progression
Valerio Orlando (Rome, Italy) (Talk 8)
Muscular dystrophies – from genetics to epigenetics
Pier Lorenzo Puri (Rome, Italy) (Talk 9)
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Experimental and in silico approaches to elucidate the role of microRNAs in eye
function
Sandro Banfi (Naples, Italy) (Talk 10)
Regulation of the Hedgehog signaling pathway in neural development and stem cells
Alberto Gulino (Rome, Italy) (Talk 11)
10.30 – 11.00
Coffee break
11.00 – 12.30
POSTER SESSION 2
13.00 - 14.00
Buffet Lunch
14.00 – 15.00
Hematopoietic Stem Cell Gene Therapy from Bench to Bedside:
Recent Advances, New Challenges and Future Promises
Luigi Naldini (Milan, Italy) (Talk 12)
12.30 – 13.00
PICTURE OF TELETHON SCIENTISTS
taken by Filippo Sbalchiero
KEYNOTE LECTURE
GSK Rare Diseases – Ambition and key role of collaborations
Jonathan Appleby (GlaxoSmithKline Alliance and Project Leader, UK)
15.00 – 16.30
PARALLEL SESSIONS A-B
A- The emerging field of mitochondrial medicine
Chairpersons: Michael Murphy (Cambridge, UK), Luca Scorrano (Padua, Italy)
Developing therapies to decrease mitochondrial damage in human diseases
Michael Murphy (Cambridge, UK) (Talk 13)
OPA1-dependent cristae remodeling disassembles respiratory chain supercomplexes,
triggering apoptotic mitochondrial dysfunction
Luca Scorrano (Padua, Italy) (Talk 14)
Toward a mitochondrial therapy of muscular dystrophies
Paolo Bernardi (Padua, Italy) (Talk 15)
Models of mitochondrial disorders in yeast, flies and mice: investigating the
pathophysiology and developing treatments in vivo
Massimo Zeviani (Milan, Italy) (Talk 16)
B- Primary Immunodeficiencies: different therapeutic approaches for a wide
spectrum of diseases
Chairpersons: Alessandro Aiuti (Milan, Italy), Federica Benvenuti (Trieste, Italy)
Hematopoietic stem cell-based gene therapy for primary immunodeficiencies
Alessandro Aiuti (Milan, Italy) (Talk 17)
Wiskott-Aldrich syndrome protein acts as a negative regulator of Toll-like receptor
signaling in dendritic cells
Federica Benvenuti (Trieste, Italy) (Talk 18)
IPEX syndrome, a monogenic autoimmune disease: biological profile and therapeutic
perspectives
Rosa Bacchetta (Milan, Italy) (Talk 19)
Cryopyrin associated periodic syndrome (CAPS): a paradigm for a group of inherited
autoinflammatory diseases
Marco Gattorno (Genova, Italy) (Talk 20)
16.30 – 17.00
Coffee break
17.00 – 19.00
POSTER SESSION 3
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18.30 – 19.00
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SPECIAL EVENT
The Chairman of Telethon Scientific Committee meets young investigators
Building a career as a scientist: mentorship, independence, leadership
Michael Caplan (New Haven, CT, USA)
Wine and Cheese
Wednesday, 9th March 2011
8.30 – 10.00
PARALLEL SESSIONS C-D
C- New strategies for the treatment of lysosomal storage diseases
Chairpersons: Beverly Davidson (Iowa City, IA, USA), Generoso Andria (Naples, Italy)
Molecular signatures of disease brain endothelia provide new sites for CNS-directed
enzyme therapy
Beverly Davidson (Iowa City, IA, USA) (Talk 21)
New therapies for lysosomal storage diseases. The model of Pompe disease
Giancarlo Parenti (Naples, Italy) (Talk 22)
CNS-directed gene/neural stem cell approaches for leukodystrophies
Angela Gritti (Milan, Italy) (Talk 23)
AAV-mediated liver gene therapy for mucopolysaccharidosis VI
Alberto Auricchio (Naples, Italy) (Talk 24)
D- Whole Genome Analysis: emerging technologies and applications
Chairpersons: Lynn Jorde (Salt Lake City, UT, USA), Graziano Pesole (Bari, Italy)
Direct estimates of the human mutation rate and disease-gene identification using
whole-genome sequence data
Lynn Jorde (Salt Lake City, UT, USA) (Talk 25)
Promises and challenges of high-throughput sequencing
Graziano Pesole (Bari, Italy) (Talk 26)
Whole Genome Analysis for the study of genetic basis of hearing loss
Paolo Gasparini (Trieste, Italy) (Talk 27)
Dissection of genetic mechanisms of hypoplastic left heart syndrome suggests a
multiple hits model
Maria Iascone (Bergamo, Italy) (Talk 28)
10.00 – 10.30
Coffee break
10.30 – 12.00
PLENARY SESSION 3 – Stem Cells for disease modelling and therapy
Chairpersons: Roger Pedersen (Cambridge, UK), Giulio Cossu (Milan, Italy)
Mechanisms of differentiation in mammalian pluripotent stem cells
Roger Pedersen (Cambridge, UK) (Talk 29)
A novel strategy for autologous cell therapy for Duchenne muscular dystrophy
Giulio Cossu (Milan, Italy) (Talk 30)
A novel role for Cripto in skeletal muscle regeneration and satellite cell mobilization
through modulation of TGFß family signaling pathways
Gabriella Minchiotti (Naples, Italy) (Talk 31)
Stem cell as a model and therapeutic tool for spinal muscular atrophy
Stefania Corti (Milan, Italy) (Talk 32)
12.00 – 12.30
12.30 – 13.00
LATE BREAKING NEWS
Poster prize and closing remarks
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PRESENTAZIONI ORALI
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PRESENTAZIONI ORALI
OPENING LECTURE
Autophagy is a catabolic process that relies on the cooperation of
two distinct types of cellular organelles, autophagosomes and lysosomes. Therefore, efficient regulation of the autophagic pathway
needs to impact on both autophagosomes and lysosomes in a coordinated fashion. We demonstrated that during starvation cells activate a transcriptional program that controls major steps of the autophagic pathway, including autophagosome formation, autophagosome-lysosome fusion and substrate degradation. The transcription
factor EB (TFEB), a previously identified master gene for lysosomal
biogenesis, coordinates this program by driving expression of both
autophagy and lysosomal genes. Starvation activates TFEB by acting on its post-translational modification. These data identify a novel mechanism that controls cellular clearance. Cells may use this
mechanism to adapt, in a coordinated fashion, to stressful conditions such as nutrient depletion. The discovery of a regulatory network that controls autophagosome/lysosome-mediated catabolic
processes suggests novel approaches to modulate cellular clearance. Recently, we tested whether TFEB overexpression could activate cellular clearance in neural stem cells (NSCs) isolated from
two mouse models of Multiple Sulfatase Deficiency (MSD) and Mucopolysaccharidosis type-IIIA (MPS-IIIA), respectively, and in human fibroblasts from patients with Pompe disease. TFEB overexpression significantly reduced lysosomal storage of GAGs in both
MSD and MPS-IIIA cells, measured by GAG staining and 3H-glucosamine incorporation into GAGs, and decreased glycogen storage
in human Pompe fibroblasts. In all cells TFEB overexpression restored normal cellular morphology, by reducing cellular vacuolization, and rescued intracellular trafficking defects. Preliminary in vivo data obtained in MSD mice show that systemic AAV-mediated
TFEB overexpression promotes cellular clearance and reduces inflammation and apoptosis in multiple tissues.
Talk 1
TELETHON TODAY AND TOMORROW
Lucia Monaco
Chief Scientific Officer, Fondazione Telethon, Milan, Italy
In the last twenty years, Telethon’s research has achieved significant
results in the fight against genetic diseases, as testified by a wealth
of high-impact scientific publications generated by the more than a
thousand research groups supported throughout Italy. The outstanding results deriving from Telethon’s basic studies have fed a rich
pipeline of preclinical and clinical studies on several rare genetic diseases, and led to successful gene therapy clinical trials.
The application of international best practices to the selection of excellent research proposals and continued support to the best scientists through an evolving portfolio of funding initiatives, spanning
from research grants to intramural institutes and career programs,
have been key to this success.
Converting research results into therapies available to patients is our
ultimate goal to fulfill the promise we make to patients and donors
year after year. However, the resources and expertise required to
complete this path are beyond Telethon’s capacity and reside typically with the pharmaceutical industry; in point of fact, the rarity of
most genetic diseases and the technological complexity of advanced
therapeutic approaches such as gene and cell therapy have been major hurdles to industrial development of such therapies so far.
In October 2010, together with the Fondazione San Raffaele,
Telethon signed an agreement with a major pharmaceutical company
for the development of gene therapies performed at the San Raffaele-Telethon Institute for Gene Therapy, right up to the distribution
of these therapies to patients. This major breakthrough, originated
from the successful gene therapy trial on ADA-SCID, represents the
first example of a collaborative approach based on the recognition of
specific competences and ownership for each development stage of
therapies that will inspire us in the advancement of more therapies
currently in our pipeline.
Besides being essential in completing the path from bench to the
bedside of patients affected by rare genetic diseases, partnerships
with pharmaceutical/biotech companies will free-up resources that
we will reinvest in research activities at earlier stages of development. In particular, basic studies, which represent the incubator of
knowledge that may constitute the background of new therapeutic
approaches, remain a key asset of Telethon’s research and will be
potentiated. To ensure maximum growth of our research efforts and
full exploitation of the research potential on genetic diseases in Italy,
Telethon has launched an integrated strategic plan involving all activities in our structure, encompassing new fundraising strategies, continued efforts in the selection, support and management of the best
fundamental research in Italy and in the full exploitation of its results, and growing commitment to advanced preclinical and clinical
activities.
Reinforced relations with the patients, whose pressing need of cures
for and knowledge of their disease are a constant stimulus to us, and
with the general public, whose endorsement and support are fundamental for the fulfillment of our mission, will always be vital to our
strategic plan.
Talk 3
PHYSIOLOGICAL AND PATHOLOGICAL REGULATION OF THE
PRO-AUTOPHAGIC FACTOR AMBRA1
Francesco Cecconi
Dulbecco Telethon Institute, Department of Biology, University of Rome “Tor
Vergata” and Department of Experimental Neuroscience, IRCCS Santa Lucia
Foundation, Rome, Italy
One of the earliest steps of autophagy is the nucleation of autophagosomes, double-membraned vesicles, which carry cytosolic
content to the lysosome and are usually generated at the ER. Autophagosome nucleation involves the ‘autophagy core complex’, a
multimolecular machinery including the Beclin 1-interacting protein
Ambra1, whose deficiency leads to uncontrolled cell proliferation
during early neurulation. This ends up in excessive apoptosis, lack
of closure of the neural tube and, ultimately, in embryonic death.
We have recently found that Ambra1 phosphorylation by the serine−threonine kinase Ulk1 and association of Ambra1 with the
dynein complex are crucial steps in the subtle regulation of autophagosome nucleation. Moreover, Ambra1 binds the mitochondrial pool of Bcl-2 that exerts both anti-apoptotic and anti-autophagic
functions, this involving a competition between Ambra1 and Bcl-2
for binding Beclin 1. Our result implies that Ambra1 might also be a
key regulator of the cross-talk between autophagy and apoptosis.
Since autophagy impairment has been linked to a number of pathological conditions, ranging from neurodegeneration and neuromuscular disorders to cancer and autoimmune diseases, we are investigating the role played by Ambra1 and its regulation in this context.
AUTOPHAGY AND GENETIC DISEASES
Talk 2
Talk 4
TFEB LINKS AUTOPHAGY TO LYSOSOMAL BIOGENESIS
AUTOPHAGY INVOLVEMENT IN MUSCLE MASS MAINTENANCE
Carmine Settembre (1,2,3), Chiara Di Malta (1), Vinicia Assunta Polito (1,2,3), Diego Medina (1), Alessandro Fraldi (1), Moises Garcia
Arencibia (4), Francesco Vetrini (2), Pasqualina Colella (1), Marco
Sardiello (2,3), David C. Rubinsztein (4), Andrea Ballabio (1,2,3,5)
Eva Masiero (2,3), Silvia Carnio (2,3), Francesca Lo Verso (1,2,3),
Marco Sandri (1,2,3)
(1) Department of Biomedical Sciences, University of Padova,
(2) Dulbecco Telethon Institute,
(3) Venetian Institute of Molecular Medicine (VIMM), Padova, Italy
(1) Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM), Naples, Italy
(2) Dept. of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, Houston, USA
(3) Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children Hospital, Houston, USA
(4) Cambridge Institute for Medical Research, Wellcome Trust/MRC Building
Addenbrooke’s Hospital, Cambridge, UK
(5) Medical Genetics, Department of Pediatrics, Federico II University, Naples,
Italy
Autophagy is required for cellular survival and for the clearance of
damaged proteins and altered organelles. Excessive autophagy activation contributes to muscle loss in different catabolic conditions.
However, the function of basal autophagy for homeostasis of skeletal muscle was unknown. To clarify this issue we have generated
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PRESENTAZIONI ORALI
conditional and inducible knockout mice for the critical gene Atg7,
to block autophagy specifically in skeletal muscle. Atg7 null muscles
reveal an unexpected phenotype which is characterized by muscle
atrophy, weakness and features of myofiber degeneration. Morphological, biochemical, and molecular analyses of our autophagy
knockout mice show the presence of protein aggregates, abnormal
mitochondria, accumulation of membrane bodies, sarcoplasmic
reticulum distension, vacuolization, oxidative stress and apoptosis.
Moreover, autophagy inhibition does not protect skeletal muscles
from atrophy during denervation and fasting, but instead promotes
greater muscle loss. In conclusion, autophagy plays a critical role
for myofiber maintenance and its activation is crucial to avoid accumulation of toxic proteins and dysfunctional organelles that, in the
end, would lead to atrophy and weakness. Thus, dissecting the regulation of autophagy system in skeletal muscle and its role in muscle homeostasis is crucial for understanding the role of unbalance
autophagy in congenital and acquired myopathies.
(1) Dipartimento di Endocrinologia, Fisiopatologia e Biologia Applicata e Centro
di Eccellenza per lo studio delle Malattie Neurodegenerative (CEND), Università
degli Studi di Milano, Milano, Italy
(2) Dipartimento di Neuroscienze, Istituto di Ricerche Farmacologiche ‘Mario
Negri’, Milano, Italy
(3) Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie, Università degli Studi di Milano, Milano, Italy
Motorneuron diseases (MNDs) comprise different types of neurodegenerative diseases in which upper and/or lower motorneurons are
affected. While some MNDs forms are linked to gene mutations
causing loss-of-functions of proteins essential for motorneuronal
survival, several others MNDs are caused by an aberrant behavior
of proteins that become toxic to motorneurons. In the latter case,
the neurotoxic event often derives from aberrant conformations
(misfolding) consequent to gene mutations or other mechanisms,
which might trigger and perturb a wide variety of processes affecting motor neuron functions and survival. SpinoBulbar Muscular Atrophy (SBMA or Kennedy’s disease) and some forms of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) are examples of this type of MNDs, since
they have been linked to neurotoxic gain-of-function(s) of specific
proteins. SBMA is linked to a mutant androgen receptor (AR) containing an elongated polyglutamine tract (ARpolyQ). Several familial ALS (fALS) are linked to point mutations in Superoxide Dismutase 1 (SOD1) or in the TDP-43 genes. Notably, the TDP-43 gene
encodes a protein involved also in most sporadic ALS (sALS). The
proteins AR, SOD1 and TDP-43 are totally unrelated and do not
share structural or functional domains but, when mutated, are
thought to misfold and to alter similar pathways in motor neurons.
In transgenic (tg) G93A-SOD1 mice, widely used as fALS animal
model, we observed an accumulation of insoluble SOD1 which was
partially linked to an inhibition of proteasome. We also observed
several autophago-lysosomal structures in affected surviving lumbar spinal cord motorneurons indicating autophagy activation. Interestingly, we found that, at the end stage of disease, the surviving spinal cord motorneurons accumulating mutant SOD1, also
over-expressed very high levels of a small heat shock proteins B8
(HspB8). Using motor neuronal cell models of SBMA and fALS, we
already found that mutant ARpolyQ and SOD1, as well as a truncated form of TDP-43 showed alteration in their solubility and clearance, accumulating into aggregates that impaired the proteasome
functions impacting on the autophagic process. We then found that
HspB8 decreases aggregation and increases solubility and clearance
of mutant ARpolyQ, SOD1 and frTDP-43, without affecting the
turnover of the wild type proteins. Notably, HspB8 acts on these
misfolded proteins even when the proteasome activity is specifically
blocked, and is paralleled by the formation of LC3-II-positive autophagosomes. On the other hand, autophagy blockage resulted in
a dramatic increase of ARpolyQ, mutant SOD1 or frTDP-43 aggregates. The effects of HspB8 seem to be mediated by autophagy,
since autophagic flux blockage resulted in the accumulation of mutant SOD1 into the HspB8/Bag3/Hsc70/CHIP multi-heteromeric
complex. This complex is known to selectively activate the p62-mediated autophagic removal of misfolded proteins in muscle cells.
Thus, we postulate that HspB8 increases mutant misfolded protein
clearance via autophagy in motorneurons.
Interestingly, in fALS muscle cell models, we did not found mutant
SOD1 aggregates or proteasome alteration, but an intense activation of autophagy. Moreover, in muscle tissue of tg G93A-SOD1
mice the over-expression of HspB8 was about ten times more intense than in wt mice, suggesting an important role of autophagy
in the removal of misfolded proteins in muscle cells.
Collectively, these results demonstrate that by assisting misfolded
proteins processing with selected intracellular chaperones, it is possible to affect their clearance and to decrease their aggregation by
stimulating autophagy without impairing the functions of the intracellular degradative systems.
Talk 5
AUTOPHAGY THWARTS COLLAGEN VI MUSCULAR DYSTROPHIES
Paolo Grumati (1), Luisa Coletto (3), Patrizia Sabatelli (4), Matilde
Cescon (1), Alessia Angelin (2), Enrico Bertaggia (3), Bert Blaauw
(3), Anna Urciuolo (1), Luciano Merlini (5), Nadir M. Maraldi (4),
Paolo Bernardi (2), Marco Sandri (3), Paolo Bonaldo (1)
(1) Dept. of Histology, Microbiology & Medical Biotechnology, University of
Padova
(2) Dept. of Biomedical Sciences, University of Padova
(3) Dulbecco Telethon Institute, Venetian Institute of Molecular Medicine,
Padova
(4) IGM-CNR, Rizzoli Hospital, Bologna
(5) Dept. of Experimental and Diagnostic Medicine, University of Ferrara
Collagen VI is an extracellular matrix protein formed by three distinct
subunits and with a broad distribution in different organs such as
skeletal muscles, skin, peripheral nerves and joints. Mutations in any
of the three genes coding for collagen VI cause several muscle diseases in humans, including Ullrich Congenital Muscular Dystrophy
(UCMD), Bethlem Myopathy (BM) and Congenital Myosclerosis [1].
Collagen VI null (Col6a1–/–) mice display an early onset myopathic
phenotype characterized by organelle defects, mitochondrial dysfunction and spontaneous apoptosis, leading to myofiber degeneration [2].
We found that persistence of abnormal organelles and apoptosis are
caused by defective autophagy. Indeed, skeletal muscles of Col6a1–/–
mice display an impairment of autophagic flux, which matches the
lower induction of Beclin1 and Bnip3 and the lack of autophagosomes
after starvation. Reactivation of the autophagic flux by either by genetic, dietary and pharmacological approaches restores myofiber survival and ameliorates the dystrophic phenotype of Col6a1–/– mice [3].
Furthermore, muscle biopsies from patients affected by BM and UCMD
show reduced levels of Beclin1 and Bnip3. These findings indicate that
defective activation of the autophagic machinery plays a key pathogenic role in congenital muscular dystrophies.
References
[1] Merlini L, Martoni E, Grumati P, Sabatelli P, Squarzoni S, Urciuolo A, Ferlini
A, Gualandi F, Bonaldo P. Autosomal recessive myosclerosis myopathy is a collagen VI disorder. Neurology 71, 1245-1253, 2008.
[2] Irwin WA, Bergamin N, Sabatelli P, Merlini L, Megighian A, Reggiani C, Braghetta P, Columbaro M, Volpin D, Bressan GM, Bernardi P, Bonaldo P. Mitochondrial dysfunction and apoptosis in myopathic mice with collagen VI deficiency. Nature Genetics 35, 367-371, 2003.
[3] Grumati P, Coletto L, Sabatelli P, Cescon M, Angelin A, Bertaggia E, Blaauw
B, Urciuolo A, Tiepolo T, Merlini L, Maraldi NM, Bernardi P, Sandri M, Bonaldo
P. Autophagy is defective in collagen VI muscular dystrophies, and its reactivation rescues myofiber degeneration. Nature Medicine 16, 1313-1320, 2010.
RNA, DNA, AND CHROMATIN IN DEVELOPMENT
AND DISEASE
Talk 7
Talk 6
FACIOSCAPULOHUMERAL DYSTROPHY: INCOMPLETE EPIGENETIC SUPPRESSION OF A RETROTRANSPOSED GENE
HSPB8 ENHANCES AUTOPHAGIC DEGRADATION OF MUTANT
MISFOLDED PROTEINS RESPONSIBLE FOR MOTORNEURON
DISEASES
Lauren Snider (1), Linda N Geng (1), Richard JLF Lemmers (2), Rabi Tawil (3), Galina N Filippova (1), Daniel G. Miller (4), Silvère M
van der Maarel (2), Stephen J Tapscott (1)
Valeria Crippa (1), Paola Rusmini (1), Elisa Onesto (1), Daniela Sau
(1), Elisa Giorgetti (1), Stefania Guareschi (1), Mariarita Galbiati
(1), Marianna Marino (2), Caterina Bendotti (2), Silvia De Biasi (3),
Angelo Poletti (1)
(1) Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA, USA
(2) Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands
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PRESENTAZIONI ORALI
lighted that LINEs constitute the bulk of repetitive element transcription and that the resulting RNAs are selectively localized in the nucleus. Notably the largest difference between DMD and control samples
appears to be in nuclear transcriptome of all repetitive elements including LINE-1.
Further, by using a novel Taqman-based highthroughput approach,
we analysed L1 copy number variation in proliferating and differentiating myoblasts derived from DMD patients and healthy donors; surprisingly, new retrotransposition events occurred during control’s differentiation, while DMD patient derived samples show a highly compromised pattern of de novo LINE-1 mobilization.
Current efforts are aimed at establishing a direct link between L1 transcription, myogenic program and its alteration in DMD progression.
(3) University of Rochester, Rochester, NY, USA
(4) University of Washington, Seattle, WA, USA
The autosomal dominant FacioScapuloHumeral muscular Dystrophy
(FSHD) is caused by the deletion of a subset of D4Z4 macrosatellite
repeats in the subtelomeric region of chromosome 4q. Unaffected
individuals have 11-100 D4Z4 repeat units and FSHD individuals
have 1-10 repeat units. Each D4Z4 macrosatellite repeat unit contains a retrotransposed gene encoding the DUX4 double-homeobox
transcription factor. We show that the DUX4 retrogene and protein
are normally expressed in human germ-line cells and their expression is epigenetically repressed in somatic tissues, likely through an
siRNA mediated mechanism. The developmentally regulated epigenetic repression is associated with decreased overall abundance of
DUX4 mRNA transcripts and the use of a non-consensus splice
donor site in the DUX4 open reading frame (ORF). The full-length
DUX4 protein induces apoptosis in many somatic cells, whereas the
utilization of the splice donor site in the ORF results in a non-toxic
truncated protein. Muscle biopsies and cultured muscle cells from
control individuals express extremely low amounts of the spliced
form of DUX4 mRNA that encodes the non-toxic protein, whereas
FSHD individuals express extremely low amounts of the full-length
DUX4 mRNA that encodes the toxic full-length DUX4 protein. The
extremely low amounts of DUX4 mRNA and protein in muscle cells
represents a small number of cells (~ 0.1%) expressing a large
amount of mRNA and protein at any point in time. Nuclear characteristics indicate that the expressed DUX4 protein in FSHD cells is
sufficient to induce cell death. Together, the data substantiate a
new model of FSHD: DUX4 mRNA and protein are normally expressed in germ-line cells and epigenetically silenced in somatic tissues, whereas the contraction of the D4Z4 repeats results in inefficient epigenetic repression and occasional bursts of the DUX4 mRNA in muscle nuclei that produce sufficient amounts of a toxic protein to induce cellular dysfunction and/or death. Therefore, FSHD
represents the first human disease to be associated with the incomplete developmental silencing of a retrogene array normally expressed early in the germ-line.
Talk 9
MUSCULAR DYSTROPHIES – FROM GENETICS TO EPIGENETICS
Valentina Saccone, Silvia Consalvi, Chiara Mozzetta, Daniela Palacios, Marta Simonatto, Fabrizia Marullo, Lucia Latella and Pier Lorenzo Puri
Dulbecco Telethon Institute (DTI), IRCCS Fondazione Santa Lucia and European Brain Research Institute, Rome
We are investigating the mechanism by which regeneration cues are
converted into the epigenetic information that regulates gene expression in skeletal muscles of dystrophic organisms. The ultimate
goals of these studies are: 1) the identification and functional characterization of the molecular link between the genetic mutations that
causes muscular dystrophies and the epigenetic underpinning of disease progression; 2) the identification of pharmacological strategies
that can counter the progression of muscular dystrophies and can be
translated into clinical trials with human patients.
We have discovered that histone deacetylases (HDACs) are a crucial link between specific genetic mutations that cause muscular dystrophies and downstream determinants of disease progression.
This indicates in principle that epigenetic events contribute to the
pathogenesis of muscular dystrophies. A large amount of experimental evidence demonstrate the key role of HDACs in the control
of the transcriptional networks underlying the potential of dystrophic muscles to either activate compensatory regeneration or undergo
fibro-adipogenic degeneration. Studies performed in mouse models
of Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) indicate that dystrophin
deficiency leads to deregulated HDAC activity, which perturbs HDAC
downstream networks and that can be restored directly, by HDAC
blockade, or indirectly, by re-expression of dystrophin. This evidence supports the current view that HDAC inhibitors (HDACi) are
emerging candidate drugs for pharmacological interventions in
muscular dystrophies, and reveals unexpected common beneficial
outcomes of pharmacological treatments or gene therapies.
In particular, we have identified a HDAC-regulated network that
controls the expression of specific miRNAs, which target structural
components (Brg1/Brm-associated factors – BAFs) of the SWI/SNF
chromatin remodeling complex to form sub-complexes containing
mutually exclusive BAF60 variants that direct the myogenic or the
fibro-adipogenic program in a novel population of muscle-derived
pluripotent cells.
This unanticipated regulatory axis is an important “epigenetic disease modifier”, since it provides the restriction point for dystrophic
muscle decision to either undergo compensatory regeneration or
adipose infiltration and fibrosis - two deleterious events in the progression of muscular dystrophies.
These results illustrate a new link between HDAC, chromatin remodelers and the fate decision of muscle-derived pluripotent cells,
and identify key targets for pharmacological interventions in the
treatment of muscular dystrophies.
The relevance of our studies is reflected in our currently undergoing
pre-clinical studies with FDA-approved HDACi that could be immediately translated into clinical trials with patients affected by DMD.
Talk 8
REPETITIVE ELEMENTS CONTRIBUTE TO HUMAN SKELETAL
MUSCLE DIFFERENTIATION AND DUCHENNE MUSCULAR
DYSTROPHY PROGRESSION
Beatrice Bodega (1) Geoffrey Faulkner (2), Yoshihide Hayashizaki
(3), Piero Carninci (3), Valerio Orlando (1)
(1) Dulbecco Telethon Institute IRCCS Santa Lucia, Rome Italy
(2) The Roslin Istitute, Edinburgh, UK
(3) Omics Science Center RIKEN Yokohama Institute, Kanagawa, Japan
It is becoming increasingly evident that noncoding RNAs (ncRNAs)
constitute an important component of chromatin and have a critical
role in organizing the epigenome architecture and epigenetic memory.
Meanwhile, genome-wide studies have revealed that ncRNAs transcription, mostly originating within intergenic regions of the genome,
is far more ubiquitous than previously thought. A large part of the
transcripts originate from repetitive sequences. To this, we recently
reported the first complete transcriptome produced by repetitive elements in the mammalian genome (Faulkner et al, Nat Genet 2009),
which covers about 20% of overall transcripts in a cell. This study revealed that repetitive element expression is regulated in a tissue specific manner and that their expression is positively correlated with expression of neighbouring genes. However, the function of this pervasive transcription is not known. Notably, LINE signal dependent expression appears to be linked to their genomic redistribution, as recent reports showed de novo LINE-1 retrotransposition events in somatic as well as cancer cells (Coufal et al., Nat 2009; Huang et al.,
Beck et al, Iskow et al. Cell 2010). The latter finding is suggestive of a
potential role of mobile elements in shaping the genome and the
epigenome to accomplish developmental programs, with potentially
dramatic implications also for disease progression.
Hence, we set out to investigate the role of noncoding transcriptome
in skeletal muscle cell differentiation, which is unexplored, as it may
represent an opportunity to unravel novel mechanisms responsible for
dystrophic muscle degeneration.
To this we generated deepseq transcriptome CAGE libraries from
Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) patients and from controls’ primary myoblasts. Cytosolic and nuclear RNA fractions were collected
and deep-sequenced at different time points: proliferating myoblasts,
myotubes upon differentiation induction (day 1 of differentiation) and
differentiated myotubes (day 8 of differentiation). This analysis high-
Talk 10
EXPERIMENTAL AND IN SILICO APPROACHES TO ELUCIDATE
THE ROLE OF MICRORNAS IN EYE FUNCTION
Sandro Banfi
Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM), Naples, Italy
MicroRNAs (miRNAs) are 21-25 nucleotide small RNAs that nega-
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PRESENTAZIONI ORALI
tively regulate the expression of their target genes and are required
for many important biological processes. However, their precise
role in vertebrate eye development and function remain unclear.
We decided to gain more insight into the role of miRNAs in eye
function by a) systematically studying their expression profiles in
the murine eye and b) carrying out loss-of-function and gain-offunction approaches in an in vivo model on those showing the most
interesting expression patterns. To achieve the first goal, we generated the first comprehensive catalog of miRNA expression in ocular
tissues, using both microarray and RNA in situ hybridization (ISH)
procedures. This analysis revealed miRNAs with differential expression in ocular tissues and provided a detailed atlas (miRNeye, freely
available at http://mirneye.tigem.it) of their tissue-specific distribution during development of the murine eye [1]. We then selected
for functional in vivo analysis a few miRNAs displaying the most restricted and intriguing expression pattern in the eye. We demonstrated that a single microRNA, miR-204, regulates multiple aspects
of eye development in the medaka fish (Oryzias latipes). Morpholino-mediated ablation of miR-204 expression resulted in an eye
phenotype that was characterized by microphthalmia, abnormal
lens formation, and altered dorso-ventral patterning of the retina
that is associated with optic-fissure coloboma. Using a variety of invivo and in-vitro approaches, we have identified the transcription
factor Meis2 as one of the main targets of miR-204 function. We
show that together with altered regulation of the Pax6 pathway, the
abnormally elevated levels of Meis2 resulting from miR-204 inactivation are largely responsible for the observed phenotype [2].
These data provide the first example of how a specific microRNA
can regulate multiple events in eye formation, and strengthen the
hypothesis that this class on non-coding RNAs may be involved in
the pathogenesis of human diseases. Finally, we also developed in
silico procedures to reliably identify bona fide targets for each human miRNAs and to predict their role in controlling specific functional pathways [3]. These procedures are based on the integration
of miRNA target prediction softwares and analysis of large collection
of publicly available transcriptome data. The effective performance
of the latter procedures will be instrumental toward a more comprehensive elucidation of the transcriptional networks controlled by
specific miRNAs in the regulation of proper eye function.
lation of target genes involved in stemness. To this regard, the transcription factor Nanog, that controls stemness acting as a key determinant of both embryonic SC self-renewal and differentiated somatic
cells reprogramming to pluripotency, turned out to be a novel Hh/Gli
target. Indeed, Gli1 and Gli2 activate Nanog transcription through
binding to Nanog-specific cis-regulatory sequences both in mouse
and human SCs. Accordingly, Nanog is highly expressed in neural
SCs and acts as a critical mediator of Hh-driven self-renewal [4]. Our
data reveal a number of mechanisms for the function of Hh in the
control of stemness, representing a crucial component of an integrated circuitry determining cell fate decision and involved in the maintenance of SCs.
References
[1] Di Marcotullio et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 101:10833-38, 2004.
[2] Canettieri et al., Nature Cell Biol. 12:132-42, 2010.
[3] Ferretti et al, EMBO J. 27, 2616–27, 2008.
[4] Po et al., EMBO J. 29:2646-58, 2010.
KEYNOTE LECTURE
Talk 12
HEMATOPOIETIC STEM CELL GENE THERAPY FROM BENCH
TO BEDSIDE: RECENT ADVANCES, NEW CHALLENGES AND
FUTURE PROMISES
Luigi Naldini
HSR-TIGET, the San Raffaele Telethon Institute of Gene Therapy, and “Vita
Salute San Raffaele” University, Milan, Italy
Hematopoietic stem cell gene therapy has a tremendous potential
to treat human disease. Upon transplantation of gene-modified
stem cells, stable integration of a therapeutic transgene into the
chromatin may ensure steady supply of the genetically modified
progeny throughout the host’s lifetime. The stem cell progeny may
then reverse pathological conditions such as immune deficiencies,
blood and storage disorders. Compared to conventional transplantation of allogenic stem cells, the use of gene-corrected, autologous
cells eliminates immune barriers, the threat of graft vs. host disease, and may augment therapeutic efficacy by increasing therapeutic gene dosage. HSC gene therapy has demonstrated efficacy
in animal disease models and in the treatment of human inherited
immunodeficiencies. Indeed, the clinical trial of Adenosine Deaminase Severe Combined Immunodeficiency gene therapy recently
completed at HSR-TIGET represents, in terms of clinical benefit and
lack of adverse side effects, the most successful application today
of gene therapy. Yet, despite the successful clinical results, the field
has also experienced the emergence of severe adverse events related to the gene transfer protocol. Whereas multiple factors determine the success of a gene therapy trial, the major hurdles to successful gene therapy today are insertional mutagenesis by integrating vectors and ectopic or nonregulated transgene expression.
Whereas the former may trigger leukemogenesis, the latter may
cause toxicity and elimination of the gene-modified cells, thus jeopardizing therapy. Thus, our efforts towards perfecting gene transfer
have aimed at minimizing the impact of vector integration in the
target cell genome and improving the regulation of its expression.
Over the past several years we have contributed to develop a new
gene transfer system based on lentiviruses which has become widely used in biomedical research. Several pre-clinical studies of ours
and others and the results of a clinical trial for adrenoleukodystrophy indicate that lentiviral vectors (LV), as compared to gammaretroviral vectors, not only provide for higher efficiency of gene
transfer, but also for a significantly decreased risk of genotoxicity,
thanks to the advanced vector design and its integration pattern in
the cell genome. Indeed, we have recently started two new clinical
trials of LV-mediated HSC gene therapy of Wiskott-Aldrich Syndrome and Metachromatic Leukodystrophy. However, whereas LV
provide the means to improve the risk/benefit ratio and broaden
the applications of stem cell gene therapy, the concerns for non
regulated transgene expression and the residual risk of insertional
mutagenesis still need to be addressed. Recently, we have provided proof-of-principle of two novel powerful strategies for targeting
gene transfer and overcoming these hurdles: 1) regulating transgene expression by exploiting cellular microRNA; 2) targeting integration at a predetermined site of the genome by forcing homologous recombination with designed Zinc finger nucleases. These approaches may substantially advance the applicability, efficiency and
safety of gene therapy.
References
[1] Karali, M., Peluso, I., Gennarino, V.A., Bilio, M., Verde, R., Lago, G., Dolle,
P. and Banfi, S. (2010) miRNeye: a microRNA expression atlas of the mouse
eye. BMC genomics, 11, 715.
[2] Conte, I., Carrella, S., Avellino, R., Karali, M., Marco-Ferreres, R., Bovolenta, P. and Banfi, S. (2010) miR-204 is required for lens and retinal development via Meis2 targeting. Proc Natl Acad Sci U S A, 107, 15491-15496.
[3] Gennarino, V.A., Sardiello, M., Avellino, R., Meola, N., Maselli, V., Anand,
S., Cutillo, L., Ballabio, A. and Banfi, S. (2008) MicroRNA target prediction by
expression analysis of host genes. Genome Res.
Talk 11
REGULATION OF THE HEDGEHOG SIGNALING PATHWAY IN
NEURAL DEVELOPMENT AND STEM CELLS
Alberto Gulino
Dept. Molecular Medicine, “La Sapienza” University, Rome
Understanding the mechanisms by which sigaling pathways control
stem cell (SC) behavior in neural development and regeneration is
mandatory for elucidating pathogenetic issues and envisaging appropriate therapeutic strategies. Hedgehog (Hh) pathway plays a pivotal
role in neural development and maintenance of SCs. The genetic and
epigenetic programs regulating Hh pathway and involved in the control of stemness is however poorly understood. Similarly, the regulation of the function of the downstream transcriptional effectors of Hh
activity, Gli1 and Gli2, is largely unknown. We identified several levels of regulation of the Hh pathway. Firstly, acetylation controls transcriptional output, where Gli1 and Gli2 are acetylated proteins whose
HDAC-mediated deacetylation promotes transcriptional activation [1].
This mechanism is turned off by HDAC1 degradation through an E3
ubiquitin ligase complex formed by Cullin3 and REN, a previously
identified Gli antagonist. Such an integrated HDAC- and ubiquitinmediated circuitry, where acetylation of Gli proteins functions as an
unexpected key transcriptional checkpoint of Hh signalling, controls
neural progenitors growth and development [2]. Secondly, we identified a microRNA control of both Hh signaling and neural progenitor
development, in which miR-125b, miR-324-5p and miR-326 target
Smoothened and Gli1 [3].
Such a multilayered control of the Gli Hh effectors results in the regu-
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PRESENTAZIONI ORALI
THE EMERGING FIELD OF MITOCHONDRIAL
MEDICINE
thy (BM) are muscle diseases due to mutations in the genes encoding the extracellular matrix protein collagen VI. A dystrophic mouse
model lacking collagen VI [1] revealed the existence of a Ca2+-mediated dysfunction of mitochondria and the sarcoplasmic reticulum
[2]. A key event is inappropriate opening of the mitochondrial permeability transition pore (PTP), an inner membrane high-conductance channel [3]. Consistently, Col6a1-/- mice could be cured with
cyclosporin A and with Debio 025 through inhibition of cyclophilin
D, a matrix protein that sensitizes the PTP to opening [3,4], a remarkable finding that has recently been extended to a severe,
UCMD-like disease in zebrafish [5] which has a PTP with the same
regulatory features as that of mammals [6]. Genetic proof of the
pathogenic role of the PTP was obtained by crossing Col6a1-/- myopathic mice with Ppif-/- mice (Ppif is the mouse gene encoding for
cyclophilin D) [7], as the double null mice displayed a striking recovery from muscle pathology [8]. Studies of myoblasts from
UCMD and BM patients demonstrated a latent mitochondrial dysfunction irrespective of the genetic lesion responsible for the lack
(or the alteration) of collagen VI [9]. These studies provided the rationale for a pilot trial with cyclosporin A in patients affected by
UCMD and BM. All patients displayed mitochondrial dysfunction and
increased frequency of apoptosis, as determined in muscle biopsies.
Both these pathological signs were largely normalized after 1
month of cyclosporin A administration, which also increased muscle
regeneration [10]. The PTP has been shown to be involved in the
pathogenesis of other mouse models of muscular dystrophy as well
[11]. These results indicate that mitochondrial dysfunction plays a
critical role in muscular dystrophies; and they represent an important proof of principle that hereditary muscle diseases can be cured
with proper drugs downstream of the genetic lesion if the pathogenetic mechanisms are understood.
Talk 13
DEVELOPING THERAPIES TO DECREASE MITOCHONDRIAL
DAMAGE IN HUMAN DISEASES
Mike Murphy
MRC-Mitochondrial Biology Unit, Wellcome Trust / MRC Building, Hills Road,
Cambridge CB2 0XY, UK
Mitochondrial oxidative damage contributes to a wide range of diseases but there are no effective therapies to address this problem. To
address this issue, over the past few years myself and collaborators
have developed mitochondria-targeted antioxidants and nitric oxide
donors that selectively block mitochondrial oxidative damage. Among
these molecules are derivatives of the natural antioxidants
ubiquinone and Vitamin E. The antioxidant efficacy of these molecules was increased considerably by targeting them to mitochondria,
which are thought to be a major source of oxidative stress in mammalian cells. This was achieved by covalent attachment of the antioxidant to a lipophilic cation. Due to the large mitochondrial membrane
potential, these cations accumulate several hundred fold within mitochondria, protecting them from oxidative damage far more effectively
than untargeted antioxidants.
To see if this approach could be used to prevent mitochondrial oxidative damage in human diseases, we determined whether these compounds could be directed to mitochondria within mice. Non-toxic doses of mitochondrially targeted antioxidants could be fed to animals
safely and led to the accumulation of intact antioxidant by mitochondria in the heart, skeletal muscle, liver and brain. The targeted version of ubiquinone (MitoQ) was protective against pathologies in animals. This molecule has since then gone through phase II trials as a
potential therapeutic agent that may be associated with mitochondrial oxidative damage. I will report on progress towards this goal and
also on the development of other related molecules which may also
have potential as mitochondrial antioxidants and redox probes in investigating and treating the many diseases that involve mitochondrial
damage and dysfunction.
References
[1] Bonaldo, P., et al. (1998) Hum. Mol. Genet. 7, 2135-2140
[2] Irwin, W. A., et al. (2003) Nat. Genet. 35, 267-271
[3] Bernardi, P., et. (2006) FEBS J. 273, 2077-2099
[4] Tiepolo, T., et al. (2009) Br. J. Pharmacol. 157, 1045-1052.
[5] Telfer, W. R., et al. (2010) Hum. Mol. Genet 19, 2433-2444
[6] Azzolin, L., Basso, E., Argenton, F., and Bernardi, P. (2010 Biochim. Biophys. Acta 1797, 1775-1779
[7] Basso, E., Fante, L., Fowlkes, J., Petronilli, V., Forte, M. A., and Bernardi,
P. (2005) J. Biol. Chem. 280, 18558-18561
[8] Palma, E., et al. (2009) Hum. Mol. Genet. 18, 2024-2031
[9] Angelin, A., et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 991-996
[10] Merlini, L., et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 5225-5229
[11] Millay, D. P., et al. (2008) Nat. Med. 14, 442-447
Talk 14
OPA1-DEPENDENT CRISTAE REMODELING DISASSEMBLES
RESPIRATORY CHAIN SUPERCOMPLEXES, TRIGGERING
APOPTOTIC MITOCHONDRIAL DYSFUNCTION
Talk 16
MODELS OF MITOCHONDRIAL DISORDERS IN YEAST, FLIES
AND MICE: INVESTIGATING THE PATHOPHYSIOLOGY AND
DEVELOPING TREATMENTS IN VIVO
Luca Scorrano
DTI - Venetian Institute of Molecular Medicine, Padua, Italy
Ileana Ferrero (2), Rodolfo Costa (3), Carlo Viscomi (1), Daniele
Ghezzi (1), Mauro Zordan (3), Paola Arzuffi (1), Paola Goffrini (2),
Massimo Zeviani (1)
Remodeling of mitochondrial cristae, controlled by oligomers of Optic
atrophy 1 (OPA1) mutated in dominant optic atrophy, supports the
complete release of cytochrome c from mitochondria during apoptosis. Here we show that proper cristae shape is required for the assembly of respiratory chain supercomplexes (RCS), functional quaternary organizations of the respiratory chain complexes.
Genetic dissociation of outer membrane permeabilization from remodeling of the cristae during cell death supports the pivotal role of
the latter in apoptotic mitochondrial dysfunction. Ablation of Opa1,
but not of the outer membrane pro-fusion proteins mitofusins, recapitulates the disassembly of RCS observed in apoptotic mitochondria.
Genetic or apoptotic perturbation of cristae shape and of RCS assembly impairs the growth ability of cells relying on mitochondrial respiration. Thus, cristae shape is a key factor for assembly and function
of RCS, determining mitochondrial dysfunction during apoptosis.
(1) Unit of Molecular Neurogenetics - Neurological Institute C. Besta, Milano,
Italy
(2) University of Parma, Italy
(3) University of Padova, Italy
The tremendous clinical, biochemical and molecular heterogeneity
of mitochondrial disorders makes virtually each member of the
whole mitochondrial proteome a candidate for disease. As a result,
only 40% of adult-onset disorders are currently diagnosed at the
molecular level, and much lesser so in infantile syndromes. However, new technological and biocomputational tools offer the possibility of rapid and affordable analysis of the exome, i.e. the coding regions of all genes in single individuals or small families. Mitochondrial disease proteins can then be selected by exploiting predictive
softwares, dedicated databases, and ex vivo experiments. Under
the umbrella of Telethon Consortium GGP07019, we have identified
several new disease genes, including Surf1, Mpv17, ETHE1,
FASTKD2, SDHAF1, AIF, and TTC19, each responsible of distinct
defects of the respiratory chain, mtDNA metabolism, or both. Structural analysis based on blue-native gel electrophoresis has allowed
us to identify the molecular consequences of the ablation or defects
of these proteins, and their physical status in normal and disease
conditions. To gain further insight on the functional role of these
disease proteins, we have then created specific recombinant lines in
Talk 15
TOWARD A MITOCHONDRIAL THERAPY OF MUSCULAR DYSTROPHIES
Paolo Bernardi
Dipartimento di Scienze Biomediche Sperimentali, Università di Padova, Padova
Ullrich Congenital Muscular Dystrophy (UCMD) and Bethlem Myopa-
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PRESENTAZIONI ORALI
yeast, flies, and mice. For instance, yeast SDHAF1 KO faithfully
replicates the defect of complex II found in patients, allowing us to
validate the corresponding mutations in vivo. Similar to human
TTC19-less patients, a TTC19 KO fly displays profound complex III
deficiency and an adult-onset neurological phenotype that mimics
the neurodegenerative process observed in humans. However,
complex III activity is normal in larval stages, suggesting a previously ignored development-dependent regulation of complex III assembly in animals. Finally, an Ethe1 KO mouse develops a disease
similar to human Ethylmalonic Encephalopathy, and has allowed us
to dissect out the pathophysiology of, and test an effective treatment for, this mitochondrial disorder of sulfur metabolism. The information obtained in this mouse model has been exploited to conceive and apply a relatively simple pharmacological treatment of
this devastating condition in children, with remarkable amelioration
of the biochemical markers and clinical features.
Talk 18
WISKOTT-ALDRICH SYNDROME PROTEIN ACTS AS A NEGATIVE REGULATOR OF TOLL-LIKE RECEPTOR SIGNALING IN
DENDRITIC CELLS
Federica Benvenuti
Cellular Immunology, ICGEB - Area Science Park, Padriciano, Trieste, Italy
WAS is an X-linked complex immunodeficiency characterized by recurrent infections, lymphomas, and a marked predisposition to develop autoimmune disorders. The disease arises from defects in the
gene that encodes for the WAS protein (WASp), a critical regulator of
actin polymerization expressed only in hematopoietic cells. A broad
range of alterations in the function of several hematopoietic cells contribute to the disease establishment. Our group focus on the role of
WASp in dendritic cells, the major class of antigen presenting cells
required to activate and modulate adaptive T cell responses. We previously highlighted the crucial importance of WASp for the correct
function of DCs during priming of CD8+ naïve T cell responses. Recently, we have unveiled a further level of complexity in the ways
DCs may contribute to the disease pathogenesis. We observed that
WASp deficient plasmacytoid dendritic cells, the major producer of
type I interferons after viral infections, are reduced in numbers and
show higher levels of maturation markers than their normal counterpart. pDCs isolated from WASp null animals contain detectable levels
of IFN-α and IL-6 mRNA at steady state whereas they do not respond
to a further stimulation by TLR agonist. These data suggest a constitutive activation of the TLR9/7 pathway in pDCs that results in cell
exhaustion. In order to evaluate the cell intrinsic role of WASp in regulating cytokine production in response to TLR agonist we silenced
WASp expression by delivery of siRNA. We found that depletion of
WASp in pDC, but not in conventional DCs, cause an increase in cytokine production upon stimulation with TLR9 and TLR7 agonist. We
are currently dissecting the molecular mechanism that link WASp to
aberrant TLRs signalling.
Based on these findings we formulated the hypothesis that constitutive production of proinflammatory cytokines by pDCs induce a state
of chronic inflammation that predispose to autoimmune phenomena.
PRIMARY IMMUNODEFICIENCIES: DIFFERENT
THERAPEUTIC APPROACHES FOR A WIDE SPECTRUM OF DISEASES
Talk 17
HEMATOPOIETIC STEM CELL-BASED GENE THERAPY FOR
PRIMARY IMMUNODEFICIENCIES
Alessandro Aiuti
San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (HSR-TIGET), Milan, Italy and University of Rome “Tor Vergata”, Rome, Italy
Gene therapy with hematopoietic stem cells (HSC) is an attractive
therapeutic strategy for several forms of primary immunodeficiencies.
Current approaches are based on ex vivo gene transfer of the therapeutic gene into autologous HSC by vector-mediated gene transfer. In
the past decade, substantial progress has been achieved in the treatment of severe combined immunodeficiency (SCID) due to IL2RG deficiency (SCID-X1), adenosine deaminase (ADA)-deficient SCID, and
chronic granulomatous disease (CGD). Results of the ADA-SCID gene
therapy trial conducted at HSR-TIGET have demonstrated long-term
restoration of immune competence and clinical benefit when infusion
of bone marrow CD34+ cells transduced with a retroviral vector encoding ADA was combined to a reduced conditioning. The occurrence
of adverse events related to insertional mutagenesis in the SCID-X1
and CGD gene therapy trial led to the development of new strategies
based on self-inactivating lentiviral vectors (LVV). LVV should provide
significant advantages in terms of safety and gene transfer efficacy into HSC. Through extensive non clinical studies, we demonstrated that
a LVV encoding for human WAS under the control of an homologous
1.6 kb promoter efficiently transduced human CD34+ cells, corrected
the human and mouse phenotype and was not associated with toxicity. In 2010 a phase I/II gene therapy protocol was started at HSRTIGET based on LVV-gene transfer into WAS patient’s CD34+ cells,
combined to reduced intensity conditioning. Initial engraftment analyses in the first patient treated is showing the presence of LVV-transduced cells at substantial level in multiple hematopoietic lineages as
well as expression of WASp protein. Long-term assessment will provide key information on the safety, biological activity, and efficacy of
LVV-based HSC gene therapy for WAS.
Upon retroviral mediated gene correction of HSC, each transduced
progenitor is univocally marked by an integration site. Long-term
studies in these patients allow for the first time to track haemopoietic
clonal dynamics and survival of single progenitor clones in humans by
retroviral tagging. We have performed a comprehensive multilineage
longitudinal insertion profile of HSC and their myeloid and lymphoid
progeny after GT for ADA-SCID. We could shape the profile of each
lineage through a combined analysis based on insertional variables allowing to uncover the effects of selective advantages of gene-corrected cells in the periphery and the frequency of identical integrants in
different haematopoietic compartments. Strikingly, we detected “core
integrants”, shared between bone marrow CD34+ cells and both lymphoid and myeloid lineages at multiple time points, stably tagging active long-term multipotent progenitors overtime. Tracking these integrants by specific PCR we confirmed the multilineage contribution to
haematopoiesis of these progenitor clones, showing fluctuating lineage outputs of several years. Despite the occurrence of insertions
near potentially oncogenic genomic sites, our data show that transplantation of ADA-transduced HSC does not result in skewing or expansion of malignant clones in vivo. The application of mathematical
models to insertion datasets from GT-treated patients is allowing to
uncover new information on the fate and activity of haematopoietic
progenitors and their differentiated progeny after transplantation.
Talk 19
IPEX SYNDROME, A MONOGENIC AUTOIMMUNE DISEASE:
BIOLOGICAL PROFILE AND THERAPEUTIC PERSPECTIVES
Rosa Bacchetta (1), for the Italian Study Group of IPEX (2)
(1) HSR-TIGET - Division of Regenerative Medicine, Stem Cells and Gene Therapy, Milan, Italy
(2) Italian Study Group of IPEX (E. Gambineri, Florence; L. Perroni, Genova; A.
Tommasini, Trieste; R. Badolato, Brescia)
Children carrying mutations in the FOXP3 gene are affected by the
syndrome known as Immune dysregulation, Polyendocrinopathy,
Enteropathy, X-linked (IPEX). Early onset severe enteropathy,
Type-1 diabetes (T1D) and eczema with elevated IgE serum levels
are the hallmarks of the disease. Mortality is generally high within
the first year of life, although some patients can partially respond
to conventional immunosuppression showing clinical improvement.
The Italian Study Group of IPEX (www.ipexconsortium.org),
through several years of research, has worked for a better understanding of the genotype/phenotype correlation and the underlying
immunological defects, with the major purpose to dissect the role of
FOXP3 in tolerance induction in humans and to design new therapeutic strategies. FOXP3 is the driving force for the function of naturally occurring regulatory T (nTreg) cells, a T cell subset specialized in controlling immune responses and maintaining self-tolerance. Indeed, in IPEX patients there is a profound functional impairment of nTreg cells, so that the disease is classified as an immunodeficiency but manifests with severe autoimmunity rather
than infections. Although the Treg dysfunction is the major cause of
the autoimmune pathology, other cell subsets can be altered by
FOXP3 mutations and these patients present an increased frequency of peripheral IL-17 producing pathogenic T cells, which may contribute to the disease progression.
Current therapies for the cure of patients with IPEX are limited. The
majority of patients are treated with immunosuppressive drugs,
with only partial control of the clinical manifestations. At present,
haematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is the only defini-
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tive cure, but it is available for a limited number of patients. Our
studies in successfully transplanted IPEX patients and in carrier
mothers showed that a small proportion of functional nTreg in the
periphery is sufficient to control pathology. This prompted us to
move towards the development of a gene therapy approach using
adoptive transfer of Treg-converted mature lymphocytes as innovative treatment of patients with IPEX Syndrome.
The brain vasculature forms an immense network such that most
neural cells are in contact with a microvessel. Here we tested the
hypothesis that endothelia lining these vessels can be harnessed to
create a cellular reservoir of enzyme replacement therapy to diseased brain. As a model system, we used mice with central nervous
system (CNS) deficits due to lysosomal storage disease (LSD mice).
The basic premise of this work is that recombinant enzyme expressed in, and secreted from, the vascular endothelia will be endocytosed by underlying neurons and glia, decreasing neuropathology. We screened a phage library in vivo by panning to identify peptides that bound the vascular endothelia in diseased and wild-type
mice. Epitopes binding diseased brain were distinct from those
panned from normal brain. Moreover, different epitopes were identified in two distinct LSD disease models, implying a unique vascular signature imparted by the disease state. Presentation of these
epitopes on the capsid of adeno-associated virus (AAV) expanded
the biodistribution of intravenously injected AAV from predominantly liver to include the CNS. Peripheral injection of the epitope-modified AAVs expressing the enzymes lacking in LSD mice reconstituted enzyme activity throughout the brain and improved disease phenotypes in two distinct disease models.
Talk 20
CRYOPYRIN ASSOCIATED PERIODIC SYNDROME (CAPS): A
PARADIGM FOR A GROUP OF INHERITED AUTOINFLAMMATORY DISEASES
Marco Gattorno (1), Isabella Ceccherini (2), Paolo Giannoni (3), Anna Rubartelli (4)
(1) UO Pediatria II and (2) Laboratorio di Genetica Molecolare, Istituto G. Gaslini, Genova, Italy
(3) Centro di Biotecnologie Avanzate, Genova, Italy
(4) Istituto per la Ricerca sul Cancro, Genova, Italy
Talk 22
Autoinflammatory diseases are a group of different conditions secondary to mutations of genes coding for proteins that play a pivotal
role in the regulation of the inflammatory response. The so-called
Cryopyrin Associated Periodic Syndrome (CAPS) are usually dominated by a characteristic urticarial rash that may be associated with a
number of other clinical manifestations. Familiar Cold Autoinflammatory Syndrome (FCAS), Muckle-Wells Syndrome (MWS) and Chronic
Infantile Neurological Cutaneous and Articular Syndrome (CINCA)
represent the clinical spectrum associated to different mutations of a
gene named NLPR3 coding for a protein called Cryopyrin.
Almost all the observed mutations of NLRP3 gene are found in the
exon 3, coding for the NACHT domain of cryopyrin, that regulates
protein oligomerization. Only 60-70% of patients with a phenotype
consistent with a CAPS present a mutation of the CIAS1/NLRP3 gene.
Cryopyrin is involved in the assembly of an intracellular multi-protein
complex called inflammasome that play a pivotal role in the induction
and secretion of the biological active 17kD form of interleukin-1β (IL1β). Since IL-1β is the crucial effector molecule in local and systemic
manifestations of the disease, its specific inhibition with the recombinant IL-1 receptor antagonist (Anakinra) or monoclonal antibodies
(Canakinumab) has shown to dramatically control the inflammatory
response of these conditions. However: i) few information is available on the mechanisms responsible for IL-1β hypersecretion in CAPS
patients and on the role of the regulatory mechanisms controlling IL1 activity; ii) some clinical manifestations, such as bone deformities
and neurosensorial hearing loss, are at least partially unrelated to the
inflammatory state, iii) the possible implication of the adaptive immunity in the maintenance and progression of the inflammation is
unknown; iv) up to 40% of the patients with a clinical phenotype of
CAPS do not present mutations of the CIAS-1 gene.
Overall objectives of our project: i) to unravel the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of CAPS, ii) to identify new molecular targets for treatment; iii) to find new genes responsible for the
CAPS-like phenotype.
Description of the project. The various aspects related to the specific
aims will be studied using two integrated approaches: i) knock-in
mice, bearing in the NACHT domain of the murine cryopyrin a specific
mutation, known to associate with human CAPS; ii) PBMC from mutated or non mutated patients or primary condrocytes and keratinocytes overexpressing the wild type or the mutated cryopyrin.
Anticipated outputs. i) Identification of new molecular targets for the
treatment of CAPS patients; ii) definition of the mechanisms leading
to bone deformities; iii) identification of new genes associated with
the CAPS phenotype.
NEW THERAPIES FOR LYSOSOMAL STORAGE DISEASES. THE
MODEL OF POMPE DISEASE
Giancarlo Parenti
Department of Pediatrics, Federico II University and Telethon Institute of Genetics and Medicine, Naples, Italy
Different approaches to treat lysosomal storage diseases (LSDs)
have been approved for clinical use or have been tested in pre-clinical studies. These approaches are aimed either at increasing the
availability of the deficient enzyme or at reducing the load of substrate in lysosomes, and include hematopoietic stem cell transplantation (HSCT), enzyme replacement therapy (ERT), substrate reduction therapy (SRT), pharmacological chaperone therapy (PCT),
and gene therapy (GT). Despite success of some of these approaches in some LSDs, it is now clear that they have limitations and
leave important issues unsolved.
Pompe disease (PD), a metabolic myopathy due to mutations of the
GAA gene encoding the lysosomal hydrolase apha-glucosidase
(GAA), is an example of LSD in which ERT with recombinant human
GAA (rhGAA), currently considered the standard of care for this disease, shows important limitations. Not all PD patients respond
equally well to ERT and some tissues, such as skeletal muscle (one
of the major sites of disease and an important target of therapy)
appear to be refractory to treatment. To improve ERT bioavailability
and skeletal muscle targeting of rhGAA novel enzyme preparations,
either modified in their oligosaccharide moieties or tagged with
mannose-6-phosphate-receptor ligands, are under investigation in
pre-clinical studies. PCT has been proposed as an alternative therapeutic approach for PD. PCT is based on the concept that smallmolecule ligands can provide protection against misfolding of mutated proteins and prevent their recognition by the quality control
systems of the endoplasmic reticulum (ER) and degradation by the
ER-associated degradation machinery (ERAD). In vitro proof-ofprinciple studies demonstrated that PCT with two imino sugars, 1deoxynojirimycin (DNJ) and its alkylated derivative Nbutyldeoxynojirimycin (NB-DNJ), has a potential for the treatment
of PD. Both imino sugars are able to enhance GAA residual activity,
to improve GAA processing into their mature lysosomal forms, and
to facilitate trafficking to the lysosomal compartment in fibroblasts
from PD patient that carry specific mutations of the GAA gene. In
addition, it has been demonstrated that PCT and ERT with rhGAA
have a synergistic effect. This synergy may be of help in reaching
therapeutic enzymatic correction in tissues responding poorly to
therapy and in improving the outcome of patients. The clinical
translation of these proof-of-principle studies is already in progress
in an Italian clinical trial supported by Telethon and starting in early
2011. An SRT-based approach was also proposed for the treatment
of PD. Pre-clinical studies done in the murine model of PD showed
that inhibition of the muscle isoform of glycogen synthase (GYS1) resulted in reduced glycogen stored in the heart and skeletal muscles,
with significant improvement of structural, metabolic and functional
defects. Additional therapeutic strategies are directed toward the
correction of the secondary intracellular abnormalities, such as the
autophagic build-up observed in PD muscle cells. In a recent study
suppression of autophagy had a beneficial effect by reducing glyco-
NEW STRATEGIES FOR THE TREATMENT OF
LYSOSOMAL STORAGE DISEASES
Talk 21
MOLECULAR SIGNATURES OF DISEASE BRAIN ENDOTHELIA
PROVIDE NEW SITES FOR CNS-DIRECTED ENZYME THERAPY
Yong Hong Chen, M Chang, Beverly L Davidson
Department of Internal Medicine, University of Iowa, Iowa City, IA, USA
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gen accumulation and improved substantially the efficacy of ERT.
Pre-clinical studies exploring the feasibility of GT have been performed in the PD mouse model. Although these studies hold great
promise, several issues remain to be addressed, including evasion
of immune response, the choice of the appropriate dosage of viral
particles and possible toxicity of vectors, the choice of most suitable
vector and of the proper route of administration to achieve sustained corrective enzyme levels in target tissues, the age at treatment to obtain complete restoration of the normal muscle architecture and motor function. Nevertheless, translation of gene therapy
into pilot clinical studies is proceeding quickly and a clinical trial of
GT in PD is currently in progress.
Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM) and Medical Genetics,
Dept. of Pediatrics, “Federico II” University, Naples, Italy
Mucopolysaccaridosis VI (MPS VI) is caused by deficient arylsulfatase
B (ARSB) activity resulting in lysosomal storage of glycosaminoglycans (GAGs). MPS VI is characterized by dysostosis multiplex,
organomegaly, corneal clouding, and heart valve thickening.
Enzyme replacement therapy (ERT) is the current treatment for
MPS VI that relies on the ability of ARSB to be taken-up by most
cells via the mannose-6-phosphate receptor pathway. However,
ERT is associated with inconvenient weekly infusions of costly recombinant enzyme and shows limited efficacy for several MPS VI
features, such as the ocular and skeletal abnormalities. Alternative
strategies with similar or better therapeutic outcomes and increased patient compliance to treatment are desirable.
Gene transfer to a factory organ like liver may provide a life-time
source of secreted ARSB. To this end, adeno-associated viral (AAV)
vectors with serotype 8 capsids (AAV2/8) represent a valuable tool
for efficient liver gene transfer. We show that intravascular administration of adeno-associated viral vectors (AAV) 2/8-TBG-felineARSB in MPS VI cats resulted in ARSB expression up to two years,
the last time point of the study. In MPS VI cats showing high serum
ARSB levels, independent of the age of treatment, we observed: i)
clearance of GAG storage; ii) improvement of long bone length; iii)
reduction of heart valve thickness; and iv) improvement in spontaneous mobility. Our results bode well for further development of
AAV2/8-mediated liver gene transfer for MPS VI patients.
Talk 23
CNS-DIRECTED GENE/NEURAL STEM CELL APPROACHES FOR
LEUKODYSTROPHIES
Margherita Neri (1,2), Annalisa Lattanzi (1,3), Chiara Cavazzin
(1,3), Sara Santambrogio (1), Beatriz Alcala’-Franco (1), Alessandra Ricca (1,3), Claudio Maderna (1), Ilaria di Girolamo (3), Sabata
Martino (3), Aldo Orlacchio (3), Luigi Naldini (1,2), Angela Gritti (1)
(1) HSR-TIGET San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy, Milan, Italy
(2) Vita-Salute San Raffaele University, Milan, Italy
(3) University of Perugia, Perugia, Italy
WHOLE GENOME ANALYSIS: EMERGING TECHNOLOGIES AND APPLICATIONS
Deficiency of arylsufatase A (ARSA) and ß-galactocerebrosidase
(GALC) characterize Metachromatic and Globoid Cell Leukodystrophies (MLD and GLD), respectively. Glycosphingolipid storage in
lysosomes throughout the central and peripheral nervous system
(CNS, PNS) leads to demyelination and neurodegeneration, which
are worsened by extensive neuroinflammation. Affected children
have mental retardation and motor dysfunction. Death typically occurs in infancy. Clinical observations suggest that enzyme deficiency might affect myelination before overt storage and inflammation
in GLD, but this issue has been poorly addressed in pre-clinical
studies. Similarly, little is known regarding the effect of GALC deficiency on neural stem cell (NSC) and progenitors in the neurogenic
niches during CNS development. Therapeutic approaches ensuring
rapid and sustained enzymatic levels in the CNS before the onset of
symptoms or in the symptomatic stage might be relevant in order
to prevent or counteract irreversible CNS damage. Gene therapy
(GT) has the potential to provide a permanent source of the deficient enzyme, either by directly delivering the missing enzyme in
the CNS or by transplanting enzyme-producing cells. In this latter
approach, the peculiar biology of neural stem cells (NSC) might be
exploited. Our goal is to develop novel combined gene- and NSCbased approaches to correct the metabolic defect and to restore tissue damage in murine models of leukodystrophies, focusing on
Twitcher mice, a relevant GLD model. In these mice we also performed pathophysiology studies, assessing the role of GALC in regulating the function of NSC niches.
Our results show that a single injection of lentiviral vectors coding
for the GALC or ARSA genes in the white matter of GLD and MLD
mouse models, respectively (direct intracerebral GT) resulted in
rapid, sustained and widespread expression of the functional enzymes in the whole CNS, with reduction of tissue storage and improved pathology. In addition, we gave proof of principle that
neonatal intracerebral NSC transplantation provides rapid and longlasting production of GALC in the CNS of Twitcher mice, with reduction of storage, amelioration of motor function and improvement in
survival. Finally, we showed impairment in the organization and
function of neurogenic niches not only in symptomatic Twitcher
mice (confirming the role of inflammation in this process) but also
in early post-natal (asymptomatic) animals, suggesting a role of
GALC in regulating neurogenesis and gliogenesis during CNS development. Overall these studies gave proof of principle for feasibility
and efficacy of intracerebral GT and NSC-based therapy as potential
approaches for the treatment of leukodystrophies. In addition, they
raise important points as regard the pathophysiology of leukodystrophies, allowing understanding obstacles that need to be overcome for the future development of clinical gene/cell therapy.
Talk 25
DIRECT ESTIMATES OF THE HUMAN MUTATION RATE AND
DISEASE-GENE IDENTIFICATION USING WHOLE-GENOME
SEQUENCE DATA
Jared C. Roach, Gustavo Glusman, Arian F. A. Smit, Chad D. Huff,
Robert Hubley, Paul T. Shannon, Lee Rowen, Krishna P. Pant,
Nathan Goodman, Michael Bamshad, Jay Shendure, Radoje Drmanac, Leroy Hood, David J. Galas, Barry Moore, Mark Yandell,
Lynn B. Jorde
Department of Human Genetics, University of Utah, Salt Lake City, UT, USA
Using whole-genome sequence data from a family of four, we recently estimated the human mutation rate to be 1.1 x 10-8 per base
pair per generation (95% CI = 6.8 x 10-9 – 1.7 x 10-8). Nearly
34,000 potential new mutations were identified initially by highthroughput sequencing, and each of these was resequenced to
eliminate false positive signals. This reduced the number of verified new mutations in each diploid genome to approximately 70. As
expected, the mutation rate is substantially elevated for CpG dinucleotides, and the transition-transversion ratio is 2.3. Our mutation
rate estimate is substantially lower than the commonly used phylogenetic estimate of 2.5 x 10-8 per base pair per generation. The difference in these figures can be reconciled by assuming a humanchimpanzee divergence time of 6-7 million years ago and by assuming a relatively large effective population size of the population
ancestral to humans and chimpanzees (40,000 – 148,000). Recently, several additional studies, including the 1000 Genomes Project,
have directly estimated the human mutation rate in families. These
estimates are remarkably similar to ours. We also demonstrate
that VAAST, a recently developed genome annotation software
package, accurately identifies two autosomal recessive diseasecausing genes in this family.
Talk 26
PROMISES AND CHALLENGES OF HIGH-THROUGHPUT SEQUENCING
Graziano Pesole
Talk 24
Institute of Biomembranes and Bioenergetics, National Research Council, Bari
and Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Bari “Aldo
Moro”, Bari, Italy
AAV-MEDIATED LIVER GENE THERAPY FOR MUCOPOLYSACCHARIDOSIS VI
Next-generation DNA sequencing (NGS) offers biomedical re-
Alberto Auricchio
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search the unprecedented opportunity to obtain quick and cheap
high-throughput analyses for a wide variety of applications including: de novo genome sequencing, genome resequencing and
detection of SNPs and structural variations, transcriptome profiling, smallRNA profiling, genome-wide identification of DNA and
RNA binding sites of proteins, epigenomics and metagenomics.
Correlations between alterations at level of the genome, the
epigenome and of gene expression profiles and clinical presentations of diseases can be revealed at large scale and used to infer
causal phenomena and disease mechanisms. Furthermore, fine
scale mapping of genetic signatures in healthy and disease conditions can be now easily achieved and opens new avenues for developing more effective strategies for diagnosis, prognosis and
therapy as well as providing the foundations for pharmacogenomics and personalized medicine. While commercial sequencing
providers often offer basic bioinformatics services and some relatively user friendly dedicated software tools are now available,
many labs require additional external bioinformatics support to
store, analyze and gain maximum benefit from huge amounts of
data provided by these new technologies. It is becoming clear
that next-generation sequencing requires dedicated next-generation bioinformatics. Indeed, most of the challenges of highthroughput data production derive from the need for efficient and
effective bioinformatics pipelines to reliably analyze the data and
produce biological knowledge. We will discuss the risks of a
widening gap between data production and interpretation as well
as possible strategies to address these issues.
Talk 28
DISSECTION OF GENETIC MECHANISMS OF HYPOPLASTIC
LEFT HEART SYNDROME SUGGESTS A MULTIPLE HITS MODEL
Iascone Maria (1), Ciccone Roberto (2), Lorenzo Galletti (3), Daniela Marchetti (1), Duccio Federici (3), Anna Rita Lincesso (1), Laura
Pezzoli (1), Paolo Ferrazzi (3), Orsetta Zuffardi (2)
(1) Laboratorio di Genetica Medica, Ospedali Riuniti, Largo Barozzi, 1 - Bergamo, Italy
(2) Genetica Medica, Università di Pavia, Pavia, Italy (3) Dipartimento Cardiovascolare, Ospedali Riuniti, Bergamo, Italy
Hypoplastic Left Heart Syndrome (HLHS) is one of the most severe
congenital heart malformations, characterized by underdevelopment of the structures in the left heart-aorta complex, including
anomalies of left ventricular myocardium. Without intervention,
HLHS has a nearly uniform fatal outcome. There are strong evidences supporting the genetic etiology of HLHS and multiple genetic loci were tentatively implicated in HLHS, although no identified
gene or pathway seems to be specific to these cardiac malformations. This study was designed to identify genetic basis of HLHS and
to elucidate the mechanism underlying the disease. To this aim, we
have analyzed 53 well-characterized patients, using an integrate
genomic approach combining DNA sequencing of five candidate
genes (NKX2-5, NOTCH1, HAND1, FOXC2 and FOXL1) and a
genome-wide survey by high-resolution array CGH. We have identified in 30 patients two de novo mutations in NOTCH1, 8 rare inherited gene variants in NOTCH1, FOXC2 and FOXL1 and 33 mostly inherited copy numbers variants. All identified variations seem to be
associated to the disease and some of them coexist in the same patient. Our findings predict that HLHS is characterized by a complex
and heterogeneous pattern of inheritance with rare de novo highly
penetrant mutation or multiple interacting low penetrant alterations
contributing to the etiology of the disorder. Moreover, in silico
analysis of the identified anomalies shows a functional association
between seven genes involved in cardiac valve development indicating that HLHS is at least in part a “valve” disease.
Talk 27
WHOLE GENOME ANALYSIS FOR THE STUDY OF GENETIC BASIS OF HEARING LOSS
Pio d’Adamo, Danilo Licastro, Diego Vozzi, Nicola Pirastu, Manolis
Athansakis, Giorgia Girotto, Paolo Gasparini
Medical Genetics, IRCCS-Burlo Garofolo, University of Trieste, Trieste, Italy
HL is a relatively common disease characterized by a large genetic heterogeneity and clinical variability, which make very difficult to obtain a correct clinical picture and an appropriate molecular diagnosis. Despite the presence of a major gene (GJB2),
data on the vast majority of genes possibly involved in HL are incomplete, and molecular epidemiology data are still lacking. To
reach the goal of completing as much as possible the pictures on
genetic basis of HL we have planned a multitask strategy extensively based on high-throughput genome technologies such as a)
whole genome genotyping (WGG) using high density SNPs microarray and b) next generation sequencing (NGS). In particular
we used WGG to carry out:
a) a GWAS on hearing quantitative traits by meta-analyzing data
from 6 isolated populations of European ancestry for an overall
number of 3417 individuals. Eight suggestive significant loci
(p<10-7) were detected with a series of genes expressed within
the inner ear. Additional biological candidates marked by a SNP
with a suggestive association (p<10−6) were identified. Some of
these new loci map to already known hereditary HL loci whose
genes still need to be identified. Data have also been used to
construct a highly significant “in silico” pathway for hearing function characterized by a network of 49 genes, 34 of which are certainly expressed in the ear.
b) a metanalysis of GWAS data on hearing qualitative traits on
several hundred cases (patients and controls) extracted from isolated population with a specific focus on age-related hearing loss.
Preliminary data on this part led to the identification of some loci
on the following chromosomes 2,13,19,17,16,20 involving in
some cases genes related with hearing development and hearing
function and but also genes whose function is still unknown. A
replica phase has been now planned on a series of case/controls
coming from different European countries soon available.
As regards to NGS we are applying this technology for:
a. whole exome sequencing of 4 cases selected from patients
identified within Carlantino isolated populations.
b. whole exome sequencing of Italian dominant families and
Qatari recessive families.
c. target re-sequencing of a series of cases affected by Usher
syndrome, which is characterized by HL coupled with retinitis
pigmentosa.
Results from all research activities will be presented and discussed.
STEM CELLS FOR DISEASE MODELLING AND
THERAPY
Talk 29
MECHANISMS OF DIFFERENTIATION IN MAMMALIAN
PLURIPOTENT STEM CELLS
Roger Pedersen
Wellcome Trust Centre for Stem Cell Research University of Cambridge, Cambridge, UK
Our current research interests focus on understanding how human embryonic stem cells (hESCs) maintain their undifferentiated state and undergo differentiation in culture, reflecting a longterm fascination with the emergence of diversity during the embryonic process of gastrulation. This knowledge is essential for a
systematic translation of basic stem cell research to therapeutic
applications. In our recent studies my group has examined the
role of the transforming growth factor family members in both
pluripotency and differentiation. This has involved analysis of the
signalling cascade induced by treating hESCs with Activin or
Nodal, determining how response to these growth factors maintains hESC pluripotency. This involved development of chemically
defined culture conditions in which the activities of specific
growth factors could be identified and studied in a controlled
manner as well as a detailed analysis of the roles of Smad proteins (Smad2 and Smad3) and their binding partners. These
studies led to our discovery of a novel type of pluripotent epiblast stem cell (EpiSC) from the epiblast layer of mouse and rat
embryos. EpiSCs share many features with hESCs, and subsequent work supports our hypothesis that hESCs are the human
counterparts of EpiSCs, with similar responses to growth factors
and mechanisms of pluripotency and differentiation. We study
epigenetic status as a property that distinguishes mouse ESCs
and induced pluripotent stem cells (iPSCs) (which lose genomic
imprints during culture) from EpiSCs and hESCs (which maintain
genomic imprints). Thus, we emphasise both genetic and epigenetic studies as instrumental for understanding developmental
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regulation of gene expression. Taken together, these studies
should significantly accelerate the progression from basic stem
cell research to clinical applications.
us to perform molecular studies, both in vitro and in vivo, to get
insight into the molecular mechanisms that underlay Cripto activity in skeletal muscle regeneration. By using gain of function and
loss-of function approaches through viral-mediated gene transfer
in vivo, we demonstrate that Cripto overexpression accelerates
regeneration leading to muscle hypertrophy, whereas conditional
loss of Cripto causes muscle regeneration defects. Moreover, we
provide novel evidence that i) Cripto is expressed by activated
satellite cells, ii) it is mitogenic for satellite cell–derived myogenic precursors, acting as a natural antagonist of the TGFß ligand Myostatin, and iii) is chemotactic through activation of the
TGFß -related Nodal pathway. All together our data provide new
insights in TGFß ligand-specific signalling by Cripto on satellite
cells and contribute in the understanding of the complex network
of signalling pathways operating in skeletal muscle regeneration,
disclosing new scenarios for the therapy of muscle disorders.
Talk 30
A NOVEL STRATEGY FOR AUTOLOGOUS CELL THERAPY FOR
DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY
Sara Benedetti, Francesco Saverio Tedesco, Hidetoshi Hoshya, Laura Perani, Giulio Cossu
Div. of Regenerative Medicine, San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy
Mesoangioblasts are recently characterized progenitor cells, associated with the vasculature and able to differentiate into different
types of solid mesoderm, including skeletal muscle [1].
When intra-arterially delivered to dystrophic muscle of dystrophic
mice and dogs, mesoangioblasts resulted in a significant functional
amelioration [2,3].
Human adult mesoangioblasts were characterized [4] and are currently used for a phase I/II study of donor cell therapy in DMD patients. This requires immune suppression and availability of an
HLA-matched donor. To overcome these limitations we are using a
human artificial chromosome containing the whole dystrophin gene
(HAC-Dys) that we transferred in mouse dystrophic mesoangioblasts. Corrected dystrophic mesoangioblasts were transplanted
in mdx/SCID mice where they readily engrafted, expressed human
dystrophin and ameliorated the phenotype for many months after
the injection. In the case, of human mesoangioblasts, cells were reversibly immortalized by transduction with floxed lentivectors expressing human telomerase reverse transcriptase (hTERT), and
Bm-1, together with the suicide gen HSTK. Immortal cells maintain
telomerase activity and long telomere while remaining untransformed, unable to generate tumors and able to terminally differentiate in vitro. The HAC-Dis has been transferred in these cells and
two clones have been selected which contain a copy of the HAC.
They will be transplanted into mdx/SCID mice before and after Cremediate excision of integrating vectors. Future development foresees a second generation HAC-Dys containing the dystrophin gene,
floxed immortalizing sequences (hTERT-Bmi-1-HSTK), an inducible
MyoD (MyoD-ER) and four full-length human dystrophin cDNAs to
compensate gene dosage insufficiency deriving from fusion of relatively few genetically corrected cells in a fiber containing a large
majority of genetically defective nuclei. If successful, this project
will set the stage for a definitive cell therapy of DMD.
This work is supported by grants from the European Community,
the European Research Council, Duchenne Parent Project, Telethon,
MDA, AFM and the Italian Ministries of Research and Health.
Talk 32
STEM CELL AS A MODEL AND THERAPEUTIC TOOL FOR
SPINAL MUSCULAR ATROPHY
Stefania Corti
Dino Ferrari Centre, Department of Neurological Sciences, University of Milan
Spinal muscular atrophy (SMA) is among the most common genetic
neurological diseases causing infant mortality. Reprogramming
adult human cells to induced pluripotent stem cells (iPSCs) makes
obtaining patient-specific cells possible for disease modeling and
therapeutic tools, but has required vector integration into the
genome, limiting its applications. Here, we discuss novel methods
of generation and potential applications of patient derived iPSCs,
with a specific focus on SMA. We present our results about the creation of human wild type (WT) and SMA-iPSCs using non-integrating episomal vectors. We obtained SMA and WT iPSC subclones free
from exogenous sequences that had morphologic and transcriptional similarities with ES (on microarray analysis) and differentiated
into all three germ layers. We differentiated iPSCs using a protocol
to promote motoneuron commitment and SMA motor neurons reproduced disease-specific features. We then compared the phenotype of SMA and WT motor neurons by using gene expression and
splicing genome-wide analysis and we found several genes differentially spliced between the two cell populations. These results offer
proof-of-concept that generating patient-specific iPSCs and motor
neurons free of exogenous elements may be possible. These patient-derived cells can be useful in design novel therapeutic approaches by a better understanding of the molecular mechanisms
that underlie neuron degeneration in this disease. Indeed, they can
be, ultimately, used as a potential cell source for cell-mediated
therapy for SMA.
References
[1] Minasi et al. Development 129, 2773, 2002.
[2] Sampaolesi et al. Science 301, 487, 2003.
[3] Sampaolesi et al. Nature 444, 574, 2006.
[4] Della Valle et al. Nature Cell Biol. 9, 255, 2007.
Talk 31
A NOVEL ROLE FOR CRIPTO IN SKELETAL MUSCLE REGENERATION AND SATELLITE CELL MOBILIZATION THROUGH MODULATION OF TGFß FAMILY SIGNALING PATHWAYS
Gabriella Minchiotti
Stem Cell Fate Laboratory, Institute of Genetics and Biophysics “A. BuzzatiTraverso”, CNR, Naples
Skeletal muscle regeneration mainly depends upon satellite cells,
a population of resident muscle stem cells. Despite extensive
studies, the molecular mechanisms underlying satellite cell mobilization and skeletal muscle regeneration still remain undefined.
We have identified the EGF-CFC protein Cripto as a new, unpredicted player of skeletal muscle regeneration. Cripto is a multifunctional protein acting as a modulator of the TGFß family signalling pathway. Despite the well-described role of Cripto in early
embryogenesis and in the multiple signalling networks that orchestrate Embryonic Stem Cell (ESC) differentiation, its role in
adult life remains elusive. Our data show that Cripto is re-expressed in the early phases of skeletal muscle regeneration, in
regenerating myofibers. This quite unexpected result, prompted
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ISTITUTI TELETHON
ABSTRACT
ABSTRACT
TELETHON INSTITUTE OF GENETICS
AND MEDICINE
N.
1
N.
2
N.
3
N.
4
N.
5
N.
6
N.
7
N.
8
N.
9
N.
10
N.
11
N.
12
N.
13
LA SINDROME OROFACIODIGITALE DI TIPO I
COME MODELLO PER LO STUDIO DELLA
FUNZIONE CILIARE
FRANCO BRUNELLA
N.
14
N.
15
N.
16
N.
17
RETI GENETICHE NELLE PATOLOGIE UMANE
DI BERNARDO DIEGO
RUOLO DEI FATTORI DI TRASCRIZIONE T-BOX
NELLE MALATTIE CONGENITE DEL CUORE E IN
ALTRI DIFETTI DELLO SVILUPPO
BALDINI ANTONIO
MECCANISMI DI SVILUPPO DEL TRONCO
ENCEFALICO E PATOLOGIE:
RUOLO DEI GENI HOXB1 E HOXB2 NELLE VIE
UDITIVE CENTRALI
STUDER MICHELE
TERAPIA GENICA IN MODELLI MURINI DELLA
MUCOPOLISACCARIDOSI II CON VETTORI
ADENOASSOCIATI
COSMA MARIA PIA
TERAPIA GENICA DIRETTA AL MUSCOLO MEDIATA
DA VETTORI AAV RISULTA IN UNA RIDUZIONE A
LUNGO TERMINE DELL’IPERBILIRUBINEMIA IN UN
MODELLO ANIMALE DELLA SINDROME DI
CRIGLER-NAJJAR DI TIPO 1
BRUNETTI PIERRI NICOLA
TERAPIA GENICA DELLA CARDIOMIOPATIA E
DELLA DISTROFIA MUSCOLARE NEL MODELLO
ANIMALE ‘BIO 14.6 HAMSTER’
NIGRO VINCENZO
UNA NUOVA CLASSE DI LIGASI E3 DELLE
UBIQUITINE: LA FAMIGLIA TRIM
MERONI GERMANA
HSR – TELETHON INSTITUTE FOR
GENE THERAPY
REGOLAZIONE GENETICA DELLO SVILUPPO
DELLA CORTECCIA CEREBRALE: RUOLO DEL
RECETTORE NUCLEARE COUP-TFI DURANTE LA
MIGRAZIONE RADIALE E LA MORFOLOGIA
FINALE DEI NEURONI DEL CORPO CALLOSO
STUDER MICHELE
RUOLO DEGLI RNA NON CODIFICANTI NELLO
SVILUPPO E NEL FUNZIONAMENTO DELL’OCCHIO
DEI MAMMIFERI
BANFI SANDRO
APPROCCI DI TERAPIA GENICA PER IL
TRATTAMENTO DI PATOLOGIE EREDITARIE
SEVERE A CARICO DEI FOTORECETTORI
AURICCHIO ALBERTO
IDENTIFICAZIONE DI NUOVI APPROCCI
TERAPEUTICI PER LE MALATTIE LISOSOMIALI
PARENTI GIANCARLO
ORGANIZZAZIONE DELLE VIE DI TRASPORTO
INTRACELLULARE DI PROTEINE: RUOLO IN
MALATTIE GENETICHE
LUINI ALBERTO
IDENTIFICAZIONE DI NETWORK GENETICI
ATTRAVERSO L’IPERESPRESSIONE IN CELLULE ES
BALLABIO ANDREA
SOLFATASI E MALATTIE: APPROFONDIMENTI
SULLE “MULTIPLE SULFATASE DEFICIENCY “
BALLABIO ANDREA
CARATTERIZZAZIONE DEL SISTEMA DI
MODIFICAZIONE DELLE SOLFATASI NEI
MAMMIFERI
COSMA MARIA PIA
TRASFERIMENTO GENETICO MEDIATO DA VIRUS
ADENO-ASSOCIATI IN MODELLI ANIMALI DI
MUCOPOLISACCARIDOSI VI
AURICCHIO ALBERTO
22
N.
18
N.
19
N.
20
N.
21
N.
22
N.
23
N.
24
PATOGENESI DELLE MANIFESTAZIONI
IMMUNITARIE E NON IMMUNITARIE NELL’ADA-SCID
AIUTI ALESSANDRO
EFFICACIA E SICUREZZA A LUNGO TERMINE
DELLA TERAPIA GENICA PER L’ADA-SCID
AIUTI ALESSANDRO
SINDROME DI WISKOTT-ALDRICH:
CARATTERIZZAZIONE DEI DIFETTI
IMMUNOLOGICI E STUDI PRECLINICI DI
TERAPIA GENICA
VILLA ANNA
SVILUPPO DI UN PROTOCOLLO DI TERAPIA
GENICA BASATA SULL’UTILIZZO DI CELLULE
CD34+ TRASDOTTE CON VETTORI LENTIVIRALI
PER IL TRATTAMENTO DELLA SINDROME DI
WISKOTT-ALDRICH
RONCAROLO MARIA GRAZIA
STUDIO DI ASPETTI BIOLOGICI E GENETICI
NELLA SINDROME DI OMENN
VILLA ANNA
TRASFERIMENTO CELLULARE E GENETICO NELLA
IPEX: IL TRASFERIMENTO GENICO DI FOXP3
MEDIATO DA VETTORI LENTIVIRALI IN CELLULE
T ISOLATE DA PAZIENTI AFFETTI DA SINDROME
DI IPEX GENERA CELLULE T REGOLATORIE CON
ELEVATA ATTIVITÀ SOPPRESSIVA
BACCHETTA ROSA
DALLA MUTAZIONE DI FOXP3 ALLA SINDROME
DA IMMUNODISFUNZIONE
POLIENDOCRINOPATIA ENTEROPATIA LEGATA
ALL’X (IPEX): AGGIORNAMENTO DAL GRUPPO
ITALIANO DI STUDIO PER LA MALATTIA
BACCHETTA ROSA
020-032 Indice per Categoria-11-ITA.qxd:telethon 001-020 IndiceCateg_II
N.
25
N.
26
N.
27
N.
28
N.
29
N.
N.
30
31
VALUTAZIONE PRECLINICA DI UN APPROCCIO DI
TERAPIA GENICA PER LA BETA TALASSEMIA
FERRARI GIULIANA
COMPRENDERE E MIGLIORARE LA SICUREZZA
DEL TRASFERIMENTO GENICO UTILIZZANDO
MODELLI MURINI PREDISPOSTI ALLO SVILUPPO
DI TUMORI E SVILUPPANDO STRUMENTI PER
L’INTEGRAZIONE SITO-SPECIFICA
NALDINI LUIGI
MIGLIORAMENTO DELL’EFFICACIA DEL
TRASFERIMENTO GENETICO NELLE CELLULE
STAMINALI EMATOPOIETICHE
NALDINI LUIGI
PARZIALE GUARIGIONE DALL’EMOFILIA B IN
CANI AFFETTI DALLA PATOLOGIA IN SEGUITO A
SOMMINISTRAZIONE DI UN VETTORE
LENTIVIRALE REGOLATO DA microRNA
NALDINI LUIGI
RISPOSTA IMMUNITARIA AL TRANSGENE A
SEGUITO DI TRASFERIMENTO CON VETTORI
LENTIVIRALI: MECCANISMI E MODULAZIONE
TRAMITE TERAPIE CELLULARI
RONCAROLO MARIA GRAZIA
RUOLO DELLE CELLULE T REGOLATORIE DI TIPO
I NELLA TOLLERANZA IMMUNITARIA
33
38
N.
39
N.
40
N.
41
N.
42
N.
43
N.
44
APPROCCI COMBINATI BASATI SUL
TRASFERIMENTO GENETICO E DI CELLULE
GRITTI ANGELA
TERAPIA EX VIVO DELLE LEUCODISTROFIE
METACROMATICA E GLOBOIDE TRAMITE
CELLULE STAMINALI EMATOPOIETICHE
N.
N.
GREGORI SILVIA
LEUCODISTROFIE METACROMATICA E GLOBOIDE
32
37
BIFFI ALESSANDRA
LEUCODISTROFIA METACROMATICA: DALLA
STORIA NATURALE DI MALATTIA VERSO
N.
45
TERAPIA GENICA DI FASE I/II
34
PRODUZIONE VETTORI LENTIVIRALI GMP PER
N.
LA TERAPIA GENICA (SINDROME DI WISKOTT-
N.
DULBECCO TELETHON INSTITUTE
46
47
BIOMARCATORI MULTIPROTEICI DELLA
SCLEROSI LATERALE AMIOTROFICA
BONETTO VALENTINA
REGOLAZIONI MOLECOLARI AD AMPIO SPETTRO
DURANTE LO SVILUPPO E IL RIPARO DELLA VIA
ASSONALE OLFATTIVA: VERSO LA
COMPRENSIONE DELLE BASI BIOLOGICHE DELLA
SINDROME DI KALLMANN
MERLO GIORGIO
SPECIFICI MECCANISMI DI TOSSICITÀ
CELLULARE E MOLECOLARE DELLE ATROFINE
CON POLIGLUTAMMINE
FANTO MANOLIS
MECCANISMI CELLULARI DI DISFUNZIONE
SINAPTICA NELLE MALATTIE DA PRIONI
CHIESA ROBERTO
IDENTIFICAZIONE DI GENI CORRELATI ALLA
SCHIZOFRENIA IN UN MODELLO MURINO DELLA
ILLINGWORTH ELIZABETH
L’INTERAZIONE TRA OLIGOPHRENIN-1 E REVERBA REGOLANO IL CICLO CIRCADIANO IN
PASSAFARO MARIA PIA
ANALISI FUNZIONALI, COMPORTAMENTALI E
GENETICHE PER CAPIRE IL RUOLO
MENTALE LEGATO AL CROMOSOMA X
DEFINIZIONE DEI MECCANISMI MOLECOLARI
DELLA PERDITA DI MASSA MUSCOLARE.
N.
PER BLOCCARE LA DEGENERAZIONE MUSCOLARE
48
D’ADAMO PATRIZIA
RUOLO DEI FATTORI EPIGENETICI
NELL’IDENTITÀ DELLE CELLULE STAMINALI E
NEI PROCESSI DI RIGENERAZIONE TISSUTALE
SANDRI MARCO
CORONA DAVIDE
CARATTERIZZAZIONE DEI MECCANISMI DI
ALTRE MALATTIE GENETICHE
CONTROLLO DEL CICLO CELLULARE E DELLA
TRASCRIZIONE MUSCOLO SPECIFICA NEL
DIFFERENZIAMENTO MIOGENICO:
N.
IMPLICAZIONI TERAPEUTICHE PER LA
RIGENERAZIONE MUSCOLARE
STUDIO FUNZIONALE DEL GENE CODIFICANTE
LA MYOTUBULARIN-RELATED-PROTEIN 2,
MTMR2, RESPONSABILE DELLA MALATTIA DI
CHARCOT-MARIE-TOOTH DI TIPO 4B
BOLINO ALESSANDRA
PROTEINE AD ESSE ASSOCIATE NEL RITARDO
IDENTIFICAZIONE DI NUOVI TARGET TERAPEUTICI
36
RUOLO DEI microRNA NELLA MIOPATIA
NEMALINICA
BANG MARIE-LOUISE
PATOGENETICO DELLE PROTEINE RAB E DELLE
MALATTIE NEUROMUSCOLARI
N.
RNA INTERFERENCE PER LA TERAPIA DELLA
DISTROFIA MUSCOLARE FACIO-SCAPOLOOMERALE (FSHD)
GABELLINI DAVIDE
CORTECCIA
NALDINI LUIGI
35
RUOLO DEL GENOMA NON CODIFICANTE NELLA
FUNZIONE DELL’EPIGENOMA NEL
DIFFERENZIAMENTO MUSCOLARE SCHELETRICO
E NELLA DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE
ORLANDO VALERIO
SINDROME DEL22Q11
RONCAROLO MARIA GRAZIA
ALDRICH E LEUCODISTROFIA METACROMATICA)
N.
Pagina 23
FAMILIARI
L’APPLICAZIONE CLINICA DI UN TRIAL DI
N.
15:53
MALATTIE NEUROLOGICHE
STAMINALI NEURONALI (NSC) PER LE
N.
N.
21-02-2011
49
RECETTORI ACCOPPIATI A PROTEINE G:
ANALISI STRUTTURA/FUNZIONE DI MUTAZIONI
PATOGENETICHE
PURI PIER LORENZO
23
FANELLI FRANCESCA
020-032 Indice per Categoria-11-ITA.qxd:telethon 001-020 IndiceCateg_II
N.
N.
N.
N.
50
51
52
53
ABSTRACT
GENERAZIONE DI CELLULE STAMINALI
PLURIPOTENTI INDOTTE (IPS) ISOLATE DA
PAZIENTI AFFETTI DA MUCOPOLISACCARIDOSI
DI TIPO IH (O SINDROME DI HURLER)
SERAFINI MARTA
BASI MOLECOLARI DELLA POLIENDOCRINOPATIA
AUTOIMMUNE DI TIPO I: STUDI FUNZIONALI E
STRUTTURALI SUL DOMINIO PHD FINGER DELLA
PROTEINA AIRE
MUSCO GIOVANNA
ESTENDERE LA VIA DI RIMODELLAMENTO DELLE
CRISTAE CONTROLLATA DA OPA1: UN APPROCCIO
INTEGRATO PER COMPRENDERE LA PATOGENESI
ED IDENTIFICARE STRATEGIE TERAPEUTICHE PER
L’ATROFIA OTTICA DOMINANTE
SCORRANO LUCA
57
N.
58
N.
59
N.
60
N.
61
N.
62
N.
N.
63
64
54
N.
55
15:53
Pagina 24
ASSOCIATE A MUTAZIONI DI UROMODULINA
RAMPOLDI LUCA
MALATTIA POLICISTICA RENALE AUTOSOMICA
DOMINANTE (ADPKD): STUDI IN VITRO E IN
VIVO PER COMPRENDERE I MECCANISMI
MOLECOLARI DELLA PATOLOGIA
BOLETTA ALESSANDRA
RUOLO DELLA TRASDUZIONE DEL SEGNALE
DELLA PI3-CHINASI ED AKT NELLA
REGOLAZIONE CELLULE STAMINALI DEGLI
EPITELI STRAFITICATI
CALAUTTI VINCENZO
MALATTIE COMUNI/COMPLESSE
N.
MODELLI CELLULARI ED ANIMALI PER
L’IDENTIFICAZIONE DEI MECCANISMI DI
PATOGENESI IN MALATTIE CISTICHE RENALI
56
L’APTOGLOBINA SVOLGE UN RUOLO CHIAVE
NELL’INSORGENZA DELLE COMPLICANZE
ASSOCIATE ALL’OBESITÀ
MAFFEI MARGHERITA
PROGETTI DI RICERCA TELETHON
ABSTRACT
MALATTIE NEUROMUSCOLARI
N.
N.
21-02-2011
N.
65
N.
66
N.
67
N.
68
N.
69
N.
70
N.
71
N.
72
RUOLO DELL’ASSE SFINGOSINA CHINASI/SFINGOSINA 1-FOSFATO NELLA RISPOSTA EVOCATA
DA IGF-1 IN MIOBLASTI MURINI
BRUNI PAOLA
UN NUOVO BERSAGLIO MOLECOLARE PER LA
TERAPIA DEL DANNO MUSCOLARE E DELLE
MIOPATIE
MINCHIOTTI GABRIELLA
RUOLO DELLA CICLINA D3 NELLA REGOLAZIONE
DELL’ATTIVITÀ DELLE CELLULE SATELLITI
DURANTE LA RIGENERAZIONE MUSCOLARE
CARUSO MAURIZIA
REALIZZAZIONE IN VITRO DI UN MODELLO
UMANO DI DISTROFIA MUSCOLARE PER LO
SCREENING E LO SVILUPPO DI NUOVE
STRATEGIE TERAPEUTICHE
ELVASSORE NICOLA
RUOLO DI INTERLUCHINA-6 NELLA DISTROFIA
MUSCOLARE DI DUCHENNE
DE BENEDETTI FABRIZIO
BASI MOLECOLARI DELL’AZIONE TERAPEUTICA
DEL NITROFLURBIPROFENE (HCT1026), UN ANTIINFIAMMATORIO CHE RILASCIA NITROSSIDO,
NELLA DISTROFIA MUSCOLARE: ANALISI DELLA
SRUTTURA E FUNZIONALITÀ DEI MITOCONDRI
NELLA RIGENERAZIONE E SVILUPPO MUSCOLARE
CLEMENTI EMILIO
USO DELL’RNA PER LA TERAPIA DELLA
DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE:
PRODUZIONE E VALIDAZIONE DI COSTRUTTI
ANTISENSO CAPACI DI INDURRE EXON
SKIPPING IN DIVERSI TIPI DI MUTAZIONI DMD
BOZZONI IRENE
VALUTAZIONE PRE-CLINICA DI
NANOPARTICELLE BIOCOMPATIBILI COME
SISTEMA DI TRASPORTO DI
OLIGORIBONUCLEOTIDI ANTISENSO PER
INDURRE IL RIPRISTINO DI DISTROFINA
TRAMITE “EXON SKIPPING”
FERLINI ALESSANDRA
24
TERAPIA GENICA SPERIMENTALE DELLA
DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE CON
FATTORI TRASCRIZIONALI SINTETICI CHE
AUMENTANO I LIVELLI DI UTROFINA, UNA
PROTEINA CHE PROTEGGE DAI DANNI CAUSATI
DALLA MANCANZA DI DISTROFINA
MATTEI ELISABETTA
IMMORTALIZZAZIONE REVERSIBILE DI
MESOANGIOBLASTI UMANI DISTROFICI CON UN
CROMOSOMA UMANO ARTIFICIALE ESPRIMENTE
LA DISTROFINA PER LA TERAPIA CELLULARE
DELLA DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE
COSSU GIULIO
ALLOTRAPIANTO DI MESOANGIOBLASTI PER LA
DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE: TRIAL
CLINICO DI FASE I/II
COSSU GIULIO
MODIFICAZIONE GENICA DI CELLULE
STAMINALI DISTROFICHE ALLO SCOPO DI
TRAPIANTO AUTOLOGO NELLA DISTROFIA
MUSCULARE DI DUCHENNE
TORRENTE YVAN
PROGENITORI MIOGENICI DERIVATI DAL
TESSUTO ADIPOSO PER IL TRATTAMENTO DELLA
DISTROFIA MUSCOLARE
DI ROCCO GIULIANA
NUOVI MECCANISMI PER IL CONTROLLO DEL
SEGNALE TGF-BETA/MIOSTATINA IN DISTROFIA
MUSCOLARE: MICRORNA, NUOVI EFFETTORI E
CROSSTALK CON ALTRE VIE DI TRASDUZIONE
PICCOLO STEFANO
MISURE DI OUTCOME NELLA DISTROFIA
MUSCOLARE DI DUCHENNE
MERCURI EUGENIO
MISURE DI OUTCOME NELLA DISTROFIA
MUSCOLARE DI DUCHENNE: VALIDAZIONE DEL
PEDIATRIC QUALITY OF LIFE INVENTORY TM
NEUROMUSCULAR MODULE NELLA
POPOLAZIONE ITALIANA E CORRELAZIONI CON
ALTRE VALUTAZIONI FUNZIONALI
MESSINA SONIA
020-032 Indice per Categoria-11-ITA.qxd:telethon 001-020 IndiceCateg_II
N.
73
N.
74
N.
75
N.
76
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77
N.
78
N.
79
N.
80
N.
81
N.
82
N.
83
N.
84
N.
N.
N.
85
86
87
LA FAMIGLIA DEI PAZIENTI AFFETTI DA
DISTROFIE MUSCOLARI: CARICO, RETE SOCIALE
E SUPPORTO PROFESSIONALE
MAGLIANO LORENZA
ANALISI DEI MECCANISMI EPIGENETICI
RESPONSABILI DELL’INSORGENZA DELLA
DISTROFIA FACIOSCAPOLOMERALE (FSHD)
GINELLI ENRICO
CRITERI CLINICI E DI LABORATORIO PER LA
DIAGNOSI DELLA FSHD E LA COSTITUZIONE DI
UN REGISTRO NAZIONALE PER LA MALATTIA
TUPLER ROSSELLA GINEVRA
RETE CLINICA E DI LABORATORIO DELLE
DISTROFIE DEI CINGOLI PER STABILIRE UN
REGISTRO NAZIONALE
COMI GIACOMO PIETRO
LO STUDIO RAMYD (VALUTAZIONE DEL RISCHIO
ARITMICO NELLA DISTROFIA MIOTONICA TIPO
I): LA FASE 2
BELLOCCI FULVIO
VERSO UNA TERAPIA MITOCONDRIALE DELLE
DISTROFIE MUSCOLARI DEL COLLAGENE VI
BERNARDI PAOLO
N.
88
N.
89
N.
90
N.
91
N.
92
N.
93
N.
94
N.
95
N.
96
N.
97
N.
98
N.
99
TERAPIA MITOCONDRIALE CON CICLOSPORINA
A IN PAZIENTI AFFETTI DA DISTROFIA
MUSCOLARE CONGENITA DI ULLRICH
MERLINI LUCIANO
RUOLO DELL’AUTOFAGIA NELLE MALATTIE
MUSCOLARI
CECCONI FRANCESCO
CARATTERIZZAZIONE CLINICA, MORFOLOGICA E
MOLECOLARE DI PAZIENTI ITALIANI CON
MIOPATIA CONGENITA
BRUNO CLAUDIO
NUOVI METODI DI VALUTAZIONE FUNZIONALE
DI PAZIENTI CON MIOPATIE METABOLICHE.
EFFETTI DI UN PROGRAMMA DI ALLENAMENTO
GRASSI BRUNO
TERAPIA CON CHAPERONES FARMACOLOGICI IN
ASSOCIAZIONE CON LA TERAPIA ENZIMATICA
SOSTITUTIVA IN PAZIENTI AFFETTI DA
MALATTIA DI POMPE
ANDRIA GENEROSO
INFLUSSO DI CALCIO ACCOPPIATO
ALL’ECCITAZIONE DEL MUSCOLO SCHELETRICO
INDUCE TRASLOCAZIONE NUCLEARE DI NFTAC1
ED AUMENTA IL RILASCIO DI IL6 DA MIOTUBI
ISOLATI DA PAZIENTI AFFETTI DA CENTRAL
CORE DISEASE
ZORZATO FRANCESCO
LE CALSEQUESTRINE NELL’OMEOSTASI DEL
CALCIO E LORO POTENZIALE RUOLO IN
MIOPATIE SCHELETRICHE UMANE EREDITARIE
PROTASI FELICIANO
CANALOPATIE DA CLORO EREDITARIE DEL
MUSCOLO SCHELETRICO E DEL RENE: DAL
GENOTIPO AL FENOTIPO E NUOVI APPROCCI
FARMACOTERAPEUTICI
CONTE CAMERINO DIANA
LAMININE E LORO RECETTORI NELLE
NEUROPATIE EREDITARIE
FELTRI MARIA LAURA
25
21-02-2011
15:53
Pagina 25
TRAFFICO INTRACELLULARE E CONTROLLO DI
QUALITÀ DELLA GLICOPROTEINA P0 NELLA
NEUROPATIA CMTB1
WRABETZ LAWRENCE
RISTABILIRE LE INTERAZIONI TRA CELLULE E
MATRICE EXTRACELLULARE PER CONTRASTARE
LA DEGENERAZIONE TISSUTALE E FAVORIRE I
PROCESSI DI RIPARAZIONE NELLE NEUROPATIE
EREDITARIE
PREVITALI STEFANO
BASI MOLECOLARI DELLA NEUROPATIA
CHARCOT-MARIE-TOOTH DI TIPO 2B
BUCCI CECILIA
MODULAZIONE DELLA NEUREGULINA-1 PER IL
TRATTAMENTO DI NEUROPATIE
DEMIELINIZZANTI
TAVEGGIA CARLA
NUOVE MISURE DI OUTCOME NELLA MALATTIA
DI CHARCOT-MARIE-TOOTH
VITA GIUSEPPE
SVILUPPO DI UN PROTOCOLLO STRUMENTALE DI
ANALISI DEL MOVIMENTO PER L’ANALISI
MULTITASKING DELLE FUNZIONI LOCOMOTORIE
NELLA MALATTIA DI CHARCOT-MARIE-TOOTH
NELL’ETA’ EVOLUTIVA E NELL’ADULTO:
CARATTERIZZAZIONE DELLA RELIABILITY E
RESPONSIVENESS TRAMITE STUDIO
MULTICENTRICO
FERRARIN MAURIZIO
STUDIO MULTICENTRICO PER VALUTARE
EFFICACIA E SICUREZZA DI UN PROTOCOLLO
RIABILITATIVO COSTITUITO DA ESERCIZI AL
TREADMILL, STRETCHING E DI
PROPRIOCEZIONE IN PAZIENTI AFFETTI DA
NEUROPATIA DI CHARCOT-MARIE-TOOTH
TIPO 1A
SCHENONE ANGELO
RUOLO DI ALTERAZIONI DELLA PROTEOLISI
NELLA DEGENERAZIONE DEI MOTONEURONI IN
MODELLI IN VIVO E IN VITRO DI SCLEROSI
LATERALE AMIOTROFICA FAMILIARE.
COINVOLGIMENTO DI PROTEASOMA,
IMMUNOPROTEASOMA, E DEL SISTEMA
AUTOFAGOSOMA/LISOSOMA
DE BIASI SILVIA
STUDIO IN VIVO E IN VITRO SULLA
INTERAZIONE TRA MECCANISMI INFIAMMATORI
ED ECCITOSSICI E SUL RUOLO DELLA PROTEINA
P38MAP CHINASI NELLA PATOGENESI DELLA
SCLEROSI LATERALE AMIOTROFICA
TORTAROLO MASSIMO
STUDIO DI NUOVE STRATEGIE PER RIPARARE IL
DANNO MITOCONDRIALE MOTONEURONALE
NELLA SLA FAMILIARE
CARRI’ MARIA TERESA
GENERAZIONE DI MODELLI SPERIMENTALI IN
VITRO E IN VIVO PER LO STUDIO DEL RUOLO
DELLA PROTEINA A-SMN NEL PROCESSO DI
ASSONOGENESI
BATTAGLIA GIORGIO STEFANO
REGOLAZIONE DELLO SPLICING ALTERNATIVO
DEL GENE SMN2 DA PARTE DELLA PROTEINA DI
LEGAME ALL’RNA SAM68 E SUE IMPLICAZIONI
NEL RECUPERO DELLA PROTEINA SMN IN
CELLULE SMA
SETTE CLAUDIO
020-032 Indice per Categoria-11-ITA.qxd:telethon 001-020 IndiceCateg_II
N.
100
N.
101
N.
N.
102
103
APPROCCIO NEUROPROTETTIVO MEDIATO DA
CELLULE STAMINALI NEURONALI COME
STRATEGIA TERAPEUTICA PER L’ATROFIA
MUSCOLARE SPINALE
CORTI STEFANIA
SVILUPPO DI UN APPROCCIO TERAPEUTICO PER
L’ATROFIA MUSCOLARE SPINALE CON DISTRESS
RESPIRATORIO DI TIPO 1 (SMARD1) MEDIATO
DA CELLULE STAMINALI NEURONALI E
MOTONEURONI DIFFERENZIATI DA CELLULE
STAMINALI PLURIPOTENTI INDOTTE
COMI GIACOMO PIETRO
MORTE DEI MOTONEURONI NELL’ATROFIA
MUSCOLARE SPINALE E BULBARE: DAI
MECCANISMI MOLECOLARI AI POTENZIALI
APPROCCI TERAPEUTICI
POLETTI ANGELO
INTERAZIONE GENETICA TRA IL SEGNALE
INNESCATO DAL FATTORE DI CRESCITA
INSULINO-SIMILE 1 E GLI ANDROGENI NELLA
PATOGENESI DELLA ATROFIA MUSCOLARE
SPINALE E BULBARE
PENNUTO MARIA
MALATTIE NEUROLOGICHE
N.
104
N.
105
N.
106
N.
107
N.
108
N.
109
N.
110
N.
N.
111
112
SVILUPPO E VALIDAZIONE DI UN NETWORK
NAZIONALE PER LA CREAZIONE DEL REGISTRO
ITALIANO DELLE MALATTIE MITOCONDRIALI
SICILIANO GABRIELE
STRATEGIE TERAPEUTICHE PER COMBATTERE LE
MALATTIE MITOCONDRIALI
ZEVIANI MASSIMO
IDENTIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE DI
GENI NUCLEARI RESPONSABILI DI MALATTIE
MITOCONDRIALI
ZEVIANI MASSIMO
FATTORI DELLA SINTESI PROTEICA
MITOCONDRIALE CODIFICATI DAL NUCLEO
POSSONO “CURARE” I DIFETTI RESPIRATORI
DOVUTI A SOSTITUZIONI DI BASI
PATOGENETICHE NEI GENI PER I tRNA
MITOCONDRIALI
FRONTALI LAURA
SBILANCIAMENTO DEI DEOSSINUCLEOTIDI,
CONSERVAZIONE DEL DNA MITOCONDRIALE E
MALATTIE MITOCONDRIALI
BIANCHI VERA
COINVOLGIMENTO DI PROTEINE MITOCONDRIALI
IN AUTOFAGIA: UNA POSSIBILE IMPLICAZIONE IN
MALATTIE MITOCONDRIALI
PINTON PAOLO
RUOLO DELLA DINAMICA MITOCONDRIALE E
DELLA AUTOFAGIA NELLA SEGREGAZIONE DEL
DNA MITOCONDRIALE MUTATO
VERGANI LODOVICA
BASI GENETICHE E TERAPIA DEL DEFICIT DI
COENZIMA Q
SALVIATI LEONARDO
IDENTIFICAZIONE DI NUOVI GENI-MALATTIA
NELLA PARAPLEGIA SPASTICA EREDITARIA
ORLACCHIO ANTONIO
26
N.
113
N.
114
N.
115
N.
116
N.
117
N.
118
N.
119
N.
120
N.
121
N.
122
N.
123
N.
124
N.
125
N.
126
21-02-2011
15:53
Pagina 26
CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DEI
PROCESSI METABOLICI CONTROLLATI DALLA
PROTEINA SEN1/SETX E DIFETTIVI NELLE
SINDROMI NEURODEGENERATIVE AOA2 E ASL4
LIBERI GIORDANO
RUOLO DELLA CHINASI MUTATA NELL’ATASSIA
TELANGIECTASIA (ATM) NEL CONTROLLO DELLA
QUALITÀ E DELLA STABILITÀ DI ALTRE
PROTEINE
BARILA’ DANIELA
HDACS COLLEGANO LA RISPOSTA DA DANNO AL
DNA, IL PROCESSAMENTO DELLE ROTTURE DEL
DNA A DOPPIO FILAMENTO E L’AUTOFAGIA
FOIANI MARCO
CONTROLLO DELL’ATTIVITÀ DI ATM DA PARTE
DEL MACCHINARIO DELL’INTERFERENZA DA RNA
D’ADDA DI FAGAGNA FABRIZIO
COMPRENSIONE DEI MECCANISMI
NEURODEGENERATIVI CAUSATI DA
ALTERAZIONI DI GENI CHE MEDIANO LA
RISPOSTA DEL DANNO AL DNA
DELIA DOMENICO
CARATTERIZZAZIONE FUNZIONALE DELLA
MUTAZIONI MISSENSE IN SCA28, SVILUPPO DI
UN MODELLO MURINO E SCREENING DI GENI
CANDIDATI PER ATASSIA CEREBELLARE
BRUSCO ALFREDO
SVILUPPO E NEURODEGENERAZIONE DI
CERVELLETTO E MIDOLLO SPINALE SONO
CONNESSI DA UN LEGAME MITOCONDRIALE: IL
RUOLO DI AFG3L2 NELLA DINAMICA E
METABOLISMO MITOCONDRIALE
CASARI GIORGIO
IL RUOLO DEL COMPLESSO PROTEASICO
MITOCONDRIALE M-AAA NELLA PATOGENESI
DELLE DEGENERAZIONI SPINOCEREBELLARI
TARONI FRANCO
STUDIO CLINICO E MOLECOLARE DELLA SINDROME
DI JOUBERT E CONDIZIONI CORRELATE
BERTINI ENRICO SILVIO
CONVULSIONI NEONATALI FAMILIARI BENIGNE
E CORRENTE M: DALL’ANALISI MUTAZIONALE
DEI GENI KCNQ2/3 AI MECCANISMI
MOLECOLARI DELLA LIBERAZIONE DI
NEUROTRASMETTITORI E DI VOLTAGGIODIPENDENZA NEI CANALI DEL POTASSIO
TAGLIALATELA MAURIZIO
INTERAZIONE ASTROCITI-NEURONI NEL
CONTROLLO DELL’ECCITABILITÀ E DEL CIRCOLO
CEREBRALE IN MODELLI GENETICI E ACQUISITI
DI EPILESSIA
CARMIGNOTO GIORGIO
RUOLO DEI GENI DELLE SINAPSINE
NELL’EPILESSIA ED AUTISMO
BENFENATI FABIO
RUOLO DELLE MUTAZIONI DEL RECETTORE
GABAA NELLA EPILESSIA IDIOPATICA
GENERALIZZATA: UNO STUDIO SULLO SVILUPPO
CANCEDDA LAURA
RUOLO DELLA FOSFORILAZIONE DI MECP2 E
DELLE CHINASI IMPLICATE NELLA SINDROME DI
RETT E NELL’ENCEFALOPATIA EPILETTICA
INFANTILE PRECOCE-2
LANDSBERGER NICOLETTA
020-032 Indice per Categoria-11-ITA.qxd:telethon 001-020 IndiceCateg_II
N.
127
DISFUNZIONE DEGLI INTERNEURONI IN
N.
EPILESSIE GENETICHE: COMPRENSIONE DEI
138
128
129
CITOSCHELETRICHE
CONSEGUENZE FUNZIONALI DI MUTAZIONI
ASSOCIATE AD EMICRANIA EMIPLEGICA
N.
130
131
PARAMETRI CLINICI E NEURORADIOLOGICI
CELLULE NEUROINFIAMMATORIE NEI GANGLI
N.
NISTRI ANDREA
132
140
N.
FORLONI GIANLUIGI
141
NUOVE PROSPETTIVE TERAPEUTICHE PER LA
N.
DI FEDE GIUSEPPE
142
ANTISENSO PER LA TERAPIA GENICA DELLA
N.
N.
134
N.
135
143
N.
144
136
PER LO STUDIO DEL RUOLO DEL FERRO NELLA
N.
AROSIO PAOLO
145
CATANIA MARIA VINCENZA
MECCANISMI DI RIATTIVAZIONE DEL GENE
FMR1 ED ANALISI DELLA PATOGENESI
NERI GIOVANNI
IDENTIFICAZIONE DEI MECCANISMI
MOLECOLARI DIPENDENTI DAL GENE ARX NEL
GENESI DELLE MALATTIE NEUROLOGICHE ARX
POST-TRADUZIONALI NEI GLOBULI ROSSI DI
DIPENDENTI
DE FRANCESCHI LUCIA
N.
DEFINIZIONE DELLA MALATTIA DI PARKINSON
TRAMITE PROFILO DI ESPRESSIONE GENICA DA
N.
146
147
BROCCOLI VANIA
RUOLO DELLE GTPasi DELLA FAMIGLIA DI RHO
NELLO SVILUPPO NEURONALE
DE CURTIS IVAN
MALATTIE CORRELATE A DIFETTI NELLA
FUNZIONE DELLE MIOSINE DI CLASSE V: BASI
MOLECOLARI DEL MECCANISMO DI
GUSTINCICH STEFANO
RICONOSCIMENTO DEL CARGO
PINK1, UNA PROTEINA MUTATA NELLA
MALATTIA DI PARKINSON A TRASMISSIONE
N.
AUTOSOMICA RECESSIVA, INTERAGISCE CON LA
PROTEINA PROAUTOFAGICA BECLIN1 E CON IL
148
RAGNINI-WILSON ANTONELLA
APPROCCI FARMACOLOGICI PER IL RIPRISTINO
DEI LIVELLI DI BDNF IN MODELLI CELLULARI ED
ANIMALI DELLA SINDROME DI RETT
SUO PARTNER ANTIAPOPTOTICO BCL-XL:
CARATTERIZZAZIONE DEL RUOLO
NEUROPROTETTIVO DI QUESTE INTERAZIONI
N.
ATTRAVERSO LA REGOLAZIONE DI MULTIPLE VIE
CELLULARI
METABOTROPICI DEL GLUTAMMATO (mGLU) DEL
DELLA MIGRAZIONE NEURONALE: STUDIO DELLA
ANALISI DI MODIFICAZIONI FUNZIONALE E
DALLA FORME MONOGENETICHE LRRK2 E
137
COINVOLGIMENTO DEI RECETTORI
CONTROLLO DELLO SVILUPPO DEL CERVELLO E
SANGUE PERIFERICO DI PAZIENTI AFFETTI
N.
MOSTACCIUOLO MARIA LUISA
VERSO UNA TERAPIA FARMACOLOGICA
MODELLI ANIMALI DI NEUROFERRITINOPATIE
PARKIN
IN FAMIGLIE CON ALTA RICORRENZA DI
MOLECOLARE DELLA SINDROME X FRAGILE:
DEL SAL GIANNINO
PAZIENTI AFFETTI DA NEUROACANTOCITOSI
N.
IDENTIFICAZIONE DEI GENI DI SUSCETTIBILITÀ
GRUPPO I NELLA FISIOPATOLOGIA DELLA
RUOLO DELLA PROLIL-ISOMERASI PIN1 NELLA
NEURODEGENERAZIONE
CICCONE ROBERTO
SINDROME DEL CROMOSOMA X FRAGILE
DENTI MICHELA ALESSANDRA
MALATTIA DI HUNGTINTON
ARRAY-CGH AD ALTA RISOLUZIONE AD ANALISI
D’ESPRESSIONE GENICA NELLO STUDIO DEI
SCHIZOFRENIA E DISTURBO BIPOLARE
SKIPPING ESONICO INDOTTO DA RNA
PARKINSONISMO LEGATA AL CROMOSOMA 17
133
MINETTI CARLO
DISORDINI DELLO SPETTRO AUTISTICO
MALATTIA DI ALZHEIMER BASATE SU UNA
DEMENZA FRONTO-TEMPORALE CON
N.
CARATTERIZZAZIONE FUNZIONALE DELL’ICCINA,
UNA NUOVA PROTEINA DI MEMBRANA
CENTRALE E PERIFERICA
PREVENTIVO CON DOXICICLINA IN SOGGETTI A
(FTDP-17)
GASPARINI LAURA
COINVOLTA NEI PROCESSI DI MIELINIZZAZIONE
INSONNIA FATALE FAMILIARE: TRATTAMENTO
VARIANTE DI ABETA CHE INIBISCE
N.
DELL’ETÀ ADULTA: STUDIO TRASLAZIONALE DEI
PROTEINA LAMINA B1 E CORRELAZIONE CON
INTERAZIONE FRA NEURONI SENSORIALI E
L’AMILOIDOGENESI
LEUCODISTROFIA AUTOSOMICA DOMINANTE
CELLULARI DI MALATTIA MEDIATI DALLA
RISCHIO GENETICO DI MALATTIA
N.
CHIEREGATTI EVELINA
MECCANISMI GENETICI, MOLECOLARI E
TRIGEMINALI COME BASE PER LO SVILUPPO DEL
N.
139
PIETROBON DANIELA
DOLORE EMICRANICO
PARKINSON FAMILIARE: ALFA-SINUCLEINA E LA
FILAMENTI INTERMEDI. VIE DI SEGNALAZIONE
FAMILIARE DI TIPO 1 E MECCANISMI
N.
MECCANISMI PATOGENETICI DEL MORBO DI
ED EFFETTI SULLE DINAMICHE
BACCI ALBERTO
DELL’EMICRANIA
Pagina 27
STRUTTURA DEI MICROFILAMENTI E DEI
SEVERA DELL’INFANZIA (SMEI) IN UN MODELLO
N.
15:53
SUA FORMA MUTATA A30P AGISCONO SULLA
MECCANISMI DELL’EPILESSIA MIOCLONICA
MURINO
21-02-2011
149
TONGIORGI ENRICO
SINDROME DI RETT CONGENITA: MODELLI
CELLULARI E MURINI PER LO STUDIO DEL
RUOLO DI FOXG1 NELLA NEUROGENESI
VALENTE ENZA MARIA
RENIERI ALESSANDRA
27
020-032 Indice per Categoria-11-ITA.qxd:telethon 001-020 IndiceCateg_II
N.
150
N.
151
N.
152
N.
153
N.
154
N.
155
RETT E VALIDAZIONE DI TERAPIE IN MODELLI
PRECLINICI: UNO STUDIO GENOMICO,
MORFOFUNZIONALE E COMPORTAMENTALE NEI
MODELLI ANIMALI E NEL PAZIENTE
PIZZORUSSO TOMMASO
REGOLAZIONE DELLA VIA DI SEGNALAZIONE DI
HEDGEHOG NELLO SVILUPPO DELLE CELLULE
NERVOSE E NELLE CELLULE STAMINALI
GULINO ALBERTO
LA MALATTIA L1-CAM (SINDROME CRASH):
ESPRESSIONE DI L1-CAM E SUO RUOLO A
LIVELLO SINAPTICO; FARMACOLOGIA DELLA SUA
VIA DI SEGNALAZIONE INTRACELLULARE
MELDOLESI JACOPO
CARATTERIZZAZIONE DEI MECCANISMI
CELLULARI ATTRAVERSO I QUALI LA
NEUROPILINA CONTROLLA LA FUNZIONE DELLE
INTEGRINE: IMPLICAZIONI PER LO SVILUPPO
VASCOLARE
SERINI GUIDO
CARATTERIZZAZIONE DELLE FUNZIONI
CELLULARI DI KRIT1, UN GENE ASSOCIATO ALLA
PATOGENESI DELLE MALFORMAZIONI
CAVERNOSE CEREBRALI
RETTA SAVERIO FRANCESCO
I GENI FRIZZLED-3 E FRIZZLED-6 NELLA
PATOGENESI DEI DIFETTI DEL TUBO NEURALE
(DTN) NELL’UOMO
CAPRA VALERIA
ALTRE MALATTIE GENETICHE
N.
N.
N.
N.
N.
N.
156
157
158
159
160
161
MODIFICAZIONE GENICA MIRATA TRAMITE
VETTORI AAV: DETERMINANTI MOLECOLARI CHE
REGOLANO LA TRASDUZIONE DEI VETTORI AAV,
L’INTEGRAZIONE SITO-SPECIFICA E LA
CORREZIONE DEL GENE INDOTTA DAL VETTORE
GIACCA MAURO
IL LIEVITO SACCHAROMYCES CEREVISIAE COME
AMBIENTE CELLULARE PER STUDIARE LA
REPLICAZIONE, L’INTEGRAZIONE E
L’INCAPSIDAZIONE DEL VIRUS ADENOASSOCIATO
GALLI ALVARO
CARATTERIZZAZIONE DELLA PROTEINA RSPONDINA1, COINVOLTA NELLA DETERMINAZIONE
DEL SESSO E NELLA DIFFERENZIAZIONE E
CARCINOGENESI DELLA PELLE
CAMERINO GIOVANNA
NUOVI PARAMETRI IMMUNOGENETICI PER
MIGLIORARE LA CURA DELLE MALATTIE
GENETICHE MEDIANTE IL TRAPIANTO
ALLOGENICO DI CELLULE STAMINALI
EMATOPOIETICHE
FLEISCHHAUER KATHARINA
ELABORAZIONE DI NUOVI APPROCCI
DIAGNOSTICI E TERAPEUTICI ALLA SINDROME
DI CRIGLER NAJJAR DI TIPO I
MURO ANDRES FERNANDO
EMOCROMATOSI: DAI GENI ALLA CLINICA E
RITORNO
CAMASCHELLA CLARA
28
N.
162
N.
163
N.
164
N.
165
N.
166
N.
167
N.
168
N.
169
N.
170
N.
171
N.
172
N.
173
N.
174
N.
175
21-02-2011
15:53
Pagina 28
NUOVE STRATEGIE PER CURARE
L’EMOCROMATOSI EREDITARIA ATTRAVERSO LA
STIMOLAZIONE DELLA PRODUZIONE EPATICA DI
EPCIDINA, L’ORMONE DEL FERRO
PIETRANGELO ANTONELLO
CARATTERISTICHE GENETICHE, BIOCHIMICHE E
CLINICHE DEL DEFICIT DI LCAT IN ITALIA
CALABRESI LAURA
MANIPOLAZIONE DELLA TRASMISSIONE DELLA
SEROTONINA SUI DEFICIT COMPORTAMENTALI E
NEUROCHIMICI PRODOTTI DALLA
FENILCHETONURIA
PASCUCCI TIZIANA
ANEMIA DISERITROPOIETICA CONGENITA DI
TIPO II: CORRELAZIONE GENOTIPO-FENOTIPO,
MECCANISMI MOLECOLARI, MODELLO ANIMALE.
NUOVE CONOSCENZE NELL’AMBITO
DELL’ERITROPOIESI E DEL SOVRACCARICO DI
FERRO
IOLASCON ACHILLE
DEFINIZIONE DELLA PATOGENESI DELLA
ANEMIA DI DIAMOND-BLACKFAN
DIANZANI IRMA
NUOVE STRATEGIE TERAPEUTICHE PER DIFETTI
EREDITARI DELLA COAGULAZIONE CAUSATI DA
MUTAZIONI DI SPLICING
PINOTTI MIRKO
OTTIMIZZAZIONE DELL’EFFICIENZA DI VETTORI
LENTIVIRALI PER LA TERAPIA GENICA DELLA
BETA-TALASSEMIA MAJOR
MAGGIO AURELIO
PRODUZIONE DI EMOGLOBINA IN CELLULE
ERITROIDI DA PAZIENTI CON BETA TALASSEMIA
ALTERANDO PROCESSI BIOMOLECOLARI IN
GRADO DI REGOLARE L’ESPRESSIONE DEI GENI
PER LE GLOBINE
GAMBARI ROBERTO
POTENZIALI EFFETTI TERAPEUTICI DELLE
CELLULE UMANE ENDOTELIALI DEI SINUSOIDI
EPATICI, DEL MIDOLLO OSSEO E DEL SANGUE DA
CORDONE NELL’EMOFILIA A
FOLLENZI ANTONIA
REGOLAZIONE DEI GENI COINVOLTI NELLA
PATOGENESI DELL’ANGIOEDEMA EREDITARIO
DA CARENZA DI C1 INIBITORE
CICARDI MARCO
RUOLO DELLA MIOSINA NON MUSCOLARE IIA
NELLA “MALATTIA ASSOCIATA A MYH9”
SAVOIA ANNA
IDENTIFICAZIONE DEI MECCANISMI RESPONSABILI
DEL DIFETTO DELLA FUNZIONALITÀ PIASTRINICA E
DELLA RIDOTTA MEGACARIOCITOPOIESI IN UNA
NUOVA VARIANTE DI MACROTROMBOCITOPENIA
EREDITARIA DI GLANZMANN (D673-E712DEL)
GRESELE PAOLO
UN NUOVO GENE RESPONSABILE DI
PIASTRINOPENIA EREDITARIA: STUDI CLINICI,
PATOGENETICI E FARMACOLOGICI
BALDUINI CARLO LUIGI
UNA CONNESSIONE TRA L’ALTERATA RISPOSTA
AI RECETTORI DI TIPO TOLL NELLE CELLULE
DENDRITICHE E LE MALATTIE AUTOIMMUNI NEI
PAZIENTI AFFETTI DALLA SINDROME DI
WISKOTT-ALDRICH
BENVENUTI FEDERICA
020-032 Indice per Categoria-11-ITA.qxd:telethon 001-020 IndiceCateg_II
N.
N.
N.
N.
N.
N.
176
177
178
179
180
181
N.
182
N.
183
N.
N.
N.
N.
184
185
186
187
EFFETTO DELLE MUTAZIONI DEL GENE CIAS-1
SUI MECCANISMI PATOGENETICI DELLE
SINDROMI PERIODICHE AUTOINFIAMMATORIE
DA DIFETTO DI CRIOPIRINA (CAPS). RICERCA DI
NUOVI GENI E DI NUOVI APPROCCI
TERAPEUTICI
GATTORNO MARCO
N.
188
21-02-2011
15:53
Pagina 29
DAL TOPO ALL’UOMO: VERSO L’IDENTIFICAZIONE
DI UNA TERAPIA GENICA PER LA VARIANTE LQT3
DI SINDROME DEL QT LUNGO
N.
189
CROTTI LIA
IDENTIFICAZIONE DEI PREDITTORI GENETICI,
ELETTROANATOMICI E STRUTTURALI DI
ARITMIE VENTRICOLARI MALIGNE IN PAZIENTI
LA MALATTIA CRONICA GRANULOMATOSA:
STUDI SUI MECCANISMI MOLECOLARI
RESPONSABILI DEL DIFETTO DI ATTIVITÀ
MICROBICIDA E PROPOSTA DI NUOVE
STRATEGIE TERAPEUTICHE PER IL
TRATTAMENTO DELLA MALATTIA
DRI PIETRO
CON SINDROME DI BRUGADA
N.
190
PIERONI MAURIZIO
EFFETTI DEL LOSARTAN VS. NEBIVOLOLO VS.
L’ASSOCIAZIONE DEI DUE FARMACI SUI LIVELLI
DI TGFB ATTIVO E SUI PROFILI DI ESPRESSIONE
QUANTITATIVA DEI GENI DEL PATHWAY DEL
ANOMALIE DEL COMPLEMENTO NELLA
GLOMERULONEFRITE MEMBRANOPROLIFERATIVA
PRIMARIA
NORIS MARINA
TGFB IN 300 PAZIENTI CON SINDROME DI
MARFAN E MUTAZIONI DEL GENE FBN1
N.
SAP REGOLA LA DIACILGLICEROLO CINASI ALFA:
IMPLICAZIONI PER LA RISPOSTA IMMUNITARIA IN
PAZIENTI XLP (MALATTIA LINFOPROLIFERATIVA
LEGATA AL CROMOSOMA X) E POSSIBILI
APPROCCI FARMACOLOGICI PER LA TERAPIA
DELL’XLP
GRAZIANI ANDREA
191
ARBUSTINI ELOISA
ANALISI DI RETI DI INTERAZIONE GENICA PER
L’IDENTIFICAZIONE DI GENI IMPLICATI NELLE
SINDROMI DI NOONAN E LEOPARD
N.
192
CESARENI GIANNI
BASI MOLECOLARI DELLA SINDROME DI
NOONAN E DELLE MALATTIE GENETICHE AD ESSA
CORRELATE
LA DROSOPHILA COME ORGANISMO MODELLO
PER LO STUDIO DELLA NIJMEGEN BREAKAGE
SYNDROME E DELLE MALATTIE AD ESSA
CORRELATE
GATTI MAURIZIO
N.
193
TARTAGLIA MARCO
IL GENE HOMEOBOX PITX2, MUTATO NELLA
SINDROME DI RIEGER, È CRUCIALE PER
DETERMINARE L’IDENTITÀ E LA FUNZIONE DEL
NODO SENOATRIALE
LA PATOGENESI DELLA SINDROME WHIM:
ANALISI DELLE FUNZIONI DEL CXCR4 NELLA
ATTIVAZIONE E NEL TRAFFICO DEI LINFOCITI
VIOLA ANTONELLA
N.
194
CAMPIONE MARINA MONICA
LA DISSEZIONE DEI MECCANISMI GENETICI
DELLA SINDROME DEL CUORE SINISTRO
IPOPLASICO SUGGERISCE UN MODELLO
MODULAZIONE DELLA ATTIVITÀ DEL FATTORE DI
INIZIO 6 (EIF6) E SUO UTILIZZO TERAPEUTICO
NELLE MALATTIE A CAUSA RIBOSOMALE
BIFFO STEFANO
“MULTIPLE-HITS”
N.
ALTERAZIONI NELLE PROPRIETÀ DI
CONTRAZIONE E RILASCIAMENTO DI
SARCOMERI CARDIACI NELLA CARDIOMIOPATIA
IPERTROFICA FAMILIARE (HCM): STUDIO A
LIVELLO DI SINGOLE MIOFIBRILLE
POGGESI CORRADO
195
ZUFFARDI ORSETTA
STUDI STRUTTURA-FUNZIONE SULLA 24-
DEIDROCOLESTEROLO RIDUTTASI, L’ENZIMA
DIFETTOSO NELLA DESMOSTEROLOSI, UNA
GRAVE MALATTIA EREDITARIA A CARICO DEL
METABOLISMO DEGLI STEROLI
N.
SVILUPPO DI MODELLI SPERIMENTALI IN VITRO
E IN VIVO PER STUDIARE LA PATOGENESI
MOLECOLARE DELLA CARDIOMIOPATIA
ARITMOGENA DEL VENTRICOLO DESTRO
RAMPAZZO ALESSANDRA
N.
NUOVI GENI E ASPETTI CLINICO-PATOLOGICI IN
FAMIGLIE AFFETTE DA CARDIOMIOPATIA
ARITMOGENA DEL VENTRICOLO DESTRO
BAUCE BARBARA
196
197
VANONI MARIA ANTONIETTA
STRUTTURA ED ATTIVITÀ ATEROPROTETTIVE
DELLE HDL IN DIFETTI GENETICI DELLE HDL
GOMARASCHI MONICA
ALLESTIMENTO DI MODELLI SPERIMENTALI DI
ALCAPTONURIA E VALUTAZIONE PRECLINICA DI
AGENTI TERAPEUTICI PER IL TRATTAMENTO
DELL’ARTROPATIA OCRONOTICA
N.
CARATTERIZZAZIONE DI UN MODELLO MURINO
KNOCK-IN DI MORTE CARDIACA IMPROVVISA
SU BASE GENETICA: IMPLICAZIONI PER LA
GESTIONE DI PAZIENTI AFFETTI DA
TACHICARDIA VENTRICOLARE
CATECOLAMINERGICA
PRIORI SILVIA GIULIANA
198
SANTUCCI ANNALISA
CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE E CELLULARE
DI UBIAD1, UN NUOVO PRODOTTO GENICO
COINVOLTO NELLA DISTROFIA DEL
CRISTALLINO DI SCHNYDER
N.
VARIABILITÀ DEL RISCHIO PER ARITMIE E
MORTE IMPROVVISA NELLA SINDROME DEL QT
LUNGO. IDENTIFICAZIONE E RUOLO DEI GENI
MODIFICATORI
SCHWARTZ PETER J.
199
SANTORO MASSIMO
COMPRENDERE IL MECCANISMO MOLECOLARE DI
UNA FORMA DOMINANTE DELLA
VITREORETINOPATIA ESSUDATIVA FAMILIARE E
GENERARE OPPORTUNI MODELLI SPERIMENTALI
PER ESPLORARE STRATEGIE TERAPEUTICHE
BONATTI STEFANO
29
020-032 Indice per Categoria-11-ITA.qxd:telethon 001-020 IndiceCateg_II
N.
200
N.
201
N.
202
N.
203
N.
204
N.
205
N.
206
N.
207
N.
208
N.
209
N.
210
N.
211
DEGENERAZIONE DELLE CELLULE GANGLIONARI
DELLA RETINA NELLE NEUROPATIE OTTICHE
MITOCONDRIALI: IDENTIFICAZIONE DEI
MECCANISMI PATOGENETICI
CARELLI VALERIO
N.
212
N.
213
N.
214
N.
215
N.
216
N.
217
N.
218
N.
219
MECCANISMI DI TRASPORTO DELLE PROTEINE
CLC COINVOLTE IN MALATTIE GENETICHE
UMANE E LORO REGOLAZIONE DA PARTE DI
LIGANDI INTRACELLULARI ED EXTRACELLULARI
PUSCH MICHAEL
N.
220
N.
221
LA MUTAZIONE T5M DELLA CONNESSINA 30,
ASSOCIATA NELL’UOMO A SORDITÀ, NEL TOPO
CAUSA UNA LIEVE PERDITA UDITIVA E RIDUCE
L’ACCOPPIAMENTO BIOCHIMICO ATTRAVERSO
LE CELLULE NON SENSORIALI DELLA COCLEA
MAMMANO FABIO
N.
222
N.
223
N.
224
N.
225
STUDIO DI SICUREZZA ED EFFICACIA IN
SOGGETTI CON AMAUROSI CONGENITA DI LEBER
(ACL) TRAMITE VETTORE ADENO-ASSOCIATO
PER TRASFERIRE IL GENE RPE65 UMANO
NELL’EPITELIO PIGMENTATO DELLA RETINA
(EPR): TRATTAMENTO E FOLLOW-UP DI 3
PAZIENTI ITALIANI
SIMONELLI FRANCESCA
INTERAZIONI NEUROVASCOLARI NELLO SVILUPPO
DELLA RETINA: INDAGINE SULL’EZIOLOGIA
CELLULARE DELLA MALATTIA DI NORRIE, E
VERIFICA DI POSSIBILI APPROCCI TERAPEUTICI
SPERIMENTALI IN MODELLI ANIMALI
GALLI RESTA LUCIA
ALLA RICERCA DELLE BASI MOLECOLARI
DELL’ALBINISMO OCULARE DI TIPO 1:
UN’ECCEZIONALE OPPORTUNITÀ PER FAR LUCE
SULLA TRASDUZIONE DEL SEGNALE NEL
SISTEMA DELLE ENDOMEMBRANE
SCHIAFFINO MARIA VITTORIA
I MECCANISMI APOPTOTICI NELLA
DEGENERAZIONE RETINICA POSSONO ESSERE
UTILIZZATI COME BERSAGLI TERAPEUTICI PER
LIMITARE LA MORTE DEI FOTORECETTORI
MARIGO VALERIA
COME TRASFORMARE CELLULE STAMINALI
EMBRIONALI IN CELLULE RETINICHE: RUOLO DI
GENI SPECIFICI DELL’OCCHIO
BARSACCHI GIUSEPPINA
UNA NUOVA STRATEGIA TERAPEUTICA MIRATA
AL DANNO OSSIDATIVO DEI FOTORECETTORI
NELLE EREDO-DEGENERAZIONI RETINICHE
INDOTTE DA MUTAZIONI DEL GENE ABCR.
STUDIO CLINICO E SPERIMENTALE
FALSINI BENEDETTO
GENETICA DELLA PERDITA UDITIVA
GASPARINI PAOLO
TRANSIZIONE EPITELIO-MESENCHIMALE E
MECCANISMI DI CROSS TALK NELLO SVILUPPO
DELLA FIBROSI EPATICA NEI DIFETTI
CONGENITI DI FIBROCISTINA (FIBROSI
EPATICA CONGENITA)
FABRIS LUCA
ATTIVAZIONE INTESTINALE DEL RECETTORE
NUCLEARE PER GLI ACIDI BILIARI FXR NEL
TRATTAMENTO DELLA COLESTASI INTRAEPATICA
PROGRESSIVA FAMILIARE
MOSCHETTA ANTONIO
30
21-02-2011
15:53
Pagina 30
LA RIDOTTA FERTILITÀ MASCHILE DA
IPERVISCOSITÀ IDIOPATICA DEL LIQUIDO
SEMINALE È CAUSATA DA MUTAZIONI E/O
VARIANTI GENICHE DEL CFTR?
STROM ROBERTO
IDENTIFICAZIONE DI NUOVE STRATEGIE PER LA
CORREZIONE DEL DIFETTO DI BASE NELLA
FIBROSI CISTICA
GALIETTA LUIS J. V.
STUDIO DEI MECCANISMI MOLECOLARI E
CELLULARI DELLA SINDROME DI LOWE MIRATO
ALL’IDENTIFICAZIONE E VALIDAZIONE DI
BERSAGLI FARMACOLOGICI
DE MATTEIS MARIA ANTONIETTA
INIZIATIVA TELETHON PER LA SCOPERTA DI
BERSAGLI FARMACOLOGICI PER LE MALATTIE
GENETICHE
DE MATTEIS MARIA ANTONIETTA
ANOMALIE GENETICHE DELLE MOLECOLE CHE
REGOLANO IL COMPLEMENTO NELLA SINDROME
EMOLITICO UREMICA
DONADELLI ROBERTA
SVILUPPO DI NUOVE STRATEGIE PER IL
TRATTAMENTO DELL’IPEROSSALURIA PRIMARIA
DI TIPO I
VOLTATTORNI CARLA
ANALISI ULTRASTRUTTURALE AD ALTA
RISOLUZIONE DEI COMPLESSI PROTEICI
RESPONSABILI DEL TRASPORTO
INTRAFLAGELLARE (IFT): SISTEMA MOLECOLARE
ESSENZIALE PER LA FORMAZIONE DELLE CIGLIA
E ALLA BASE DELLA MALATTIA DEL RENE
POLICISTICO (PKD, POLYCYSTIC KIDNEY
DISEASE)
LUPETTI PIETRO
DETERMINANTI GENETICHE DELL’IPODISPLASIA
RENALE NON SINDROMICA (RHD) E FENOTIPI
ASSOCIATI
GHIGGERI GIAN MARCO
DELUCIDARE LE BASI GENETICHE DELLA
MENOPAUSA PRECOCE E ALCUNI DEI
MECCANISMI MOLECOLARI DELLA PATOLOGIA
TONIOLO DANIELA
VARIAZIONI DEL NUMERO DI COPIE (CNVS) DEL
CROMOSOMA Y
KRAUSZ CSILLA GABRIELLA
IL RUOLO DELLA SOLFATAZIONE DEI
PROTEOGLICANI NELLO SVILUPPO ED
OMEOSTASI DELLO SCHELETRO: UN APPROCCIO
IN VIVO CON UN MODELLO MURINO DI
DISPLASIA DIASTROFICA
ROSSI ANTONIO
DISPLASIA FIBROSA POLIOSTOTICA - MODELLI
DI MALATTIA E MODELLI DI TERAPIA
BIANCO PAOLO
NUOVI APPROCCI TERAPEUTICI PER
L’OSTEOPETROSI
TETI ANNA MARIA
APPROCCIO FARMACOLOGICO PER LA CURA
DELL’OSTEOPETROSI AUTOSOMICA RECESSIVA
RANKL-DIPENDENTE
SOBACCHI CRISTINA
020-032 Indice per Categoria-11-ITA.qxd:telethon 001-020 IndiceCateg_II
N.
226
N.
227
N.
228
N.
229
N.
230
N.
231
N.
232
N.
233
N.
234
N.
242
243
LEPTINA, STATO METABOLICO E CELLULE T
REGOLATORIE NATURALI: BASI CELLULARI E
DIABETE DI TIPO 1
N.
236
MATARESE GIUSEPPE
EFFETTI PROTETTIVI DI COMPOSTI FITOCHIMICI
NEI CONFRONTI DEI DANNI INDOTTI DA
CITOCHINE NELLE CELLULE BETA
PANCREATICHE ED ESPLORAZIONE DEI
MECCANISMI COINVOLTI
N.
237
MASIELLO PELLEGRINO
VALUTAZIONE DEL POTENZIALE TERAPEUTICO
DELLE CELLULE REGOLATORIE INKT NEL
DIABETE AUTOIMMUNE DI TIPO 1
TERAPIA GENICA DEI DIFETTI DI ADESIONE
DELL’EPIDERMIDE
MAVILIO FULVIO
N.
LE TRANSGLUTAMINASI E IL LORO RUOLO NELLA
PATOGENESI DELL’ITTIOSI LAMELLARE E DELLA
SINDROME DA ESFOLIAZIONE CUTANEA
CANDI ELEONORA
238
FALCONE MARIKA MARIA CATERINA
NUOVI INIBITORI DELL’ANGIOGENESI VEGFDIPENDENTE ASSOCIATA A MALATTIE
NEOVASCOLARI DELL’OCCHIO
N.
MECCANISMI MOLECOLARI DELL’ATTIVAZIONE
DI NEMO E CORRELAZIONE CON LA PATOGENESI
DELL’INCONTINENTIA PIGMENTI
URSINI MATILDE VALERIA
239
N.
N.
LA SINDROME TRAPS (TUMOR NECROSIS FACTOR
RECEPTOR ASSOCIATED SYNDROME): NUOVI
ASPETTI PATOGENETICI E RISPOSTA AL
TRATTAMENTO ANTI-IL-1 IN ETÀ PEDIATRICA
MARTINI ALBERTO
240
241
DE FALCO SANDRO
UTILIZZO DI TIMP3 PER BLOCCARE LE
COMPLICANZE METABOLICHE E VASCOLARI
DELL’OBESITÀ
DIFETTI DI IMPRINTING GENOMICO COME CAUSA
DI DISORDINI CONGENITI DELLA CRESCITA
RICCIO ANDREA
FEDERICI MASSIMO
LA FUNZIONE DEL GENE PREP1 NEL DIABETE
TIPO 2
BEGUINOT FRANCESCO
UN NUOVO SCREENING GENETICO DEL GENE
DELLA TG2 IN UNA COORTE DI SOGGETTI
AFFETTI DA DIABETE 2 ED UNO STUDIO
FUNZIONALE ASSOCIATO
SERVIZI TELETHON ALLA RICERCA
MASSA ORNELLA
ABSTRACT
NETWORK DI BIOBANCHE GENETICHE DI
TELETHON (TGBN)
N.
CENTRO PER LO STUDIO DI GENOMICA
FUNZIONALE IN VIVO
ALTRUDA FIORELLA
245
NEUROFISIOLOGIA SPERIMENTALE NEI MODELLI
BIANCHI MARCO E.
ANIMALI
248
FILOCAMO MIRELLA
N.
247
235
MOLECOLARI PER UN UN INTERVENTO
SVILUPPO PRE-CLINICO DI VETTORI
LENTIVIRALI PER LA TERAPIA GENICA
DELL’EPIDERMOLISI BOLLOSA GIUNZIONALE
RECCHIA ALESSANDRA
CENTRO PER LA MUTAGENESI CONDIZIONALE
N.
Pagina 31
IMMUNOTERAPEUTICO INNOVATIVO NEL
STUDIO DEI MECCANISMI COINVOLTI NEI
DIFETTI CUTANEI CARATTERIZZANTI LA
SINDROME DI HAY-WELLS E SVILUPPO DI
STRATEGIE TERAPEUTICHE
MISSERO CATERINA
244
246
N.
RUOLO DI P63 NELL’EPIDERMIDE NORMALE E
NELLE DISPLASIE ECTODERMICHE
MELINO GENNARO
N.
N.
15:53
MALATTIE COMUNI/COMPLESSE
STUDIO DEL RUOLO DELLA SEDLINA NELLA
PATOGENESI DELLA
SPONDILOEPIFISODISPLASIA TARDA (SEDT)
WILSON CATHAL
ABSTRACT
N.
21-02-2011
LEOCANI LETIZIA
N.
249
N.
250
N.
251
SERVIZIO DI GENOTIPIZZAZIONE DI SNPS
BURLO-CBM
GASPARINI PAOLO
N.
SERVIZIO PER L’IDENTIFICAZIONE E LA
VALIDAZIONE DELLE MUTAZIONI GENICHE
NIGRO VINCENZO
31
252
SERVIZI BIOINFORMATICI PER L’ANALISI DI
DATI GENERATI DALLE PIATTAFORME DI
SEQUENZIAMENTO DI NUOVA GENERAZIONE
PESOLE GRAZIANO
IMMUNOGENETICA-TELETHON “CORE FACILITY”
PER LA PURIFICAZIONE DI ANTICORPI
MONOCLONALI DI GRADO CLINICO
HORENSTEIN ALBERTO LEONARDO
SERVIZIO DI PROTEOMICA TELETHON
CRESCENZI MARCO
SERVIZIO TELETHON PER LA MICROSCOPIA
ELETTRONICA: ANALISI ULTRASTRUTTURALE E
IMMUNO-LOCALIZZAZIONE SU MODELLI DI
MALATTIE GENETICHE
TACCHETTI CARLO
SERVIZIO TELETHON DI MICROSCOPIA
ELETTRONICA TEEMCOF
POLISHCHUK ROMAN
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TELETHON INSTITUTE OF GENETICS AND MEDICINE
TELETHON INSTITUTE OF GENETICS AND MEDICINE
ABSTRACT N. 2
Telethon Institute of Genetics and Medicine - Other Genetic Diseases
ABSTRACT N. 1
Responsabile
Telethon grant N.
Telethon Institute of Genetics and Medicine - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Totale
FRANCO BRUNELLA
Num Centri: 1
TGM06A01
567.542
Durata (anni): 5
DI BERNARDO DIEGO
TGM06E01
398.412
Durata (anni): 5
Anno d’inizio: 2006
RETI GENETICHE NELLE PATOLOGIE UMANE
Anno d’inizio: 2006
Belcastro Vincenzo (1), Iorio Francesco (1), Siciliano Velia (1), Di
Bernardo Diego (1,2)
LA SINDROME OROFACIODIGITALE DI TIPO I COME MODELLO PER LO STUDIO DELLA FUNZIONE CILIARE
(1) TIGEM - Via P Castellino 111, 80131, Napoli
(2) Dip. Informatica e Sistemistica - Università degli Studi “Federico II” Napoli
Iaconis Daniela (1), Zullo Alessandro (1), Bimonte Sabrina (1),
Tammaro Roberta (1), Dallai Romano (2), Ascenzi MariaGrazia (3),
Capasso GiovanBattista (4), Fabiola Giusti (2), Dolle Pascal (5),
Igarashi Peter (6), Franco Brunella (1,7)
La nostra ricerca mira a sviluppare e applicare protocolli sperimentali e algoritmi computazionali per dedurre reti geniche e le modalità d’azione di farmaci.
Abbiamo sviluppato e applicato metodi di reverse-engineering per
definire la rete di trascrizione regolata dal fattore di trascrizione
p63, le cui mutazioni sono causative di sindromi ereditarie, in cheratinociti primari al [Della Gatta et al., Genome Ris. 2008; Bansal et
al, Molecular Systems Biololgy, 2007; Bansal et al, Bioinformatica,
2006].
Abbiamo esteso il nostro approccio di reverse-engineering per identificare reti di regolazione trascrizionali ‘consenso’ per specie umana
e murine per tutti i geni conosciuti utilizzando i dati di microarray
disponibili nelle banche dati pubbliche. Abbiamo raccolto un set di
dati eterogenei dei profili di espressione genica (22.255) da una varietà di campioni umani e condizioni sperimentali. Abbiamo sviluppato un nuovo approccio di reverse-engineering in grado di quantificare la misura in cui sono correlati i livelli di mRNA di due geni tra
di loro attraverso un set di dati complessi. Abbiamo individuato
sperimentalmente un sottoinsieme d’interazioni proteina-proteina
non precedentemente descritto nella letteratura. Abbiamo scoperto
i moduli di regolazione trascrizionale nell’ambito della rete, costituita da geni fortemente connessi tra loro, che svolgono specifiche
funzioni biologiche. Abbiamo scoperto che questi geni collegati tendono ad essere vicini fisicamente a livello della cromatina nel nucleo. Abbiamo dimostrato che la rete può essere usata per predire
la funzione biologica e la localizzazione subcellulare di una proteina,
e per chiarire la funzione di un gene-malattia. In particolare abbiamo scoperto che il gene precursore granulin (GRN), le cui mutazioni
causano la degenerazione frontotemporale senile, è coinvolto in
funzioni lisosomiali. Abbiamo sviluppato uno strumento online
(http://netview.tigem.it) per interrogare ed esplorare la rete di regolazione trascrizionale identificata [Belcastro et al, in esame].
Nel campo della ricerca farmacologica, abbiamo sviluppato un metodo automatico ed affidabile che sfrutta la somiglianza in profili di
espressione genica in seguito a trattamento con farmaci, per prevedere similarità tra farmaci [Iorio et al., PNAS, 2010]. Abbiamo costruito una “rete di farmaci” di 1.302 nodi (farmaci) e 41.047 archi
(che indicano somiglianze tra coppie di farmaci).
Usando questa rete, abbiamo identificato correttamente il MOA per
nove composti antitumorali, e siamo stati in grado di scoprire un effetto non conosciuto per un noto farmaco. Abbiamo scoperto che
Fasudil (un inibitore della Rho-chinasi) potrebbe essere “riposizionato” come un enhancer di autofagia cellulare, potenzialmente applicabile a diverse patologie neurodegenerative. Il nostro approccio
è stato implementato in un tool (Mode of Action by Network Analysis, MANTRA, http://mantra.tigem.it).
(1) TIGEM, - Via Pietro Castellino 111, 80131, Naples, Italy
(2) Department of Evolutionary Biology, University of Siena, , Italy
(3) Department of Orthopedic Surgery, Biomechanics Research Division, University of California at Los Angeles, CA, USA
(4) Chair of Nephrology, School of Medicine, Second University of Naples, Naples, Italy
(5) Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Illkirch Cedex,
France
(6) Department of Internal Medicine and Division of Basic Sciences, University
of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, Dallas, Texas, USA
(7) Department of Pediatrics, Medical Genetics Services, University Federico II,
Naples, Italy
La sindrome Oro-facio-digitale di tipo I (OFDI; MIM 311200) è trasmessa come tratto dominante legato al cromosoma X con letalità
nei maschi. Si manifesta con anomalie craniofaciali, degli arti ed a
carico del sistema nervoso, anche il rene policistico puo’ essere
presente. Studi precedenti hanno dimostrato che la malattia è
causata da mutazioni nel gene Cxorf5 che è stato rinominato
OFD1. Studi funzionali hanno dimostrato che OFDI fa parte del
gruppo di malattie associate a disfunzione ciliare.
Con lo scopo di studiare la funzione del gene Ofd1 e delle ciglia
primarie in condizioni fisiologiche e patologiche abbiamo utilizzato
differenti modelli murini per studiare il ruolo di Ofd1 nello sviluppo
degli arti e nella patogenesi del rene policistico.
Lo studio del modello con inattivazione arto-specifica ci ha permesso di dimostrare che il gene è importante per la corretta specificazione delle dita e per la formazione dell’asse antero posteriore degli arti. Studi ultrastrutturali e d’immunofluorescenza hanno
dimostrato che Ofd1 è necessario per una corretta formazione
delle ciglia primarie anche nell’arto. La mancata specificazione
delle dita in questo modello è associata ad una progressiva perdita della trasduzione del segnale di Shh ed ad un difettoso processamento di Gli3. I difetti dell’allungamento degli arti sono invece
associati ad una difettosa trasduzione del segnale di Ihh ed a problemi di mineralizzazione durante lo sviluppo endocondrale.
L’inattivazione rene specifica nel topo del gene ha prodotto un
modello con rene policistico e progressivo deterioramento della
funzione renale.
Questo modello ci ha permesso di dimostrare che le ciglia si formano inizialmente per poi sparire dopo lo sviluppo delle cisti renali, suggerendo che l’assenza di ciglia primarie possa essere una
conseguenza piuttosto che la causa primaria della formazione delle cisti renali. Studi d’immunofluorescenza ed analisi delle proteine hanno dimostrato un’aumentata attività del segnale di mTOR in
strutture renali. Il trattamento di questi modelli murini con rapamicina, uno specifico inibiotore di mTOR, ha evidenziato una significativa riduzione del numero e delle dimensioni delle cisti renali negli animali trattati se paragonati ad animali non trattati
suggerendo che in questo modello le alterazioni del pathway sono
dipendenti da mTOR.
Riteniamo che il modello animale che abbiamo generato possa
rappresentare un buon modello per studiare la relazione tra il
pathway di mTOR e lo sviluppo delle cisti e potrebbe eventualmente portare all’identificazione di nuovi bersagli terapeutici per
la malattia cistica renale. Quasi tutte le cellule sono provviste di
ciglia e riteniamo quindi che la rilevanza dei risultati ottenuti possano avere implicazioni e ricadute al di là delle malattie genetiche
rare e possono aiutare a capire i meccanismi alla base di altre
condizioni patologiche caratterizzate da rene policistico ed anomalie degli arti e del sistema nervoso.
ABSTRACT N. 3
Telethon Institute of Genetics and Medicine - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
BALDINI ANTONIO
TGM06A05
250.000
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2006
RUOLO DEI FATTORI DI TRASCRIZIONE T-BOX NELLE MALATTIE CONGENITE DEL CUORE E IN ALTRI DIFETTI DELLO
SVILUPPO
Caprio Cinzia (1,2), Fulcoli Gabriella (1,2), Pane Luna (1,2), Ferrentino Rosa (1,2), Baldini Antonio (1)
(1) Istituto di Genetica e Biofisica “Adriano Buzzati-Traverso” - Via Pietro Castellino 111, Napoli
(2) TIGEM - Via Pietro Castellino 111, Naples, Italy
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TELETHON INSTITUTE OF GENETICS AND MEDICINE
La sindrome da delezione del 22 (22q11.2DS) è la più comune sindrome da delezione (1:4000 nati vivi). La mutazione di TBX1, uno
dei geni localizzati nella delezione, è sufficiente a generare la maggior parte se non tutte le manifestazioni fenotipiche. Tbx1 è necessario per lo sviluppo cardiaco e faringeo, e in molti dei tessuti affetti
ne riduce la proliferazione cellulare. Durante lo sviluppo cardiaco
Tbx1 è importante nei progenitori cardiaci dove regola positivamente la proliferazione e negativamente il differenziamento. Abbiamo
identificato meccanismi molecolari distinti che sono alla base delle
due funzioni. Ora vogliamo identificare strategie per la soppressione
del fenotipo, identificare meccanismi molecolari attraverso i quali
Tbx1 regola i suoi geni target, e validare i risultati in un modello
cellulare umano della malattia.
Per la “cura” del fenotipo, abbiamo considerato la proliferazione cellulare come potenziale target. Abbiamo riscontrato che l’inibitore
del ciclo cellulare p21 è regolato negativamente da Tbx1. p53 regola positivamente inibitori del ciclo cellulare, e quindi ci siamo chiesti
se la riduzione del dosaggio di p53, per via genetica o farmacologica, possa influire il fenotipo aploinsufficiente in topi mutanti per
Tbx1. I risultati sono stati molto incoraggianti in quanto la mutazione eterozigote di p53 causa l’eliminazione pressocchè completa dal
fenotipo da mutazione di Tbx1, mentre la soppressione farmacologica, sebbene meno efficace, causa comunque una significativa riduzione dell’incidenza delle anomalie fenotipiche.
Il meccanismo attraverso il quale p53 interferisce con l’aploinsufficienza di Tbx1 non è ancora chiaro. È stato dimostrato che p53 regola almeno alcuni dei suoi target trascrizionali (compreso p21) interagendo con un componente di un complesso di rimodellamento
della cromatina. Abbiamo dimostrato che Tbx1 interagisce con lo
stesso componente. Pertanto è possibile che il bilancio tra dosaggio
di p53 e di Tbx1 venga “letto” a livello della cromatina.
Abbiamo poi generato un modello cellulare umano della sindrome
per validare i nostri risultati. Abbiamo ottenuto fibroblasti cutanei di
un paziente con 22q11.2DS e li abbiamo riprogrammati (in parallelo
con fibroblasti di un controllo) e ottenuto induced pluripotent stem
(iPS) cells. Abbiamo poi sottoposto le iPS dei controlli ad un protocollo per il differenziamento cardiomiocitico per determinare la finestra temporale di espressione di TBX1 e altri marcatori del differenziamento cardiaco. I risultati hanno dimostrato che il protocollo di
differenziamento è molto efficace e induce l’espressione di TBX1 e
di altri marcatori secondo uno schema temporale e quantitativo del
tutto paragonabile a quello che abbiamo precedentemente ottenuto
con cellule ES murine.
Questi risultati sono incoraggianti in quanto dimostrano che il modello iPS è adeguato per lo studio del fenotipo cellulare in precursori
cardiaci derivanti da pazienti con 22q11.2DS.
mazione di specifiche popolazioni e circuiti neuronali nel tronco encefalico murino in sviluppo. I geni Hox sono coinvolti nei processi di
formazione dei rombomeri (r) lungo l’asse antero-posteriore così
come nella successiva specificazione delle identità cellulari lungo
l’asse dorso-ventrale durante la neurogenesi. In particolare, i geni
homeobox Hoxb1 e Hoxb2 sono importanti per specificare nella regione ventrale e motoria di r4 i neuroni facciali branchiomotori ed i
neuroni efferenti motori delle vie uditive. Per meglio comprendere i
derivati sensoriali di r4, abbiamo generato una linea transgenica
che permette di marcare geneticamente r4 in modo permanente e
generare una mappa del destino a lungo termine di tutti i derivati di
r4, dalla loro origine alla loro destinazione finale e dall’embriogenesi
fino all’adulto (r4-Cre/YFP). Il nostro studio mostra che dalla parte
sensoriale di r4 si originano vari sottotipi cellulari coinvolti nelle vie
uditive centrali: neuroni che vanno a formare il nucleo ventrale del
lemnisco laterale, i cui assoni proiettano al talamo, neuroni che innervano direttamente il collicolo inferiore, e cellule specifiche del
“rhombic lip” di r4 che colonizzano la parte rostrale del nucleo cocleare dorsale e la parte posteriore del nucleo cocleare ventrale.
Questo suggerisce un fondamentale contributo delle cellule derivate
da r4 nel circuito auditorio ascendente dalla coclea al talamo.
Per analizzare in modo specifico il ruolo di Hoxb1 tardivo e ristretto
ad r4, abbiamo incrociato la linea r4-Cre/YFP con alcune linee di
Hoxb1 geneticamente modificate e seguito il destino e le proiezioni
di tutti i derivati di r4. Abbiamo dimostrato che nei topi mutanti per
Hoxb1 il VLL e le sue proiezioni sono ridotte, le cellule granulari derivate da r4 si generano ectopicamente nel nucleo cocleare e il nucleo olivococleare motorio non si forma. Di conseguenza, il circuito
sensoriale e motorio che amplifica la risposta della coclea è danneggiato e la trasmissione di stimoli uditivi di bassa intensità è severamente affetta causando la progressiva perdita dell’udito nei topi
mutanti di Hoxb1. I nostri dati inoltre hanno rivelato che Hoxb1 agisce attraverso Hoxb2, un altro gene Hox espresso nei vari nuclei
uditivi a stadi più tardivi, nel corretto sviluppo del sistema auditorio
e hanno aperto nuove prospettive sul ruolo dei geni Hox nelle vie
uditive e più generale sull’origine e i meccanismi delle disgenesie
del tronco encefalico.
ABSTRACT N. 5
Telethon Institute of Genetics and Medicine - Neurological Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
ABSTRACT N. 4
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
STUDER MICHELE
TGM06A03
174.724
Durata (anni): 4
TGM06A04
130.445
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2006
REGOLAZIONE GENETICA DELLO SVILUPPO DELLA CORTECCIA CEREBRALE: RUOLO DEL RECETTORE NUCLEARE COUPTFI DURANTE LA MIGRAZIONE RADIALE E LA MORFOLOGIA
FINALE DEI NEURONI DEL CORPO CALLOSO
Telethon Institute of Genetics and Medicine - Neurological Diseases
Responsabile
STUDER MICHELE
Alfano Christian (1,2), Viola Luigi (1), Heng Julian (3), Pirozzi Marinella (1), Clarkson Michael (2), Guillemot Francois (3), Studer Michèle (1,2)
Anno d’inizio: 2006
MECCANISMI DI SVILUPPO DEL TRONCO ENCEFALICO E PATOLOGIE: RUOLO DEI GENI HOXB1 E HOXB2 NELLE VIE UDITIVE CENTRALI
(1) TIGEM - Via Pietro Castellino, 111, 80131, Naples, Italy
(2) INSERM U636; Centre of Biochemistry; University of Nice Sophia-Antipolis;
Valrose Campus; 06108 Nice, France
(3) Department of Molecular Neurobiology, National Institute of Medical Research, UK
Di Bonito Maria (1,2), Narita Yuichi (3), Sequino Luigi (4), Avallone
Bice (5), Franzè Annamaria (6), Puelles Luis (7), Rijli Filippo (3),
Studer Michèle (1,2)
Il Corpo Calloso (CC) è la più importante commissura neuronale,
che connette regioni omotipiche dei due emisferi cerebrali nei
mammiferi. Nell’uomo esistono varie patologie di tipo cognitivo connesse a difetti avvenuti durante la formazione del CC [Paul LK et al.
Nat Rev Neurosci (2007) 8: 287-299.]. Benchè diversi studi suggeriscano un deficit nella migrazione radiale dei neuroni corticali, come eziologia plausibile di una genesi anomala del CC, prove dirette
di un legame tra questi due processi sono ancora al di là da venire.
In questo studio dimostriamo che il recettore nucleare COUP-TFI
(Nr2f1) [Armentano M et al. Nat Neurosci (2007), Armentano M et
al. Development (2006) 133: 4151-4162] modula la migrazione radiale corticale controllando in questo modo la morfologia finale dei
neuroni nati in fasi tardive della corticogenesi, la formazione del CC
oltre che l’innervazione degli assoni del CC. Tramite analisi molecolare ed elettroporazione ex-vivo di un vettore che esprime la GFP in
neocortecce della linea murina mutante per COUP-TFI, i neuroni del
calloso, sebbene correttamente specificati, non raggiungono la piastra corticale e mostrano difetti morfologici durante la loro migrazione. In assenza di COUP-TFI i livelli di Rnd2, una molecola della
famiglia delle Rho-GTPasi essenziale nella migrazione radiale neuronale e regolata da Ngn2, aumentano in modo anomalo nei progeni-
(1) TIGEM - Via P. Castellino 111, 80131 Naples, Italy
(2) INSERM U636; Centre of Biochemistry; University of Nice Sophia-Antipolis;
Valrose Campus; 06108 Nice, France
(3) Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, Maulbeerstrasse 66,
4058 Basel, Switzerland
(4) Institute of Audiology, Department of Neuroscience and Behavioral Sciences, University “Federico II”, Naples, Italy
(5) Department of Biological Sciences, University “Federico II”, Naples, Italy
(6) IGB “A. Buzzati Traverso” C.N.R., Via P. Castellino 111, 80131 Napoli, Italy
(7) Department of Human Anatomy and Psychobiology, and CIBER en Enfermedades Raras U736, University of Murcia, 30100, Murcia, Spain
Le vie uditive centrali ascendenti sono situate nel tronco cerebrale
(nuclei cocleari, complesso olivare superiore), il mesencefalo (collicolo inferiore), il talamo (corpo genicolato mediale) e la corteccia
uditiva. Esistono anche vie efferenti motorie e circuiti interneuronali
che permettono, in attività congiunta con le vie ascendenti sensoriali, di eseguire un’analisi complessa del suono. Vari fattori trascrizionali ed in particolare i geni Hox sono richiesti per la corretta for-
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TELETHON INSTITUTE OF GENETICS AND MEDICINE
tori intermedi e nei neuroni precoci della corteccia embrionale [Armentano M et al. Nat Neurosci (2007), Heng JI et al. Nature (2008)
455: 114-118]. Il nostro studio dimostra una repressione diretta di
Rnd2 da parte di COUP-TFI nei neuroni postmitotici grazie a saggi
biomolecolari (QPCR, ChIP), alla generazione di doppi mutanti per
COUP-TFI e Ngn2 e ad una nuova linea murina “condizionale” in cui
COUP-TFI è selettivamente eliminato nei neuroni corticali appena
generati. Inoltre, diminuendo i livelli alterati di Rnd2 nei neuroni
mutanti per COUP-TFI, è possibile ristabilire una corretta migrazione neuronale. Infine, per mezzo di esperimenti di elettroporazione
in utero mostriamo che la perdita di COUP-TFI incide in maniera intrinseca sulla formazione del CC e sull’acquisizione della loro corretta morfologia finale, quali l’arborizzazione dendritica e l’innervazione assonale contro laterale. Questi difetti sono recuperati in maniera significativa ristabilendo la migrazione radiale ed abbassando i livelli di Rnd2 nei neuroni mutanti. Nel complesso i nostri dati mostrano che COUP-TFI promuove una corretta migrazione radiale dei
neuroni tramite regolazione negativa dei livelli di Rnd2 in modo tale
da favorire una corretta formazione del CC. Infine è importante sottolineare che questo studio fornisce una prova diretta del fatto che
una fine modulazione della migrazione radiale neuronale favorisce
l’acquisizione di una corretta morfologia finale da parte dei neuroni
del corpo calloso.
glio principali dell’attività del miR-204. In particolare, abbiamo dimostrato che i livelli anormalmente elevati di Meis2 (conseguenza
dell’inattivazione di miR-204), insieme alla susseguente misregolazione del pathway di Pax6, sono in gran parte responsabili del fenotipo osservato. Questi dati forniscono un primo esempio di come
anche un solo miRNA possa regolare molteplici eventi durante la
formazione dell’occhio e rafforzano l’ipotesi che questa classe di
RNA non-codificanti possa essere coinvolta nella patogenesi di malattie oculari umane.
ABSTRACT N. 7
Telethon Institute of Genetics and Medicine - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 2
Totale
Num Centri: 1
BANFI SANDRO
TGM06D01
515.641
Durata (anni): 5
865.000
Durata (anni): 5
Anno d’inizio: 2006
Surace Enrico Maria (1), Manfredi Anna (1), Marrocco Elena (1),
Gargiulo Annagiusy (1), Mussolino Claudio (1), Puppo Agostina (1),
Colella Pasqualina (1), Trapani Ivana (1), Allocca Mariacarmela (1),
Di Vicino Umberto (1), Doria Monica (1), Iodice Carolina (1), Auricchio Alberto (1,2)
Telethon Institute of Genetics and Medicine - Other Genetic Diseases
Telethon grant N.
TGM06B01
APPROCCI DI TERAPIA GENICA PER IL TRATTAMENTO DI
PATOLOGIE EREDITARIE SEVERE A CARICO DEI FOTORECETTORI
ABSTRACT N. 6
Responsabile
AURICCHIO ALBERTO
(1) TIGEM - Via Pietro Castellino 111, Naples, Italy
(2) Medical Genetics, Departement of Pediatrics, University of Naples Federico
II - Naples
Anno d’inizio: 2006
RUOLO DEGLI RNA NON CODIFICANTI NELLO SVILUPPO E
NEL FUNZIONAMENTO DELL’OCCHIO DEI MAMMIFERI
La maggior parte delle patologie ereditarie che portano alla cecità
come la malattia di Stargardt (STGD), la Retinite Pigmentosa (RP) e
l’Amaurosi Congenita di Leber (LCA) sono causate da mutazioni in
geni espressi nei fotorecettori della retina. Il trasferimento di geni
alla retina mediante l’uso di vettori derivati dagli AAV (Virus Adeno
Associati) rappresenta una strategia molto promettente per il trattamento delle patologie retiniche ereditarie. Di recente abbiamo dimostrato l’efficacia dei vettori AAV nella retina di pazienti affetti da
LCA in assenza di effetti collaterali (Maguire A. M. et al., N Engl J
Med, 2008). Tuttavia nel caso di forme di degenerazione severa dei
fotorecettori, sebbene siano stati caratterizzati diversi vettori AAV
capaci di trasdurre questi sottotipi retinici, studi sperimentali in diversi modelli animali non hanno portato ad evidenze di un recupero
della loro funzionalità. Recentemente abbiamo riportato che nuovi
sierotipi di AAV (AAV 2/7 e 2/8) sono capaci di trasdurre i fotorecettori murini più efficientemente dell’AAV 2/5, il sierotipo che rappresentava il miglior veicolo di trasferimento genico in queste cellule (Allocca M. et al., J Virol, 2007).
Abbiamo inoltre recentemente confermato questi dati di trasduzione
anche in retina porcina, che rispetto a quella murina è più simile a
quella umana per dimensioni e struttura (Mussolino et al., Gene
Therapy, 2010, in press).
Inoltre, abbiamo osservato che l’inserimento della sequenza target
per un miRNA espresso in retina nella regione 3’ UTR della cassetta
di espressione del transgene, restringe l’espressione genica del promotore ubiquitario CMV ai fotorecettori.
Considerando che il trasferimento genico mediato dall’AAV 2/5 alle retine di topi deficienti per beta-PDE o AIPL1 ha mostrato scarsa efficacia terapeutica, abbiamo deciso di testare l’efficacia dell’
AAV 2/8 in questi modelli che ricapitolano il fenotipo di forme severe di RP e LCA.
Nel modello murino di degenerazione severa dei fotorecettori rd10,
dovuto all’assenza della beta-PDE, il trasferimento genico mediato
da AAV2/8, ha mostrato un parziale e transiente effetto protettivo,
sia singolarmente somministrato che in combinazione con il calcioantagonista Nilvadipine o con la privazione di luce (Allocca et al,
IOVS, 2010 under review). Questi dati evidenziano la necessità di
strumenti di trasferimento genico più efficaci di quelli da noi usati, o
di una maggiore conoscenza della patogenesi del modello rd10 per
ottenere livelli di protezione clinicamente rilevanti.
Nel modello Aipl1-/- di LCA4, il trasferimento genico mediato da
AAV 2/8 ha portato ad un significativo miglioramento morfologico
dei fotorecettori. In più, il trasferimento genico di Aipl1 mediato
dall’AAV 2/8 in retina porcina wild-type ha confermato la localizzazione dell’espressione del transgene nei fotorecettori e l’assenza di
effetti tossici (Testa, Surace et al,IOVS, 2010, under review). Questi dati, in combinazione con l’evidenza che i pazienti italiani affetti
da LCA4 mostrano severi difetti visivi con conservazione dei PR periferici, suggeriscono che l’LCA4 potrebbe essere un possibile obbiettivo per la terapia genica mediata da AAV.
Conte Ivan (1,2), Karali Marianthi (1), Avellino Raffaella (1), Carrella Sabrina (1), Peluso Ivana (1), Meola Nicola (1), Gennarino Vincenzo Alessandro (1), Banfi Sandro (1)
(1) TIGEM - Via Pietro Castellino, 111, 80131 Naples, Italy,
email [email protected]
(2) Genetics and Biophysics Adriano Buzzati Traverso CNR, Naples, Italy
L’occhio è un organo altamente specializzato il cui sviluppo e maturazione richiedono il susseguirsi coordinato di una serie di eventi
morfogenetici e di differenziamento cellulare. Questo progetto si
propone di identificare nuovi meccanismi che possano contribuire al
controllo dell’espressione genica nei vari tipi cellulari che formano
l’occhio. Più in dettaglio, ci proponiamo di identificare e caratterizzare in dettaglio i microRNA (miRNA) che svolgano un ruolo nel differenziamento e mantenimento dell’occhio. I miRNA sono piccoli
RNA di lunghezza compresa tra i 21 e i 25 nucleotidi che regolano
in modo negativo l’espressione dei loro geni bersaglio e sono necessari per molti e fondamentali processi biologici. Tuttavia, il loro ruolo preciso nell’ambito dello sviluppo e del funzionamento oculare rimane ancora largamente ignoto. Per questo motivo, abbiamo deciso di studiare in modo più dettagliato il ruolo funzionale dei miRNA
nell’occhio. A tale scopo, abbiamo a) studiato in modo sistematico
le loro modalità di espressione nell’occhio murino e b) successivamente abbiamo caratterizzato funzionalmente in vivo (mediante
studi di inattivazione e sovraespressione) i miRNA con i domini di
espressione oculare più interessanti.
Per realizzare il primo obiettivo, abbiamo generato il primo catalogo
globale di espressione dei miRNA nei vari tessuti che compongono
l’occhio usando sia analisi di microchip che ibridazione in situ con
sonde a RNA. Questa analisi ha evidenziato la presenza di numerosi
miRNA con espressione differenziale nei tessuti oculari analizzati e
ha dato luogo ad un atlante dettagliato (denominato miRNeye e accessibile liberamente al sito web http://mirneye.tigem.it) della loro
espressione tessutale durante le varie fasi dello sviluppo oculare
dell’occhio murino (Karali M et al. BMC Genomics. 2010 Dec
20;11(1):715.). Abbiamo quindi selezionato alcuni dei miRNA con i
domini di espressione più ristretti e interessanti all’interno dell’occhio da sottoporre ad analisi funzionale in vivo. Abbiamo cosi’ dimostrato che il miRNA miR-204, da solo, è in grado di regolare molteplici aspetti dello sviluppo oculare nell’organismo medakafish (Oryzias latipes).
L’inattivazione, mediata da morfolino, del miR-204 è in grado di determinare un fenotipo oculare aberrante, caratterizzato da microftalmia, anomalie della formazione del cristallino e coloboma oculare
associato ad alterazione dell’asse dorso-ventrale della retina. Abbiamo individuato nel fattore di trascrizione Meis2 uno dei geni bersa-
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TELETHON INSTITUTE OF GENETICS AND MEDICINE
ABSTRACT N. 8
lezione della fenilalanina in posizione 508 (Delta 508), la quale causa una scorretta struttura della proteina e la sua conseguente ritenzione nel reticolo endoplasmico (il sito di sintesi), dove viene degradata. Di conseguenza, la proteina è assente dalla superficie cellulare. Questo conduce all’addensamento del muco che ricopre gli epiteli dei polmoni e di altri organi, ed a uno stato di infiammazione
bronchiale cronica accompagnato da frequenti infezioni. Questa forma di fibrosi cistica è quindi dovuta ad una incapacità della CFTRDelta-508 di uscire dal reticolo endoplasmico e di essere trasportata
alla superficie cellulare. Lo scopo del nostro progetto è di correggere questo difetto. Gli approcci basati su terapia genetica sono stati
inutili fino a questo momento, mentre lo sviluppo di potenziali farmaci per facilitare l’arrivo della CFTR alla superficie cellulare ha dimostrato parziale efficacia in vitro. Tuttavia, il meccanismo d’azione
dei farmaci finora trovati rimane ignoto e la loro efficacia è modesta. Per superare questi limiti, abbiamo disegnato un approccio per
identificare le reti molecolari su cui i farmaci finora trovati agiscono,
ed anche per identificare, più in generale, le reti molecolari che
possano influenzare favorevolmente l’arrivo alla superficie cellulare
di CFTR. Questo è indispensabile per poi manipolare tali reti molecolari con farmaci che possano potenziare la correzione del difetto
di CFTR. A tal fine abbiamo usato tecniche bioinformatiche per identificare: a) proteine la cui espressione sia modificata dai farmaci noti; b) proteine la cui espressione corregga il difetto di CFTR; e c)
proteine capaci di interagire con CFTR. Il numero totale trovato è
stato di diverse centinaia. Infine, abbiamo organizzato queste proteine in reti molecolari. Per ora, abbiamo identificato quattro reti
molecolari, e ci siamo focalizzati solo su una di queste, caratterizzata da uno specifico gruppo di chinasi.
Abbiamo quindi testato l’ uso di inibitori della chinasi meglio caratterizzata nella rete. Due di questi inibitori hanno causato una correzione del difetto di CFTR pari a quella indotta dai farmaci più attivi
sinora identificati. Sulla base di questi risultati, riteniamo che l’approccio da noi proposto abbia il potenziale di arricchire il repertorio
attualmente disponibile di potenziali farmaci per il trattamento della
fibrosi cistica.
Nota: questo progetto è finanziato da un grant assegnato collettivamente ai laboratori di A. Luini, M.A. De Matteis e R. Polishuk.
Telethon Institute of Genetics and Medicine - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
PARENTI GIANCARLO
TGM06C05
409.500
Durata (anni): 5
Anno d’inizio: 2006
IDENTIFICAZIONE DI NUOVI APPROCCI TERAPEUTICI PER
LA MALATTIE LISOSOMIALI
Parenti Giancarlo (1,2), Cardone Monica (1), Donaudy Francesca
(1), Porto Caterina (1,2), Rossi Barbara (1), Pignata Antonella (1),
Tarallo Antonietta (1)
(1) TIGEM - Via Pietro Castellino 111, Naples, Italy – email: [email protected]
(2) Department of Pediatrics, Federico II University, Naples
Negli ultimi decenni notevoli progressi sono stati compiuti nel trattamento delle malattie da accumulo lisosomiale (LSD). Le terapie
esistenti, tuttavia, mostrano limitazioni in termini di efficacia, biodisponibilità, sicurezza e costi, e c’è la necessità di identificare strategie terapeutiche complementari a quelle già esistenti. Terapie basate sull’utilizzo di piccole molecole (terapia di riduzione del substrato, SRT; terapia con chaperones farmacologici, PCT) sono approcci
emergenti che possono risultare utili in questo senso.
Negli ultimi anni abbiamo studiato approcci basati sulla PCT e abbiamo fornito le basi per l’utilizzo di chaperones farmacologici nella malattia di Pompe (PD), una miopatia metabolica dovuta alla
carenza della idrolasi lisosomiale alfa-glucosidasi (GAA). Un risultato innovativo dei nostri studi è la dimostrazione di un effetto sinergico di PCT e terapia enzimatica sostitutiva (ERT) con GAA
umana ricombinante (rhGAA) in questa malattia. Questi risultati
sono in corso di traduzione clinica in un trial basato sulla combinazione di ERT e PCT.
Abbiamo inoltre esplorato le potenzialità della SRT per il trattamento delle mucopolisaccaridosi (MPS). La ERT ha mostrato limiti importanti nel trattamento di queste patologie, data la sua scarsa efficacia in organi come l’osso, il cuore, l’occhio. L’incapacità di enzimi
ricombinanti di attraversare la barriera emato-encefalica rende inadatta l’ERT per il trattamento di molte MPS in cui il coinvolgimento
neurologico è una delle principali cause di handicap. In uno studio
attualmente in corso, abbiamo individuato una molecola che è in
grado di interferire con la sintesi di proteoglicani e di ridurre l’accumulo di glicosaminoglicani in fibroblasti MPSIIIA, MPSII e MPSVI e
nel modello animale della MPSIIIA. Questo effetto è dovuto alla
competizione con il legame dello xilosio ai residui di serina e all’allungamento della catena di glicosaminoglicani.
Abbiamo infine studiato alcuni aspetti della fisiopatologia della PD e
gli effetti di anomalie cellulari innescate dall’accumulo di glicogeno
sull’efficacia della ERT. Abbiamo osservato anomalie morfologiche
dell’apparato di Golgi in cellule PD. La distribuzione intracellulare
del recettore catione-indipendente del mannosio-6-fosfato (CI-MPR)
è risultata alterata, con una ridotta disponibilità del recettore sulla
membrana plasmatica, e un alterato riciclo dalla membrana plasmatica al trans-Golgi. La ridotta disponibilità di CI-MPR influenza
l’assorbimento della rhGAA e ha un impatto sfavorevole sull’efficacia della ERT.
ABSTRACT N. 10
Telethon Institute of Genetics and Medicine - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 1
LUINI ALBERTO
700.000
Anno d’inizio: 2006
(1) TIGEM - Via Pietro Castellino 111, 80131, Naples, Italy email: [email protected]
(2) Dept. of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, Houston, TX 77030, USA
(3) Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children Hospital, Houston, TX 77030, USA
(4) Cambridge Institute for Medical Research, Wellcome Trust/MRC Building
Addenbrookès Hospital, Cambridge
(5) Medical Genetics, Pediatrics, Federico II University, Naples, Italy
TGM06F02
Durata (anni): 3
45.000
Durata (anni): 1
Settembre Carmine (1,2,3), Di Malta Chiara (1), Polito Assunta Vinicia (1,2,3), Arencibia Moises Garcia (4), Vetrini Francesco (2), Erdin Serkan (2,3), Erdin Serpil Uckac (2,3), Huynh Tuong (2,3), Medina Diego L. (1), Colella Pasqualina (1), Sardiello Marco (2,3), Rubinsztein David C (4), Ballabio Andrea (1,2,3,5)
Telethon Institute of Genetics and Medicine - Other Genetic Diseases
Telethon grant N.
TGM06D05
IDENTIFICAZIONE DI NETWORK GENETICI ATTRAVERSO L’IPERESPRESSIONE IN CELLULE ES
ABSTRACT N. 9
Responsabile
BALLABIO ANDREA
Anno d’inizio: 2010
L’autofagia è un processo catabolico basato sulla cooperazione di
due differenti organelli cellulari: gli autofagosomi e i lisosomi. Di
conseguenza, un’efficiente autofagia implica una coordinata regolazione delle attività di entrambi gli organelli. Noi qui dimostriamo
che, in condizioni di assenza di nutrienti, la cellula attiva un programma trascrizionale che controlla i principali steps dell’autofagia
quali la formazione dell’autofagosoma, la fusione autofagosoma-lisosoma e la degradazione dei substrati.
Il fattore di trascrizione EB (TFEB), precedentemente identificato
come principale regolatore della biogenesi del lisosoma, co-ordina
questo programma genetico, regolando la trascrizione di geni lisosomiali ed autofagici. La localizzazione nucleare e l’attività di TFEB
sono negativamente regolate attraverso una fosforilazione su di una
serina operata dalla kinasi ERK2, la cui attività è regolata dai livelli
extracellulari di nutrienti. Analogamente alla starvation, l’inibizione
farmacologica di ERk induce l’autofagia attivando TFEB. Questi dati
ORGANIZZAZIONE DELLE VIE DI TRASPORTO INTRACELLULARE DI PROTEINE: RUOLO IN MALATTIE GENETICHE
Luini Alberto, Raman Parashuraman, Ramanath Hegde, Bao Cutrona Meritxell
TIGEM - Via Pietro Castellino 111, Naples, Italy
Una delle più frequenti malattie genetiche legate alla funzione di
trasporto intracellulare è la fibrosi cistica. La fibrosi cistica è una
grave malattia genetica causata da mutazioni del gene che codifica
per una proteina canale del cloro, normalmente localizzato sulla superficie cellulare, detta Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator
(CFTR). In circa il 70% dei casi di malattia, la mutazione è una de-
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TELETHON INSTITUTE OF GENETICS AND MEDICINE
identificano un ruolo di TFEB e MAP kinasi nella regolazione dell’autofagia e identificano un nuovo meccanismo che controlla la clearance cellulare.
signalling di ERK e un accumulo di beta-catenina risultanti in un
blocco del differenziamento eritroide al chromatophilic erythroblast
stage e del differenziamento dei linfociti B a pro-B stage. Inoltre
abbiamo osservato riduzione della linea mieloide matura e aberrante sviluppo dei linfociti T. Questi difetti venivano revertiti dopo blocco di FGF pathway nei topi Sumf1-/-. Questi dati indicano che
Sumf1 controlla il differenziamento delle HSPCs attraverso la modulazione dei pathways di FGF e Wnt.
ABSTRACT N. 11
Telethon Institute of Genetics and Medicine - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
BALLABIO ANDREA
TGM06C01
472.786
Durata (anni): 4
ABSTRACT N. 13
Anno d’inizio: 2006
Telethon Institute of Genetics and Medicine - Other Genetic Diseases
Responsabile
SOLFATASI E MALATTIE: APPROFONDIMENTI SULLE “MULTIPLE SULFATASE DEFICIENCY “
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Medina Diego L. (1), Fraldi Alessandro (1), Bouche Valentina (1),
Annunziata Fabio (1), Mansueto Gelsomina (1), Spampanato Carmine (1), Puri Claudia (1), Pignata Antonella (1), Martina Jose A. (2),
Sardiello Marco (3,4), Polischuk Roman (1), Puertollano Rosa (2),
Ballabio Andrea (1,3,4,5)
La Mucopolisaccaridosi VI (MPS VI) o syndrome di MaroteauxLamy è una malattia da accumulo lisosomiale di glicosaminoglicani (GAG) causata dal deficit nell’attività dell’arilsolfatasi B (ARSB). La patologia è caratterizzata da disostosi multipla, organomegalia, ispessimento delle valvole cardiache e opacizzazione
della cornea.
Esistono sia gatti che ratti affetti da MPS VI che presentano rispettivamente mutazioni missenso e non senso nel gene codificante per l’ARSB.
In un precedente lavoro abbiamo riportato che nei ratti MPS VI, dopo trasferimento genico di ARSB al fegato mediante vettori AAV2/8,
lo sviluppo di una risposta immunitaria di tipo umorale diretta contro l’ARSB limita l’efficacia terapeutica non consentendo di ottenere
elevati livelli di attività ARSB circolante. Per inibire la risposta immunitaria, abbiamo co-somministrato diversi farmaci immunosoppressori (CTLA4-Ig, Rapamicina, Fk506 e Ciclosporina A) contemporaneamente al trasferimento genico in ratti MPSVI sia neonati che
giovani adulti.
In molti ratti trattati, sebbene non in tutti, abbiamo misurato elevati livelli circolanti di ARSB, fino all’80% dei valori normali, efficiente
captazione dell’enzima dai tessuti affetti e completa correzione del
fenotipo sia viscerale che scheletrico.
Diversamente, nei gatti MPS VI, che producono una proteina ARSB
inattiva, abbiamo ottenuto livelli circolanti di ARSB simili al normale
e stabili per più di un anno dopo il trasferimento genico al fegato in
assenza di risposte immuni nei confronti del transgene.
In gatti MPSVI neonati, è possibile ottenere livelli circolanti di ARSB
pari al normale solo somministrando, per via sistemica, alte dosi di
vettore AAV (6x1013 gc/kg).
Questo suggerisce che la proliferazione degli epatociti negli animali
neonati, con conseguente diluizione del vettore, può limitare l’efficacia terapeutica quando si utilizzano basse dosi di vettore. Quando
invece il vettore è iniettato in giovani adulti, è possibile ottenere livelli enzimatici in circolo simili o superiori al normale con dosi di
vettore più basse, fino a 2x1012 gc/kg. Nei gatti MPS VI con elevata attività ARSB circolante abbiamo osservato, indipendentemente
dall’età al trattamento:i) risoluzione dell’accumulo di GAG ii) miglioramento della lunghezza delle ossa lunghe iii) riduzione dell’inspessimento patologico delle valvole cardiache e iv) miglioramento della
motilità spontanea.
Questi risultati suggeriscono che, il trasferimento genico di ARSB al
fegato mediato da vettori AAV2/8 rappresenta una promettente
strategia terapeutica per il trattamento di pazienti MPS VI con mutazioni missenso.
Telethon Institute of Genetics and Medicine - Other Genetic Diseases
Num Centri: 1
COSMA MARIA PIA
TGM06C02
350.000
Durata (anni): 5
Anno d’inizio: 2006
(1) TIGEM - Via Pietro Castellino 111, Naples, Italy
(2) Medical Genetics, Department of Pediatrics, University of Naples Federico II
- Naples
(3) Department of Pathobiology, School of Veterinary Medicine,University of
Pennsylvania, Pa, Usa
(4) Lysosomal Diseases Research Unit, Sa Pathology (at Women’s and Children’s Hospital), Adelaide, Australia
ABSTRACT N. 12
Totale
430.147
Durata (anni): 5
Cotugno Gabriella (1,2), O’malley Thomas (3), Ferla Rita (1,2), Annunziata Patrizia (1,2), Bartolomeo Rosa (1,2), O’donnell Patricia
(3), Wang Ping (3), Russo Fabio (1), Capalbo Anita (1), Tessitore
Alessandra (1), Faella Armida (1), Sleeper Meg M. (3), Knox Van
W. (3), Fernandez Steven (3), Levanduski Leah (3), Hopwood John
(4), Kaskins Mark (3), Auricchio Alberto (1,2)
Le malattie da accumulo lisosomiale (LSD) sono caratterizzate dall’accumulo patologico di materiale non degradato nei lisosomi. Queste malattie sono dovute a mutazioni che cadono in circa 50 geni
differenti coinvolti in diversi aspetti della funzione degradativa lisosomiale. Noi ipotizziamo che una strategia volta direttamente allo
smaltimento del materiale tossico accumulato nei lisosomi potrebbe
avere un impatto generale sulla terapia di questo gruppo di malattie. L’esositosi lisosomiale è un processo regolato dal Ca2+ coinvolto nella secrezione e nel riparo della membrana plasmatica (PM).
Durante questo processo i lisosomi si fondono con la PM, svuotando
il loro contenuto fuori della cellula. In questo lavoro, mostriamo che
questo processo è regolato dal fattore trascrizionale EB (TFEB).
TFEB aumenta la dinamica delle vescicole e porta all’aumento del
rilascio di Ca2+ dai depositi acidici attraverso l’attivazione del gene
TRPML1. Inoltre, mostriamo che nelle LSD, mentre la funzione catabolica dei lisosomi è compromessa, l’esocitosi lisosomiale è invece
funzionale. Infatti, l’induzione dell’esocitosi lisosomiale in seguito
all’overespressione di TFEB porta ad una diminuzione dell’accumulo
patologico, portando ad un recupero della normale morfologia cellulare in quattro diverse LSD. I nostri dati indicano che l’esocitosi lisosomiale modula lo smaltimento dei rifiuti cellulari e suggerisce
una nuova strategia terapeutica per le LSD e per quelle malattie associate all’accumulo intracellulare di molecole tossiche.
Telethon grant N.
TGM06C03
TRASFERIMENTO GENETICO MEDIATO DA VIRUS ADENO-ASSOCIATI IN MODELLI ANIMALI DI MUCOPOLISACCARIDOSI
VI
(1) TIGEM - Via P. Castellino 111, 80131 Naples, Italy – email: [email protected]
(2) Lab of Cell Biology, NHLBI, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland USA
(3) Dept. of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, Houston, TX USA
(4) Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children Hospital, Houston, TX, USA
(5) Medical Genetics, Dept of Pediatrics, Federico II University, Naples, Italy
Responsabile
AURICCHIO ALBERTO
Anno d’inizio: 2006
CARATTERIZZAZIONE DEL SISTEMA DI MODIFICAZIONE
DELLE SOLFATASI NEI MAMMIFERI
Buono Mario (1), Visigalli Ilaria (2), Bergamasco Roberta (1), Biffi
Alessandra (2), Cosma Maria Pia (1)
(1) TIGEM - Via Pietro Castellino 111, Naples, Italy
(2) San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy, Division of Regenerative
Medicine, San Raffaele Scientific Institute, Italy
La self renewal e il differenziamento delle cellule ematopoietiche è
controllata dall’attivazione dei pathways di FGF, Wnt e Notch che rimodellano l’eparan solfato proteoglicano. SUMF1, che è mutato nella deficienza multipla di solfatasi, attiva le solfatasi Sulf1 e Sulf 2
che rimodellano l’eparan solfato proteoglicano. Abbiamo dimostrato
che FGF signalling pathway è constitutivamente attivo nelle cellule
Sumf1-/- HSPCs. Questa iperattivazione risulta in un aumento del
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TELETHON INSTITUTE OF GENETICS AND MEDICINE
ABSTRACT N. 14
niezioni IM di vettori AAV. Pertanto la terapia genica diretta al muscolo, mediata da vettori AAV ha grosse potenzialitá per la cura della sindrome di Crigler-Najjar di tipo 1.
Telethon Institute of Genetics and Medicine - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
COSMA MARIA PIA
ABSTRACT N. 16
TGM06C04
375.098
Durata (anni): 5
Anno d’inizio: 2007
Telethon Institute of Genetics and Medicine - Neuromuscular Diseases
Responsabile
TERAPIA GENICA IN MODELLI MURINI DELLA MUCOPOLISACCARIDOSI II CON VETTORI ADENOASSOCIATI
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Polito Vinicia Assunta, Abbondante Serena, Polishchuk Roman, Nusco Edoardo, Salvia Rosaria, Cosma Maria Pia
La mucopolisaccaridosi di tipo II è un disordine devastante associato ad una attesa di vita breve. Pazienti affetti mostrano molti sintomi che coinvolgono i vari organi del corpo e possono includere anche un progressivo deterioramento del CNS. MPSII è dovuta alla
inattività dell’enzima IDS che risulta nell’accumulo di dermatan e
heparan solfato nei lisosomi, con conseguente degenerazione cellulare e tissutale. Abbiamo sviluppato un protocollo di ERT (enzyme
replacment therapy) nel modello murino per la MPSII che consente
all’enzima IDS di raggiungere il cervello e correggere in maniera
sostanziale il fenotipo cerebrale nei topi. Questi trattamenti sono
stati fatti anche in topi adulti e con dosi relativamente basse di enzima infuso. Questo studio ha dimostrato che la MPSII puo’ essere
trattata per via sistemica con una terapia ERT.
Num Centri: 1
Obiettivi. Scopo del nostro studio è stato quello di valutare gli effetti
degli steroidi e della terapia genica, da soli e in associazione, sulla funzione cardiaca. Background. Le distrofie muscolari sono malattie genetiche debilitanti che affliggono una popolazione significativa di bambini
e adulti in tutto il mondo. Sono colpiti sia i muscoli scheletrici sia il
cuore. Non solo in pazienti, ma anche nelle portatrici, la cardiomiopatia può essere la principale causa di morte. Il criceto BIO14.6 mutato
nel delta-sarcoglicano è uno dei modelli più comunemente usato per
studiare la cardiomiopatia dilatativa e la distrofia muscolare. Abbiamo
precedentemente dimostrato che la terapia genica può far recuperare
il fenotipo e prolungare la durata della vita nel criceto cardiomiopatico.
Nei pazienti con simili difetti genetici, gli steroidi sono stati ampiamente utilizzati per rallentare la progressione della malattia.
Metodi. Abbiamo iniettato il cDNA umano del delta-sarcoglicano mediante AAV2/8, con una singola iniezione intraperitoneale in criceti
BIO14.6 a due settimane di età. Abbiamo poi trattato i criceti con deflazacort. Il trattamento è stato somministrato a metà dei criceti che
avevano ricevuto l’AAV e a criceti non trattati, nonché ai criceti normali.
Risultati. Entrambe le attività orizzontali e verticali sono state incrementate dal deflazacort in tutti i gruppi di criceti. Nel gruppo di criceti
trattati con AAV (gruppo BIO14.6AAV) abbiamo riscontrato un miglioramento della frazione di eiezione e di accorciamento e una riduzione
del diametro ventricolare sinistro sistolico e diastolico. Questi parametri sono simili a quelle dei criceti “wild-type” e una prova di recupero
funzionale. Come negli esperimenti precedenti, il trattamento AAV da
solo è stato in grado di preservare la frazione di eiezione (70 ± 7%
EF). Tuttavia, il valore EF è diminuito (52 ± 14%) con una combinazione di AAV e deflazacort. Questo risultato è stato sorprendente, in
quanto il trattamento combinato AAV più deflazacort ha determinato
un fenotipo molto simile a quello osservato nei criceti affetti che non
avevano ricevuto alcun trattamento. Ciò è avvenuto senza alcuna modifica nella trasduzione AAV o nell’espressione del delta-sarcoglicano.
Conclusioni. Si conferma che la terapia genica migliora la funzione
cardiaca nei criceti BIO14.6. I nostri risultati suggeriscono che il deflazacort è inefficace e può addirittura avere un impatto negativo sul recupero della cardiomiopatia, probabilmente aumentando l’attività motoria. Questo è inaspettato e può avere un significato in termini di raccomandazioni di uno stile di vita per i pazienti.
BRUNETTI PIERRI NICOLA
TGM06C07
290.000
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2007
(1) TIGEM - via Pietro Castellino 111, 80131, Naples, Italy, [email protected]
(2) Institute of Genetics and Biophysics, CNR, Napoli
(3) A.O. Monaldi, Seconda Università di Napoli
(4) Centro di Biotecnologie, Ospedale A. Cardarelli, Napoli
(5) Laboratorio di Genetica Medica, Dipartimento di Patologia Generale e CIRM,
Seconda Università degli Studi di Napoli
(6) Medical Genetics, Dipartimento di Pediatria, Università degli Studi di Napoli
“Federico II”
Telethon Institute of Genetics and Medicine - Other Genetic Diseases
Totale
190.000
Durata (anni): 4
Rotundo Ida Luisa (1), Faraso Stefania (1), De Leonibus Elvira (1,2),
Nigro Gerardo (3), Vitiello Carmen (1), Lancioni Alessio (1), Di Napoli
Daniele (4), Castaldo Sigismondo (4), Russo Vincenzo (3), Russo Fabio (1), Piluso Giulio (5), Auricchio Alberto (1,6), Nigro Vincenzo (1,5)
ABSTRACT N. 15
Telethon grant N.
TGM06F01
TERAPIA GENICA DELLA CARDIOMIOPATIA E DELLA DISTRIFIA MUSCOLARE NEL MODELLO ANIMALE ‘BIO 14.6 HAMSTER’
TIGEM - Via Pietro Castellino 111, Naples, Italy
Responsabile
NIGRO VINCENZO
Anno d’inizio: 2009
TERAPIA GENICA DIRETTA AL MUSCOLO MEDIATA DA VETTORI AAV RISULTA IN UNA RIDUZIONE A LUNGO TERMINE
DELL’IPERBILIRUBINEMIA IN UN MODELLO ANIMALE DELLA
SINDROME DI CRIGLER-NAJJAR DI TIPO 1
Pastore Nunzia (1), Sepe Rosa Maria (1), Vetrini Francesco (1), Edoardo Nusco (1), Auricchio Alberto (1,2), Brunetti-Pierri Nicola (1,2)
(1) TIGEM - Via Castellino, 111; 80131, Naples, Italy
(2) Department of Pediatrics, Federico II University of Naples, Italy
La sindrome di Crigler-Najjar è una malattia autosomica recessiva
caratterizzata da iperbilirubinemia severa dovuta alla deficienza
dell’enzima epatico uridina difosfo-glucuronosil trasferasi 1 A1
(UGT1A1). La terapia attualmente si basa sulla fototerapia per ridurre i livelli di bilirubina sierica e sul trapianto di fegato che è l’unico trattamento permanente disponibile. Purtoppo il trapianto epatico è associato ad elevata morbiditá e mortalitá e pertanto c’è una
grossa motivazione per lo sviluppo della terapia genica per questa
malattia. Sebbene il trasferimento genico al fegato, che è la sede
naturale dell’enzima carente, sia la soluzione piú ovvia, l’espressione ectopica della UGT1A1 per aumentare la clearance di metaboliti
tossici ha importanti vantaggi. Il muscolo è la sede ectopica preferita per raggiungere questo obiettivo perché è accessibile facilmente
e in maniera sicura mediante semplice iniezione intramuscolare
(IM). Inoltre, la somministrazione IM è stata ampiamente studiata
per la terapia genica di varie malattie genetiche e anche in alcuni
trial clinici. In questo studio, abbiamo valutato l’efficacia della terapia genica diretta al muscolo per la terapia della sindrome di Crigler-Najjar di tipo 1 usando vettori virali Adeno Associati (AAV). Abbiamo iniettato un vettore AAV del sierotipo 1 esprimente l’UGT1A1
sotto il controllo del promotore muscolo-specifico della creatina fosfo-chinasi (MCK) alla dose di 3x10e12 copie genomiche/kg nei muscoli dei ratti Gunn, il modello animale della sindrome di CriglerNajjar di tipo 1. Le iniezioni IM del vettore AAV hanno condotto all’espressione dell’enzima funzionalmente attivo nel muscolo come
dimostrato da analisi di Western blot e da saggi di attività enzimatica. I ratti Gunn iniettati con il vettore AAV hanno mostrato una riduzione del 50-75% dei livelli di bilirubina nel siero già 3 settimane
dopo l’iniezione e tale riduzione si è mantenuta per almeno 1 anno
dopo l’iniezione. Questi risultati mostrano che è possibile ottenere
una riduzione clinicamente rilevante e duratura dei livelli di bilirubina nel siero mediante un approccio semplice e sicuro basato sull’i-
ABSTRACT N. 17
Telethon Institute of Genetics and Medicine - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 2
MERONI GERMANA
TGM06D02
407.150
Durata (anni): 5
Anno d’inizio: 2006
UNA NUOVA CLASSE DI LIGASI E3 DELLE UBIQUITINE: LA
FAMIGLIA TRIM
Napolitano Luisa MR (1), Lancioni Alessio (2), De Leonibus Elvira
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21-02-2011
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HSR-TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY
(2), Hay Ronald T (3), Nigro Vincenzo (2), Meroni Germana (1)
[email protected]
(2) University of Rome “Tor Vergata”, Rome, Italy
(3) Bone Metabolic Unit, San Raffaele Hospital, Milano, Italy
(4) Second Division of Pediatrics, IRCCS, Institute G. Gaslini, Genova, Italy
(5) Pathology Unit, San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy
(6) Pediatric Immunohematology and Bone Marrow Transplantation Unit, San
Raffaele Scientific Institute, Milano, Italy
(7) Department of Pathology, University of Brescia, Brescia, Italy
(8) Department of Immunobiology, Yale University School of Medicine, New
Haven, USA
(9) Molecular genetics of mental retardation Unit, San Raffaele Scientific Institute, Milano, Italy
(1) Cluster in Biomedicine (CBM) - ss 14, km 163.5 - Basovizza - Trieste. Tel
040 3757718, Fax 040 3757710, email: [email protected]
(2) TIGEM - Via Pietro Castellino 111, Naples, Italy
(3) College of Life Science, University of Dundee, Dundee, Scotland, UK
La famiglia genica TRIM è caratterizzata dalla presenza del motivo
tripartito composto da un dominio RING, uno o due domini B-box
ed una regione Coiled-coil.
Le proteine TRIM sono coinvolte in diverse patologie e rappresentano la più ampia famiglia di E3 ligasi contenenti il dominio RING. Le
E3 ligasi sono le molecole responsabili del trasferimento specifico
del peptide ubiquitina al substrato. Mentre il loro ruolo come E3 ligasi è stato per molti membri stabilito, poco si sa delle loro specifiche interazioni con gli enzimi di coniugazione dell’ubiquitina (UBE2)
che determinano la topologia della risultante modificazione. Abbiamo condotto uno screening di interazioni tra le proteine TRIM e la
famiglia di UBE2.
Abbiamo evidenziato una generale preferenza delle proteine TRIM
per le classi D ed E degli enzimi UBE2 ma abbiamo anche rilevato
interazioni molto specifiche, es. TRIM9-UBE2G2. Abbiamo dimostrato che l’attività E3 ligasica delle proteine TRIM è molto specifica ed evidente solo in presenza degli enzimi E2 con i quali interagiscono. Abbiamo dimostrato che TRIM32, il gene implicato nella
Distrofia Muscolare dei Cingoli di tipo 2H, agisce con UBE2D, E, N
ed in maniera peculiare con gli enzimi UBE2V. TRIM18/MID1, implicato nella forma legata al cromosoma X della Sindrome di Opitz
G/BBB (OS), mostra preferenza per UBE2D, E ed N per la sua attività di E3 ligasi. OS è una condizione caratterizzata da difetti dello
sviluppo della linea mediana. I pazienti maschi con OS legata all’X
causata da mutazioni nel gene MID1 mostrano espressività variabile
dei segni clinici. Abbiamo generato una linea di topo knock-out che
porta l’allele non funzionale dell’ortologo murino del gene MID1.
I topi deficienti per Mid1 presentano i difetti anatomici cerebrali osservati nei pazienti: ipoplasia del verme cerebellare. Abbiamo trovato che la presenza di questo difetto correla con deficienze di
coordinazione motoria e di apprendimento procedurale.
Il difetto è limitato ai lobi anteriori del verme, la porzione adiacente
al midbrain dorsale.
Analisi durante lo sviluppo embrionale ci hanno permesso di rilevare che la mancanza di Mid1 causa un accorciamento della porzione caudale del midbrain; la rostralizzazione del confine tra midbrain e cervelletto; e la diminuzione dell’espressione di una molecola chiave dello sviluppo di questa regione, Fgf17. Quindi, la
mancanza di Mid1 causa una incorretta determinazione del confine tra midbrain e cervelletto che risulta in un anomalo sviluppo
dei lobi più anteriori del verme. Questo modello animale rappresenta uno strumento per ulteriori studi in vivo al fine di capire il
ruolo fisiologico e patologico di Mid1 e per comprendere lo sviluppo dei domini anteriori del cervelletto.
I nostri risultati rappresentano la base per futuri studi sulle specifiche reazioni catalizzate da TRIM E3 ligasi nel determinare la modificazione e quindi il destino dei loro target e per comprendere la patogenesi delle malattie in cui sono coinvolti.
Il deficit di Adenosina Deaminasi (ADA-SCID) è caratterizzato da
una compromissione nello sviluppo e nella funzione linfocitaria e da
danno sistemico d’organo dovuto all’accumulo di metaboliti tossici.
Di recente abbiamo dimostrato che il difetto di attivazione delle cellule T contribuisce ai difetti immunologici e al fenotipo clinico dell’ADA-SCID (Cassani et al, Blood 2008). Attualmente stiamo studiando i meccanismi molecolari che causano manifestazioni autoimmuni
e la patogenesi delle alterazioni non-immunologiche, che restano
ancora in gran parte sconosciute. Le manifestazioni autoimmuni sono frequentemente osservate nelle forme più lievi della malattia o
dopo la terapia enzimatica sostitutiva con PEG-ADA (ERT). Al fine di
studiarne la patogenesi, abbiamo generato un modello murino per
lo studio dell’autoimmunità, mediante la somministrazione a lungo
termine di PEG-ADA. I topi ADA-/- trattati con ERT hanno una bassa immunoricostituzione e sviluppano manifestazioni autoimmuni
con produzione di autoanticorpi, mentre topi sottoposti a trapianto
o terapia genica (TG) sono simili ai topi wildtype. Poichè la tolleranza periferica è mediata principalmente dalle cellule T regolatorie
(nTregs), che possiedono un unico macchinario biochimico volto a
generare e mantenere elevate le concentrazioni di adenosina, abbiamo ipotizzato che il compartimento nTreg potrebbe essere particolarmente colpito nell’ADA-SCID, trovando differenze fenotipiche e
funzionali nelle nTregs isolate da topi ADA-/- e da pazienti. La produzione di autoanticorpi è una caratteristica della maggior parte
delle malattie autoimmuni. Durante lo sviluppo delle cellule B, quelle in grado di riconoscere il self ad alta affinità vengono generalmente rimosse in diversi punti di controllo. Perciò, abbiamo testato
la reattività verso antigeni self a partire da anticorpi a singola cellula clonati da pazienti ADA-SCID. I nostri dati suggeriscono un difetto in entrambi i punti di controllo centrale e periferico delle cellule
B, risultante in una perdita della contro selezione dei cloni autoreattivi. Queste due linee parallele di ricerca forniscono nuovi elementi
nella predisposizione all’autoimmunità per l’ADA-SCID.
Recentemente abbiamo dimostrato che la carenza di ADA nei topi e
nei pazienti provoca uno specifico fenotipo osseo, che sottolinea il
ritardo di crescita spesso osservato in questi pazienti (Sauer et al,
Blood 2009). Tuttavia, ulteriori domande restano aperte per le manifestazione non immuni nell’ ADA-SCID, in particolare i difetti cognitivi e neurologici. Abbiamo utilizzato test di imaging, strumentali, psicometrici e clinici e trovato alterazioni nei pazienti con malattia all’esordio o trattati con PEG-ADA. Per testare se queste alterazioni sono tipiche della malattia abbiamo studiato il metabolismo di
ADA nel cervello e le anomalie comportamentali nei topi ADA-/-.
Questi hanno un comportamento alterato dal punto di vista esplorativo, motivazionale ed emozionale, ed un fenotipo simil-ansia per
alcuni test (Open Field e Dark/Light).
Uno sbilancio nella distribuzione del recettore dell’adenosina A2a
nel cervello dei topi ADA-/- e la diminuzione della percezione del
dolore suggerisce un ruolo molto importante per il recettore Adora2a rispetto al recettore Adora1 per il comportamento. I nostri risultati miglioreranno le nostre conoscenze sulla patogenesi delle alterazioni neurologiche in ADA-SCID e la loro correzione con le terapie disponibili.
HSR - TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY
ABSTRACT N. 18
HSR- TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY - Other Genetic Diseases
Responsabile
AIUTI ALESSANDRO
Totale
786.461
Telethon grant N.
Num Centri: 1
ABSTRACT N. 19
TGT06A01
Durata (anni): 5
HSR- TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY - Other Genetic Diseases
Anno d’inizio: 2006
Responsabile
Telethon grant N.
PATOGENESI DELLE MANIFESTAZIONI IMMUNITARIE E NON
IMMUNITARIE NELL’ADA-SCID
Totale
Num Centri: 2
Sauer Aisha V (1), Brigida Immacolata (1,2), Jofra Hernandez Raisa
(1), Scaramuzza Samantha (1), Carriglio Nicola (1,2), Mrak Emanuela (3), Traggiai Elisabetta (4), Sanvito Francesca (5), Casiraghi
Miriam (6), Ferrua Francesca (6), Roncarolo Maria Grazia (1,6), Poliani Pietro L (7), Sessa Maria (1), Rubinacci Alessandro (3), Meffre
Eric (8), D’adamo Patrizia (9), Aiuti Alessandro (1,2,6)
AIUTI ALESSANDRO
TGT06F01
2.119.179
Durata (anni): 5
Anno d’inizio: 2006
EFFICACIA E SICUREZZA A LUNGO TERMINE DELLA TERAPIA
GENICA PER L’ADA-SCID
Aiuti Alessandro (1,2), Ferrua Francesca (1), Galimberti Stefania
(3), Brigida Immacolata (1), Biasco Luca (1), Scaramuzza Samantha (1), Selleri Silvia (1), Casiraghi Miriam (1), Callegaro Luciano (1), Cicalese Maria Pia (1), Tabucchi Antonella (4), Carlucci Filip-
(1) HSR-TIGET - Via Olgettina 58, Milan, Italy; Tel. 02-26434435, e-mail
39
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Pagina 40
HSR-TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY
po (4), Aker Memet (5), Slavin Shimon (5), Marktel Sarah (1), Ciceri Fabio (7), Valsecchi Maria Grazia (3), Bordignon Claudio (6),
Roncarolo Maria Grazia (1,6)
(2), Schena Francesca (3), Sauer Aisha Vanessa (1), Draghici Elena
(1), Catucci Marco (1), Aiuti Alessandro (1,5), Roncarolo Maria Grazia
(1,4), Naldini Luigi (1,4), Traggiai Elisabetta (3), Villa Anna (1,6)
(1) HSR-TIGET - Via Olgettina 58, 20132, Milan, Italy
(2) University of Rome Tor Vergata, Rome, Italy
(3) Dep. of Clinical Medicine, Prevention and Medical Biotechnology, Univ. of
Milano-Bicocca, Milan, Italy
(4) Dip. MISEMB, University of Siena, Siena, Italy
(5) Hadassah Univ. Hospital, Dep. of BMT and Pediatrics, Jerusalem, Israel
(6) Vita-Salute San Raffaele University, Milan, Italy
(7) Division of Hematology and BMT, Scientific Institute H San Raffaele, Milan, Italy
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
Sindrome di Wiskott-Aldrich (WAS) è una immunodeficienza Xlinked caratterizzata da trombocitopenia, eczema, infezioni ricorrenti, autoimmunità e linfomi. Il trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSC) da donatori HLA-identici è curativa, ma non disponibile per tutti i pazienti. La terapia basata sul trapianto di cellule staminali ematopoietiche autologhe geneticamente corrette potrebbe rappresentare un valido approccio alternativo. Abbiamo sviluppato un protocollo di terapia genica utilizzando un vettore lentivirale di terza generazione esprimente il cDNA umano di WASp sotto il controllo di un frammento di 1,6 kb del promotore autologo
(w1.6W). In passato, abbiamo dimostrato il recupero dell’ espressione WASP e la correzione funzionale delle cellule T nel modello
murino dei topi WAS knock out. Tuttavia, un aspetto ancora da indagare è la ricostituzione delle cellule B nei topi trattati con la terapia genica. A questo scopo, abbiamo trapiantato topi was-/ - dopo
irradiamento subletale (700 rad) con Lin- cellule wt , cellule Linnon tradotte provienti da midollo osseo di topi knock out e cellule
Lin- trasdotte con il vettore w1.6W lentivirale provenienti da midollo di topi was-/-. In primo luogo, abbiamo analizzato la ricostituzione delle cellule B nei diversi tessuti (midollo osseo, milza, sangue
periferico e cavità peritoneale). Cellule B esprimenti WASp erano
presenti in tutti i tessuti isolati da topi trattati con la terapia genica,
ma i più alti livelli sono stati individuati nella zona marginale della
milza e nelle cellule B della cavità peritoneale, suggerendo un vantaggio selettivo per cellule che esprimono WASp in queste sottopopolazioni. Per verificare la funzionalità delle cellule B, abbiamo testato in vivo con antigeni dello pneumococco (vaccino P23) i topi
trattati con terapia genica, in quanto pazienti WAS e topi mostrano
una ridotta risposta agli antigeni polisaccaridici. Abbiamo eseguito
la vaccinazione quattro mesi dopo la terapia genica, iniettando i.p.
0.5 microgr/topo di vaccino P23. Il siero è stato raccolto al settimo
giorno dopo il vaccino e gli anticorpi specifici IgM contro Ags P23
sono stati quantificati. I topi trattati con la terapia genica hanno
mostrato un miglioramento della risposta anticorpale rispetto ai topi
trapiantati con cellule non trasdotte, raggiungendo livelli paragonabili a topi trapiantati con cellule ottenute da midollo wt. Inoltre,
avendo trovato positività nei topi knock out di autoanticorpi contro
il DNA a doppio filamento (dsDNA) mediante test ELISA, abbiamo
valutato la presenza di tali anticorpi nei topi trattati con terapia genica. La terapia genica è stata in grado di correggere parzialmente
il fenotipo come dimostra la diminuita frequenza di topi positivi per
gli anticorpi anti-dsDNA. In conclusione, i nostri dati dimostrano
che il trasferimento del gene mediato da vettore lentivirale ripristina l’espressione di WASp nelle cellule B, normalizza la risposta agli
antigeni polisaccaridici e diminuisce i titoli di autoanticorpi. Queste
osservazioni contribuiscono alla validazione del nostro approccio di
terapia genica per i pazienti WAS.
L’immunodeficienza severa combinata da deficit di adenosin deaminasi
(ADA-SCID) è caratterizzata da compromissione dello sviluppo e delle
funzioni delle cellule T, B ed NK, e da manifestazioni sistemiche di tossicità metabolica. In assenza di un donatore familiare HLA-identico, il
trapianto da donatori alternativi è una procedura ad alto rischio, mentre la terapia enzimatica sostitutiva (ERT) spesso non riesce a sostenere una adeguata ricostituzione immunologica a lungo termine (Aiuti
et al., Immunol Res 2009; Cancrini et al., Haematologica 2010; Gaspar et al., Blood 2009). A partire dall’anno 2000, abbiamo messo in
atto un approccio di terapia genica basato sul trasferimento del gene
ADA in cellule staminali ematopoietiche (CSE) autologhe midollari utilizzando un vettore gammaretrovirale. I pazienti hanno ricevuto condizionamento con busulfano ad intensità ridotta e la ERT è stata sospesa
prima della terapia genica. Tre bambini sono stati trattati in studi pilota e 12 nel contesto di uno studio clinico di fase I/II che ha completato
l’arruolamento. Attualmente, tutti e 15 i pazienti trattati con questi
protocolli sono vivi (follow up mediano: 4.7 anni (range 2.3-10.2)), e
solo 2 pazienti hanno introdotto la ERT (Aiuti et al., N Engl J Med
2009; Cappelli et al., Immunol Allergy Clin. North Amer. 2010; Ferrua
et al., Curr Opin Allergy Clin Immunol 2010; e A. Aiuti, dati non pubblicati). Le cellule geneticamente corrette ADA+ sono state individuate
a lungo termine in diverse linee del midollo osseo e del sangue periferico dei pazienti, a livelli più alti nei linfociti, con conseguente efficiente
detossificazione metabolica purinica sistemica. Studi immunologici
hanno mostrato un incremento progressivo delle conte dei linfociti T e
normalizzazione delle loro funzioni in vitro, con risultante protezione
dalle infezioni severe. La maggior parte dei pazienti hanno interrotto o
ridotto la profilassi antimicrobica e le immunoglobuline sono state sospese in 8 pazienti. Studi combinati sul fenotipo, ciclo cellulare e lunghezza dei telomeri, indicano che l’espansione omeostatica dei linfociti
T contribuisce in modo sostanziale nelle prime fasi del processo di ricostituzione immunologica, in modo simile a quanto avviene nel trapianto di midollo osseo, e che la terapia genica non è associata a senescenza nel compartimento delle CSE (Selleri et al., sottomesso).
Quattro pazienti hanno presentato manifestazioni cliniche di autoimmunità, che sono state anche osservate in pazienti con forme di malattia lievi o trattati con ERT. Non sono stati osservati eventi avversi
correlati alla terapia genica, inclusa l’oncogenesi inserzionale, per un
lungo periodo di follow up. Questo è consistente con il pattern policlonale delle integrazioni del vettore e del repertorio delle cellule T, la
mancanza di deviazioni in vivo verso inserzioni potenzialmente pericolose e l’assenza di perturbazioni trascrizionali significative di proto oncogeni cellulari o alterazioni nel comportamento cellulare in cloni di
cellule T isolate dai pazienti (Aiuti et al., N Engl J Med 2009; Cassani
et al., Blood 2009; Biasco et al., EMBO Mol Med 2010). L’analisi della
distribuzione genomica dei vettori retrovirali in questi pazienti paragonata a quella osservata in coloro che hanno ricevuto infusioni di cellule
T mature trasdotte ha mostrato come le inserzioni del vettore siano
associate a regioni trascrizionalmente attive e si localizzino in base alle
condizioni genetiche e cromatiniche specifiche delle cellule bersaglio in
vitro, e la distribuzione in vivo sembra rispecchiare direttamente queste preferenze senza particolari deviazioni (Biasco et al., EMBO Mol
Med 2010). Riassumendo, la terapia genica con CSE per l’ADA-SCID
ha un favorevole profilo rischio-beneficio ed è efficace nel restaurare
normali funzioni immunologiche e metabolismo purinico.
ABSTRACT N. 21
HSR- TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 2
HSR- TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY - Other Genetic Diseases
VILLA ANNA
Totale
303.140
Telethon grant N.
Num Centri: 2
TGT06F02
652.918
Durata (anni): 5
Anno d’inizio: 2006
Aiuti Alessandro (1,2), Scaramuzza Samantha (1), Ferrua Francesca (3), Bosticardo Marita (1), Castiello Maria Carmina (1), Biasco
Luca (1), Ripamonti Anna (1), Radrizzani Marina (4), Salomoni Monica (4), Casiraghi Miriam (3), Evangelio Costanza (3), Cicalese Maria Pia (3), Finocchi Andrea (2), Biffi Alessandra (1,3), Ciceri Fabio
(5), Naldini Luigi (1,6), Villa Anna (1,7), Roncarolo Maria Grazia
(1,6)
TGT06A02
Durata (anni): 5
RONCAROLO MARIA GRAZIA
SVILUPPO DI UN PROTOCOLLO DI TERAPIA GENICA BASATA
SULL’UTILIZZO DI CELLULE CD34+ TRASDOTTE CON VETTORI LENTIVIRALI PER IL TRATTAMENTO DELLA SINDROME DI
WISKOTT-ALDRICH
ABSTRACT N. 20
Responsabile
HSR-TIGET - Via Olgettina 58, Milan, Italy; tel 0226435273; fax 0226434668
Department of Pathology Brescia; Italy
Laboratory of Immunology and Rheumatic Disease IGG , Genoa Italy
Università Vita-Salute San Raffaele, Milan, Italy
University of Rome “Tor Vergata”, Rome Italy
CNR, ITB Segrate Milano
Anno d’inizio: 2006
SINDROME DI WISKOTT-ALDRICH: CARATTERIZZAZIONE
DEI DIFETTI IMMUNOLOGICI E STUDI PRECLINICI DI TERAPIA GENICA
(1) HSR-TIGET - Via Olgettina, 58, 20132, Milan, Italy
(2) University of Rome “Tor Vergata”, Rome, Italy
Bosticardo Marita (1), Castiello Maria Carmina (1), Poliani Luigi Pietro
40
033-132 Abstract-11_ITA.qxd:telethon 021-234 Abstract
21-02-2011
15:54
Pagina 41
HSR-TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY
(3) Pediatric Immunohematology and Bone Marrow Transplant Unit, Scientific
Institute HS Raffaele, Milan, Italy
(4) MolMed SpA, Milan, Italy
(5) Division of Hematology , Scientific Institute HS Raffaele, Milan, Italy
(6) Vita-Salute San Raffaele University, Milan, Italy
(7) IRGB-CNR, Milano, Italy
(6) Institute for Research in Biomedicine,Bellinzona, Switzerland
(7) Dipartimento di Biologia e Genetica per le Scienze Mediche
La sindrome di Omenn è una immunodeficienza combinata ad esordio precoce caratterizzata da eritrodermia, alopecia, linfoadenopatia
e diarrea intrattabile. Gli esami di laboratorio indicano un aumento
del numero di linfociti T autologhi, assenza di linfociti B circolanti,
bassissimo livello di immunoglobuline con la notevole eccezione delle IgE che spesso sono aumentate. I linfociti T hanno un fenotipo di
memoria attivato con un repertorio molto limitato di cellule T che
infiltrano organi bersaglio con conseguente danno tissutale. In passato, abbiamo dimostrato che mutazioni nei geni RAG che diminuiscono ma non aboliscono il processo di ricombinazione VDJ sono
causa di malattia. Per comprendere meglio la basi fisiopatologiche
di questa malattia, abbiamo recentemente generato un modello di
topo knock-in che porta una mutazione missenso, R229Q, nel gene
RAG2. I topi RAG2 R229Q/R229Q costituiscono un buon modello in
quanto ricapitolano molti segni clinici della malattia.. Infatti a partire da tre mesi di età, sviluppano alopecia, eritrodermia, colite a
cause di un massivo infiltrato di linfociti T ed eosinofili (Marrella et
al, 2007). Abbiamo dimostrato che questo modello può essere considerato uno strumento utile per studiare in dettaglio la patogenesi
dell’autoimmunità che caratterizza particolare immunodeficienza. In
particolare, abbiamo esaminato il possibile ruolo finora non esplorato dei linfociti B nella patogenesi della malattia. Qui, noi dimostriamo la presenza di plasmacellule nei linfonodi di pazienti OS, in cui
non vi sono linfociti B circolanti. Il modello murino presenta al di là
del grave arresto dello sviluppo delle cellule B, la presenza di cellule
secernenti immunoglobuline (ISC). La elevata presenza di ISC ben
correla con l’aumentata espressione di Blimp1 e Xbp1 e con gli elevati livelli di cellule T attivate indotte un alterato ambiente citochinico. La rilevazione di autoanticorpi patogeni ad alta affinità verso gli
organi bersaglio e gli elevati livelli di BAFF indicano un’alterata selezione dei linfociti B. Infatti il blocco dell’asse BAFF-BAFFR mediante
un anticorpo diretto contro il recettore di BAFF migliora il danno
tessutale e diminuisce in modo importante i livelli di autoanticorpi.
In conclusione i nostri dati indicano un ruolo cruciale dei linfociti B
nella patogenesi dell’autoimmunità della sindrome di Omenn.
La sindrome di Wiskott-Aldrich Syndrome (WAS) è un’immunodeficienza ereditaria, legata al cromosoma X, caratterizzata da trombocitopenia, infezioni ricorrenti, autoimmunità e un maggior rischio di
sviluppare tumori, in particolare linfomi. La terapia genica basata
sul trapianto di cellule staminali/progenitrici ematopoietiche autologhe trasdotte rappresenta una valida alternativa al trapianto allogenico, in mancanza di un donatore HLA-identico o per quei pazienti
ad alto rischio di complicazioni.
Abbiamo dimostrato precedentemente che il vettore lentivirale codificante per il gene was umano sotto il controllo del promotore endogeno, è in grado di correggere efficacemente cellule umane e murine. Si è quindi sviluppato e validato un protocollo di trasduzione di
CD34+ derivate da midollo (BM) o sangue periferico mobilizzato
(MPB) usando un vettore, purificato ed adatto all’uso clinico. Usando un protocollo che prevede 60 ore di coltura e due cicli di esposizione al vettore, con una molteplicità di infezione pari a 100 per
ogni ciclo, si sono ottenuti buoni livelli di trasduzione sia nei donatori sani (57.8 ± 16.1%, con un numero di integrazioni (VCN) per
cellula di 0.64 ± 0.31), sia nei pazienti WAS (82.1 ± 10.2, VCN per
cellula di 1.44 ± 0.48), senza segni evidenti di tossicità. Le CD34+
derivate dal paziente, trasdotte e differenziate in vitro in megacariociti, mostrano una normale espressione della proteina WASp. Per
studiare la capacità di biodistribuzione delle cellule umane trasdotte, ed escludere il rilascio del vettore in vivo, queste cellule sono
state trapiantate in topi immunodeficienti. I nostri risultati indicano
che tali cellule sono in grado di attecchire e differenziarsi normalmente nei diversi organi ematopoietici, dando origine a cellule
linfoidi e mieloidi trasdotte. La mobilizzazione del vettore lentivirale
e la sua trasmissione alla linea germinale dell’ospite, sono state
escluse usando approcci differenti. L’analisi delle cellule cresciute in
vitro e attecchite in vivo, mostrano uno spettro dei siti di integrazione del vettore policlonale, con integrazioni uguali presenti in differenti linee cellulari ematopoietiche.
Sulla basi dei dati preclinici, nell’Aprile del 2010 è iniziato un protocollo clinico di terapia genica per valutare la sicurezza e l’efficacia di
questo approccio in 6 pazienti WAS.
I pazienti riceveranno un precondizionamento con l’anticorpo monoclonale anti-CD20, busulfano a dosi ridotte e fludarabina; l’ATG sarà
incluso nel trattamento in caso di manifestazioni di carattere autoimmune. Il primo paziente è stato trattato recentemente con cellule CD34+ purificate sia da BM, sia da MPB e trasdotte con alta efficienza (88-92 % di traduzione nei progenitori clonogenici, per BM
e MPB rispettivamente) e con una VCN per cellula di 1.4 nel BM e
1.9 nel MPB. Il paziente ha ben tollerato il condizionamento, non
mostrando sintomi di tossicità e recuperando bene da una neutropenia transiente. Attualmente, 6 mesi dopo la terapia genica, è indipendente da trasfusioni di piastrine. Le analisi iniziali mostrano la
presenza del vettore, con espressione della proteina, in più linee
cellulari, sia a livello del sangue periferico che del midollo. Gli studi
a lungo termine forniranno informazioni chiave sulla sicurezza e
l’efficacia della terapia genica basata sull’uso di vettori lentivirali in
combinazione con un condizionamento a basso dosaggio, nel trattamento dei pazienti WAS.
ABSTRACT N. 23
HSR- TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 1
La sindrome da Immunodisregolazione, Poliendocrinopatia, Enteropatia, legata al cromosoma X (IPEX), è una malattia genetica causata da mutazioni del gene FOXP3, fattore di trascrizione essenziale
per lo sviluppo e la funzione delle cellule T regolatorie CD4+CD25+
(nTreg). Tali cellule svolgono un ruolo centrale nel controllo delle risposti immuni ad antigeni autologhi, allergeni e antigeni tumorali.
Nei pazienti IPEX la mancanza di nTreg funzionanti causa una precoce sintomatologia sistemica autoimmune spesso fatale. Attualmente le possibilità terapeutiche per questi pazienti sono limitate.
La maggior parte di essi viene sottoposta ad immunosoppressione
farmacologica, con benefici solo parziali. Il trapianto di cellule staminali emopoietiche è, ad oggi, l’unica cura definitiva, tuttavia è disponibile solo per un numero limitato di pazienti. Tuttavia, una piccola percentuale di cellule Treg funzionanti periferiche è sufficiente
per mantenere sotto controllo la patologia, come abbiamo dimostrato studiando pazienti chimerici post-trapianto e le madri portatrici. Quindi, una possibile strategia terapeutica alternativa al trapianto, per il ripristino della tolleranza in questa patologia, consisterebbe nella generazione in vitro di cellule nTreg mediante il trasferimento genico del gene FOXP3 con vettori lenti virali e la loro successiva infusione nei pazienti IPEX. Abbiamo precedentemente di-
VILLA ANNA
351.200
Anno d’inizio: 2006
(1) HSR-TIGET - Via Olgettina 58, 20134, Milan, Italy; email: [email protected], 0226434669
(2) Vita-Salute San Raffaele University, Milan, Italy
TGT06A04
Durata (anni): 4
321.867
Durata (anni): 5
Passerini Laura (1), Fousteri Georgia (1), Amendola Mario (1), Joffre Tatiana (1), Rossi-Mel Eva (1), Naldini Luigi (1,2), Roncarolo
Maria Grazia (1,2), Bacchetta Rosa (1)
HSR- TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY - Other Genetic Diseases
Telethon grant N.
TGT06A03
TRASFERIMENTO CELLULARE E GENETICO NELLA IPEX: IL
TRASFERIMENTO GENICO DI FOXP3 MEDIATO DA VETTORI
LENTIVIRALI IN CELLULE T ISOLATE DA PAZIENTI AFFETTI
DA SINDROME DI IPEX GENERA CELLULE T REGOLATORIE
CON ELEVATA ATTIVITÀ SOPPRESSIVA
ABSTRACT N. 22
Responsabile
BACCHETTA ROSA
Anno d’inizio: 2007
STUDIO DI ASPETTI BIOLOGICI E GENETICI NELLA SINDROME DI OMENN
Marrella Veronica (1,2), Cassani Barbara (3), Poliani Pietro Luigi
(4), Sauer Aisha Vanessa (1), Schena Francesca (5), Facchetti Fabio (2), Grassi Fabio (6,7), Traggiai Elisabetta (5), Villa Anna (3,4)
(1) HSR-TIGET - Via Olgettina 58, Milan, Italy; telefono 0226435273, fax
0226434660, [email protected]
(2) CNR-ITB, Segrate
(3) Fondazione Humanitas per la Ricerca, Rozzano
(4) Department of Pathology, Brescia
(5) Laboratory of Immunology and Rheumatic Disease,IGG, Genoa
41
033-132 Abstract-11_ITA.qxd:telethon 021-234 Abstract
21-02-2011
15:54
Pagina 42
HSR-TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY
mostrato che la trasduzione di FOXP3 in cellule T CD4+ genera una
popolazione omogenea di cellule Treg che può essere espansa in vitro. Abbiamo quindi utilizzato questo protocollo sperimentale per
valutare la possibilità di trasferire il gene FOXP3 in cellule CD4+
isolate da pazienti affetti da IPEX con diverse mutazioni di FOXP3. I
nostri risultati dimostrano che nelle cellule CD4+ di vari pazienti
con diverse mutazioni è possibile ottenere una sovra-espressione
elevata e stabile di FOXP3 ectopico. Quindi le cellule T effettrici così
trasdotte vengono convertite in cellule T regolatorie con attività
soppressiva in vitro. Risultati preliminari indicano inoltre che le cellule trasdotte con LV-FOXP3 inibiscono le risposte effettrici in vivo
in un modello xenogenico di malattia del trapianto contro l’ospite
(xeno-GvHD). Questi risultati dimostrano che è possibile conferire
attività soppressiva alle cellule T mediante trasferimento genico di
FOXP3, anche in presenza di mutazioni del gene nelle cellule riceventi, come in quelle isolate da pazienti IPEX. Questi risultati preludono quindi allo sviluppo di una terapia genica per il trattamento
dei pazienti affetti da IPEX.
per esempio CD25, CTLA4 e Stat-5. In due pazienti IPEX-like abbiamo identificato mutazioni del gene CD25 (c.497 G>A and c.452
A>G) e abbiamo dimostrato che il difetto genetico di CD25 causa
un’immunodeficienza con disregolazione, in cui una marcata espansione delle cellule CD8+ conduce al danno tessutale autoimmune,
nonostante le cellule nTregs siano presenti. Tuttavia, l’introduzione
dell’analisi della demetilazione di FOXP3 (TSDR) ha permesso di
identificare nella maggior parte dei pazienti IPEX-like un difetto
quantitativo delle cellule nTregs indicativo di un difetto di tolleranza
periferica anche in questi pazienti.
I risultati ottenuti da questa ricerca hanno quindi fornito importanti
informazioni sui meccanismi di immunoregolazione e sulla diagnosi
degli stessi, e saranno di beneficio per pazienti affetti da IPEX o da
altre patologie autoimmuni.
ABSTRACT N. 25
HSR- TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY - Other Genetic Diseases
Responsabile
ABSTRACT N. 24
Telethon grant N.
Totale
Progetti di Ricerca - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 5
Num Centri: 1
BACCHETTA ROSA
GGP07241
539.700
Durata (anni): 3
FERRARI GIULIANA
TGT06C01
1.088.810
Durata (anni): 5
Anno d’inizio: 2006
VALUTAZIONE PRECLINICA DI UN APPROCCIO DI TERAPIA
GENICA PER LA BETA TALASSEMIA
Anno d’inizio: 2007
Frittoli Marta Claudia (1,8), Lidonnici Maria Rosa (1), Roselli Emanuela Anna (1), Mezzadra Riccardo (1), Rossi Claudia (1), Tiboni
Francesca (1), Mandelli Giacomo (1), Mavilio Fulvio (2,3), Grande
Alexis (2), Amato Antonio (4), Tonon Giovanni (5), Cappellini Maria
Domenica (6), Andreani Marco (7), Lucarelli Guido (7), Roncarolo
Maria Grazia (1,8,9), Marktel Sarah (8), Ferrari Giuliana (1,9)
DALLA MUTAZIONE DI FOXP3 ALLA SINDROME DA IMMUNODISFUNZIONE POLIENDOCRINOPATIA ENTEROPATIA LEGATA ALL’X (IPEX): AGGIORNAMENTO DAL GRUPPO ITALIANO
DI STUDIO PER LA MALATTIA.
Gambineri Eleonora (2), Perroni Lucia (3), Tommasini Alberto (4),
Badolato Raffaele (5), Cecconi Massimiliano (3), Ciullini-Mannuriti
Sara (2), Vignoli Marina (2), Valencic Elena (4), Gasparin Chiara
(4), Passerini Laura (1), Di Nunzio Sara (1), Aydin Didem (1), Barzaghi Federica (1), Olek Sven (7), Roncarolo Maria-Grazia (1,6),
Bacchetta Rosa (1)
(1) HSR-TIGET - Via Olgettina 58, 20132, Milan, Italy
(2) Dept of Biomedical Sciences, Univ. of Modena and Reggio Emilia, Modena
(3) San Raffaele Scientific Institute, Gene expression Unit, Milan
(4) Associazione Nazionale Microcitemie Italia (ANMI ONLUS), Centro Studi Microcitemie, Rome
(5) Functional Genomic of Cancer Unit, Division of Molecular Oncology, San
Raffaele Scientific Institute, Milan
(6) Policlinico, Mangiagalli, Regina Elena Foundation IRCCS, University of Milan, Milan
(7) International Center for Transplantation in Thalassemia and Sickle-Cell
Anemia, Mediterranean Institute of Haematology, Policlinic of Tor Vergata
University, Rome
(8) Pediatric Immunohematology and Bone Marrow Transplantation Unit, San
Raffaele Scientific Institute, Milan
(9) Vita-Salute San Raffaele University, Milan
(1) HSR-TIGET - Via Olgettina 58, 20134, Milan, Italy; [email protected],
0226434669
(2) University of Florence, Department of Sciences for Woman and Child’s
Health, Florence
(3) Human Genetics Lab, Ospedali Galliera, Genoa
(4) IRCCS Burlo Garofalo, Pediatric Immunology Lab, Trieste
(5) Institute of Molecular Medicine “Angelo Nocivelli”, University of Brescia
(6) Vita-Salute San Raffaele University, Milan
(7) Epiontis GmbH, Berlin, Germany
La sindrome da Immunodisregolazione, Poliendocrinopatia, Enteropatia, legata al cromosoma X (IPEX), è una malattia genetica autoimmune causata da mutazioni di FOXP3, gene chiave per le cellule T regolatorie timiche (nTregs). La malattia è caratterizzata da
manifestazioni autoimmuni multiple ad esordio precoce. Gli obiettivi
del Gruppo Italiano di Studio per IPEX (www.ipexconsortium.org)
sono: a) comprendere come il difetto genetico conduce alla malattia, b) studiare i meccanismi immunologici responsabili dell’autoimmunità, c) definire nuove linee terapeutiche. Ad oggi, sono stati
analizzati per la mutazione di FOXP3, 85 soggetti con manifestazioni cliniche di IPEX, 19 dei quali presentavano mutazioni, tra cui 7
non precedentemente descritte. L’enteropatia grave, generalmente
associata ad endocrinopatia ed eczema, è presente in tutti i pazienti
spesso come primo sintomo. Un genotipo simile non sempre determina lo stesso fenotipo e l’espressione della proteina non correla
con la gravità della malattia. Pertanto, l’analisi genetica di FOXP3 è
necessaria e dirimente per la diagnosi. Come abbiamo inizialmente
dimostrato, le cellule nTregs hanno una funzione alterata, mentre
altri tipi di cellule T regolatorie sono normali. Recentemente è stato
ipotizzato che il gene FOXP3 svolga una funzione anche nelle cellule
T effettrici (Teff), suggerendo la possibilità che la mancata funzione
regolatoria non sia l’unico movente patogenetico in IPEX. Noi abbiamo dimostrato un’elevata frequenza di cellule Th17 nei pazienti
IPEX. Inoltre, le cellule FOXP3mut co-esprimevano markers di
membrana propri delle cellule Th17 e i cloni nTregsmut producevano IL-17 in presenza di citochine infiammatorie, quali quelle presenti nel siero dei pazienti. Quindi, mutazioni di FOXP3 si associano
ad espansione delle cellule Th17 per diretto contributo delle cellule
nTregsmut che convertono in Th17 patogeniche.
Nei pazienti, chiamati IPEX-like, con sintomatologia tipica di IPEX
ma senza mutazioni di FOXP3, abbiamo esteso l’analisi genetica a
geni che codificano per molecole essenziali per la funzione e il mantenimento delle cellule Tregs, come
Le talassemie sono tra le patologie monogeniche più diffuse al mondo. Attualmente l’unica cura definitiva è il trapianto allogenico di
midollo osseo, che è però limitato ad una minoranza di pazienti con
un donatore compatibile. Il trapianto di cellule staminali ematopoietiche (CSE) autologhe, corrette geneticamente con il gene della beta-globina, offre il vantaggio di poter curare virtualmente tutti i pazienti. Per proporre un’applicazione clinica, sono necessari studi
preclinici di efficacia e sicurezza in cellule umane.
Recentemente abbiamo sviluppato un nuovo vettore lentivirale
(VL), GLOBE, in grado di correggere il fenotipo talassemico in modelli preclinici murini (Miccio et al., 2008). L’efficacia del vettore è
stata poi valutata in cellule CD34+ di pazienti talassemici. I risultati
mostrano la correzione dei parametri legati al fenotipo di malattia,
quali la sintesi di HbA e l’eritropoiesi inefficace. Il vettore GLOBE è
in grado di trasdurre efficientemente cellule CD34+ garantendo livelli fisiologici di HbA nella progenie eritroide ad un basso numero
di copie per cellula. Il rapporto tra catene alpha /beta è assimilabile
a quello di un portatore sano, suggerendo che il trasferimento genico con GLOBE può garantire un’espressione del transgene a livelli
terapeutici. Per valutare il rischio di genotossicità, abbiamo mappato i siti d’integrazione di GLOBE in cellule CD34+, trovando una
preferenza per le regioni intrageniche, senza prevalenza d’integrazione in protoncogeni, in geni oncosoppressori o correlati al ciclo
cellulare (Roselli et al., 2010).
Nella terapia genica delle malattie ereditarie del sistema ematopoietico, la bassa frequenza e la natura quiescente delle CSE costituiscono i maggiori ostacoli per il successo terapeutico. I transgeni
che non conferiscono un vantaggio selettivo intrinseco alle CSE devono essere associati a un marcatore di selezione. Una possibile
strategia è l’utilizzo di geni per recettori di fattori di crescita, che
conferiscono un vantaggio selettivo ligando-dipendente alle cellule
trasdotte. Abbiamo dimostrato che una forma tronca del recettore
per l’eritropoietina (tEpoR) può fornire un vantaggio competitivo al-
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HSR-TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY
le CSE dopo trapianto in modelli murini, promuovendo un’espansione in vivo delle CSE trasdotte rispetto a quelle non trasdotte. Inoltre, dati ottenuti con cellule CD34+ da sangue di cordone ombelicale, indicano che il tEpoR è in grado di proteggere le cellule da apoptosi indotta da deprivazione di citochine. Il profilo dell’espressione
genica, valutata con studi di microarray, ha identificato uno specifico gruppo di trascritti up- o down- regolati in cellule esprimenti il
tEpoR, tra cui geni coinvolti nel controllo dell’apoptosi.
L’ipotesi che tEpoR possa favorire l’attecchimento delle cellule trasdotte, favorendo la loro sopravvivenza in vivo, piuttosto che indurre un’espansione proliferativa, potrebbe avere importanti implicazioni per la bio-sicurezza nell’ambito della terapia genica.
CCR5 e un aumento nei marker istonici di trascrizione/elongazione
pre-esistenti in AAVS1. In conclusione, con questo studio abbiamo
definito le caratteristiche essenziali del locus e della cassetta di
espressione che permettono di ottenere una integrazione sito-specifica sicura ed efficace in cellule umane primarie.
ABSTRACT N. 27
HSR- TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
ABSTRACT N. 26
Num Centri: 1
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
NALDINI LUIGI
TGT06D01
906.204
Durata (anni): 5
595.769
Durata (anni): 5
Anno d’inizio: 2006
Gentner Bernhard (1,2), Montini Eugenio (1), Giustacchini Alice
(1,2), Boccalatte Francesco (1,2), Saini Massimo (1,2), Merella Stefania (1), Benedicenti Fabrizio (1), Plati Tiziana (1,2), Aiuti Alessandro (1,2,3), Biffi Alessandra (1,2), Naldini Luigi (1,2)
Anno d’inizio: 2006
COMPRENDERE E MIGLIORARE LA SICUREZZA DEL TRASFERIMENTO GENICO UTILIZZANDO MODELLI MURINI PREDISPOSTI ALLO SVILUPPO DI TUMORI E SVILUPPANDO STRUMENTI PER L’INTEGRAZIONE SITO-SPECIFICA
(1) HSR-TIGET - Via Olgettina 58, 20132, Milan, Italy; tel. 0226434680
(2) Vita Salute San Raffaele University, Milan, Italy
(3) Department of Pediatrics, Children’s Hospital Bambino Gesù and University
of Rome Tor Vergata School of Medicine, Rome, Italy
Lombardo Angelo (1,2), Cesana Daniela (1), Ranzani Marco (1,2),
Genovese Pietro (1,2), Bartholomä Cynthia (3), Volpin Monica (1,2),
Merella Stefania (1), Benedicenti Fabrizio (1), Di Stefano Bruno (4),
Provasi Elena (2,5), Colombo Daniele (1,2), Neri Margherita (1,2),
Magnani Zulma (5), Holmes Michael (6), Gregory Philip (6), Broccoli
Vania (4), Sanvito Francesca (7), Ponzoni Maurilio (7), Doglioni Claudio (7), von Kalle Christof (3), Schmidt Manfred (3), Bonini Chiara
(5), Gritti Angela (1), Montini Eugenio (1), Naldini Luigi (1,2)
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
(7)
TGT06D02
MIGLIORAMENTO DELL’EFFICACIA DEL TRASFERIMENTO GENETICO NELLE CELLULE STAMINALI EMATOPOIETICHE
HSR- TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY
Responsabile
NALDINI LUIGI
Il successo della terapia genica è fondato su robusta espressione del
transgene, assenza di espressione ectopica o non fisiologica e l’utilizzo di vettori non-genotossici. Abbiamo identificato un gruppo di
microRNA (miR-126, miR-130a e altri) specifici per le cellule staminali e progenitrici ematopoietiche. Nel corso del differenziamento, il
livello di questi microRNA cala rapidamente. Abbiamo disegnato sequenze bersaglio per questi microRNA le quali, quando aggiunte alle
3’UTR di un transgene, ne inibiscono l’espressione nelle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche, mentre la permettono nella loro
progenie differenziata. L’aggiunta della sequenza bersaglio di miR126 al transgene timidina cinasi (TK) protegge le cellule staminali
ematopoietiche dal suicidio in vivo indotto da somministrazione di
ganciclovir, mentre le cellule staminali ematopoietiche trasdotte con
un vettore TK di controllo vengono rapidamente uccise (p<0.001).
Stiamo attualmente sfruttando la sequenza bersaglio di miR-126 per
regolare l’espressione di transgeni terapeutici per la leucodistrofia
globoide e la granulomatosi cronica legata all’X, con lo scopo di rendere più sicura la terapia genica basata su cellule staminali ematopoietiche, prevenendo la tossicità del transgene a livello delle staminali . Abbiamo inoltre dimostrato che questi nuovi vettori non interferiscono con la funzione fisiologica di miR-126. Per studiare la genotossicità dei vettori lentivirali, abbiamo eseguito un’analisi dei siti
d’integrazione dei vettori lentivirali in cellule staminali ematopoietiche trapiantate in topi immunodeficienti e abbiamo trovato gli stessi
siti comuni d’integrazione (CIS) riportati in cellule di pazienti da un
recente trial clinico per l’adrenoleucodistrofia (ALD). Sorprendentemente, la maggior parte dei CIS del nostro modello sperimentale e
dei pazienti ALD sono raggruppate in ampie regioni cromo somali di
qualche milione di basi, in cui si ha alta densità di integrazioni lentivirali. Al contrario, le integrazioni in CIS associate allo sviluppo di tumori in studi precedenti con vettori gammaretrovirali, sono sempre
mirate su geni singoli e contenute in stretti intervalli genomici. Queste scoperte implicano che i CIS dei vettori lentivirali sono prodotti
da una preferenza d’integrazione verso specifiche regioni genomiche
e non indicano una selezione oncogenetica.
HSR-TIGET - Via Olgettina, 58, 20132, Milan, Italy
Vita-Salute San Raffaele University, Milan, Italy
NCT-Heidelberg, National Center for Tumor Diseases, Heidelberg, Germany
Stem Cell and Neurogenesis Unit, San Raffaele Institute, Milan, Italy
Experimental Hematology Unit, San Raffaele Institute, Milan, Italy
Sangamo BioSciences Inc., CA, USA
Dept. of Pathology San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy
Per identificate i possibili effetti genotossici dovuti a integrazioni di
vettori abbiamo sviluppato e validato un saggio di genotossicità in
vivo basato sulla misurazione del tempo richiesto per lo sviluppo di
tumori dopo trapianto con cellule staminali ematopoietiche (CSE) di
topi proni allo sviluppo di tumori Cdkn2a-/- e trasdotte con un vettore. Per aumentare la sensibilità di questo modello e renderlo atto
ad identificare mutazioni genotossiche subdole abbiamo sviluppato
due approcci basati sull’iniezione diretta di vettore in topi Cdkn2a-/o topi eterozigoti per la stessa mutazione. Con questi due approcci
è stato possibile misurare la genotossicita residua di un SIN LV con
un forte enhancer/promoter in posizione interna, il quale era invece
neutrale nel saggio di trapianto basato su CSE e stabilito un nuovo
saggio di genotossicità per versioni migliorate di SIN LVs. L’integrazione sito-specifica può superare i limiti delle attuali strategie di
trasferimento genico, i.e. la mutagenesi inserzionale e l’espressione
incontrollata del transgene. Tuttavia, l’identificazione di un sito appropriato all’integrazione e l’interazione tra il transgene e il sito di
inserzione non sono stati finora studiati. Abbiamo quindi valutato
l’impatto trascrizionale/epigenetico che diverse cassette di espressione per un transgene hanno sul gene CCR5 o sul locus AAVS1.
Utilizzando le zinc finger nucleasi abbiamo inserito queste cassette
in entrambi i siti genici con alta efficienza in cellule primarie umane,
inclusi linfociti T, NSC e IPSC. L’espressione del transgene è stata
sempre più alta dal locus AAVS1. In seguito, abbiamo misurato il livello di espressione dei 26 geni fiancheggianti i due siti di inserzione scoprendo che la up-regolazione trascrizionale causata dalle cassette dipende dal sito studiato, ed era assente in AAVS1. Dato che
l’integrazione delle cassette in AAVS1 avviene nell’introne 1 del gene PPP1R12C e con lo stesso orientamento trascrizionale, abbiamo
valutato se la presenza di nuovi elementi trascrizionali attivi in cis
interferisse con la trascrizione di PPP1R12C. Infatti, l’analisi di cloni
cellulari contenenti l’inserzione in entrambi gli alleli ha rivelato che
la trascrizione di PPP1R12C era diminuita a causa dalla presenza di
siti accettori di splicing (SA) in alcune delle cassette studiate. Eliminando questi siti o inserendo le cassette in orientamento opposto
ha permesso di ottenere un’alta espressione del transgene mantenendo però normale l’espressione di PPP1R12C. Infine, l’analisi epigenetica dei loci, prima e dopo l’integrazione bi-allelica delle cassette, ha mostrato una diminuzione nei marker istonici repressivi nel
ABSTRACT N. 28
HSR- TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 2
NALDINI LUIGI
TGT06D03
433.306
Durata (anni): 5
Anno d’inizio: 2006
PARZIALE GUARIGIONE DALL’EMOFILIA B IN CANI AFFETTI
DALLA PATOLOGIA IN SEGUITO A SOMMINISTRAZIONE DI
UN VETTORE LENTIVIRALE REGOLATO DA microRNA
Cantore Alessio (1), Ranzani Marco (1), Damo Martina (1), Sergi
Sergi Lucia (1), Vallanti Giuliana (2), Radrizzani Marina (2), Brown
Brian (3), Nichols Timothy (4), Montini Eugenio (1), Naldini Luigi (1)
(1) HSR-TIGET - Via Olgettina 58, 20132, Milan, Italy
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HSR-TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY
LV. Infatti, la co-cultura di my-DC con p-DC, esposte a LV, induce
la piena attivazione delle my-DC, analogamente a ciò che accade
per una tipica risposta anti-virale (Rossetti M. et al. Hum Gene
Ther. 2010). Inoltre, abbiamo studiato l’induzione di tolleranza Tgspecifica inducendo l’espressione IL-10 in DC. Dati preliminari indicano che la traduzione con LV-IL-10 di cellule CD34+ durante il differenziamento in DC, può essere utilizzato per generare DC con
proprietà tollerogeniche. Alternativamente, per generare tolleranza
Tg-specifica in protocolli di terapia genica diretta al fegato, sono
stati sviluppati LV miR142-regolati (LV.142T) (Brown BD et al. Nature Med 12, 585-91, 2006; Brown BD et al. Blood 110, 4144-52,
2007). I nostri studi dimostrano che l’inibizione dell’espressione del
Tg in APC non abolisce la risposta cellulare, ma ne altera le caratteristiche, provocando una rapida contrazione della risposta cellulare
Tg-specifica, e l’induzione di cellule T regolatorie (Tregs) Tg-specifiche (Annoni A et al. Blood. 114, 5152-61, 2009). Per ridurre il rischio di mutagenesi dovuta all’integrazione, e per ampliarne le possibili applicazioni di questi LV, abbiamo valutato l’utilizzo di LV integrasi-deficienti (IDLV). IDLV.142T generano un basso livello di
espressione del transgene a derivante dal genoma provirale che
transitoriamente si accumula nelle cellule trasdotte. Abbiamo poi
esaminato se la piattaforma IDLV mantiene la capacità di generare
tolleranza ad un antigene (Ag) specifico come la controparte integrasi-competente. I risultati hanno indicato che la risposta secondaria all’Ag codificato non può essere indotta nei topi trattati
IDLV.142T come accade in topi iniettati con IDLV in assenza della
regolazione miR-142. Inoltre, abbiamo potuto rilevare induzione
Tregs Ag-specifiche trasferendo cellule T CD4+ OTII-FOXP3GFP
(TCR specifico un epitopo dell’ovalbumina presentato IAB (OVA)) in
topi che avevano ricevuto IDLV.Ova 142T.
Questi dati dimostrano che l’espressione del transgene indotta da
IDLV.142T può indurre tolleranza all’Ag-codificato come dimostrato
con LV integranti. Questa importante e inaspettata caratteristica
candida IDLV per sviluppo di nuove strategie immunomodulatorie
per individui sottoposti somministrazione sistemica di particolari enzimi di cui sono deficienti o per evitare l’insorgenza di malattie autoimmuni in soggetti a rischio.
(2) MolMed, Milano, Italy
(3) Mount Sinai School of Medicine, New York, USA
(4) University of North Carolina, Chapel Hill, USA
La terapia genica da tempo rappresenta una promessa di cura per i
pazienti affetti da emofilia. Tuttavia, nonostante i successi ottenuti
in modelli preclinici, nessuna strategia di terapia genica ha finora ottenuto benefici clinici definitivi. Il nostro gruppo ha ottenuto la completa e duratura guarigione dall’emofilia B nel modello murino della
patologia, in seguito a una singola somministrazione di un vettore
lentivirale (VL) regolato da microRNA. Ora abbiamo valutato questa
strategia di terapia genica in cani affetti da emofilia B, un modello
animale di malattia spontaneo. Abbiamo prodotto su larga scala VL
altamente purificato, utilizzando strutture certificate per uso clinico.
Abbiamo infuso 1,5x1010 unità integranti di VL nella vena porta di
un cane emofilico di 8 mesi di 20 Kg tramite un piccolo intervento
chirurgico. L’infusione è stata ben tollerata e priva di conseguenze,
se non una lieve tossicità epatica risoltasi spontaneamente dopo
qualche giorno. Ad oggi il cane è vivo e in salute (1,5 anni di osservazione). Il tempo di coagulazione del sangue risulta stabilmente accorciato e il cane è privo di anticorpi contro il fattore IX della coagulazione (FIX). Da una misurazione quantitativa del FIX è risultato
che il cane possiede circa lo 0,2% dei livelli normali di FIX. Nel tentativo di aumentare questi livelli, abbiamo programmato di iniettare
altri cani a dosi superiori e/o con vettori migliorati. Abbiamo infatti
valutato una serie di modifiche alla nostra strategia terapeutica al fine di aumentarne l’efficacia. Ad esempio l’utilizzo di un transgene
ottimizzato nei codoni oppure una singola somministrazione di inibitore del proteasoma prima della somministrazione del VL sono risultati entrambi indipendentemente in un aumento sostanziale della efficacia del VL a parità di dose infusa nel modello murino di malattia.
Al fine di valutare la biosicurezza dell’integrazione di VL nel fegato
abbiamo somministrato VL in topi neonati proni a sviluppare tumori
a causa della delezione genetica di Cdkn2a oppure dell’esposizione a
insulto epatico cronico. Il trattamento con un VL genotossico induce
carcinoma epatocellulare (CEC) nel 30% dei topi Cdkn2a-/- e nel
75% dei topi sottoposti al trattamento con CCl4. Al contrario, in seguito a trattamento con VL terapeutico non si osservano segni di genotossicità tramite curve di sopravvivenza e incidenza di CEC. Questi
risultati riportano la prima somministrazione endovenosa di VL in un
cane ed indicano che la terapia genica diretta al fegato è fattibile e
può apportare un beneficio clinico sostenuto nel tempo, senza indurre risposta immunitaria nei confronti del transgene. I nostri studi di
biosicurezza ci permetteranno di soppesare i rischi di genotossicità
nel fegato, cosa ad oggi solo poco conosciuta, i quali, insieme ai benefici constatati negli studi volti a valutare e migliorare l’efficacia, ci
consentiranno di definire il rapporto rischio/beneficio in vista di una
futura sperimentazione clinica.
ABSTRACT N. 30
HSR- TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 2
RONCAROLO MARIA GRAZIA
Totale
636.927
Num Centri: 2
TGT06E02
Durata (anni): 5
409.314
Durata (anni): 5
Anno d’inizio: 2006
Magnani Chiara Francesca (1), Tomasoni Daniela (1), Andolfi Grazia
(1), Roncarolo Maria Grazia (1,2)
HSR- TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY
Telethon grant N.
TGT06E01
RUOLO DELLE CELLULE T REGOLATORIE DI TIPO I NELLA
TOLLERANZA IMMUNITARIA
ABSTRACT N. 29
Responsabile
GREGORI SILVIA
(1) HSR-TIGET - Via Olgettina, 58, 20132 Milan, Italy
(2) Vita-Salute San Raffaele University, Milan, Italy
Anno d’inizio: 2006
L’induzione di tolleranza transgene-specifica è fondamentale per lo
sviluppo di protocolli di terapia genica. Tra i diversi meccanismi
coinvolti nella promozione della tolleranza, il meccanismo più importante è l’induzione di cellule T regolatorie (Tr). Le cellule Tr sono
state classificate in cellule regolatorie naturally occurring (nTr) e
cellule indotte in periferia. Le cellule nTr vengono generate nel timo
e la loro funzione soppressoria è strettamente dipendente dell’
espressione costitutiva del fattore trascrizionale FOXP3, mentre le
cellule Tr1 vengono indotte in periferia in seguito a stimolazione
con antigeni in presenza di IL-10, secernono alti livelli di IL-10 in
assenza di IL-4, e sopprimono le risposte immunitarie attraverso
meccanismi citochino-dipendenti.
Abbiamo identificato una nuova classe di cellule dendritiche umane
(DC), denominate DC-10 per la loro eccezionale capacità di produrre IL-10. Le DC-10 sono in grado di promuovere in differenziamento di cellule Tr1 attraverso il pathway ILT4/HLA-G che è dipendente
da IL-10 (Gregori S, et al. Blood. 2010 Aug 12;116(6):935-44). I livelli di espressione di ILT4, HLA-G e di IL-10 sono fondamentali per
l’induzione di cellule Tr1, come dimostrato dal fatto che le DC differenziate da monociti in presenza di G-CSF non sono in grado di promuovere il differenziamento delle cellule Tr1 cells, poichè G-CSF
non promuove l’espressione di elevati livelli di HLA-G, ILT4 e IL-10
(Rossetti M, et al. Eur J Immunol. 2010 Nov;40(11):3097-106). Le
DC-10 inducono cellule Tr1 allergene-specifiche in vitro (Pacciani V,
et al., I J Allergy Clin Immunol. 2010 Mar;125(3):727-36) e cellule
Tr1 allo-specifiche utilizzabili come terapia cellulare (Bacchetta R et
al. Haematologica. 2010 Dec;95(12):2134-43). Nonostante le cellu-
RISPOSTA IMMUNITARIA AL TRANSGENE A SEGUITO DI
TRASFERIMENTO CON VETTORI LENTIVIRALI: MECCANISMI
E MODULAZIONE TRAMITE TERAPIE CELLULARI
Annoni Andrea (1), Rossetti Maura (1,2), Cantore Alessio (1),
Brown Brian D (1,3), Goudy Kevin (1), Andolfi Grazia (1), Gregori
Silvia (1), Sergi Sergi Lucia (1), Naldini Luigi (1,2), Roncarolo Maria
Grazia (1,2)
(1) HSR-TIGET - Via Olgettina 58, 20132, Milan, Italy
(2) Vita-Salute San Raffaele University, Milan
(3) Mount Sinai School of Medicine, Dep. Genetics and Genomic sciences, New York
L’induzione di tolleranza al transgene (Tg) è necessaria per lo sviluppo di protocolli di terapia genica efficaci. Sia componenti della
particella virale che la stessa proteina codificata contribuiscono a
questa risposta, che è dipendente dall’interferone di tipo I (Brown
BD et al. Blood 109, 2797-805, 2007). I nostri studi hanno dimostrato che i vettori lentivirali (LV) trasducono in modo efficiente i
precursori delle cellule dendritiche (DC) senza alterarne il fenotipo e
la funzione, mentre sono scarsamente trasdotte le DC plasmacitoidi
circolanti (p-) e le mieloidi (my-). Le alterazioni del fenotipo e delle
funzioni delle my-DC che innescano la risposta adattativa Tg-specifica non sono direttamente causati dalla trasduzione con LV, ma
dalla presenza di IFN-alfa secreto da pDC sensibili alla presenza di
44
033-132 Abstract-11_ITA.qxd:telethon 021-234 Abstract
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15:54
Pagina 45
HSR-TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY
le T soppressorie indotte con le DC-10 contengono fino al 15% di
cellule Tr1 allo-specifiche già differenziate (Gregori S, et al. Blood.
2010 Aug 12;116(6):935-44 Gregori S, et al. Blood. 2010 Aug
12;116(6):935-44; Bacchetta R et al. Haematologica. 2010
Dec;95(12):2134-43), esse contengono ancora cellule T effettrici
che rappresentano un ostacolo per lo sviluppo di un’efficace terapia
cellulare. Per superare questo limite abbiamo sviluppato un vettore
LV che codifica IL-10 umana e GFP (LV-hIL-10), e abbiamo dimostrato che cellule umane T CD4+ trasdotte con LV-hIL-10 acquisiscono il fenotipo e le funzione associate alle cellule Tr1. Abbiamo
anche dimostrato che le cellule Tr1 possono lisare specificamente
cellule mieloidi attraverso un meccanismo che richiede il riconoscimento HLA di classe I, l’adesione mediata da LFA-1, e l’attivazione
via CD2 e CD226. L’eliminazione delle cellule mieloidi rappresenta
un meccanismo di “bystander suppression” mediata dalle cellule
Tr1, che amplifica il “loop” tollerogenico indotto da IL-10 e TGF-beta. Per caratterizzare il profilo di espressione genica delle cellule Tr1
abbiamo confrontato l’espressione dei geni tra cloni Tr1 e Th0 resting o stimolati con anti-CD3/28 mAbs. I risultati hanno dimostrato
che le cellule Tr1 sono caratterizzate da un profilo anti-infiammatorio, anti-proliferativo, e immuno-modulante. Sono state inoltre
identificate una serie di molecole di superficie che potrebbe essere
utile per identificare le cellule Tr1 in vivo. Tra i geni up-regolati nei
cloni Tr1 sono state identificate molecole che potrebbero rappresentare dei “master regulators” delle cellule Tr1 e molecole coinvolte nella loro funzioni effettrici.
In conclusione, questi studi ci hanno permesso di estendere la nostra conoscenza sui meccanismi di tolleranza indotti dalle cellule
Tr1 e hanno consentito di definire nuovi protocolli finalizzati all’espansione di tali cellule per future applicazioni cliniche.
nente dell’enzima GALC nel SNC del topo Twitcher, con riduzione
degli accumuli e aumento della sopravvivenza (Neri et al, sottomesso per la pubblicazione). Infine, abbiamo mostrato un ruolo di GALC
nel regolare la neurogenesi durante lo sviluppo del SNC (Santambrogio et al., sottomesso per la pubblicazione). Nel complesso questi studi hanno dato la prova di principio di fattibilità ed efficacia
della terapia genica intracerebrale e della terapia cellulare basata
sulle cellule staminali neurali come potenziali approcci per il trattamento delle leucodistrofie. Inoltre questo lavoro ha ampliato la conoscenza dei meccanismi patogenetici delle leucodistrofie permettendo di capire quali siano gli ostacoli che necessitano di essere superati per il futuro sviluppo di terapie cliniche.
ABSTRACT N. 32
HSR- TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 2
GRITTI ANGELA
Totale
640.550
Num Centri: 1
Anno d’inizio: 2006
(1) HSR-TIGET - Via Ogettina 58, 20132, Milan, Italy
(2) Department of Experimental Medicine and Biochemical Science, Perugia
University, Perugia
La Leucodistrofia Metacromatica (LDM) e la Leucodistrofia a Cellule
Globoidi (LCG) sono malattie demielinizzanti da accumulo lisosomiale (LSD) dovute al deficit degli enzimi Arilsulfatasi A (ARSA) e
Galattocerebrosidasi (GALC). Data l’assenza di terapie efficaci, è urgente identificare nuove possibilità terapeutiche per la cura di tali
patologie. Il nostro gruppo ha dimostrato che il trapianto di cellule
staminali ematopoietiche (CSE) geneticamente corrette mediante
vettori lentivirali (VL) permette di ricostituire l’attività enzimatica
deficitaria a livello del sistema nervoso centrale e periferico di animali affetti da LDM o LCG. Nel modello animale di LDM il trattamento non solo previene le manifestazioni patologiche e cliniche se applicato in fase pre-sintomatica, ma corregge anche i deficit neurologici e i danni neuronali già presenti quando applicato in una fase
sintomatica.
Il grado di efficacia di tale intervento dipende dal livello di attività
enzimatica ricostituito nelle CSE, nella loro progenie differenziata
e negli organi target, ad evidenziare il concetto che il vantaggio
della terapia genica risiede proprio nell’espressione dell’enzima
funzionale nelle CSE e nella loro progenie a livelli ampiamente superiori rispetto a quelli riscontrati in cellule wild-type. Per rispondere a tale esigenza di sovra-espressione dell’enzima funzionale
nelle CSE e nella loro progenie, abbiamo ottimizzato la trasduzione di CSE umane derivate da fonti clinicamente rilevanti (midollo
osseo) utilizzando VL prodotti su larga scala, allo scopo di ottenere una trasduzione efficiente ed una sostenuta espressione dell’enzima nelle cellule trasdotte.
La riproducibilità e la sicurezza del protocollo di trasduzione sono
state dimostrate in adeguati modelli pre-clinici. È stata ottimizzata
la produzione su larga scala di VL clinical grade, con titolo elevato e
di alta qualità. Una sperimentazione clinica di terapia genica con
CSE autologhe in pazienti affetti da LDM è iniziata nell’Aprile 2010
ed è attualmente aperta al reclutamento. Il primo paziente è stato
recentemente arruolato e trattato. Il follow up a 6 mesi dal trattamento testimonia la fattibilità e la sicurezza a breve termine del
trattamento. L’efficacia sarà valutabile solo attraverso il follow up a
lungo termine. Lo stesso approccio sperimentale è stato applicato
alla LCG. In questo caso abbiamo però osservato un’elevata tossicità conseguente all’espressione de novo di GALC nelle CSE. Tale
tossicità si è manifestata come apoptosi e incapacità funzionale delle CSE tradotte, che non sono più state in grado di proliferare, differenziare in vitro e ripopolare un ospite letalmente irradiato. Questi risultati possono essere spiegati dall’accumulo di molecole proapoptotiche sintetizzate da GALC, quali la ceramide, dopo il trasferimento genico. Cellule ematopoietiche differenziate della linea mieloide, cioè la popolazione effettrice nel trapianto di CSE per la cura
delle LSD, non risentono della tossicità indotta dall’espressione de
novo di GALC.
Abbiamo pertanto sviluppato una strategia volta a controllare l’e-
TGT06B02
Durata (anni): 5
562.562
Durata (anni): 5
Visigalli Ilaria (1), Capotondo Alessia (1), Plati Tiziana (1), Lorioli
Laura (1), Ungari Silvia (1), Cesani Martina (1), Montini Eugenio
(1), Delai Stefania (1), Milazzo Rita (1), Gentner Bernhard (1), Martino Sabata (2), Naldini Luigi (1), Biffi Alessandra (1)
HSR- TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY - Other Genetic Diseases
Telethon grant N.
TGT06B01
TERAPIA EX VIVO DELLE LEUCODISTROFIE METACROMATICA
E GLOBOIDE TRAMITE CELLULE STAMINALI EMATOPOIETICHE
ABSTRACT N. 31
Responsabile
BIFFI ALESSANDRA
Anno d’inizio: 2006
APPROCCI COMBINATI BASATI SUL TRASFERIMENTO GENETICO E DI CELLULE STAMINALI NEURONALI (NSC) PER LE
LEUCODISTROFIE METACROMATICA E GLOBOIDE
Neri Margherita (1,3), Lattanzi Annalisa (1,2), Cavazzin Chiara (1,2),
Santambrogio Sara (1,3), Alcalà-Franco Beatriz (1), Ricca Alessandra
(1,2), Maderna Claudio (1), Di Girolamo Ilaria (2), Martino Sabata
(2), Orlacchio Aldo (2), Naldini Luigi (1,3), Gritti Angela (1)
(1) HSR-TIGET - Via Olgettina 58, 21032, Milan, Italy
(2) Università di Perugia, Perugia
(3) Vita-Salute S.Raffaele University, Milano
La Leucodistrofia metacromatica (MLD) e la Leucodistrofia a cellule
globoidi (GLD) sono caratterizzate rispettivamente dall’assenza degli enzimi Arilsulfatasi A (ARSA) e ß-galattocerebrosidasi (GALC).
L’accumulo di glicosfingolipidi nei lisosomi nel sistema nervoso centrale e periferico (SNC, SNP) porta a demielinizzazione e neurodegenerazione, aggravate da neuroinfiammazione. Osservazioni cliniche suggeriscono che la carenza dell’enzima potrebbe avere un ruolo nella demelinizzazione prima della conclamata formazione di accumuli, ma questo aspetto è stato poco studiato. In egual modo,
poco si sa degli effetti dell’assenza di GALC nelle cellule staminali
neurali (NSC) nella nicchia neurogenica durante lo sviluppo del
SNC. Per contrastare o prevenire un danno irreversibile al SNC sono
necessari approcci che assicurino rapidamente livelli sostenuti di
enzima prima della comparsa dei sintomi. La terapia genica è in
grado di fornire una fonte permanente di enzima, sia somministrando direttamente il gene carente nel SNC sia trapiantando cellule che
producono enzima funzionale. L’obiettivo di questo progetto è sviluppare nuovi approcci combinati di terapia genica e terapia cellulare basata sulle NSC per correggere il difetto metabolico e riparare il
danno tissutale nei modelli murini di luecodistrofie, focalizzandosi
su un modello GLD, il topo Twitcher, che riproduce le caratteristiche
della patologia umana.
In questi topi abbiamo anche studiato la patofisiologia della malattia, caratterizzato il ruolo dell’enzima GALC nel regolare la funzione
della nicchia staminale neurale.
I nostri dati mostrano che la terapia genica intracerebrale diretta
garantisce una rapida, consistente e diffusa espressione degli enzimi nell’intero SNC e una significativa riduzione degli accumuli tissutali (Lattanzi et al., Hum Mol Gen 2010). Allo stesso modo, il trapianto intracerebrale di NSC assicura produzione rapida e perma-
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HSR-TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY
ABSTRACT N. 34
spressione dell’enzima tossico nelle CSE, ed a garantirne l’espressione sovra-fisiologica nelle cellule effettrici, basata sull’utilizzo di
VL regolati da un microRNA specifico per le HSC. Tale strategia protegge le CSE dal danno funzionale e dall’apoptosi causati dall’espressione de novo di GALC ed ha permesso un sostanziale miglioramento del fenotipo del modello animale di LCG.
HSR- TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
ABSTRACT N. 33
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 2
RONCAROLO MARIA GRAZIA
TGT06F03
908.258
Durata (anni): 5
TGT06F04
6.317.110
Durata (anni): 5
Anno d’inizio: 2006
PRODUZIONE VETTORI LENTIVIRALI GMP PER LA TERAPIA
GENICA (SINDROME DI WISKOTT-ALDRICH E LEUCODISTROFIA METACROMATICA)
HSR- TELETHON INSTITUTE FOR GENE THERAPY - Other Genetic Diseases
Responsabile
NALDINI LUIGI
Bellintani Francesca (3), Vallanti Giuliana (3), Rossetti Francesca
(3), Martelli Letizia (3), Marano Giuseppina (3), Addamo Roberto
Raffaele (3), Piacenza Luca (3), Marzocca Marisa (3), Pozza Chiara
(3), Gatti Alessandra (3), Massariello Paola (3), Salomoni Monica
(3), Benati Claudia (3), Fracchia Sergio (3), Lorini Alessandro (3),
Dieci Marco (3), Ziliotto Raul (3), Benedicenti Fabrizio (1), Plati Tiziana (1), Scaramuzza Samantha (1), Biffi Alessandra (1), Aiuti
Alessandro (1), Bordignon Claudio (2,3), Radrizzani Marina (3),
Naldini Luigi (1,2)
Anno d’inizio: 2006
LEUCODISTROFIA METACROMATICA: DALLA STORIA NATURALE DI MALATTIA VERSO L’APPLICAZIONE CLINICA DI UN
TRIAL DI TERAPIA GENICA DI FASE I/II
Biffi Alessandra (1), Fumagalli Francesca (2,3), Lorioli Laura (1),
Rovelli Attilio (4), Cesani Martina (5), Plati Tiziana (1), Del Carro
Ubaldo (2), Baldoli Cristina (6), Roncarolo Maria Grazia (1,3), Naldini Luigi (1,3), Sessa Maria (1,2)
(1) HSR-TIGET - Via Olgettina 58, 20132, Milan, Italy
(2) Vita-Salute San Raffaele University, Milano, Italy
(3) MolMed S.p.a., Milano, Italy
(1) HSR-TIGET - Via Olgettina 58, 20132 Milan, Italy; Phone 02-26434678; fax
02-26434668; e.mail [email protected]
(2) Dept. of Neurology, San Raffaele Scientific Institute, Milan
(3) Vita-Salute San Raffaele University, Milan
(4) Bone Marrow Transplant Unit, San Gerardo Hospital, Monza
(5) Dept of Developmental & Stem Cell Biology, Joslin Diabetes Center and
Harvard Medical School, Boston, MA, USA
(6) Head & Neck Department, San Raffaele Scientific Institute, Milan
Si è sviluppato un processo GMP per la produzione e la purificazione di
un vettore lentivirale (LV) in collaborazione con HSR-TIGET, MolMed e
Généthon, attualmente utilizzato per la produzione di LV impiegati in
protocolli di terapia genica ex-vivo, sponsorizzati da Telethon.
Sei lotti di vettori GMP sono stati prodotti su larga scala da MolMed, tre
per WAS (WASP LV) e tre per ARSA (ARSA LV). I lotti GMP sono stati
caratterizzati in termini di sicurezza, identità, efficienza e purezza. Il
processo di produzione utilizzato per i due vettori è stato identico.
Si è definita una strategia di controllo di qualità e si sono sviluppati e
validati metodi analitici adatti; solo pochi di loro sono specifici per ogni
singolo vettore.
Questo approccio ha portato alla definizione di metodi di produzione e
caratterizzazione, in gran parte applicabili non solo ai vettori MLD e
WAS, ma anche ad altri vettori di terza generazione che codificano per
transgeni diversi. Il processo di trasduzione su larga scala è stato ideato
sulla base di studi preclinici che hanno individuato il numero di copie di
vettore integrate per cellula, necessario per ciascuna applicazione clinica; i risultati attesi sono stati raggiunti durante le prove di validazione,
confermando l’efficacia dei lotti di vettore purificato prodotti in GMP.
Si è anche verificata la loro sicurezza, in quanto le cellule trasdotte non
presentavano contaminazioni da batteri, funghi o virus, inclusi i Lentivirus competenti per la replicazione (RCL). Esperimenti di trasduzione
condotti su cellule CD34+ di Midollo Osseo mostrano che l’esposizione
al vettore non influisce sulla vitalità, sulla crescita e sulla capacità di
differenziazione di tali cellule, confermando i dati ottenuti precedentemente su cellule CD34+ da cordone ombelicale.In conclusione, il nostro
processo di produzione e purificazione è applicabile a vettori codificanti
per vari transgeni, consentendo la produzione di vettori lentivirali purificati di grande qualità. Utilizzabili per applicazioni cliniche.
I processi di trasduzione eseguiti in condizione GMP garantiscono la
qualità del prodotto in termini di identità/efficacia, purezza e sicurezza.
Negli ultimi 7 anni abbiamo studiato la storia naturale della Leucodistrofia Metacromatica (LDM) in un’ampia coorte di pazienti
con la prospettiva di trasferire in clinica un approccio di terapia
genica basata su cellule staminali ematopoietiche autologhe e vettori lentivirali.
Obiettivi dello studio sono stati i) identificare i fattori prognostici
molecolari, clinici e strumentali per la selezione appropriata dei pazienti arruolabili nel trial di terapia genica e ii) validare i parametri
per monitorare la storia naturale di malattia e valutare i possibili
benefici della nuova terapia.
È stato osservato che i pazienti con esordio precoce hanno una progressione più rapida e grave di malattia, mentre le varianti ad esordio tardivo hanno un’evoluzione più lieve ed eterogenea. Il nostro
studio ha permesso di dimostrare il valore di alcuni test clinici (la
scala di valutazione delle funzioni motorie “Gross Motor Function
Measure”, GMFM) e strumentali (Risonanza Magnetica dell’encefalo,
RM; Elettroneuronografia, ENG) per un monitoraggio quantitativo
dell’evoluzione di malattia.
Nel Marzo 2010 il protocollo di terapia genica è stato approvato dalle Autorità Competenti Italiane ed è attualmente aperto al reclutamento. In relazione alle informazioni ottenute in questo studio, abbiamo identificato come candidabili al protocollo di terapia genica,
pazienti LDM affetti dalla forma tardo infantile e giovanile precoce,
presentando un miglior rapporto rischio-beneficio considerata la
gravità della loro malattia.
I pazienti verranno trattati solo in fase pre- o, limitatamente alle
forme giovanili precoci, pauci-sintomatica, con l’obiettivo di fornire
loro una ragionevole aspettativa di beneficio clinico. Inoltre, in base
a considerazioni etiche sulla sperimentazione in età pediatrica, abbiamo stabilito come end-point primario di efficacia clinica il mantenimento delle abilità motorie o la ridotta progressione del deficit
motorio, misurato mediante la scala GMFM, confrontando con i dati
ottenuti dai pazienti non trattati. Quali end-points secondari di efficacia clinica considereremo la stabilità o la ridotta progressione della malattia, misurata mediante RM dell’encefalo ed ENG. Il primo
paziente, con diagnosi molecolare e familiare compatibile con LDM
tardo infantile, è stato recentemente trattato in fase pre-sintomatica. Ad oggi riportiamo un buon esito della procedura in termini trapiantologici e della sicurezza a breve termine. Il follow up a lungo
termine potrà dimostrare l’efficacia del trattamento nel prevenire
e/o mitigare i sintomi di malattia.
In relazione a queste valutazioni, è necessario proseguire il nostro
studio di storia naturale non solo per offrire un adeguato supporto
ai pazienti, ma, soprattutto, per ottenere informazioni più dettagliate circa l’andamento di malattia nelle fasi precoci. Nel corso del
2010 è proseguito il follow-up di 9/30 pazienti precedentemente arruolati ed sono stati reclutati 7 nuovi pazienti.
DULBECCO TELETHON INSTITUTE
ABSTRACT N. 35
Dulbecco Telethon Institute - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
SANDRI MARCO
TCR09003
610.000
Durata (anni): 5
Anno d’inizio: 2010
DEFINIZIONE DEI MECCANISMI MOLECOLARI DELLA PERDITA DI MASSA MUSCOLARE. IDENTIFICAZIONE DI NUOVI
TARGET TERAPEUTICI PER BLOCCARE LA DEGENERAZIONE
MUSCOLARE
Masiero Eva (1,2), Coletto Luisa (1), Grumati Paolo (3), Carnio Silvia (1), Bertaggia Enrico (1,2), Bernardi Paolo (2), Bonaldo Paolo
(3), Sandri Marco (1,2)
(1) DTI - Venetian Institute of Molecular Medicine, 35129 Padova - via Orus 2 ,
35129 Padova, Italy
46
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DULBECCO TELETHON INSTITUTE
ABSTRACT N. 37
(2) Department of Biomedical Sciences, University of Padova, 35121 Padova
(3) Department of Histology, Microbiology & Medical Biotechnology, University
of Padova, 35121 Padova
Dulbecco Telethon Institute - Neuromuscular Diseases
Responsabile
La progressiva perdita di massa muscolare è il comune denominatore di molte malattie muscolari genetiche per le quali attualmente non esiste una cura.
Promuovere la crescita della massa muscolare o prevenire le vie
di segnale che conducono alla degenerazione muscolare sono approcci terapeutici alternativi per conservare la forza e la massa
muscolare. Tuttavia l’inaspettato fallimento della sperimentazione
clinica dell’inibitore della miostatina ci dice che dobbiamo conoscere nei dettagli le vie di segnale che controllano la massa muscolare prima di addentrarci nella applicazione clinica di possibili
nuove terapie.
Il nostro progetto è proprio focalizzato su questo aspetto. Abbiamo recentemente scoperto che il sistema dell’autofagia è cruciale
per il mantenimento della massa muscolare. Infatti quando lo abbiamo inibito specificamente nel muscolo scheletrico con un approccio genetico abbiamo visto che i muscoli degeneravano, diventavano più deboli e acquisivano una serie di anomalie che sono caratteristiche di diverse miopatie. L’inibizione dell’autofagia
causa uno stress ossidativo, la comparsa di aggregati proteici,
l’accumulo di mitocondri anomali e la distensione del reticolo sarcoplasmatico.
Alcune di queste alterazioni morfologiche, presenti negli animali
in cui l’autofagia era stata bloccata, erano molto simili a quelle
descritte nel difetto di collagene VI ovvero nella distrofia di Ullrich e nella miopatia di Bethlem. Abbiamo quindi dimostrato che in
queste distrofie c’è un difetto del sistema autofagico e che se tale
difetto veniva corretto con un approccio genetico, nutrizionale o
farmacologico ottenevamo un netto miglioramento della forza e
della struttura dei muscoli nell’animale che mima la distrofia
umana. Questi dati sottolineano che un difetto dell’ autofagia può
essere alla base della debolezza di alcune distrofie muscolari congenite e che la conoscenza dei suoi meccanismi di base ci può
aiutare a sviluppare nuovi approcci terapeutici per combattere la
debolezza muscolare.
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 1
Gli RNA non codificanti (nc RNAs) sembrano costituire una componente fondamentale della cromatina ed avere un ruolo critico nell’organizzare la struttura tridimensionale dell’epigenoma. Recenti
studi hanno dimostrato che la trascrizione dei ncRNAs, per la maggior parte derivante da regioni intergeniche del genoma, sia molto
più ubiquitaria di quanto precedentemente pensato. Una gran parte
di questi trascritti origina da sequenze ripetute. A questo proposito,
abbiamo recentemente riportato il primo trascrittoma completo prodotto da sequenze ripetute nel genoma (Faulkner et al., NatGenet
2009), che rappresenta circa il 20% della trascrizione globale di
una cellula. Questo studio ha dimostrato che la trascrizione degli
elementi ripetuti è regolata in modo tessuto-specifico e correla positivamente con l’espressione dei geni vicini. Di fatto, la funzione di
questi trascritti è tuttora sconosciuta.
Recentemente alcuni lavori hanno dimostrato che eventi di retrotrasposizione di elementi ripetuti LINE-1 avvengono in cellule somatiche e tumorali, suggerendo che la loro trascrizione sia correlata alla
loro ridistribuzione genomica (Coufal et al., Nat 2009; Huang et al.,
Beck et al, Iskow et al. Cell 2010). Questi dati permettono di ipotizzare un ruolo degli elementi ripetuti del DNA nel modulare la struttura tridimensionale che il genoma acquisisce al fine di eseguire
uno specifico programma di sviluppo o differenziamento.
Per acquisire una visione globale della funzione dei ncRNAs in tessuti normali e patologici, abbiamo caratterizzato gli RNA associati a
Polycomb e i trascritti derivanti da elementi ripetuti in diversi modelli cellulari di differenziamento muscolare scheletrico mediante
CAGE-deep-sequencing.
Abbiamo generato il trascrittoma di mioblasti primari derivati da
pazienti affetti da distrofia muscolare di Duchenne e controlli sani;
l’RNA citosolico e nucleare è stato estratto e sequenziato con piattaforme deep-sequencing in diversi momenti del differenziamento:
mioblasti proliferanti, miotubi dopo 1 giorno o 7 giorni di differenziamento. Questa analisi ha evidenziato che la maggior parte degli
elementi ripetuti trascritti è costituita da LINEs, e il loro RNA è nucleare. Inoltre, la differenza più significativa tra campioni DMD e
controlli sembra proprio risiedere nella trascrizione degli elementi
ripetuti, incluse le sequenze LINEs. Inoltre, utilizzando un approccio
TaqMan, abbiamo analizzato la variazione nel numero di copie di LINE-1 durante il differenziamento miogenico di miobalsti DMD e di
controllo; sorprendentemente, durante il differenziamento normale
avvengono eventi di retrotrasposizione che invece non sono presenti nei campioni DMD.
Gli esperimenti in corso sono finalizzati a stabilire una correlazione
diretta tra la trascrizione e mobilizzazione di LINE-1, il programma
miogenico e la sua alterazione nella progressione della distrofia.
TCR05004
830.000
Anno d’inizio: 2006
(1) DTI - IRCCS Santa Lucia, Rome, Italy
(2) The Roslin Institute and R(D)SVS University of Edinburgh, Roslin
(3) Omics Science Center RIKEN Yokohama Institute, Kanagawa, Japan
PURI PIER LORENZO
Durata (anni): 5
865.000
Durata (anni): 5
Bodega Beatrice (1), Faulkner Geoffrey (2), Hayashizaki Yoshihide
(3), Carninci Piero (3), Orlando Valerio (1)
Dulbecco Telethon Institute - Neuromuscular Diseases
Telethon grant N.
TCR05001
RUOLO DEL GENOMA NON CODIFICANTE NELLA FUNZIONE
DELL’EPIGENOMA NEL DIFFERENZIAMENTO MUSCOLARE
SCHELETRICO E NELLA DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE
ABSTRACT N. 36
Responsabile
ORLANDO VALERIO
Anno d’inizio: 2006
CARATTERIZZAZIONE DEI MECCANISMI DI CONTROLLO DEL
CICLO CELLULARE E DELLA TRASCRIZIONE MUSCOLO SPECIFICA NEL DIFFERENZIAMENTO MIOGENICO: IMPLICAZIONI
TERAPEUTICHE PER LA RIGENERAZIONE MUSCOLARE
Saccone Valentina, Consalvi Silvia, Mozzetta Chiara, Palacios Daniela, Simonatto Marta, Marullo Fabrizia, Latella Lucia
DTI - IRCCS Fondazione Santa Lucia and European Brain Research Institute
I nostri studi sono volti alla identificazione e caratterizzazione dei
meccanismi attraverso cui i segnali rigenerativi emanati dai muscoli distrofici vengono convertiti nelle informazioni epigenetiche
che regolano l’espressione genica in varie sottopopolazioni intramuscolari. Questi studi sono finalizzati a determinare il legame
tra mutazioni geniche responsabili delle distrofie muscolari e gli
eventi epigenetici che determinano la progressione della malattia, ed ad identificare nuovi bersagli per interventi farmacologici
che possano essere portati in sperimentazione clinica su pazienti
distrofici.
Abbiamo recentemente individuato e caratterizzato un nuovo
network di interazioni funzionali tra enzimi che regolano la struttura della cromatina - istone deacetilasi (HDACs) e fattori di rimodellamento (SWI/SNF) - e microRNA in specifiche sottopopolazioni di cellule pluripotenti intramuscolari. Farmaci epigenetici,
come gli inibitori delle HDACs, sono in grado di dirigere l’espressione genica in queste cellule in modo da risolvere la loro pluripotenza nella direzione promiogenice e di bloccare il potenziale
fibroadipogenico.
Questo effetto è alla base della capacità degli inibitori delle HDAC
di promuovere rigenerazione compensatoria e di bloccare fibrosi
ed adipogenesi nei muscoli di pazienti distrofici. Sono in corso
studi preclinici in modelli animali di distrofia muscolare che preludono all’uso di questi farmaci nella sperimentazione clinica in pazienti affetti da distrofia muscolare di Duchenne.
ABSTRACT N. 38
Dulbecco Telethon Institute - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
GABELLINI DAVIDE
TCP05001
517.000
Durata (anni): 5
Anno d’inizio: 2006
RNA INTERFERENCE PER LA TERAPIA DELLA DISTROFIA MUSCOLARE FACIO-SCAPOLO-OMERALE (FSHD)
Bortolanza Sergia (1,2), Nonis Alessandro (3), Sanvito Francesca
(4), Sitia Giovanni (5), Di Serio Clelia (3), Chamberlain Joel (6),
Gabellini Davide (1,2)
47
033-132 Abstract-11_ITA.qxd:telethon 021-234 Abstract
21-02-2011
15:54
Pagina 48
DULBECCO TELETHON INSTITUTE
scheletrico del muscolo, mentre più raramente in alpha-tropomiosina, beta-tropomiosina, troponina T1, e cofilin-2. Attualmente non
esistono terapie o marcatori e lo sviluppo di terapie è complicata
dalla eterogeneità clinica e genetica della malattia. I microRNA
(miR) appartengono ad un gruppo recentemente scoperto di piccole
molecole che regolano negativamente l’espressione genica e sembrano essere coinvolti praticamente in ogni aspetto biologico. Sulla
base di un recente studio in cui una serie di miR sono risultati specificamente associati a disfunzioni nei muscoli di pazienti con NM
(Eisenberg et al. PNAS 104, 17016-21, 2007), abbiamo ipotizzato,
a prescindere dalla mutazione causativa di NM, la presenza di specifici meccanismi di regolazione alla base della patologia controllata
dai miR. Pertanto, mediante lo studio del modello di topo Acta1(H40Y) knockin (KI), che esprime una forma mutante di alphaactina scheletrica e sviluppa una grave forma di NM, l’obiettivo di
questo studio è stato di verificare se i miR possano essere coinvolti
nella regolazione delle vie patologiche sottostanti la NM. Analisi d’espressione di geni e miR sul diaframma e muscolo tibiale anteriore
estratti da topi Acta1(H40Y)KI e wildtype di 3 e 10 settimane d’età,
ci hanno permesso di correlare l’espressione dei geni e miR con i
differenti stadi di gravità della malattia. Diversi miR sono risultati
similmente up-regolati sia nel topo che nell’uomo, convalidando così il topo Acta1(H40Y)KI come un modello affidabile di NM. Il nostro
obiettivo futuro è quello di studiare l’effetto della modulazione dell’espressione dei miR sulla patologia della malattia. Questo studio
fornisce nuove conoscenze sui meccanismi patogenetici alla base
NM e suggerisce l’uso potenziale dei miR sia per future applicazioni
terapeutiche per il trattamento della NM che come marcatori diagnostici per la classificazione dei casi di NM e la previsione di gravità della malattia.
(1) DTI – DIBIT, Via Olgettina 58, 20132, Milan, Italy
(2) Division of Regenerative medicine, Stem cells, and Gene therapy, San Raffaele Scientific Institute, Milano, Italy
(3) Università Vita-Salute San Raffaele, Milano, Italy
(4) San Raffaele Scientific Institute, Facilities, Pathology, Milano, Italy
(5) Division of Immunology, Transplantation, and Infectious Diseases, San Raffaele Scientific Institute, Milano, Italy
(6) Division of Medical Genetics, Department of Medicine, University of Washington, Seattle, WA, USA
La distrofia muscolare facio-scapolo-omerale (FSHD), la terza più
comune miopatia, è causata da una complessa cascata di eventi
epigenetici iniziata dalla contrazione della sequenza ripetuta D4Z4
situata sul cromosoma 4q35. Normalmente, D4Z4 reprime l’espressione di geni nelle sue vicinanze e la riduzione nel numero di unità
ripetute D4Z4 nei pazienti FSHD provoca un aumento dell’espressione di alcuni geni in 4q35. Tra i geni che sono stati riportati essere over-espressi nei pazienti FSHD, una serie di evidenze indicano
che la sovra-espressione del gene FRG1 gioca un ruolo fondamentale nella FSHD. In particolare, topi, rane e vermi che over-esprimono FRG1 sviluppano un fenotipo simile ai pazienti FSHD. Come
risultato, i topi transgenici che sovra-esprimono FRG1 hanno fornito
il primo modello animale della FSHD.
Finora, lo sviluppo di approcci terapeutici per le distrofie muscolari
è stato principalmente focalizzato sulla distrofia muscolare di Duchenne e la FSHD è stata a lungo trascurata. Per questo motivo, al
momento non è disponibile alcun trattamento terapeutico per la
FSHD.
Per malattie ereditarie associate a meccanismi di guadagno di funzione, uno schema terapeutico semplice sarebbe quello di eliminare
il prodotto genetico che governa tutti i processi patogeni mediante
RNA interference (RNAi): un processo di silenziamento genico RNAdipendente che viene attivato da piccole molecole di RNA a doppia
elica (shRNAs). La somministrazione di RNAi con vettori virali costituisce uno strumento di grande rilevanza per il targeting terapeutico di prodotti genici patogeni dominanti. In particolare, abbiamo
deciso di impiegare virus adeno-associati ricombinanti (rAAVs) per
la somministrazione sistemica di shRNAs per testare l’efficacia del
silenziamento di FRG1 in vivo come un possibile approccio di terapia genica per la FSHD.
Abbiamo clonato tre dei nostri migliori shRNAs in rAAVs. I rAAVs
sono stati inizialmente testati in colture cellulari e tutti i rAAVs sono
riusciti a ridurre l’espressione di FRG1. Successivamente, abbiamo
testato i virus in vivo, dove siamo stati in grado di trasdurre efficacemente l’intera muscolatura scheletrica dei topi FRG1 con una singola iniezione a bassa pressione per via endovenosa. Il trattamento
con rAAVs-shRNA è risultato sicuro come giudicato da esami sierologici e istopatologici di diversi tessuti. È interessante notare che,
abbiamo scoperto che una singola somministrazione sistemica di
rAAV-shRNAa è sufficiente per ottenere un efficace silenziamento di
FRG1 a lungo termine e determinare un recupero significativo del
fenotipo a livello sia istologico che funzionale.
I nostri studi pongono le basi per lo sviluppo di efficaci trattamenti
terapeutici per la FSHD.
ABSTRACT N. 40
Dulbecco Telethon Institute - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 1
I poli-fosfoinositidi (fosfolipidi) sono importanti secondi messaggeri
intracellulari che controllano diverse funzioni tra cui il sorting degli
endosomi e il traffico di membrana. La concentrazione dei fosfolipidi
è strettamente controllata da chinasi e fosfatasi. Diverse malattie
genetiche sono causate da mutazioni in geni che codificano per
queste chinasi e fosfatasi e ciò sottolinea l’importanza di una corretta regolazione cellulare del metabolismo dei fosfolipidi.
Una di queste malattie è la neuropatia di Charcot-Marie-Tooth di tipo 4B1 (CMT4B1), una forma molto severa con esordio nell’infanzia, caratterizzata da demielinizzazione del nervo e da particolari
ispessimenti focali di mielina denominati “myelin outfoldings”. Questa neuropatia è causata dalla mancanza di un enzima MTMR2,
Myotubularin-related protein 2, una proteina fosfatasi che defosforila in vitro PtdIns(3)P e PtdIns(3,5)P2 fosfoinositidi in posizione 3
dell’anello inositolico. Si presume quindi che MTMR2 abbia un ruolo
nel controllo del traffico di membrana durante la mielinizzazione. Al
fine di dimostrare il ruolo biologico di MTMR2 nel sistema nervoso ci
siamo avvalsi anche di un altro modello il topo Plt (Pale tremor) in
cui la fosfatasi FIG4 è assente. Questo topo sviluppa una severa
neurodegenerazione del sistema nevoso centrale e una neuropatia.
Mutazioni di perdita di funzione nel gene FIG4 causano anche un’altra forma di neuropatia nell’uomo, CMT4J. Dato che FIG4 agisce sugli stessi substrati di MTMR2, abbiamo generato un topo knockout
per entrambe FIG4 e MTMR2, allo scopo di vedere se esse interagiscano funzionalmente e di dimostrare quindi in vivo il ruolo biochimico di MTMR2 nella regolazione di fosfolipidi. L’analisi di questo
nuovo modello ha rilevato che la perdita di MTMR2 peggiora la neurodegenerazione del sistema nervoso centrale e l’ipomielinizzazione
TCP07006
517.000
Anno d’inizio: 2006
(1) DTI - San Raffaele Scientific Institute, Via Olgettina 58, 20132, Milan,
Italy; [email protected]
(2) INSPE-Institute of Experimental Neurology, San Raffaele Scientific Institute
(3) Myelin Biology Unit, San Raffaele Scientific Institute
(4) Life Sciences Institute, University of Michigan, Ann Arbor MI
(5) Department of Human Genetics, University of Michigan, Ann Arbor MI
BANG MARIE-LOUISE
Durata (anni): 5
800.000
Durata (anni): 5
Vaccari Ilaria (1,2), Dina Giorgia (2), Cerri Federica (2), Wrabetz
Lawrence (3), Quattrini Angelo (2), Weisman Lois (4), Meisler Miriam (5), Bolino Alessandra (1,2)
Dulbecco Telethon Institute - Neuromuscular Diseases
Telethon grant N.
TCR05002
STUDIO FUNZIONALE DEL GENE CODIFICANTE LA MYOTUBULARIN-RELATED-PROTEIN 2, MTMR2, RESPONSABILE DELLA
MALATTIA DI CHARCOT-MARIE-TOOTH DI TIPO 4B
ABSTRACT N. 39
Responsabile
BOLINO ALESSANDRA
Anno d’inizio: 2008
RUOLO DEI microRNA NELLA MIOPATIA NEMALINICA
Castaldi Alessandra (2,3), Corrada Dario (4), Hardeman Edna (5),
Bang Marie-Louise (1,3)
(1) DTI - Institute of Biomedical Technologies (ITB), Consiglio Nazionale delle
Ricerche (CNR) - [email protected]
(2) University of Milan
(3) MultiMedica, Scientific and Technology Pole
(4) Institute of Biomedical Technologies (ITB) - Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR)
(5) Children’s Medical Research Institute, University of Sydney
La miopatia nemalinica (NM) è una malattia neuromuscolare clinicamente e geneticamente eterogenea, caratterizzata da debolezza
muscolare e ipotonia a causa di alterazioni sarcomeriche e la formazione di corpi bastoncellari “nemaline” nelle fibre muscolari. La
malattia colpisce circa 1 su 50.000 ed è causata da mutazioni nelle
proteine del filamento sottile, in particolare nebulina e alpha-actina
48
033-132 Abstract-11_ITA.qxd:telethon 021-234 Abstract
21-02-2011
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DULBECCO TELETHON INSTITUTE
del sistema nervoso periferico caratteristiche del topo FIG4 knockout. Inoltre, la perdita del 50% (aploinsufficienza) di FIG4 nel topo
knock-out per MTMR2 riduce gli outfoldings di mielina tipici di
CMT4B1. Abbiamo perciò concluso che MTMR2 e FIG4 interagiscono
geneticamente e funzionalmente e che perciò MTMR2 ha un ruolo
nella regolazione del metabolismo di fosfolipidi PtdIns(3)P e PtdIns(3,5)P2 nel sistema nervoso.
sistemica. Infine, questo è il primo studio che fornisce una strategia
facilmente attuabile per l’identificazione e validazione di biomarcatori multiproteici, potenzialmente applicabile a molte malattie neurologiche.
ABSTRACT N. 42
Dulbecco Telethon Institute - Neurological Diseases
ABSTRACT N. 41
Responsabile
Telethon grant N.
Dulbecco Telethon Institute - Neurological Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Totale
BONETTO VALENTINA
Num Centri: 1
TCR08002
800.000
Durata (anni): 5
MERLO GIORGIO
TCR07004
170.000
Durata (anni): 2
Anno d’inizio: 2008
REGOLAZIONI MOLECOLARI AD AMPIO SPETTRO DURANTE
LO SVILUPPO E IL RIPARO DELLA VIA ASSONALE OLFATTIVA: VERSO LA COMPRENSIONE DELLE BASI BIOLOGICHE
DELLA SINDROME DI KALLMANN
Anno d’inizio: 2009
BIOMARCATORI MULTIPROTEICI DELLA SCLEROSI LATERALE AMIOTROFICA
Garaffo Giulia (1), Provero Paolo (1), Peano Clelia (2), Pinciroli Patrizia (2), Battaglia Cristina (2), Francalanci Floriana (1), Santoro
Massimo (1), Merlo Giorgio (1,3)
Nardo Giovanni (1,2), Pozzi Silvia (1,2,3), Pignataro Mauro (1,2),
Lauranzano Eliana (1,2), Spano Giorgia (1,3), Garbelli Silvia (4,5),
Mantovani Stefania (4,5), Marinou Kalliopi (6), Papetti Laura (6),
Monteforte Marta (7), Torri Valter (7), Paris Luca (2), Bazzoni Gianfranco (2), Lunetta Christian (8), Corbo Massimo (8), Mora Gabriele
(6), Bendotti Caterina (3), Bonetto Valentina (1,2)
(1) Molecular Biotechnology Center, University of Torino - Via Nizza 52 10126
Torino
(2) CNR-Istituto Tecnologie Biomediche, Milano
(3) DTI - Molecular Biotechnology Center, University of Turin
(1) DTI - “Mario Negri” Institute for Pharmacological Research, Via La Masa 19,
20156 Milan, Italy; Tel: +390239014548; Fax:+390239014744; E-Mail: [email protected]
(2) Department of Molecular Biochemistry and Pharmacology, “Mario Negri” Institute for Pharmacological Research, Milano, Italy
(3) Department of Neuroscience, “Mario Negri” Institute for Pharmacological
Research, Milano, Italy
(4) IRCCS Fondazione Salvatore Maugeri, Pavia, Italy
(5) ISPESL—National Institute for Occupational Safety and Prevention, Research Center at the IRCCS Fondazione Salvatore Maugeri, Pavia, Italy
(6) IRCCS Fondazione Salvatore Maugeri, Milano, Italy
(7) Department of Oncology, “Mario Negri” Institute for Pharmacological Research, Milano, Italy
(8) NEuroMuscular Omnicentre (NEMO), Niguarda Cà Granda Hospital, Milano,
Italy
Durante lo sviluppo embrionale, l’epitelio olfattivo periferico e il cervello anteriore subiscono un processo di morfogenesi e differenziamento, in modo altamente coordinato. I neuroni recettoriali olfattivi
(NRO) immaturi emettono i loro assoni in direzione centripeta, per
formare sinapsi con neuroni di proiezioni centrali. L’allungamento
assonale è accompagnato dalla migrazione dei neuroni GnRH+, un
processo specificamente alterato nella sindrome di Kallmann, e che
porta a anosmìa e grave ipogonadismo.
L’allungamento e collegamento assonale sono controllati da interazioni tra NRO e cellule adiacenti (via segnali morfogenetici, molecole di guidance, ECM), ma recenti osservazioni indicano che i fattori
di trascrizione Dlx5, Fez e Emx2 sono dei regolatori chiave di questo processo. Il nostro obiettivo è indagare sulle network trascrizionali dello sviluppo olfattivo, per individuare quei geni e microRNA
essenziali per il collegamento assonale. Utilizziamo per queste analisi embrioni knock-out per Dlx5, un omeogene espresso nei NRO
precoci. I nostri lavori precedenti indicano che Dlx5 è necessario
per il differenziamento dei NRO e per la formazioni delle connessioni olfattive.
Abbiamo confrontato i profili di geni espressi e di miR tra NRO normali e Dlx5-/-, e combinato questi dati con una network di coespressione (CLOE) e con la predizione dei Dlx-binding-sites sul genoma (via Position Weight Matrix). Osserviamo che Dlx5 controlla il
differenziamento dei NRO mediante regolazione dei miR classe -200
(e altri miR), e controlla il collegamento assonale mediante cambiamenti dell’espressione genica. Stiamo validando funzionalmente alcuni geni e miR, candidati target di Dlx5 e rilevanti per il differenziamento e il collegamento assonale con, rispettivamente, cellule
staminali neurali e modelli di Zebrafish reporter.
Un valore aggiunto dello studio deriva dal fatto che il sistema olfattivo periferico è in grado di rigenerare i neuroni e i collegamenti assonali, sia in situazioni fisiologiche che in seguito a lesioni. Dunque,
le ricerche sulle network regolative del sistema olfattivo potrebbero
avere implicazioni più generali sulla biologia della rigenerazione e
riparazione del nervo.
La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è una patologia neurodegenerativa, per cui non esiste una terapia efficace, che colpisce i motoneuroni e porta invariabilmente alla morte entro 2-4 anni dalla diagnosi. Per la SLA non c’è ancora un test specifico diagnostico e/o
prognostico di laboratorio. La diagnosi è principalmente di tipo clinico e si basa sull’evoluzione dei sintomi e per questo è formulata con
considerevole ritardo, in media dopo un anno dalla comparsa dei
primi sintomi, molto probabilmente al di fuori della finestra terapeutica di un qualsivoglia approccio farmacologico. Inoltre, l’andamento della malattia è molto variabile. Biomarcatori della SLA sarebbero quindi utili per una diagnosi precoce, per monitorare la progressione della malattia e determinare l’efficacia di un nuovo trattamento. L’obbiettivo dei nostri studi era quello di identificare una
combinazione di proteine biomarcatori nelle cellule mononucleate
da sangue periferico (PBMC), che oltre ad essere facilmente reperibili evidenziano delle alterazioni biochimiche simili a quelle trovate
nel sistema nervoso centrale di pazienti e modelli animali. Abbiamo
messo a punto un approccio per confrontare il profilo proteico delle
PBMC di pazienti SLA sporadici (sSLA), pazienti neurologici non SLA
e controlli sani. In questa analisi i pazienti sSLA sono stati suddivisi
in due gruppi sulla base del grado di gravità della malattia. Lo
screening iniziale è stato fatto su campioni in pool, poi sono state
selezionate una serie di proteine alterate nella patologia e sono state validate attraverso un’analisi immunochimica su singoli campioni
di pazienti sSLA e controlli, e sulle PBMC e midolli spinali di ratti
transgenici G93A SOD1 a diversi stadi della malattia. Abbiamo identificato una combinazione di proteine che é strettamente associata
alla SLA e può distinguere accuratamente tra due gradi di gravità
della malattia (90%), tra pazienti sSLA e controlli sani (98%) e pazienti con malattie neurologiche che possono assomigliare alla SLA
(91%). I nostri biomarcatori multiproteici sono facilmente misurabili
in saggi immunologici su larga scala e quindi adatti allo sviluppo di
test di laboratorio da utilizzare facilmente nella pratica clinica. Inoltre, le modifiche del profilo proteico rilevate nelle PBMC dei pazienti
sSLA suggeriscono il coinvolgimento di meccanismi patogenici quali
stress del reticolo endoplasmatico, stress nitrativo, disturbi della regolazione redox e del processamento dell’RNA, alterazioni precedentemente viste nel midollo spinale di pazienti e modelli animali.
Questo parallelo avalla l’uso delle PBMC per studi in vitro della SLA
e rafforza la teoria che la SLA è una malattia multicellulare e multi-
ABSTRACT N. 43
Dulbecco Telethon Institute - Neurological Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
FANTO MANOLIS
TCR08003
198.750
Durata (anni): 2
Anno d’inizio: 2009
SPECIFICI MECCANISMI DI TOSSICITÀ CELLULARE E MOLECOLARE DELLE ATROFINE CON POLIGLUTAMMINE
Napoletano Francesco, Occhi Simona, Calamita Piera, Volpi Vera,
Fanto Manolis
DTI - DIBIT-HSR, Via Olgettina 58, 20132, Milan, Italy
Le patologie di Poliglutamine (poliQ) sono malattie neurodegenera-
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DULBECCO TELETHON INSTITUTE
tive che manifestano sia effetti di tossicità generali che specifici della proteina mutante. L’atrofia Dentatorubropallidoluysiana (DRPLA)
è uno di questi disordini causati dalle mutazioni nella proteina
Atrophin-1. Abbiamo generato parecchi modelli per DRPLA in drosofila ed abbiamo analizzato i meccanismi della tossicità dell’organismo e cellulare. La nostra analisi genetica ed ultrastrutturale della
neurodegenerazione suggerisce che l’autofagia svolge un ruolo
chiave nella degenerazione cellulare quando le proteine poliQ sono
over-espresse in cellule neuronali e gliali. La digestione degli organelli autofagici è ostruita al livello lisosomale dopo fusione corretta
fra autofagosomi e lisosomi. Ciò conduce ad accumulazione di pigmenti autofluorecenti e residui proteci, degradati solitamente dal sistema autofago-lisosomale. In queste circostanze, ulteriore induzione farmacologica e genetica di autofagia non migliora la neurodegenerazione da polyQ Atro, contrariamente a molte altre circostanze
neurodegenerative. Le grandi alterazioni nella trascrizione accompagnano la neurodegenerazione nelle malattie da polyQ. Qui riportiamo che il gene oncosoppressore fat media la neurodegenerazione
indotta dalla proteina Atro polyQ. Abbiamo controllato le alterazioni
trascrizionali iniziali in un modello in Drosofila di atrofia Dentatorubral-pallidoluisiana ed abbiamo trovato che polyQ Atrophins reprime
fat. Fat protegge dalla neurodegenerazione e dalla tossicità di Atro
attraverso la cascata della chinasi Hippo. La via Fat/Hippo non provoca neurodegenerazione stimolando la crescita eccessiva, piuttosto esso altera il flusso autofagico in neuroni fotoricettori, alterando
l’omeostasi delle cellule. I nostri dati forniscono così una spiegazione del meccanismo specifico di una malattia da polyQ e rivelano un
ruolo neuroprotettivo inatteso della via Fat/Hippo.
(2) European School of Molecular Medicine (SEMM), sede di Napoli (TIGEM)
(3) Università degli Studi di Salerno
La sindrome da delezione 22q11.2 (del22q11.2) è la più comune
sindrome da microdelezione. La patologia è associata alla perdita di
molti geni, ma è stato dimostrato sia nell’uomo che nel topo, che la
mutazione nel fattore di trascrizione TBX1 è sufficiente a ricapitolare la maggior parte dei sintomi clinici. Questa ricerca si focalizza sugli aspetti comportamentali e psichiatrici della patologia, sia per la
loro alta incidenza, sia perché la loro base genetica non è ancora
nota, precludendo lo sviluppo di una terapia mirata. Il nostro scopo
è identificare le basi patogenetiche di questi deficit, utilizzando modelli animali di del22q11.2.
I topi Tbx1+/- mostrano una riduzione della inibizione pre-impulso
(PPI), indicativa di un difetto nel filtro sensorimotorio cerebrale. Nel
cervello murinoTbx1 è espresso solo nelle cellule endoteliali (CE)
pertanto un’eventuale influenza del gene sullo sviluppo e sulla funzione cerebrale sarebbe di tipo cell-non autonomo. Il nostro studio
rivela un’alterata vascolarizzazione del cervello nei topi Tbx1-/-, introducendo la possibilità che i deficit comportamentali siano secondari alle anomalie vascolari. Abbiamo rilevato un incremento nella
densità dei vasi cerebrali che si presentano tortuosi e disorganizzati
e con un sensibile aumento delle protrusioni neoangiogeniche. Questo fenotipo appare cell-autonomo,come dimostrato in colture di CE
nulle per Tbx1. Allo scopo di identificare i target endoteliali di
Tbx1,abbiamo anche effettuato RNA-seq sulle stesse CE e molti geni del Notch-Delta signaling, che sappiamo reprimere fortemente
l’angiogenesi, sono risultati downregolati, come Dll4,Narp1 e Vegfr3. È interessante notare che la mutazione di Dll4 nel topo causa
una ipervascolarizzazione cerebrale simile a quella riscontrata nei
Tbx1-/-. Pertanto valutiamo l’ipotesi che il ruolo di TBX1 nell’angiogenesi cerebrale sia mediato dal signaling Dll4-Notch.
È inoltre noto come la rete vascolare cerebrale possa influenzare la
proliferazione dei progenitori neuronali, così come la loro migrazione e l’estensione delle proiezioni assonali. Per identificare eventuali
difetti neuronali secondari alle anomalie vascolari, stiamo analizzando,nei mutanti Tbx1-/-, i principali marker assonali e neuronali.
Questi studi hanno rivelato una larga espansione dei domini dopaminergici telencefalici che mesencefalici in embrioni a 13.5 giorni
p.c. I neuroni dopaminergici costituiscono parte del circuito di PPI e
lo squilibrio dei livelli di dopamina è fortemente implicato nella schizofrenia, il più comune disordine psichiatrico associato alla
del22q11.2. Anche la proliferazione neuronale è incrementata nei
topi Tbx1-/- ed un eventuale correlazione di questi fenotipi è attualmente oggetto di studio.
In conclusione, la mutazione di Tbx1 causa molteplici difetti cerebrali che potrebbero sottendere al fenotipo comportamentale. Studi
futuri saranno orientati ad una migliore definizione del fenotipo
neuronale, fondamentale per dirigere nel modo più appropriato l’analisi delle interazioni CE-neuroni.
ABSTRACT N. 44
Dulbecco Telethon Institute - Neurological Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
CHIESA ROBERTO
TCR08005
800.000
Durata (anni): 5
Anno d’inizio: 2009
MECCANISMI CELLULARI DI DISFUNZIONE SINAPTICA NELLE MALATTIE DA PRIONI FAMILIARI
Senatore Assunta (1,2), Colleoni Simona (2), Verderio Claudia (3),
Restelli Elena (1,2), Bertani Ilaria (1,2), Mantovani Susanna (1,2),
Condliffe Steven (3), Forloni Gianluigi (2), Matteoli Michela (3),
Gobbi Marco (2), Chiesa Roberto (1,2)
(1) DTI - “Mario Negri” Institute for Pharmacological Research, Via G. La Masa
19, 20156 Milan, Italy; E-mail:[email protected]
(2) Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri
(3) Università di Milano
ABSTRACT N. 46
Topi transgenici Tg(PG14) che esprimono una proteina prionica
(PrP) recante una mutazione inserzionale associata a una forma
ereditaria di malattia da prioni producono nel cervello una forma
aggregata di PrP. Man mano che questa si accumula nel cervello i
topi sviluppano una sindrome neurologica progressiva caratterizzata
da atassia e atrofia cerebellare dovuta a perdita sinaptica e degenerazione dei neuroni granulari. Al fine di caratterizzare una possibile
disfunzione sinaptica nelle fasi precoci della malattia, abbiamo analizzato l’efficienza della neurotrasmissione cerebellare. Tali analisi
hanno evidenziato una selettivo deficit del rilascio di glutammato
dai neuroni granulari del cervelletto causato da alterazioni dell’influsso di calcio. Stiamo attualmente studiando i meccanismi molecolari alla base di questo difetto.
Dulbecco Telethon Institute - Neurological Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 1
TCP04006
863.750
Anno d’inizio: 2008
(1) CNR Institute of Neuroscience, Cellular and Molecular Pharmacology, Department of Pharmacology, University of Milan, Italy
(2) DTI - CNR, Milan, Italy
(3) Department of Genetics and Development, Institut Cochin, 24 rue du Faubourg Saint Jacques, Paris, France
(4) Neuromuscular Diseases and Neuroimmunology, Neurological Institute
Foundation “Carlo Besta”, 20133 Milan, Italy
ILLINGWORTH ELIZABETH
Durata (anni): 5
800.000
Durata (anni): 5
Valnegri Pamela (1,2), Khelfaoui Malik (3), Bassani Silvia (1,2),
Chelly Jamel (3), Billuart Pierre (3), Sala Carlo (1,4), Passafaro Maria (1,2)
Dulbecco Telethon Institute - Neurological Diseases
Telethon grant N.
TCR07006
L’INTERAZIONE TRA OLIGOPHRENIN-1 E REV-ERBA REGOLANO IL CICLO CIRCADIANO IN CORTECCIA
ABSTRACT N. 45
Responsabile
PASSAFARO MARIA PIA
Anno d’inizio: 2006
Oligophrenin-1 regola la morfologia e la formazione delle spine dendritiche nel cervello, mutazioni in questo gene causa il ritardo mentale. Tramite two-hybrid screening abbiamo trovato come interattore di oligophrenin-1, Rev-erba: un recettore nucleare che regola la
trascrizione genica ciclicamente. Abbiamo dimostrato come l’interazione tra oligophrenin-1 e Rev-erba in corteccia e ippocampo regoli
la localizzazione di Rev-erba a livello dendritico, riducendo la sua
attività repressionale a livello nucleare. Inoltre, abbiamo osservato
per la prima volta la presenza di un ciclo circadiano a livello cortica-
IDENTIFICAZIONE DI GENI CORRELATI ALLA SCHIZOFRENIA
IN UN MODELLO MURINO DELLA SINDROME DEL22Q11
Cioffi Sara (1,2), Flore Gemma (1), Bilio Marchesa (1), Illingworth
Elizabeth (1,3)
(1) DTI - Telethon Institute of Genetics and Medicine, via Pietro Castellino 111,
80131 Naples, Italy
50
033-132 Abstract-11_ITA.qxd:telethon 021-234 Abstract
21-02-2011
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DULBECCO TELETHON INSTITUTE
ABSTRACT N. 48
le regolato dall’interazione tra Rev-erba e oligophrenin-1 che coinvolge i geni clock bmal1 e SNK. Abbiamo anche osservato come la
localizzazione a livello dendritico sia regolata dall’attività sinaptica,
mediante l’attivazione del recettore AMPA.
In questo lavoro abbiamo dimostrato per la prima volta l’interazione
tra l’attività sinaptica, il ciclo circadiano e il ritardo mentale.
Dulbecco Telethon Institute - Neurological Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
ABSTRACT N. 47
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
D’ADAMO PATRIZIA
TCR09001
210.000
Durata (anni): 2
TCR09002
800.000
Durata (anni): 5
Anno d’inizio: 2010
RUOLO DEI FATTORI EPIGENETICI NELL’IDENTITÀ DELLE
CELLULE STAMINALI E NEI PROCESSI DI RIGENERAZIONE
TISSUTALE
Dulbecco Telethon Institute - Neurological Diseases
Responsabile
CORONA DAVIDE
Corona Davide
Anno d’inizio: 2010
DTI - Università degli Studi di Palermo, Dipartimento STEMBIO, Sezione di Bioscienze, Viale delle Scienze, Edificio 16
ANALISI FUNZIONALI, COMPORTAMENTALI E GENETICHE
PER CAPIRE IL RUOLO PATOGENETICO DELLE PROTEINE RAB
E DELLE PROTEINE AD ESSE ASSOCIATE NEL RITARDO MENTALE LEGATO AL CROMOSOMA X
Ogni cellula del nostro corpo ha un corredo di DNA e di geni uguale
a quello di tutte le altre. Tuttavia tessuti diversi sono costituti da
cellule diverse: le cellule nervose sono diverse da quelle del fegato
e così via. Le nostre cellule possono diversificarsi perché possono
decidere se attivare o no certi geni. I ricercatori hanno individuato i
“fattori epigenetici” che possono accendere o spegnere i geni, indipendentemente dalla sequenza del DNA. I fattori epigenetici regolano l’espressione dei geni e loro difetti possono causare patologie.
Molte sindromi genetiche umane infatti sono causate da alterazioni
epigenetiche, che essendo reversibili sono bersagli ideali per la terapia genica.
Le cellule staminali sono delle cellule speciali in grado di generare
qualsiasi altro tipo di cellula e sono finemente regolate a livello epigenetico. Attualmente tra le cellule staminali meglio caratterizzate
ci sono quelle dell’organismo modello D.melanogaster. Altre cellule
durante la rigenerazione tissutale possono diventare multipotenti,
cioè acquistare il potenziale di dare origine ad altri tipi cellulari. Alcune cellule di D.melanogaster sono in grado di fare ciò e sono dunque anche loro un sistema eccellente per studiare i fattori epigenetici durante la rigenerazione cellulare.
La possibilità di manipolare i fattori epigenetici di cellule multipotenti è molto attraente per l’applicazione in terapia genica ed in medicina rigenerativa. Per poter sfruttare il potenziale della terapia
epigenetica è tuttavia necessario avere una conoscenza dettagliata
dei meccanismi molecolari attivi durante la riprogrammazione epigenetica. Per questa ragione propongo una serie di approcci biochimici e genetici per svelare i meccanismi coinvolti nell’identità delle
cellule staminali e negli eventi che rendono multipotente una cellula, sfruttando come sistema modello la D.melanogaster.
Giannandrea Maila (1), Mignogna Maria Lidia (1), Bianchi Veronica
(1), Vismara Elena Maria Carlotta (1), Bassani Silvia (2), Maida Simona (3), Matafora Vittoria (4), Bachi Angela (4), Menegon Andrea
(3), Passafaro Maria (2), D’Adamo Patrizia (1)
(1) DTI - DIBIT, San Raffaele Scientific Institute, Via Olgettina 58, 20132, Milan, Italy
(2) DTI - CNR, Milan, Italy
(3) NeuroTechnology Lab. Alembic (Advanced Light and Electron Microscopy
Bio-Imaging Centre), San Raffaele Scientific Institute, Milan
(4) Biomolecular Mass Spectrometry Unit, Division of Genetics and Cell Biology, San Raffaele Scientific Institute, Milan
L’obiettivo della nostra ricerca è la comprensione dei meccanismi
molecolari coinvolti nell’apprendimento e nella formazione della
memoria e per questo cerchiamo e studiamo i geni responsabili
del ritardo mentale (RM) non specifico associato al cromosoma X
(XLMR). Abbiamo così individuato delle mutazioni nei geni GDI1 e
RAB39B, i quali codificano due proteine funzionalmente correlate.
Infatti, GDI1 mantiene le proteine RAB legate al GDP nel citosol,
così che siano pronte per passare da una conformazione inattiva
(quando legate al GDP) ad uno stato attivo (legate al GTP). Sono
note più di 60 diverse RAB e il loro ruolo in generale è quello di
controllare il traffico intracellulare di esocitosi, endocitosi e riciclo.
Mentre alcune RAB hanno funzioni ben descritte in particolari vie
di traffico vescicolare, il ruolo di altre RAB non è ancora stato
identificato.
In due famiglie MRX abbiamo recentemente identificato due diverse
mutazioni nel gene RAB39B, le quali causano l’assenza della corrispondente proteina. I pazienti di entrambe le famiglie presentano
un RM da moderato a severo ed alcuni di loro manifestano anche
epilessia, macrocefalia e autismo. RAB39B è una delle RAB la cui
funzione è sconosciuta e dalla sua caratterizzazione abbiamo scoperto che è espressa prevalentemente nel cervello, in particolare
nei neuroni, che è parte di un traffico vescicolare che coinvolge
l’apparato di Golgi e che è importante per la formazione e/o il mantenimento delle sinapsi, poiché una riduzione del 70% della sua
espressione causa una diminuzione del 40% del numero di presinapsi. Per poter capire quali meccanismi molecolari sono alterati in
assenza di RAB39B, abbiamo cercato quali fossero le sue proteine
interattrici, gli effettori.
Il saggio dei due ibridi in lievito ci ha così permesso di identificare
PICK1 (Protein Interacting with C Kinase 1) come principale effettore di RAB39B.
Questa scoperta ci ha portato a focalizzare la nostra attenzione sul
ruolo di RAB39B nel traffico dei recettori neuronali, poiché PICK1 è
coinvolta nel traffico e nel posizionamento del recettore metabotropico mGluR7 e della subunità GluR2 dei recettori AMPA. Infatti
PICK1 agisce a livello sia pre- che post-sinaptico ed influenza la formazione di LTP e LTD.
In futuro analizzeremo le caratteristiche delle reti neuronali sviluppate in presenza o assenza di RAB39B tramite l’uso di micro-electrode arrays (MEAs). Inoltre, cercheremo le possibili alterazioni dell’eso-endocitosi di mGluR7 e GluR2 in neuroni ippocampali in cui
RAB39B non è espressa. Stiamo anche generando un topo knockout per RAB39B, che verrà utilizzato in studi di comportamento.
In conclusione, la mancanza di RAB39B causa una riduzione del numero di sinapsi, un fenotipo che correla con le caratteristiche del
RM e che potrebbe essere dovuto ad un’alterazione del traffico di
recettori neuronali. Se questo sarà il caso, i nostri studi potrebbero
condurre allo sviluppo di nuove e specifiche terapie farmacologiche
per il RM.
ABSTRACT N. 49
Dulbecco Telethon Institute - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
FANELLI FRANCESCA
TCR05003
815.720
Durata (anni): 5
Anno d’inizio: 2006
RECETTORI ACCOPPIATI A PROTEINE G: ANALISI STRUTTURA/FUNZIONE DI MUTAZIONI PATOGENETICHE
Felline Angelo, Seeber Michele, Fanelli Francesca
DTI - Department of Chemistry, University of Modena and Reggio Emilia, via
Campi 183, 41125 Modena
La Retinite Pigmentosa (RP) costituisce un gruppo di malattie umane ereditarie caratterizzate da degenerazione retinica e perdita della vista graduale e progressiva in circa 1.5 milioni di pazienti nel
mondo [Mendes HF et al. Trends Mol Med 2005, 11, 177-85]. Nonostante l’elevata eterogeneità genetica della sindrome, più di 120
mutazioni puntiformi riguardano il gene della rodopsina, pigmento
visivo che genera un segnale elettrico in risposta ad illuminazione.
La maggior parte delle mutazioni della rodopsina causano la forma
Autosomica Dominante (ADRP) della malattia (http://www.retinainternational.com/sci-news/rhomut.htm). Un’analisi recente di dati
pubblicati indica che 89% dei mutanti di rodopsina caratterizzati
biochimicamente sono misfoldati e, come tali, sono potenzialmente
trattabili con agenti farmacologici capaci di ripristinare la struttura
nativa (i.e. chaperon farmacologici) [Krebs, MP Et al. J Mol Biol
2010, 395, 1063-781]. Al momento, le proprietà strutturali di tali
mutanti sono sconosciute, cosa che limita la progettazione razionale
di agenti terapeutici.
Noi abbiamo intrapreso un progetto di screening computazionale fi-
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DULBECCO TELETHON INSTITUTE
nalizzato alla comprensione, attraverso la simulazione computazionale, dei determinanti strutturali dell’effetto patogeno della maggior
parte delle mutazioni spontanee della rodopsina [Felline, A et al.
Journal of Chemical Theory and Computation 2009, 5, 2472-2485:
Fanelli, F et al. FASEB J 2010, 24, 3196-209]. Simulazioni della denaturazione meccanica e termica della rodopsina combinate con le
analisi delle reti strutturali della proteina sono state effettuate sulla
forma nativa e su sets di mutanti misfoldati associati ad ADRP. La
distribuzione di nodi iperconnessi nella rete strutturale (hubs) riflette l’esistenza di comunicazione molecolare all’interno e tra i due poli
del fascio di eliche, aspetto legato all’evidenza che diverse mutazioni ADRP condividono il fenotipo nonostante le differenze topologiche
e chimico-fisiche della sostituzione. Grazie a questa comunicazione,
le mutazioni ADRP condividono una più o meno marcata abilità di ridurre le connettività degli hubs nel secondo loop extracellulare
(EL2), che costituisce gran parte del sito di legame del retinale e
contribuisce al core di stabilità della rodopsina. Questi risultati suggeriscono che il sito di legame del retinale può essere il target della
progettazione di farmaci basata sulla struttura. In questo contesto,
i nostri modelli computazionali possono essere utilizzati per la progettazione di ligandi capaci di ripristinare le proprietà strutturali
della forma nativa, e come tali, efficaci come chaperon farmacologici. Un altro suggerimento derivante dallo studio è che lo stesso ligando può essere efficace verso diversi mutanti ADRP.
una media di tre copie plasmidiche integrate per ogni vettore, in linea con quanto pubblicato in letteratura. Infine, le MPS-IH iPS sono
state iniettate in topi immunodeficienti per testare la formazione del
teratoma.
In conclusione, siamo riusciti ad isolare con successo diverse linee
di cellule iPS da pazienti MPS-IH. La completa caratterizzazione ha
rivelato la loro efficiente funzionalità e, quindi, il loro possibile impiego per studi riguardanti i complessi meccanismi coinvolti in questa malattia. In particolare, gli studi in corso sono rivolti a testare il
potenziale di differenziamento delle linee cellulari MPS-IH iPS nei
tessuti maggiormente colpiti da questa patologia, come osso, cartilagine e cellule neuronali.
ABSTRACT N. 51
Dulbecco Telethon Institute - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 1
SERAFINI MARTA
TCP07004
517.000
Durata (anni): 5
800.000
Durata (anni): 5
Anno d’inizio: 2008
Chignola Francesca (1), Gaetani Massimiliano (1), Org Toni (2),
Mollica Luca (1), Mannella Valeria (1), Zucchelli Chiara (1), Spitaleri
Andrea (1), Peterson Paert (2), Musco Giovanna (1)
Dulbecco Telethon Institute - Other Genetic Diseases
Telethon grant N.
TCR07003
BASI MOLECOLARI DELLA POLIENDOCRINOPATIA AUTOIMMUNE DI TIPOI: STUDI FUNZIONALI E STRUTTURALI SUL
DOMINIO PHD FINGER DELLA PROTEINA AIRE
ABSTRACT N. 50
Responsabile
MUSCO GIOVANNA
(1) DTI - S.Raffaele Scientific Institute, Via Olgettina 58, 20132, Milan, Italy
(2) Univerity of Tartu, Estonia
Anno d’inizio: 2008
La poliendocrinopatia autoimmune di tipo I (APECED) è una rara
malattia autosomica recessiva caratterizzata da fenomeni autoimmuni diretti principalmente contro il sistema endocrino. La sindrome si manifesta con candidiasi muco-cutanee, ipoparatiroidismo autoimmune, malattia di Addison e insufficienza gonadica. Nonostante
i progressi nelle terapie i pazienti hanno una bassa qualità di vita ed
un’aspettativa di vita estremamente ridotta. La malattia è causata
da mutazioni (puntiformi o delezioni) nel gene regolatore autoimmune AIRE che codifica per la proteina AIRE (~600 aminoacidi) la
cui funzione è tuttora poco chiara. Abbiamo recentemente dimostrato che AIRE funziona come attivatore di trascrizione associandosi direttamente alla proteina istone H3, tramite un nuovo meccanismo che coinvolge una porzione di AIRE denominata PHD finger. I
dettagli molecolari di tale meccanismo sono stati chiariti tramite la
struttura NMR del complesso di AIRE-PHD1 e un peptide corrispondente ai primi 10 aminoacidi dell’istone H3.
È noto inoltre che mutazioni all’interno di AIRE-PHD1 causano APECED; il nostro obiettivo è stato quello quindi di caratterizzare l’effetto di tali mutazioni nell’interazione con H3.
La funzione di una proteina è strettamente legata ai suoi interattori.
Al momento sono noti solo pochissimi interattori di AIRE, obiettivo
di questo progetto è di identificare ligandi di AIRE tramiti metodi
proteomici e di caratterizzare a livello atomico tali interazioni.
Obiettivo ultimo del progetto è di chiarire ulteriormente sia la funzione di AIRE che il suo ruolo nella patogenesi di APECED.
GENERAZIONE DI CELLULE STAMINALI PLURIPOTENTI INDOTTE (IPS) ISOLATE DA PAZIENTI AFFETTI DA MUCOPOLISACCARIDOSI DI TIPO IH (O SINDROME DI HURLER)
Gatto Francesca (1,2), Vallier Ludovic (4), Rovelli Attilio (3), Biondi
Andrea (2,3), Serafini Marta (1,2)
(1) DTI - STEMMPS unit, Centro di Ricerca M.Tettamanti, Ospedale San Gerardo, Via Pergolesi, 33, Monza, Italy; tel. 039-2332232 fax 039-2332167; email
address: [email protected]
(2) Fondazione M. Tettamanti, University of Milano-Bicocca, Monza
(3) Fondazione MBBM, Clinica Pediatrica, University of Milano-Bicocca, Monza
(4) MRC Centre for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, University of
Cambridge, UK
La mucopolisaccaridosi di tipo IH (MPS-IH) o sindrome di Hurler è
una malattia a carattere autosomico recessivo, appartenente alla
famiglia delle patologie metaboliche da accumulo lisosomiale. È originata da mutazioni nel gene IDUA che causano una deficienza dell’enzima a-L-iduronidasi. L’accumulo intra-cellulare dei substrati
non metabolizzati dall’enzima (in particolare, eparan e dermatan
solfato) in tutti i tessuti causa un progressivo deterioramento ed
anomalie funzionali in molteplici organi. Recentemente, è stato scoperta una nuova popolazione di cellule staminali pluripotenti, denominate induced Pluripotent Stem cells (iPS), che si possono isolare
con la riprogrammazione di cellule somatiche adulte in cui vengono
sovraespressi specifici fattori di pluripotenza.
Le iPS possiedono un profilo trascrizionale ed epigenetico simile alle
cellule staminali embrionali ed hanno la capacità di differenziarsi in
tutti i tipi cellulari appartenenti ai tre diversi foglietti embrionali. Nel
nostro studio, ci prefiggiamo l’obiettivo di impiegare le cellule iPS
come modello cellulare per delucidare alcuni meccanismi della malattia ancora sconosciuti, in particolare riguardanti il danno a livello
scheletrico e neuronale.
Prima di tutto, sono state isolate linee cellulari di fibroblasti umani
da biopsie cutanee di pazienti MPS-IH. In seguito, i fibroblasti affetti sono stati riprogrammati con quattro vettori lentivirali codificanti i
fattori di pluripotenza c-Myc, Sox2, Klf 4 and Oct-4. Circa quattro
settimane dopo, le prime colonie di iPS sono emerse in coltura; alcune linee di MPS-IH iPS sono state, quindi, selezionate e caratterizzate. L’analisi genetica delle cellule ottenute ha confermato il genotipo specifico della malattia, identico a quello precedentemente
valutato al momento della diagnosi. Le cellule sono state, quindi,
analizzate dal punto di vista morfologico ed è stata calcolata l’efficienza di isolamento (0.015%). Abbiamo, inoltre, valutato la positività per i marcatori di pluripotenza (Sox 2, Nanog, Oct-4 e TRA 1
60) ed il contenuto esogeno ed endogeno dei geni trasdotti. Successivamente, è stato calcolato il numero totale di integrazioni virali
nei vari cloni selezionati Le linee di MPS-IH iPS analizzate rivelano
ABSTRACT N. 52
Dulbecco Telethon Institute - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
SCORRANO LUCA
TCR07002
1.448.750
Durata (anni): 5
Anno d’inizio: 2007
IL RIMODELLAMENTO DELLE CRISTAE MITOCONDRIALI IN
VIVO: MODELLI ANIMALI PER LO STUDIO ED IL TRATTAMENTO DELL’ATROFIA OTTICA DOMINANTE
Soriano Maria Eugenia, Varanita Tatiana, Zaninello Marta, Scorrano
Luca
Dulbecco-Telethon Institute, Venetian Institute of Molecular Medicine - Via
Orus 2, 35129 Padova-ITALY
Optic Atrophy 1 (OPA1) è una proteina mitocondriale della famiglia
delle dinamine la cui mutazione provoca una degenerazione autosomica dominante del nervo ottico conosciuta come ADOA (autosomal
dominant optic atrophy). OPA1 è presente nella membrana interna
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DULBECCO TELETHON INSTITUTE
mitocondriale come proteina integrale e in forma solubile nello spazio intermembrana. OPA1 promuove la fusione mitocondriale che in
equilibrio con l’evento di fissione controllano la morfologia mitocondriale. Inoltre, OPA1 controlla la morfologia delle cristae mantenendone chiuse le giunzioni grazie alla formazione di oligomeri ad alto
peso molecolare. Questi oligomeri sono bersagli precoci durante l’apoptosi, e la loro disgregazione induce rimodellamento delle cristae
mitocondriali, rilascio del citocromo c e morte cellulare. In situ, la
sovraespressione di Opa1 stabilizza i complessi e protegge della
morte cellulare.
Allo scopo di chiarire il ruolo di OPA1 in vivo, abbiamo creato due
modelli di topi transgenici: (i) il primo sovraesprime sotto il controllo del promotore della beta actina nel locus HPRT del cromosoma X
una copia del transgene della variante 7 di Opa1 murina; (ii) e un
secondo nel quale il gene Opa1 è condizionalmente deleto.
Topi che sovraesprimono Opa1 (Opa1tg) sono vitali, fertili e non
manifestano alcun fenotipo. La sovraespressione di OPA1 si osserva
nel cervello, cuore, fegato, rene e muscolo scheletrico. Il consumo
di ossigeno e la capacità di ritenzioni di calcio mitocondriale non
sembrano essere alterati. Studi biochimici hanno evidenziato che i
mitocondri di topi Opa1tg hanno più complessi ad alto peso molecolare di OPA1. In seguito al trattamento la proteina “BH3 only protein” cBID, questi complessi sono più resistenti alla disgregazione e
vi è minor rilascio di cytocromo c. Per verificare l’importanza della
sovraespressione di Opa1 in vivo, abbiamo valutato la risposta ai
danni (i) da ischemia cerebrale indotta dall’occlusione della arteria
media cerebrale (Middle Cerebral Artery occlusion, MCAo) e (ii) da
ischemia e riperfusione nel cuore. Sezioni seriali del cervello mostrano un minore danno in topi Opa1tg 3 giorni dopo MCAo. Allo
stesso modo, il rilascio di LDH usato come marker del danno miocardico è minore nei topi Opa1tg. Inoltre, stiamo valutando il ruolo
di OPA1 mediante la sua deplezione condizionale di in cellule gangliarii della retina e nei neutrofili. L’insieme di questi risultati chiarirà il ruolo essenziale di questa proteina nei diverse tipi cellulari.
In conclusione, abbiamo dimostrato che la funzione antiapoptotica
di OPA1 è rilevante anche in vivo e perciò i nostri modelli murini sono un ottimo modello per lo studio dei processi cellulari regolati da
OPA1 in vivo.
di 50 mutazioni di UMOD, la maggioranza delle quali sono cambi
missenso che molto probabilmente alterano la conformazione della
proteina. Attraverso la caratterizzazione di diversi modelli cellulari
abbiamo dimostrato che le mutazioni di uromodulina portano ad un
difetto del trasporto intracellulare della proteina mutata e ritenzione
della stessa nel reticolo endoplasmatico (ER) (Bernascone et al.,
Traffic, 2006). Questi dati sono in accordo con quanto osservato
nelle biopsie renali di pazienti, ovvero la presenza di aggregati intracellulari di uromodulina, e con la marcata riduzione dei livelli urinari della proteina osservata nelle urine dei pazienti (Rampoldi et
al., Hum Mol Genet, 2003). Recentemente, abbiamo generato e caratterizzato il primo modello murino di UAKD, ovvero un topo transgenico per uromodulina mutata (Bernascone et al., Hum Mol Genet, 2010).
Questi animali sviluppano una malattia renale molto simile a quella
umana, caratterizzata da progressiva perdita della capacità di concentrazione delle urine, insufficienza renale cronica e danno tubulointerstiziale, con infiltrato infiammatorio e fibrosi. La ritenzione di
uromodulina mutata nel ER precede tutti gli altri sintomi e rappresenta un evento chiave nella patogenesi della malattia. I nostri risultati dimostrano chiaramente un effetto da “guadagno di funzione” delle mutazioni di uromodulina e costituiscono la base per studi
futuri che saranno indirizzati a capire quali segnali di stress sono
attivati nelle cellule che accumulano uromodulina mutata e qual’è il
contributo dell’infiammazione e della fibrosi nello sviluppo e progressione della malattia.
I risultati dei nostri studi hanno la potenzialità di identificare bersagli terapeutici che saranno testati nel modello murino con la prospettiva di poter essere applicati anche ad altre malattie tubulo-interstiziali del rene o ad altre malattie da accumulo.
ABSTRACT N. 54
Dulbecco Telethon Institute - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
ABSTRACT N. 53
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
RAMPOLDI LUCA
TCR08006
800.000
Durata (anni): 5
TCR07005
800.000
Durata (anni): 5
Anno d’inizio: 2008
MALATTIA POLICISTICA RENALE AUTOSOMICA DOMINANTE
(ADPKD): STUDI IN VITRO E IN VIVO PER COMPRENDERE I
MECCANISMI MOLECOLARI DELLA PATOLOGIA
Dulbecco Telethon Institute - Other Genetic Diseases
Responsabile
BOLETTA ALESSANDRA
Castelli Maddalena (1,2), Chiaravalli Marco (1), Boca Manila (1),
Wodarczyk Claas (1), Boletta Alessandra (1)
Anno d’inizio: 2009
(1) DTI - Dibit San Raffaele Scientific Institute, Via Olgettina, 58, 20132, Milan
(2) Università Vita Salute San Raffaele, Milan
MODELLI CELLULARI ED ANIMALI PER L’IDENTIFICAZIONE
DEI MECCANISMI DI PATOGENESI IN MALATTIE CISTICHE
RENALI ASSOCIATE A MUTAZIONI DI UROMODULINA
Il rene policistico autosomico dominante (ADPKD) è una delle malattie genetiche più comuni con un’incidenza di 1 su 1000. La caratteristica principale di questa malattia è il formarsi di cisti in entrambi i reni.
Mutazioni in due geni sono state associate con ADPKD: PKD1 e
PKD2. Il primo è responsabile per l’85% dei casi mentre il secondo
per il restante 15%.
Il principale interesse del nostro gruppo è di capire la funzione del
prodotto genico di PKD1, la Policistina-1 (PC-1). Questa è un recettore di membrana di 520 KDa coinvolto nell’induzione e mantenimento di uno stato differenziato in cellule epiteliali renali.
Il nostro laboratorio ha precedentemente riportato che PC-1 media
tubulogenesi, riarrangiamenti nel cistoscheletro di actina e migrazione cellulare in un modo dipendente da PI3kinase (Boca et al,
2007).
Più recentemente, abbiamo osservato che fibroblasti mancanti di
PC-1 (Pkd1-/-) non sono in grado di orientarsi correttamente durante la migrazione. Questo difetto dipende largamente da una
mancata capacità di organizzare il citoscheletro dei microtubuli.
Siccome la capacità delle cellule di orientarsi durante la migrazione
cellulare dipende da un complesso, detto di polarità, composto da
una protein chinasi C atipica (aPKC) e da due molecole chiamate
Par3 e Par6, abbiamo testato se PC-1 fosse in grado di regolare
questo processo. Abbiamo osservato che l’equilibrio del complesso,
ovvero la quantità di Par3 e Par6 legata ad aPKC cambia in assenza
di PC-1 con diminuita associazione di Par3 e una aumentata Par6.
Abbiamo quindi testato se PC-1 fosse in grado di associarsi direttamente al complesso. A questo scopo abbiamo utilizzato un nuovo
modello murino sviluppato nel nostro laboratorio, che permette la
visualizzazione della PC-1 endogena grazie all’inserimento di tags
multipli a valle del gene Pkd1 endogeno. Abbiamo osservato che
PC-1 co-immunoprecipita con aPKC e Par3, ma non con Par6, sia in
fibroblasti, che nei reni in vivo.
Schaeffer Céline (1), Bernascone Ilenia (1), Trudu Matteo (1), Perucca Simone (1), Brunati Martina (1), Amoroso Antonio (2), Ghiggeri GianMarco (3), Scolari Francesco (4), Rastaldi Maria Pia (5),
Devuyst Olivier (6), Rampoldi Luca (1)
(1) DTI - Molecular Genetics of Renal Disorders, Division of Genetics and Cell
Biology, San Raffaele Scientific Institute, Via Olgettina 58, 20132 Milan, Italy.
Phone: +39 0226434947; Fax: +39 9226434767; E-mail: [email protected]
(2) Dept of Genetics, Biology and Biochemistry, University of Turin, Turin
(3) Division of Nephrology, G. Gaslini Institute, Genoa
(4) Division of Nephrology, Hospital of Montichiari, Brescia
(5) Fondazione IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico, Milan
(6) Institute of Physiology, University of Zurich, Zurich
La malattia cistica della midollare renale (MCKD) (MIM 603860) e la
nefropatia iperuricemica familiare giovanile (FJHN) (MIM 162000)
sono malattie autosomiche dominanti caratterizzate da alterazione
della capacità di concentrazione delle urine, fibrosi tubulo-interstiziale, iperuricemia e gotta, cisti renali ed insufficienza renale cronica.
Non esistono ad oggi terapie specifiche, se non la dialisi ed il trapianto di rene. MCKD/FJHN sono causate da mutazioni del gene
UMOD che codifica per uromodulina e sono collettivamente chiamate
malattie renali associate ad uromodulina (UAKD) (Hart et al., J Med
Genet, 2002).
L’uromodulina è la proteina più abbondante nelle urine. È espressa
esclusivamente dalle cellule tubulari epiteliali del tratto ascendente
spesso dell’ansa di Henle (TAL) da dove è rilasciata nel lume tubulare. L’uromodulina esercita un ruolo protettivo contro le infezioni delle vie urinarie e la formazione di calcoli renali.
Il nostro progetto di ricerca ha lo scopo di identificare i meccanismi
molecolari di patogenesi di UAKD. Ad oggi sono state descritte più
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DULBECCO TELETHON INSTITUTE
Infine, per determinare il ruolo fisiologico di queste osservazioni abbiamo studiato lo sviluppo renale in un modello murino inattivato
per il gene Pkd1. Siccome aPKC e Par3 sono essenziali per un processo biologico chiamato convergent extension che è stato recentemente descritto giocare un ruolo nello sviluppo renale, abbiamo testato se PC-1 fosse in grado di regolare questo processo. Abbiamo
trovato che reni embrionali derivati da topi Pkd1-/- presentano un
difetto di convergent extension. Infine, abbiamo osservato che l’espressione della PC-1 e quella di Par3 sono regolati durante lo sviluppo renale in un modo molto simile.
Proponiamo un modello in cui PC-1 è in grado di regolare il complesso Par3/aPKC in diversi contesti, incluso un processo di convergent extension durante lo sviluppo renale che determina la diminuzione di diametro dei tubuli renali e ne previene la dilatazione e la
formazione di cisti.
Tel.050-995169, Fax. 050-578772, e-mail. [email protected]
(2) Department of Endocrinology and Kidney,University-Hospital of Pisa
INTRODUZIONE:
Abbiamo precedentemente dimostrato che la molecola infiammatoria aptoglobina (Hp), è un marker di obesità (Chiellini C et al., J Cell
Physiol, 2002; Chiellini C et al., J Clin Endocrinol Metab, 2004). L’obesità è definita come uno stato cronico di bassa infiammazione a
causa degli aumentati livelli sierici di molecole pro-infiammatorie.
L’infiltrazione macrofagica del TA (IMT) è un elemento chiave di
questa condizione, e insieme alla ridotta espressione di adiponectina, costituisce una delle cause dello sviluppo di insulino resistenza
ed epato-steatosi. Abbiamo recentemente dimostrato che Hp recluta i monociti in vitro (Maffei M. et al., BMC Biol, 2009). Scopo di
questo studio è stato valutare il ruolo di Hp nel metabolismo, con
particolare riguardo al TA, al suo assetto infiammatorio e alla
espressione di specifiche adipochine. METODI: Topi Hp-/- e di controllo (WT) sono stati studiati in regime di dieta normale (CF) o in
seguito a dieta grassa (HFD). Cellule 3T3-L1 e adipociti umani sono
stati trattati con Hp ricombinante. Biopsie di TA umano sono state
usate per studi di espressione genica.
RISULTATI:
I nostri dati indicano che gli adipociti murini rilasciano Hp e che l’induzione osservata in condizioni di obesità è specifica del TA. Il profilo metabolico nei topi Hp-/- e WT è stato valutato misurando i parametri fisici, la tolleranza al glucosio, il contenuto in trigliceridi del
fegato, i livelli ematici di leptina, insulina, glucosio e adiponectina.
Nessuno di queste variabili è risultata significativamente affetta dal
genotipo. Le differenze si sono invece rivelate in seguito a trattamento con HFD.
I topi Hp-/- obesi sono risultati più insulino sensibili rispetto ai WT
obesi e, al contrario di questi, non hanno sviluppato la tipica epatomegalia/steatosi. Inoltre, i topi Hp-/- mostrano livelli di adiponectina più elevati. Coerentemente con questa osservazione, il trattamento di cellule 3T3-L1 e adipociti umani con Hp inibisce l’espressione di adiponectina. Inoltre i topi Hp-/- obesi mostrano una minore IMT rispetto ai topi obesi WT, in accordo con quanto precedentemente osservato in vitro dal nostro gruppo (Maffei M. et al., BMC
Biol, 2009). Nel TA di soggetti umani obesi, l’elevata espressione di
Hp è associata con la maggior abbondanza di trascritti per TNF-alfa,
MCP-1 ed F4/80.
CONCLUSIONI:
In condizioni di obesità la mancanza di Hp protegge parzialmente
dall’insorgenza dell’intolleranza al glucosio e dell’epato-steatosi,
promuovendo meccanismi che aumentano i livelli di adiponectina e
riducono la infiltrazione macrofagica del TA. Inoltre, nel TA di soggetti umani obesi l’espressione di Hp è associata a quella di altri
markers infiammatori.
ABSTRACT N. 55
Dulbecco Telethon Institute - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
CALAUTTI ENZO
TCP06001
504.500
Durata (anni): 5
Anno d’inizio: 2006
RUOLO DELLA TRASDUZIONE DEL SEGNALE DI PI3-CHINASI
E AKT NELLA REGOLAZIONE DELLE CELLULE STAMINALI DEGLI EPITELI STRATIFICATI
Saoncella Stefania, Tassone Beatrice, Deklic Erika, Calautti Enzo
DTI -, Molecular Biotechnology Center, University of Turin, Via Nizza 52, 1026
Torino, tel: 011 6706411; fax: 011 6706432; e-mail: [email protected]
La comprensione dei segnali molecolari che regolano le due funzioni
chiave delle cellule staminali, cioè l’autorinnovamento e il differenziamento, è di importanza fondamentale per lo sviluppo di terapie
cellulari o geniche basate sull’ uso delle cellule staminali.
La fosfoinositide 3-chinasi (PI3K) e il suo effettore a valle Akt
(isoforme -1, -2 e -3) sono stati implicati nella regolazione delle
cellule staminali con modalità tessuto-specifica e contesto-dipendente. Lo scopo di questo studio è testare l’ ipotesi che la segnalazione dipendente da PI3K/Akt è anche un importante regolatore
dell’autorinnovamento e/o differeziamento delle cellule staminali
corneali, e pertanto che la manipolazione di questo pathway potrebbe migliorare le applicazioni terapeutiche dei cheratinociti staminali nelle malattie genetiche che colpiscono gli epiteli stratificati.
Nell’epitelio corneale umano in vivo, Akt attivo è riscontrabile specificamente nel limbo, l’area del tessuto maggiormente arricchita per
cellule staminali. In cheratinociti primari isolati dal tessuto limbare
e anche in cloni di cheratinociti derivati da singole cellule staminali
(olocloni), abbiamo trovato che l’attività di autorinnovamento delle
cellule è strettamente correlata al livello di attivazione dei segnali
molecolari dipendenti da Akt.
Inoltre, il potenziale di autorinnovamento dei cheratinociti è sostanzialmente ridotto da un’ inibizione transitoria del pathway di PI3K.
Sorprendentemente, il silenziamento di specifiche isoforme di Akt
tramite RNAi suggerisce che isoforme distinte potrebbero giocare
ruoli selettivi nella staminalità di queste cellule.
Questi risultati suggeriscono che la manipolazione farmacologica di
componenti individuali della via di segnalazione di PI3K/Akt potrebbe migliorare le nostre capacità di espandere le cellule staminali
epiteliali a scopo terapeutico, preservandone intatte le loro funzioni
di autorinnovamento e differenziamento.
PROGETTI DI RICERCA TELETHON
ABSTRACT N. 57
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Dulbecco Telethon Institute - Common/Complex Diseases
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
TCR07007
800.000
138.700
Durata (anni): 2
Anno d’inizio: 2008
Donati Chiara, Bernacchioni Caterina, Cencetti Francesca, Bruni
Paola
MAFFEI MARGHERITA
Durata (anni): 5
GGP08053
RUOLE DELL’ASSE SFINGOSINA CHINASI/SFINGOSINA 1FOSFATO NELLA RISPOSTA EVOCATA DA IGF-1 IN MIOBLASTI MURINI
ABSTRACT N. 56
Responsabile
BRUNI PAOLA
Dipartimento di Scienze Biochimiche, Università di Firenze - Viale GB Morgagni
50, 50134 Firenze
Anno d’inizio: 2008
Dati presenti in letteratura dimostrano che sfingosina 1-fosfato
(S1P) regola processi biologici fondamentali in cellule di muscolo
scheletrico. Questo lipide bioattivo è infatti responsabile dell’attivazione delle cellule satelliti, di cui stimola la proliferazione e del differenziamento di mioblasti (Bruni and Donati, Cell Mol. Life Sci. 65,
3725-3736,2008). Inoltre, poichè il metabolismo di S1P e le risposte mediate dai suoi recettori sono sotto il controllo di regolatori sia
fisiologici che patologici delle cellule muscolari scheletriche fra cui
L’APTOGLOBINA SVOLGE UN RUOLO CHIAVE NELL’INSORGENZA DELLE COMPLICANZE ASSOCIATE ALL’OBESITÀ
Lisi Simonetta (1,2), Gamucci Olimpia (1,2), Scabia Gaia (1,2),
Marchi Matilde (1,2), Santini Ferruccio (2), Maffei Margherita (1,2)
(1) DTI - University-Hospital of Pisa, Via Paradisa, 2, 56124, Pisa, Italy;
54
033-132 Abstract-11_ITA.qxd:telethon 021-234 Abstract
21-02-2011
15:54
Pagina 55
PROGETTI DI RICERCA TELETHON
PDGF, TNFalpha, e TGFbeta (Donati et al, FEBS Lett 581, 43844388, 2007); Cencetti et al, Mol Biol Cell. 21, 1111-1124, 2010;
Nincheri et al, Cell. Signal. 22, 1688-1699, 2010), lo sfingolipide
prende parte agli effetti biologici specifici esercitati da fattori di crescita e citochine coinvolti nel controllo della rigenerazione del muscolo scheletrico. Il fattore di crescita insulino-simile (IGF-1) è il
principale regolatore fisiologico delle cellule progenitrici del muscolo
scheletrico. La capacità di IGF-1 di regolare molteplici aspetti della
biologia del muscolo quali proliferazione, differenziamento, sopravvivenza e motilità è ben nota, sebbene i meccanismi molecolari della sua complessa azione biologica non siano ancora completamente
definiti. In questo studio abbiamo determinato se l’asse sfingosina
chinasi (SK)/S1P prende parte alle vie di segnalazione mediate da
IGF-1 nei mioblasti. I risultati che abbiamo ad ora ottenuto dimostrano che l’attività di SK viene aumentata in seguito alla stimolazione con IGF-1 (50 ng/ml). L’effetto del fattore di crescita non implica la regolazione trascrizionale di SK1 o SK2, in quanto il contenuto proteico delle due isoforme non varia; IGF-1 è invece responsabile della traslocazione a membrana di SK1 in seguito a fosforilazione mediata da ERK.
Degno di nota, l’inibizione farmacologica di SK o il silenziamento
specifico di SK1 è responsabile della riduzione dell’azione miogenica
di IGF-1. Inoltre, è stato anche preso in considerazione il possibile
ruolo modulatorio dell’azione di IGF-1 sulla via di degradazione di
S1P. È emerso che il fattore di crescita non modifica la degradazione di S1P poiché non altera il contenuto proteico di S1P liasi sebbene il silenziamento di tale enzima aumenti i livelli basali dei marker
miogenici, a sostegno della sua partecipazione alla regolazione dei
livelli intracellulari di S1P. È interessante notare che l’inibizione di
SK è responsabile del potenziamento della proliferazione indotta da
IGF-1. La modulazione negativa della duplicazione del DNA mediata
da IGF-1 da parte dell’asse SK/S1P dipende dal legame dello sfingolipide agli specifici recettori S1P1 e S1P3, in quanto il loro silenziamento porta ad una attenuazione dell’effetto biologico.
Il presente studio amplia la nostra conoscenza e la comprensione
del meccanismo grazie al quale IGF-1 regola la rigenerazione del
muscolo scheletrico, mettendo in evidenza nuovi possibili bersagli
molecolari per migliorare il riparo del muscolo scheletrico.
Cripto accelera la rigenerazione muscolare e determina ipertrofia
della fibra mentre, al contrario, la perdita/riduzione dell’espressione
di Cripto causa difetti della rigenerazione muscolare (i.e. fibre di
diametro ridotto). Inoltre, esperimenti in vitro ed ex vivo su fibre
isolate, dimostrano che Cripto induce proliferazione delle cellule satelliti agendo come antagonista di uno dei ligandi della famiglia del
TGFß, la Miostatina.
Le nostre evidenze sperimentali suggeriscono che l’antagonismo
funzionale tra Cripto e miostatina possa costituire un bersaglio farmacologico per incrementare la rigenerazione muscolare e la massa
muscolare scheletrica per scopi terapeutici.
ABSTRACT N. 59
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 1
La conoscenza dei meccanismi che regolano la proliferazione, autoriproduzione e differenziamento delle cellule progenitrici del musclo
scheletrico è essenziale per la progettazione di nuove strategie di rigenerazione nelle distrofie muscolari. In studi precedenti abbiamo dimostrato che la ciclina D3 è indotta durante il differenziamento di
mioblasti in vitro tramite meccanismi controllati da MyoD e pRb, due
fondamentali regolatori della miogenesi, e che MyoD induce un differenziamento difettivo in fibroblasti isolati da topi privi di ciclina D3
(Cenciarelli et al., Mol. Cell. Biol. 19, 5203-5217, 1999; De Santa et
al., Mol. Cell. Biol. 27, 7248-7265, 2007). I nostri studi sono ora focalizzati sulla definizione del ruolo funzionale della ciclina D3 nella rigenerazione muscolare. Come primo approccio, abbiamo inibito l’espressione della ciclina D3 in mioblasti in coltura tramite la tecnologia
della “RNA-interference”. Abbiamo osservato che mioblasti deprivati
di ciclina D3 presentano una ridotta capacità proliferativa e un’espressione prematura di tratti associati al differenziamento terminale.
La ciclina D3 gioca quindi un ruolo essenziale nel mantenimento di un
corretto equilibrio tra proliferazione e differenziamento dei mioblasti.
Abbiamo poi determinato che in vivo la ciclina D3 è espressa ad alti
livelli nel muscolo del topo nelle prime settimane post-nascita. Nel
muscolo adulto la ciclina D3 non è espressa, ma viene re-indotta, in
seguito a danno, nelle fasi precoci della rigenerazione muscolare. La
ciclina D3 è quindi espressa in vivo durante la miogenesi che avviene
post-nascita e durante la rigenerazione. Per identificare il ruolo della
ciclina D3 nel muscolo scheletrico, abbiamo usato topi geneticamente
deprivati di ciclina D3. Questi topi presentano una ridotta dimensione
corporea ma non hanno difetti evidenti nel muscolo. Abbiamo però
determinato che i muscoli privi di ciclina D3 contengono miofibre pù
piccole del normale e un numero ridotto di cellule satelliti. Inoltre, fibre espiantate da muscoli privi di ciclina D3 generano meno mioblasti
del normale. Quindi, la ciclina D3 sembra essere coinvolta nella crescita e nel mantenimento delle fibre muscolari controllando la funzione delle cellule satelliti. Stiamo attualmente analizzando una cinetica
di rigenerazione indotta da danno dei muscoli privi di ciclina D3. I
risultati sinora ottenuti indicano che 3 giorni dopo il danno i muscoli
privi di ciclina D3 contengono un numero inferiore di precursori proliferanti e, in concomitanza, un numero maggiore di piccole miofbre
di nuova sintesi.
GGP08120
261.800
Anno d’inizio: 2008
CNR-Istituto di Neurobiologia e Medicina Molecolare - Via del Fosso di Fiorano,
64 -00143- Roma
MINCHIOTTI GABRIELLA
Durata (anni): 3
199.000
Durata (anni): 3
De Luca Giulia, Ferretti Roberta, Mezzaroma Eleonora, Bruschi Marco, Caruso Maurizia
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Telethon grant N.
GGP08126
RUOLO DELLA CICLINA D3 NELLA REGOLAZIONE DELL’ ATTIVITÀ DELE CELLULE SATELLITI DURANTE LA RIGENERAZIONE MUSCOLARE
ABSTRACT N. 58
Responsabile
CARUSO MAURIZIA
Anno d’inizio: 2008
UN NUOVO BERSAGLIO MOLECOLARE PER LA TERAPIA DEL
DANNO MUSCOLARE E DELLE MIOPATIE
Guardiola Ombretta (1), Lafuste Peggy (2), Brunelli Silvia (3), Iaconis Salvatore (1), Andolfi Gennaro (1), Cossu Giulio (3), Carmeliet
Peter (2), Minchiotti Gabriella (1)
(1) Stem Cell Fate Laboratory, Institute of Genetics and Biophysics “A. BuzzatiTraverso”, CNR, Naples, Italy
(2) VIB Vesalius Research Center, K.U.Leuven, Leuven, Belgium
(3) Division of Regenerative Medicine, Stem Cells and Gene Therapy DIBIT H
San Raffaele, Milan, Italy
Il muscolo scheletrico ha una propria capacità di rigenerarsi, tuttavia, un danno muscolare esteso e le malattie muscolari degenerative, come le distrofie, possono portare ad un’alterazione della funzionalità muscolare. La capacità del tessuto muscolare di rigenerare
in modo efficace, dal punto di vista clinico, è oggetto di ricerca da
molti anni. Tuttavia, data la complessità del processo biologico, è
necessaria una più approfondita conoscenza dei meccanismi molecolari che controllano le varie fasi della rigenerazione muscolare per
poter utilizzare tali conoscenze nell’individuazione di nuove strategie terapeutiche. Scopo di questo progetto è quello di valutare il
potenziale valore terapeutico della proteina extracellulare Cripto nel
danno e nella rigenerazione muscolare. Cripto è un gene chiave nell’embriogenesi e nel differenziamento delle cellule staminali embrionali. I nostri dati svelano una nuova funzione di Cripto nella rigenerazione del muscolo scheletrico ed, in particolare, nella mobilizzazione delle cellule staminali muscolari, le cellule satelliti. I nostri risultati mostrano, per la prima volta, che Cripto non solo è riespresso in seguito a danno muscolare ma che svolge un ruolo funzionale nella rigenerazione muscolare. Infatti, risultati ottenuti in
modelli di danno muscolare indotto da cardiotossina (CTX), attraverso l’uso di vettori adenovirali (Adenovirus) e adenovirali associati (AAV), dimostrano che l’overespressione di una forma secreta di
ABSTRACT N. 60
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
ELVASSORE NICOLA
GGP08140
135.900
Durata (anni): 2
Anno d’inizio: 2008
REALIZZAZIONE IN VITRO DI UN MODELLO UMANO DI DISTROFIA MUSCOLARE PER LO SCREENING E LO SVILUPPO DI
NUOVE STRATEGIE TERAPEUTICHE
55
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15:54
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
Serena Elena (1,2), Zatti Susi (1,2), Zoso Alice (1,2), Lo Verso
Francesca (1,2), Cimetta Elisa (1,2), Elvassore Nicola (1,2)
(5) Unità di Medicina Molecolare, IRCCS Ospedale Pediatrico Bambino Gesù,
Roma
(6) U.O. Patologie Muscolari e Neuroimmunologia, IRCCS Fondazione Istituto
Neurologico C. Besta, Milano
(1) Dip. di Principi e Impianti di Ingegneria Chimica “I. Sorgato” - via Marzolo
9, 35131 Padova
(2) Venetian Institute of Molecular Medicine, via Orus 2, 35131 Padova
L’infiammazione è una caratteristica tipica dei muscoli distrofici e
gioca un ruolo nella progressione del danno. Il nostro scopo è dimostrare che la citochina infiammatoria IL-6 sia un mediatore centrale
dell’infiammazione, danno e degenerazione muscolare e della
osteoporosi nella DMD. Lo scopo ultimo è quello di produrre il razionale per un trattamento anti-infiammatorio che possa essere più efficace e con minori effetti collaterali di quello disponibile basato sui
glucocorticoidi (GC).
IL-6 è altamente espressa nei muscoli dei topi distrofina-deficienti
(mdx) e dei pazienti con DMD, in particolare nelle cellule infiammatorie infiltranti. I livelli sierici di IL-6 sono alti nei pazienti con DMD
rispetto ai controlli e i livelli pre-terapia steroidea correlano con la
funzionalità muscolare (North Star) a 6 anni di età.
Per valutare l’effetto di IL-6 sulla malattia muscolare in topi abbiamo usato due approcci. Incrociando topi mdx con topi overesprimenti IL-6 a livello sistemico (mdx/IL6) abbiamo osservato che la
overespressione di IL-6 peggiora il fenotipo muscolare: a) i muscoli
dei topi mdx/IL6 mostrano aumentato numero di cellule CD45+,
aree necrotiche più grandi, e presenza diffusa di fibre centro-nucleate (suggestive di rigenerazione difettiva); b) maggior compromissione della performance funzionale; c) andatura incerta a età
giovanile e mortalità elevata. Utilizzando un approccio terapeutico
con un anticorpo anti-IL-6R abbiamo osservato un significativo miglioramento del fenotipo muscolare: a) riduzione delle aree necrotiche nel diaframma; b) aumentata espressione di citochine anti-infiammatorie (IL-1Ra, Il-10, sTNFRII); c) miglioramento della
performance su tapis roulant; d) protezione delle fibre muscolari
dal danno meccanico causato dall’esercizio.
La caratterizzazione dell’infiltrato infiammatorio e del profilo citochinico in muscoli di pazienti con DMD ha mostrato: a) cellule CD45+
con macrofagi sia M1 che M2 e producenti IL-6 e TNFalfa; b) aumentata espressione di classiche citochine infiammatorie (p.e. TNFalfa, MCP-1, IL-6) e di fattori profibrogenici (TGFbeta); c) nessuno
di questi parametri è correlato con la funzionalità muscolare a 6 anni. Ciò suggerisce che, a differenza della IL-6 sierica, la valutazione
di un singolo parametro in biopsia non è correlato alla perdita di
funzionalità muscolare. Abbiamo anche valutato il ruolo di IL-6 nell’indurre perdita di osso: a) circa il 50% dei pazienti presenta ridotta massa ossea, associata ad un aumento di NTx (un marcatore di
riassorbimento osseo); b) topi mdx hanno ridotto osso corticale e
trabecolare con aumentati osteoclasti e ridotti osteoblasti; c) sieri di
pazienti con DMD inducono aumentata osteoclastogenesi e inibiscono la funzione osteoblastica; d) in colture di osso (calvaria) sieri di
topi mdx inducono attività osteoclastica che viene inibita dalla neutralizzazione di IL-6. I nostri risultati aprono nuove prospettive per
approcci anti-IL-6.
La realizzazione di un modello in vitro di muscolo scheletrico umano
rappresentativo di patologie genetiche, quali la Distrofia Muscolare
di Duchenne, apre nuove prospettive nello sviluppo di strategie terapeutiche innovative.
Scopo principale di questo progetto di ricerca è lo sviluppo di un
modello in vitro di miotubi distrofici umani per screening highthroughput e per lo sviluppo di nuove terapie.
Attraverso un’opportuna progettazione del microambiente di coltura, è stato possibile controllare e migliorare il differenziamento funzionale di mioblasti umani provenienti da individui sani e pazienti
distrofici.
In particolare, allo scopo di aumentare il grado di differenziamento
dei mioblasti umani, sono stati ottimizzati: le proprietà meccaniche
(modulo elastico, E) e biochimiche (proteine d’adesione della matrice extracellulare) del substrato, l’organizzazione topologica delle
cellule a livello micrometrico (micropatterning) e le densità cellulari
locali e globali. È stato sviluppato un idrogel elastico di poliacrilammide foto-polimerizzabile, con proprietà meccaniche simili a quelle
del tessuto in vivo (E= 12, 15, 18, 21 kPa), la cui superficie è stata
funzionalizzata attraverso l’adsorbimento di proteine d’adesione (laminina, fibronectina e matrigel) organizzate in un micro-pattern a
corsie parallele (con larghezza e spaziatura comprese tra 100 e 500
µm).
Durante il progetto è stato dimostrato come il differenziamento funzionale di mioblasti umani sia guidato principalmente dall’elasticità
del substrato: miotubi coltivati su idrogel elastici (E=15kPa) con un
pattern proteico di matrigel (corsie larghe 500 µm) mostrano un
marcato differenziamento funzionale con la più alta percentuale
(60,0±3,8%) di miotubi aventi una definita organizzazione sarcomerica dell’alfa-actinina e della catena pesante della miosina II dopo 7 giorni. Miotubi sani coltivati in queste condizioni inoltre, hanno
una significativa espressione di distrofina localizzata a livello della
membrana cellulare. La maturazione funzionale dei miotubi è stata
valutata attraverso analisi del calcio.
È stata inoltre sviluppata una piattaforma microfluidica ad hoc, al fine di sviluppare e testare nuovi approcci terapeutici su miotubi
umani distrofici in maniera automatizzata, robusta e highthroughput. La piattaforma, oltre ad essere biocompatibile, presenta tre caratteristiche fondamentali: i) è stata progettata per essere facilmente interfacciata alla micro-coltura di miotubi umani; ii) permette di generare flussi compartimentalizzati (fino ad 8), stabili ed a
concentrazioni note e controllate; iii) permette un controllo temporale altamente definito delle stimolazioni imposte. Per fornire la
prova di fattibilità di test di terapia genica nella piattaforma, sono
stati condotti degli esperimenti di infezione con adenovirus codificanti GFP. Test in vitro di terapia cellulare sono in via di sviluppo.
In questo progetto, tramite un’adeguata progettazione del microambiente di coltura, il differenziamento funzionale di mioblasti
umani è stato significativamente migliorato rispetto alle tradizionali
tecniche di coltura. Sono stati inoltre sviluppati miotubi umani funzionali sani e distrofici potenzialmente utili per studi fisiologici e fisiopatologici.
ABSTRACT N. 62
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
ABSTRACT N. 61
DE BENEDETTI FABRIZIO
Totale
529.126
Telethon grant N.
Num Centri: 5
GGP06119
Durata (anni): 2
GGP07006
268.400
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2007
BASI MOLECOLARI DELL’AZIONE TERAPEUTICA DEL NITROFLURBIPROFENE (HCT1026), UN ANTI-INFIAMMATORIO CHE
RILASCIA NITROSSIDO, NELLA DISTROFIA MUSCOLARE:
ANALISI DELLA SRUTTURA E FUNZIONALITÀ DEI MITOCONDRI NELLA RIGENERAZIONE E SVILUPPO MUSCOLARE
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
CLEMENTI EMILIO
Anno d’inizio: 2006
De Palma Clara (4), Sciorati Clara (1), Falcone Sestina (4), Touvier
Thierry (3), Pisoni Serena (4), Buono Roberta (4), Pambianco Sarah
(4), Brunelli Silvia (1,2), Clementi Emilio (1,3,4)
RUOLO DI INTERLUCHINA-6 NELLA DISTROFIA MUSCOLARE
DI DUCHENNE
(1) Divisione Medicina Rigenerativa, IRCCS H San Raffaele, Milano
(2) Dipartimento Medicina Sperimentale, Università Milano Bicocca, Monza
(3) IRCCS E. Medea, Bosisio Parini
(4) Unità Operativa di Farmacologia Clinica, Dip Scienze Cliniche L. Sacco, Università di Milano, Via GB Grassi 74, 20157 Milano. Tel 0250319640; Fax
0250319646
Pelosi Laura (2), Rufo Anna (3), Carvello Francesco (1), D’Amico
Adele (5), De Pasquale Loredana (1), Berardinelli Maria Grazia (2),
Del Fattore Andrea (3), Morandi Lucia (6), Bianchi Maria Luisa (4),
Bertini Enrico (5), Musarò Antonio (2), Teti Anna (3), De Benedetti
Fabrizio (1)
Nostri studi recenti hanno dimostrato che la combinazione di un donatore di NO e dell’attività antinfiammatoria non steroidea ha effetto
terapeutico in modelli murini di distrofia muscolare (Brunelli et al,
Proc Natl Acad Sci U S A. 104: 264-269, 2007).
Abbiamo ora osservato che una combinazione di farmaci approvati
(1) Unità di Reumatologia, IRCCS Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Piazza S.
Onofrio 4, 00165 Roma, Tel 0668592309 e-mail: [email protected]
(2) Dip. Istologia Embriologia Medica, Università di Roma La Sapienza
(3) Dip. Medicina Sperimentale, Università dell’Aquila
(4) IRCCS Istituto Auxologico Italiano, Milano
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
per uso umano, il donatore di NO isosorbide dinitrato e il farmaco
antinfiammatorio non steroideo ibuprofene sono dotati di grande efficacia ed un ottimo profilo di sicurezza (Sciorati et al,Br J Pharmacol. 160: 1550-1560, 2010). Evidenze preliminari suggeriscono che
parte dell’effetto benefico di NO osservato coinvolgesse modifiche
nella dinamica mitocondriale. I mitocondri sono infatti organuli assai
dinamici in cui processi di fissione e fusione si alternano incessantemente. Studi recenti hanno dimostrato che queste dinamiche mitocondriali giuocano un ruolo rilevante nella funzionalità del muscolo
scheletrico; per esempio topi deficienti nei processi di fusione mitocondriale sviluppano una miopatia letale (Chen et al, Cell 141: 280289, 2010), mentre la sovraespressione delll’apparato fissogeno
causa atrofia muscolare (Romanello et al, EMBO J. 29: 1774-1785,
2010).
Drp1, o GTPasi relata alla dinamina 1, giuoca un ruolo cruciale nella
fissione mitocondriale (Labrousse et al, Mol Cell 4: 815-826, 1999).
Questa sua funzione è critica per la sopravvivenza cellulare come dimostrato dal fatto che topi privi di Drp1 mostrano anormalità nel
processo di sviluppo che portano a letalità dal giorno 12.5 di vita
embrionale (ishihara et al., 2009); nell’uomo una mutazione dominante negativa di drp1 è stata associata a mortalità perinatale Waterham et al, N Engl J Med. 356: 1736-1741, 2007). Nonostante
queste osservazioni il ruolo di Drp1 nella fisiopatologia muscolare
non era stato ancora investigato. Nel corso del presente progetto di
ricerca abbiamo dimostrato che l’allungamento mitocondriale è essenziale per l’inizio del processo di differenziamento miogenico e che
questo evento dipende dalla generazione intracellulare di NO. L’inibizione della generazione di NO in precursori miogenici portava ad inibizione della elongazione mitocondriale con inibizione della miogenesi. Questo effeto dell’assenza di NO era dovuto ad un aumento nella
attività, traslocazione ed aggancio al mitocondrio di Drp1, e si accompagnava ad una disfunzione mitocondriale latente che aumentava la sensibilità dei precursori miogenici alla morte per apoptosi. Gli
effetti dovuti alla inibizione della sintesi di NO non si osservavano in
precursori miogenici in cui fosse stata transfettata una proteina dominante negativa di Drp1 (K38A). Sia l’abrogazione da parte di NO
dell’azione di Drp1 che il mantenimento conseguente della corretta
funzionalità mitocondriale erano mediati dalla attivazione della guanilato ciclasi NO-dipendente, uno dei mediatori fisiologici dell’azione
di NO. Questi risultati, riportati in De Palma et al. (Cell Death Differ.
17: 1684-1696, 2010) svelano un nuovo livello di regolazione della
miogenesi in cui la morfologia e funzionalità mitocondriali sono interconnesse in modo inscindibile al differenziamento stesso.
Per studiare questi aspetti più in dettaglio, e comprendere il possibile ruolo di Drp1 nei meccanismi patogenetici sottostanti alla distrofia
muscolare, abbiamo generato un topo transgenico condizionale che
esprime Drp1 solo in presenza della Cre ricombinasi (TgDrp). Abbiamo inizialmente incrociato topi di questa linea con topi esprimenti la
Cre ricombinasi in modo muscolo specifico (MyoDCreK1); gli incroci
sono vitali ed i topi overesprimono Drp1 nel muscolo scheletrico. Risultati preliminari mostrano che questi topi hanno muscoli più piccoli
(ridotta area di sezione sagittale) che possono essere la conseguenza di un alterata funzionalità mitocondriale. Stiamo al momento studiando in questi topi l’effetto del danno muscolare acuto (indotto da
cardiotossina). Successivamente studieremo il ruolo di Drp1 nelle diverse fasi della miogenesi incrociando topi TgDrp con topi esprimenti
una Cre ricombinasi inducibile da tamossifene sotto il controllo di un
promotore muscolo specifico (MlcCreERT2).
muscolari, in assenza della distrofina, diventano più sensibili al danno muscolare che comporta infiammazione cronica, suscettibilità allo stress ossidativo, aumento della fibrosi e degenerazione del tessuto muscolare.
Molte delle mutazioni legate al gene della distrofina possono essere
curate tramite la strategia dell’exon skipping che permette, mediante l’esclusione di un determinato esone, il ripristino della corretta fase di lettura, portando così alla sintesi di una proteina più corta
ma funzionale. Un punto cruciale di questo approccio terapeutico è
la scelta di una sequenza antisenso che consenta una buona efficienza di skipping. I nostri risultati mostrano come per l’esone 51 la
più alta attività di skipping sia stata ottenuta utilizzando una molecola antisenso, inserita nel backbone dell’snRNA U1, diretta sia contro le giunzioni di splicing che contro una sequenza interna all’esone. La molecola selezionata è ora in fase pre-clinica. Analisi simili
sono in corso per l’ottimizzazione dello skipping dell’esone 45.
Sfruttando questa terapia abbiamo studiato il coinvolgimento dei
miRNA, fini regolatori dell’espressione genica, nella DMD. Tra i miRNA sovra-espressi nella patologia abbiamo identificato miR-31, che
ha come target il 3’UTR della distrofina. Tramite esperimenti in vitro
abbiamo dimostrato come, interferendo con l’attività di questo miR,
si possa migliorare il recupero di distrofina a seguito dell’exon-skipping, ed eventualmente di tutte quelle terapie volte al recupero dell’espressione della distrofina.
Abbiamo inoltre dimostrato che la presenza di miRNA muscolo-specifici (miR-1, miR-133 e miR-206) nel sangue di pazienti DMD può essere utilizzata come metodo diagnostico/outcome terapeutico della
patologia. I loro livelli correlano infatti con la severità della malattia.
Infine abbiamo individuato un gruppo di miRNA, sotto-espressi nella
patologia, il cui livello di espressione correla con la quantità di distrofina presente nella fibra. Il meccanismo da noi identificato mostra come la distrofina, oltre ad avere un ruolo strutturale, è in grado di influenzare l’espressione genica attraverso il pathway dell’ ossido nitrico. In assenza di distrofina si ha infatti delocalizzazione
dell’nNOS (neuronal nitric oxide synthase) dal sarcolemma con conseguente diminuzione dell’ossido nitrico intracellulare; questo fenomeno altera la S-nitrosilazione di HDAC2 e la sua associazione con
la cromatina. Tra i miRNA regolati da questo meccanismo ci sono
miR-1 e miR-133, coinvolti nell’induzione e nel mantenimento del
differenziamento muscolare terminale, e miR-29 e miR-30, coinvolti
nella regolazione della fibrosi.
ABSTRACT N. 64
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 4
BOZZONI IRENE
Totale
211.000
Num Centri: 1
Anno d’inizio: 2009
(1) Section of Medical Genetics, University of Ferrara, Ferrara
(2) Department of Histology, Microbiology & Medical Biotechnology, University
of Padova, Padova
(3) Lab. Musculoskeletal Cell Biology, Rizzoli Orthopedic Institute, Bologna
(4) Department of Life and Ambient Sciences, University of Piemonte Orientale
and INSTM, UdR Piemonte Orientale, Alessandria
GGP07049
Durata (anni): 3
515.700
Durata (anni): 2
Ferlini Alessandra (1), Rimessi Paola (1), Braghetta Paola (2), Bonaldo Paolo (2), Maraldi Nadir M (3), Sabatelli Patrizia (3), Sparnacci Katia (4), Laus Michele (4)
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Telethon grant N.
GGP09093
VALUTAZIONE PRE-CLINICA DI NANOPARTICELLE BIOCOMPATIBILI COME SISTEMA DI TRASPORTO DI OLIGORIBONUCLEOTIDI ANTISENSO PER INDURRE IL RIPRISTINO DI DISTROFINA TRAMITE “EXON SKIPPING”
ABSTRACT N. 63
Responsabile
FERLINI ALESSANDRA
Anno d’inizio: 2007
Abbiamo testato nel topo mdx e in cellule miogeniche diversi tipi di
nanoparticelle (NP) polimeriche core-shell come sistemi di trasporto
per oligoribonucleotidi antisenso 2’-O-metil-fosforotioato (AONs).
Nel topo mdx le NP ZM2, costituite da polimetilmetacrilato (PMMA)
e N-isopropilacrilammide, legano e trasportano gli AONs in modo
efficiente: iniezioni intraperitoneali (IP) di basse dosi (52.5mg/kg)
di ZM2-AON ripristinano la distrofina nei muscoli scheletrici e nel
cuore, permettendo la localizzazione della proteina nel 40% delle fibre muscolari con skipping dell’esone 23 (RealTime-RT-PCR) fino al
20%, misurabile anche nel muscolo liscio erettore del pelo. Questa
struttura istologica di facile accesso potrebbe essere un interessante biomarker meno invasivo rispetto alla biopsia muscolare. Un
gruppo di topi mdx è stato analizzato a distanza di un lungo periodo
(12 settimane) dalla fine del trattamento con ZM2-AON. Nei topi
trattati la proteina è ancora presente fino a 3 mesi dopo l’interruzione del trattamento. Lo skipping dell’esone 23 è circa il 10% in
USO DELL’RNA PER LA TERAPIA DELLA DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE: PRODUZIONE E VALIDAZIONE DI COSTRUTTI ANTISENSO CAPACI DI INDURRE EXON SKIPPING
IN DIVERSI TIPI DI MUTAZIONI DMD
Martone Julie, Cazzella Valentina, Cacchiarelli Davide, Incitti Tania,
Sthandier Olga, Pinnarò Chiara, Cesana Marcella, Legnini Ivano,
Bozzoni Irene
Dept. of Biology and Biotechnology “C. Darwin” Sapienza - University of Rome
- P.le A. Moro 5 00185 Rome Italy tel: +39 6 49912202 fax: +39 6 49912500
email: [email protected]
La Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD) è una malattia neurodegenerativa causata da mutazioni nel gene della distrofina. Le fibre
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21-02-2011
15:54
Pagina 58
PROGETTI DI RICERCA TELETHON
tutti i muscoli analizzati, compreso il cuore. La proteina distrofina è
chiaramente visibile e correttamente localizzata nel sarcolemma
delle fibre muscolari scheletriche, con una percentuale di fibre di
positive del 7-40%, confermata da western blotting. Anche i topi
trattati con la stessa quantità di AON nudo mostrano una debole
positività, sia a livello di RNA (skipping fino al 6%) che di proteina
(positività del 5-15%). I nostri risultati confermano l’effetto protettivo e di lento rilascio che le nanoparticelle ZM2 esercitano sull’AON, con conseguente persistenza dello skipping e dell’espressione della proteina distrofina, non osservati utilizzando i AON nudi.
Abbiamo inoltre testato un altro tipo di NP costituita da PMMA (Z2),
per trasportare AONs in cellule miogeniche sane (WT) e in cellule
miogeniche di paziente, e abbiamo dimostrato che esse legano e
trasportano AONs fluorescenti all’interno delle cellule muscolari, inducendo skipping specifici nelle cellule WT, fino a 5 giorni dopo la
trasfezione, senza alcun effetto tossico per le cellule in coltura. Nelle cellule WT trattate con Z2-AON i livelli di skipping sono più elevati rispetto all’uso dei AONs nudi , invece nelle cellule di paziente
non è stato osservato un significativo miglioramento. Stiamo valutando la biodistribuzione in vivo (modelli animali) di diversi composti NP-AON (tramite Odyssey), poiché e fondamentale conoscere la
diffusione tissutale dei composti per ottimizzare la efficacia del trattamento. Le vie di somministrazione saranno sia IP che orale. Abbiamo infatti evidenze che I complessi NP-AON passino la barriera
gastrica e inducano recupero della espressione di distrofina nel muscolo liscio intestinale. Sono in corso studi tramite somministrazione orale di NP-AON anche utilizzando nuovi composti con maggiore
capacita di legame per molecole antisenso.
man Mol Genetics; 1;19(5):752-60, 2010). Questo è il primo esempio di modello transgenico che esprime un fattore trascrizionale artificiale di tipo “zinc finger” e i risultati ottenuti indicano che il “targeting” trascrizionale di geni endogeni è uno strumento terapeutico
potenzialmente efficace nella cura della DMD e di altre malattie genetiche. Con l’attuale progetto ci proponiamo di veicolare fattori
trascrizionali sintetici ZFP TFs basati su Jazz direttamente nel topo
distrofico, mediante vettori virali Adeno-Associati ricombinanti
(rAAV) con alta affinità per il tessuto muscolare e progettati in modo che esprimano il gene terapeutico sotto il controllo di un promotore muscolo specifico. Abbiamo messo a punto un efficiente metodo di preparazione e purificazione di rAAV capaci di infettare le cellule muscolari sia in vitro che in vivo. I primi esperimenti di iniezione sistemica in topi neonati con il vettore AAV6-EGFP hanno dimostrato buoni livelli di infezione e di espressione del gene “reporter”
EGFP nel muscolo e non in altri tessuti. Anche l’iniezione di AAV6Jazz ha prodotto, come atteso, l’espressione di Jazz nelle fibre muscolari in co-localizzazione con i nuclei.
ABSTRACT N. 66
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
MATTEI ELISABETTA
Totale
124.000
Telethon grant N.
Num Centri: 1
329.900
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2008
Benedetti Sara (1,2), Tedesco Francesco Saverio (1), Hoshiya Hidetoshi (1), D’Antona Giuseppe (3), Gerli Mattia F.M. (1), Tonlorenzi
Rossana (1), Chaouch Soraya (4), Mouly Vincent (4), Antonini Stefania (1), Torrente Yvan (5), Kazuki Yasuhiro (6), Lombardo Angelo
(7,8), Naldini Luigi (7,8), Bottinelli Roberto (3), Messina Graziella
(1,9), Oshimura Mitsuo (6), Cossu Giulio (1,9)
GGP10094
Durata (anni): 2
GGP08030
IMMORTALIZZAZIONE REVERSIBILE DI MESOANGIOBLASTI
UMANI DISTROFICI CON UN CROMOSOMA UMANO ARTIFICIALE ESPRIMENTE LA DISTROFINA PER LA TERAPIA CELLULARE DELLA DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE
ABSTRACT N. 65
Responsabile
COSSU GIULIO
Anno d’inizio: 2010
TERAPIA GENICA SPERIMENTALE DELLA DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE CON FATTORI TRASCRIZIONALI SINTETICI CHE AUMENTANO I LIVELLI DI UTROFINA, UNA PROTEINA CHE PROTEGGE DAI DANNI CAUSATI DALLA MANCANZA DI DISTROFINA
(1) Division of Regenerative Medicine, San Raffaele Scientific Institute, via Olgettina 58, 20132, Milan, Italy, telephone+390226434954, Fax:
+390226434621, E-mail: [email protected]
(2) Department of Histology and Medical Embryology, University of Rome, La
Sapienza, Rome
(3) Department of Physiology and Interuniversity Institute of Myology, University of Pavia, Pavia
(4) Université Pierre et Marie Curie/Paris 6/Inserm UMR_S 974, CNRS UMR
7215, Institut de Myologie, Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière, Paris
(5) Stem Cell Laboratory, Department of Neurological Science, University of
Milan, Fondazione IRCCS Policlinico Mangiagalli-Regina Elena, Milan,
(6) Department of Biomedical Science, Institute of Regenerative Medicine and Biofunction, Graduate School of Medical Science, Tottori University, Yonago, Tottori
(7) San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy, Division of Regenerative
Medicine, Stem Cells and Gene Therapy, San Raffaele Scientific Institute, Milan
(8) Vita Salute San Raffaele University, San Raffaele Scientific Institute, Milan
(9) Department of Biology, University of Milan, Milan
Passananti Claudio (2), Strimpakos Georgios (1), Onori Annalisa
(2), Pisani Cinzia (2), Di Certo Maria Grazia (1), Severini Cinzia (1),
Luvisetto Siro (3), Corbi Nicoletta (2), Mattei Elisabetta (1)
(1) Laboratorio Transgenici - IBCN (ex Istituto di Neurobiologia e Medicina Molecolare), CNR – ROMA - Via del Fosso di Fiorano, 64 - 00143 - Roma. Tel.
+39.06.50170323 - FAX +39.06.501703313 - email: [email protected]
(2) Laboratorio ZIF - Istituto di Biologia e Patologia Molecolari, CNR – Roma
(3) IBCN (ex Istituto di Neuroscienze), CNR - Roma
La Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD) colpisce un individuo
maschio ogni 3000 nati ed è una malattia genetica, causata da una
mutazione sul cromosoma X, per la quale non esiste ancora una cura efficace. La DMD è caratterizzata da una progressiva degenerazione dei muscoli dovuta all’assenza della distrofina e la sua cura
dipende dallo sviluppo di terapie innovative mirate ad aumentare
l’attesa e la qualità di vita dei pazienti distrofici. L’aumento di
espressione di geni correlati alla distrofina, come l’utrofina, rappresenta una promettente strategia terapeutica grazie alla sua capacità di sostituire funzionalmente la distrofina, senza provocare le
reazioni immunitarie che si manifestano in pazienti DMD sottoposti
a terapia genica con il gene della distrofina.
Sono stati proposti diversi approcci sperimentali per aumentare i livelli di utrofina nel muscolo. Il nostro gruppo di ricerca ha progettato un fattore trascrizionale sintetico di tipo zinc finger (ZFP-TF),
chiamato “Jazz”, che lega specificamente il promotore dell’utrofina
e ne aumenta i livelli in vitro (Onori et al, Biochem Cell Biol.
Jun;85,3, 2007; Desantis et al, Neuromusc Dis, 19,2:158-62,
2009). Abbiamo realizzato un topo transgenico che esprime Jazz
sotto il controllo di un promotore muscolo-specifico e abbiamo verificato un effettivo aumento dei livelli di espressione di utrofina nel
muscolo (Passananti et al, Methods Mol Biol.;649:183-206. 2010;
Mattei et al. PLoS ONE. Aug 22;2:e774, 2007). Il topo transgenico
Jazz è stato poi incrociato con un ceppo di topi distrofici mdx (murine dystrophy X-linked) e, attraverso analisi istologiche e fisiologiche, abbiamo dimostrato una riduzione del danno muscolare e un
notevole recupero della forza e della resistenza muscolare nei topi
mdx-Jazz rispetto ai fratelli di nidiata distrofici (Di Certo et al, Hu-
La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una malattia genetica
dovuta all’assenza della distrofina, la quale genera un progressivo
deterioramento del tessuto muscolare portando infine ad una prematura morte. Questo progetto si prefigge di sviluppare un nuovo
approccio di terapia cellulare per la DMD, basato sul trapianto di
mesoangioblasti (MABs, progenitori associati ai vasi) umani distrofici, previa correzione del difetto genetico con un cromosoma artificiale umano (HAC) contenente l’intero locus della distrofina (DYSHAC). Gli HACs presentano diversi vantaggi rispetto ai vettori comunemente adottati per la terapia genica, quali il mantenimento in
forma episomale e la capacità di contenere intere regioni geniche
comprensive d’elementi regolatori. Tuttavia, non ci sono prove di
terapie efficaci per patologie genetiche basate sull’uso degli HACs.
Qui di seguito riportiamo la possibilità di trasferire il DYS-HAC in
MABs murini distrofici (mdx(DYS-HAC)MABs). Gli mdx(DYSHAC)MABs hanno colonizzato efficacemente il muscolo scheletrico di
topi distrofici, producendo un considerevole numero di fibre esprimenti la distrofina le quali hanno permesso un significativo e stabile
miglioramento morfologico e funzionale del fenotipo distrofico. Possiamo quindi affermare che la terapia genica basata sugli HACs si è
dimostrata efficace in un modello pre-clinico di DMD, gettando le
basi per la sua futura applicazione clinica con i mesoangioblasti
umani (hMABs). In questo caso, poichè in coltura i hMABs entrano
in senescenza, è necessario un processo di immortalizzazione prima
del trasferimento del DYS-HAC. L’immortalizzazione è stata ottenu-
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
ta tramite trasduzione con vettori lentivirali “floxati” esprimenti
hTERT(iresHSV1-TK) e Bmi-1(iresHSV1-TK), per impedire l’accorciamento dei telomeri e promuovere il ciclo cellulare. Tre cloni sono
stati selezionati per l’espressione di hTERT e Bmi-1 e quindi caratterizzati per la capacità proliferativa, non tumorigenicità e potenziale miogenico in vitro. In seguito la stessa strategia è stata adottata
per immortalizzare i hMABs distrofici (DMD hMABs) prima del trasferimento di un nuovo DYS-HAC privato di transgeni immunogenici
(DYS-HAC2). Finora dal trasferimento del DYS-HAC2 sono stati ottenuti due cloni in cui la presenza dell’HAC è stata confermata sia
per PCR sia per FISH. Al momento stiamo testando la reversibilità
dell’immortalizzazione, tramite l’utilizzo di un lentivirus non integrante esprimente la Cre ricombinasi, e la potenzialità di tali cloni di
colonizzare il muscolo scheletrico distrofico formando fibre esprimenti la distrofina. Attualmente diverse strategie di terapia cellulare e genica stanno avvicinandosi alla sperimentazione clinica, ma finora solo l’exon skipping è risultato promettente. D’altra parte, una
larga parte di mutazioni che rimangono impossibili da riparare potranno trarre beneficio da una terapia cellulare basata sul trapianto
di cellule staminali contenenti l’intero locus della distrofina.
Centro Dino Ferrari, - Via F Sforza, 35 20122 Milano
(2) UMR S 787, INSERM/UPMC, Institut de Myologie, Facultè de Medecine Pierre et Marie Curie, Paris Cedex 13, France
(3) AADM/UNAERP Ribeirao Preto-SP-Brazil
La Distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una malattia monogenica legata al cromosoma X; la fisiopatologia è caratterizzata da degenerazione progressiva della muscolatura scheletrica e cardiaca. Il
gene mutato codifica per una proteina citoscheletrica, la distrofina.
Il malfunzionamento della distrofina si riflette sull’elasticità della fibra, portando alla sua degenerazione. Nonostante i numerosi approcci terapeutici intrapresi nel corso degli anni, la DMD rimane ad
oggi una patologia priva di cure efficaci e risolutive. Recenti progressi hanno permesso l’individuazione di una varietà di possibili
approcci terapeutici che riguardano sia trattamenti farmacologici,
che terapie genetiche che fanno uso di differenti tipi di cellule staminali identificati negli ultimi tempi. Una combinazione di queste
strategie potrebbe aumentare la possibilità di un successo in terapia. Recentemente, un’esclusione forzata (skipping) di un singolo
esone è stata utilizzata per ricostituire il quadro di lettura (reading
frame), dando così origine ad una proteina distrofina più corta, ma
funzionale in un modello animale della DMD. Abbiamo isolato le cellule staminali CD133+ da biopsie muscolari di cani Golden Retriever
affetti da distrofia muscolare (GRMD). I cani GRMD sono disponibili
nella facility AMM a San Paolo del Brasile. Le cellule sono state
iniettate nelle arterie succlavie e femorali di 7 cani GRMD di un anno di età: 5 cani sono stati trattati con cellule CD133+ ingegnerizzate, 2 con cellule non trasdotte. Il trapianto intra-arteria di cellule
staminali ingegnerizzate espanse in coltura ha consentito a queste
cellule di propagare l’effetto delle loro potenzialità rigenerative in
vivo. I cani GRMD non trattati hanno rappresentato i nostri controlli
negativi e due cani sani della stessa età e razza i nostri controlli positivi. Le cellule isolate dalle biopsie muscolari dei cani distrofici sono state trasdotte con un vettore lentivirale codificante per due
AONs in grado di permettere lo skipping degli esoni 6-7-8 dal momento che la mutazione è contenuta nel sito di splicing dell’esone
7. Abbiamo verificato l’espressione della distrofina mediante analisi
di RTPCR e Western blotting. Gli animali trapiantati sono stati analizzati a diversi tempi (6, 12 mesi dopo il trapianto) e le biopsie sono state valutate tramite colorazione ematossilina eosina e Azan
Mallory al fine di analizzare la morfologia dei tessuti. La presenza di
fibre distrofina positive è stata determinata mediante colorazioni in
immunofluorescenza. I cani sono stati monitorati per controllarne le
condizione di salute generale e la endurance paragonandoli ai cani
non trattati. Sono stati valutati: la temperatura, la frequenza cardiaca, respiratoria, cardiaca, il peso, le CK e la capacità di deglutire.
Sono stati condotti specifici test di deambulazione. I cani trattati
con le cellule CD133+ ingegnerizzate hanno mostrato un miglioramento della capacità motorie e dell’atrofia muscolare.
ABSTRACT N. 67
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
COSSU GIULIO
GUP07006
100.000
Durata (anni): 1
Anno d’inizio: 2008
ALLOTRAPIANTO DI MESOANGIOBLASTI PER LA DISTROFIA
MUSCOLARE DI DUCHENNE: TRIAL CLINICO DI FASE I/II
Cossu Giulio
Division of Regenerative Medicine, San Raffaele Scientific Institute, via Olgettina 58, 20132, Milan, Italy, telephone+390226434954, Fax: +390226434621,
E-mail: [email protected]
Questo progetto è dedicato alla creazione di un Scientific Advisory
Board (SAB) con il fine di aiutare la pianificazione del trial clinico “Allotrapianto di mesoangioblasti per la Distrofia Muscolare di Duchenne: trial clinico di fase I/II” programmato per il 2011.
Il Board è composto da by Robert Griggs (presidente, Rochester,
USA), Rudolph Korinthenberg (Freiburg, Germania), Alejandro Madrigal (London, UK), Eugenio Mercuri (Roma), Tiziana Mongini (Torino)
e Thomas Rando (Stanford, USA)Incontri con il SAB si sono svolti a
Milano, l’ultimo dei quali il 19 giugno 2010; il prossimo è previsto per
il mese di giugno 2011, dopo l’inizio del trial. L’Advisory Board si è incontrato con i PI del Trial Clinico per dare supporto alle preparazione
del Protocollo Clinico di uno studio mono-centrico, prospettico, sequenziale, non-randomizzato, aperto, di fase I-II “Terapia cellulare
della Distrofia Muscolare di Duchenne basata sul trapianto intra-arterioso di mesoangioblasti da donatore HLA-identico in regime di immunosoppressione con FK506”. Il protocollo prevede quattro infusioni
sequenziali a dosi scalari e a intervalli di due mesi l’una dall’altra. Le
prime due infusione in una arteria femorale e le ultime due in multipli
distretti arteriosi. L’obiettivo primario di questo studio è la verifica
dela sicurezza di infusioni multiple intra-arteriose, mentre l’obiettivo
secondario è la valutazione dell’effetto di queste infusioni nel modificare la forza muscolare dei pazienti.
ABSTRACT N. 69
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 1
GGP09292
98.100
Anno d’inizio: 2007
(1) Laboratorio di Biologia Vascolare e Medicina Rigenerativa, Centro Cardiologico Fondazione Monzino, Milano - Via Parea 4, 20138 Milano, Italy
(2) Lab di Patologia Vascolare, Istituto Dermopatico dell’Immacolata, Roma
(3) Istituto di Cardiologia, Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma
TORRENTE YVAN
Durata (anni): 2
119.300
Durata (anni): 2
Gentile Antonietta (2), Toietta Gabriele (2), Pazzano Vincenzo (3),
Crea Filippo (3), Capogrossi Maurizio (2), Di Rocco Giuliana (1)
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Telethon grant N.
GGP07106
PROGENITORI MIOGENICI DERIVATI DAL TESSUTO ADIPOSO PER IL TRATTAMENTO DELLA DISTROFIA MUSCOLARE
ABSTRACT N. 68
Responsabile
DI ROCCO GIULIANA
Anno d’inizio: 2009
L’analisi del potenziale miogenico di cellule derivate da diversi fonti
di tessuto adiposo umano ha evidenziato la presenza nel tessuto
adiposo epicardico di cellule in grado di differenziare verso il fenotipo muscolare. In particolare tale studio ha rivelato che non solo le
cellule mesenchimali presenti nel compartimento adiposo, ma anche le cellule derivate dallo strato epiteliale epicardico ad esso associate possono essere incorporate all’interno di miotubi scheletrici
in differenziamento. Abbiamo quindi analizzato e paragonato il potenziale miogenico e l’efficienza di fusione di tre linee primarie
umane non muscolari, specificamente le cellule epicardiche, le mesenchimali e le endoteliali, in condizioni di cocultura con mioblasti
primari. Abbiamo dimostrato che le cellule epicardiche fondono
spontaneamente con miotubi scheletrici con una efficienza che è si-
MODIFICAZIONE GENICA DI CELLULE STAMINALI DISTROFICHE ALLO SCOPO DI TRAPIANTO AUTOLOGO NELLA DISTROFIA MUSCULARE DI DUCHENNE
Meregalli Mirella (1), Farini Andrea (1), Belicchi Marzia (1), Parolini
Daniele (1), Razini Paola (1), Cassinelli Letizia (1), Sitzia Clementina (1), Angeloni Valentina (1), Maciotta Simona (1), da Silva Bizario Joao (3), Garcia Luis (2), Bresolin Nereo (1), Torrente Yvan (1)
(1) Stem Cell Laboratory, Department of Neurological Sciences, Università degli Studi di Milano, Fondazione IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico di Milano,
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
gnificativamente alta se paragonata a quella di cellule mesenchimali. Inoltre abbiamo evidenziato che, sebbene con un’efficienza minima, anche le cellule endoteliali sono potenzialmente in grado di fondere con i miotubi. In tutti i casi di fusione analizzati, una volta entrati nel miotubo i nuclei di cellule non muscolari sono riprogrammati
ad esprimere geni muscolo-specifici. La competenza di fusione determinata in vitro è correlata a quella in vivo ed è direttamente proporzionale alla capacità di ricostituire l’espressione di distrofina dopo
trapianto in topi mdx. Ulteriori dati hanno rivelato che l’efficienza di
fusione di diversi tipi cellulari non muscolari è correlata all’espressione della molecola di adesione VCAM1. Inoltre abbiamo evidenziato
che fattori solubili secreti da miotubi in differenziamento, come IL4 e
IL13, sono in grado di stimolare l’espressione di VCAM1 in cellule
non muscolari e che la presenza di VCAM1 è necessaria per il processo di fusione.
Questi risultati sono applicabili anche alla fusione tra mioblasti e
miotubi, e dimostrano per la prima volta che l’effetto di citochine come IL4 sull’accrescimento delle fibre muscolare è mediato, almeno
in parte, dall’induzione di VCAM1.
Bianco Flaviana (1), Rossi Francesca (12), Motta Maria Chiara (4),
Sacco Annalisa (1), Donati Maria Alice (13), Mongini Tiziana (12),
Pini Antonella (11), Battini Roberta (9), Pegoraro Elena (10), Pane
Marika (1), Previtali Stefano (14), Gasperini Serena (13), Napolitano Sara (14), Martinelli Diego (1), Bruno Claudio (7,9), Vita Giuseppe (5), Comi Giacomo (3), Bertini Enrico (6), Mercuri Eugenio (1)
(1) Department of Paediatric Neurology, Catholic University, Rome, Italy
(2) Biostatistics Unit, Dep of Health Sciences, University of Genoa, Italy
(3) Department of Neurological Sciences, IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico,
University of Milan, Italy
(4) Child Neurology and Psychiatry Unit, IRCCS “C. Mondino” Foundation, University of Pavia, Italy
(5) Department of Neurosciences, Psychiatry and Anaesthesiology, University
of Messina, Messina, Italy
(6) Department of Laboratory Medicine, Unit of Molecular Medicine, Bambino
Gesù Hospital, Rome, Italy
(7) Neuromuscular Disease Unit, G. Gaslini Institute, Genoa, Italy
(8) Dipartimento di Medicina Sperimentale, Seconda Università di Napoli, Italy
(9) Department of Developmental Neuroscience, Stella Maris Institute, University of Pisa, Italy
(10) Department of Neurosciences, University of Padua, Padua, Italy
(11) Child Neurology and Psychiatry Unit, Maggiore Hospital, Bologna, Italy
(12) Neuromuscular Center, S.G. Battista Hospital, University of Turin, Italy
(13) Metabolic and Neuromuscular Unit, Meyer Hospital, Florence, Italy
(14) Department of Neurology, San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy
(15) Department of Paediatric Medicine, Unit of Metabolism, Bambino Gesù Hospital, Rome, Italy
ABSTRACT N. 70
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
PICCOLO STEFANO
GGP07218
305.700
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2007
BACKGROUND: Alcune valutazioni, quali il ‘Six minute walk test’
(6MWT), alcune prove temporizzate e la scala North Star Ambulatory Assessment (NSAA) sono state recentemente indicate come le
misure di outcome piu idonee in pazienti deambulanti affetti da distrofia muscolare di Duchenne (DMD). Per nessuna di queste misure son stati finora riportati dati longitudinali.
OBIETTIVI: Lo scopo di questo studio è quello di valutare longitudinalmente diverse misure di valutazione in un gruppo di pazienti
deambulanti affetti da DMD valutati per 12 mesi con lo scopo di
stabilire il range e lo spettro di possibili variazioni a 12 mesi anche
in relazione ad età e trattamento con steroidi.
METODI: 106 pazienti deambulanti affetti da DMD sono stati valutati usando 6MWT, NSAA a baseline e a 12 mesi. Sono state raccolte
informazioni cliniche riguardo ad età e terapia con steroidi.
RISULTATI: Durante i 12 mesi dello studio abbiamo osservato una
caduta media di 25.8 metri nel 6MWT con una SD di 74.3 m. Nella
NSAA la caduta media era di 2.2 punti con una SD di 3.7. Non tutti
i ragazzi DMD nel nostro gruppo mostravano una caduta di performance nei 12 mesi in quanto i ragazzi piu giovani mostravano un
miglioramento sia nel 6MWT che nella NSAA fino all’età di 7 anni.
NSAA e 6MWT mostravano una correlazione molto alta (r=0.52,
p<0.001).
CONCLUSIONI: I risultati del nostro studio forniscono dati longitudinali sia per la NSAA che per il 6MWT per un periodo di 12 mesi.
Questi dati sono estremamente utili al momento di disegnare nuovi
studi clinici in questa popolazone di pazienti.
NUOVI MECCANISMI PER IL CONTROLLO DEL SEGNALE TGFBETA/MIOSTATINA IN DISTROFIA MUSCOLARE: microRNA,
NUOVI EFFETTORI E CROSSTALK CON ALTRE VIE DI TRASDUZIONE
Morsut Leonardo (1), Sartori Roberta (2), Dupont Sirio (1), Sandri
Marco (2), Piccolo Stefano (1)
(1) Dipartimento di Biotecnologie Mediche - viale G. Colombo 3, 34126 Padova
(2) VIMM, via Orus, Padova
La pluripotenza e il differenziamento sono intimamente legati al
controllo del segnale TGFb. Poco e’ pero’ conosciuto sui fattori intracellulari che controllano negativamente l’attivita’ Smad nei tessuti di mammifero.
Topi knockout per Ectodermin (anche noto come TRIM33 o TIF1g)
dimostrano che questa proteina e’ un potente inibitore dell’a ttivita’
di Smad4 in vivo. All’eccesso di attivita’ di TGFb corrispondono fenotipi embrionali finora mai riportati. Per esempio, scopriamo che
Ecto e’ richiesto per bilanciare il self-renewal di popolazioni staminali con il loro differenziamento.
In assenza di Ecto i precursori del mesoderma adottano un destino
esclusivamente anteriore, rivelando come Smad signaling allochi i
destini lungo la stria primitiva in modo dose-dipendente. Questi
studi validano Ecto come un essenziale nuovo regolatore negativo
del segnale TGFb.
Inoltre, abbiamo realizzato la delezione genetica condizionale di
Smad4 ed Ecto nel muscolo scheletrico. Questo tessuto e’ sotto il
controllo negativo di TGFß1 e Myostatina. La perdita di Ecto dal muscolo embrionale non ha fenotipo, mentre rivela un ruolo, sebbene
marginale, per mantenere il muscolo trofico durante la denervazione, in linea con il suo ruolo come anti-Smad. Quello che e’ risultato
davvero rimarchevole e’ invece il fenotipo muscolare di Smad4, che
anche rivela come una nuova via di segnale sia operante nell’omeostasi del muscolo adulto. I dettagli saranno presentati al meeting.
ABSTRACT N. 72
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 10
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 11
MERCURI EUGENIO
GUP07009
151.000
Durata (anni): 2
GUP09010
189.000
Durata (anni): 2
Anno d’inizio: 2010
MISURE DI OUTCOME NELLA DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE: VALIDAZIONE DEL PEDIATRIC QUALITY OF LIFE
INVENTORY TM NEUROMUSCULAR MODULE NELLA POPOLAZIONE ITALIANA E CORRELAZIONI CON ALTRE VALUTAZIONI FUNZIONALI
ABSTRACT N. 71
Responsabile
MESSINA SONIA
Mercuri Eugenio (1), Vita Giuseppe (2), Bertini Enrico (3), Berardinelli Angela (4), Minetti Carlo (5), Politano Luisa (6), Mongini Tiziana (7), Pegoraro Elena (8), Morandi Lucia (9), D’Angelo Maria Grazia (10), Messina Sonia (2,1)
Anno d’inizio: 2008
MISURE DI OUTCOME NELLA DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE
(1) Department of Paediatrics, Policlinico Gemelli Cattolica University, Via Largo Gemelli, 8, 00168- Rome
(2) Department of Neuroscienze,University of Messina, Messina
(3) Department of Laboratories, Bambino Gesù Hospital, Rome
(4) Unit of Child Neuropsychiatry, IRCCS “C.Mondino” Institute, Pavia
(5) Department of Pediatrics, Giannina Gaslini Institute; Genoa
(6) Department of Sperimental Medicine, II University of Naples
Mazzone Elena (1), Vasco Gessica (1), Sormani Maria Pia (2), Torrente Yvan (3), Berardinelli Angela (4), Messina Sonia (1,5), D Amico Adele (6), Doglio Luca (7), Politano Luisa (8), Cavallaro Filippo
(5), Frosini Silvia (9), Bello Luca (10), Bonfiglio Serena (3), Zucchini Elisabetta (11), De Sanctis Roberto (1), Scutifero Marianna (8),
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
della rete sociale e del sostegno professionale come fattori di protezione dal carico.
Mentre numerosi studi sono stati condotti sul carico familiare nelle
patologie mentali, nei tumori e nelle demenze, solo pochi dati sono
disponibili sul carico nelle DNM. La mancanza di questi dati rende più
difficile l’allocazione delle risorse sanitarie, economiche e professionali
a sostegno delle famiglie, e lo sviluppo di interventi di sostegno basati sulla valutazione dei bisogni di cura propri di queste patologie.
Questo studio si propone di fornire dati sul carico, la rete sociale e
le modalità di cura a disposizione delle famiglie di 800 pazienti italiani, minorenni con DNM. Lo studio sarà condotto in 8 centri specializzati per la diagnosi e la cura di queste patologie, in ciascuno
dei quali verranno coinvolti in maniera randomizzata 100 pazienti
(età tra 4 e18 anni, in carico al centro da almeno 6 mesi, non affetti
da altre patologie oltre la DNM) e altrettanti familiari-chiave (età tra
18 e 80 anni, non affetti da patologie croniche richiedenti assistenza continuativa né coinvolti nell’assistenza continuativa ad altri congiunti oltre il paziente).
Se presente verrà invitato a partecipare (previo consenso dei genitori) anche il familiare minorenne (di età tra 9 e 17 anni), più
prossimo per età al paziente. I dati saranno raccolti utilizzando
questionari validati, sviluppati per un uso nella routine e disponibili in più lingue. La partecipazione di centri distribuiti sull’intero
territorio nazionale e la numerosità del campione fornirà dati rappresentativi della situazione delle famiglie di pazienti con NDM in
Italia che potranno essere utilizzati per sviluppare programmi mirati di sostegno familiare.
(7) Department of Neuroscienze, AOU S. Giovanni Battista, University of Turin
(8) Department of Neuroscienze, University of Padova
(9) Muscle Pathology and Neuroimmunology, Neurological Inst “Carlo Besta”
(10) IRCCS E Medea Bosisio Parini, NeuroMuscular Unit Department of Neuro
Rehabilitation
La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è la forma più frequente
di distrofia in età infantile. Recentemente vari approcci terapeutici
promettenti sono stati sviluppati. Alcuni delle principali difficoltà nel
disegnare sperimentazioni terapeutiche in questa malattia sono la
mancanza di strumenti validati per valutare la Qualità della Vita
(QoL) in bambini con malattie neuromuscolari e la mancanza di accordo a livello internazionale sulle misure di outcome da utilizzare.
Recentemente, il Pediatric Quality of Life Inventory TM Neuromuscular Module (PedsQL NM) è stato proposto come strumento validato per valutare la QoL in bambini con malattie neuromuscolari. Il
questionario è stato validato nell’atrofia muscolare spinale (SMA) in
USA. Finora nessuno studio sistematico è stato programmato per la
DMD. Lo scopo di questo studio è di validare il PedsQL NM in bambini ed adolescenti con DMD. Inoltre, nella coorte di pazienti deambulanti oltre i 4 anni, correleremo la QoL con i risultati di valutazioni
funzionali quali il 6 Minute Walk Test (6MWT), il North Star Ambulatory Assessment (NSAA) e le prove temporizzate, misure di outcome considerate appropriate per futuri trial clinici.
Documenteremo inoltre possibili cambiamenti tra le valutazioni a
baseline e dopo 6 e 12 mesi in una relativamente ampia coorte di
pazienti DMD di età fra i 2 ed i 18 anni. Uno dei punti cruciali della
gestione clinica e uno degli scopi principali della missione del Telethon è migliorare la QoL dei pazienti con malattie neuromuscolari,
ma al momento non abbiamo a disposizione strumenti validati per
valutare la QoL in bambini con queste malattie. Questo progetto
renderà disponibile tale strumento in Italia ed ogni partner sarà in
condizione di partecipare a trial terapeutici internazionali come il
FOR DMD nel quale alcune delle valutazioni validate in questo progetto sono state scelte come misure di outcome.
ABSTRACT N. 74
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 2
ABSTRACT N. 73
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 9
MAGLIANO LORENZA
GUP10002
145.000
Durata (anni): 2
GGP07078
129.900
Durata (anni): 2
Anno d’inizio: 2007
ANALISI DEI MECCANISMI EPIGENETICI RESPONSABILI
DELL’INSORGENZA DELLA DISTROFIA FACIO-SCAPOLO-OMERALE (FSHD)
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
GINELLI ENRICO
Cheli Stefania (1), Francois Stephanie (2), Ferrari Francesco (3),
Tenedini Elena (3), Roncaglia Enrica (3), Ferrari Sergio (3), Ginelli
Enrico (1), Meneveri Raffaella (2)
Anno d’inizio: 2010
LA FAMIGLIA DEI PAZIENTI AFFETTI DA DISTROFIE MUSCOLARI: CARICO, RETE SOCIALE E SUPPORTO PROFESSIONALE
(1)
(2)
(3)
lia,
Politano Luisa (2), Balottin Umberto (3), Vita Giuseppe (4), Pane
Marika (5), D’Amico Adele (6), Angelini Corrado (7), Battini Roberta
(8), D’Angelo Maria Grazia (9), Magliano Lorenza (1)
Dept Biology and Genetics for Medical Sciences, University of Milan, Milan
Dept of Experimental Medicine, University of Milano-Bicocca, 20052 Monza
Department of Biomedical Sciences, University of Modena and Reggio Emi41100 Modena, Italy
Per determinare la disregolazione globale dell’espressione genica in
cellule FSHD-1 (con contrazione 4q) FSHD-2 (senza contrazione 4q,
o fenotipiche) durante gli stadi precoci del differenziamento muscolare, abbiamo utilizzato il differenziamento in vitro di mioblasti
FSHD-1 e FSHD-2 insieme alla analisi con gene chip. Con questo
approccio abbiamo derivato che il profilo di espressione genica è
modificato solamente a livello di mioblasti FSHD-1 e miotubi FSHD2. I cambiamenti osservati in FSHD-1 riguardano un generale difetto nella progressione del ciclo cellulare, probabilmente dovuto a una
up-regolazione dei marcatori miogenici PAX3 e MyoD1 e a un deficit
di fattori coinvolti nella organizzazione della cromatina a livello di
sequenze ripetute D4Z4 (SUV39H1 e HMGB2). D’altra parte i miotubi FSHD-2 sono caratterizzati da un generale deficit del metabolismo degli RNA, della sintesi e degradazione delle proteine, e in misura minore del ciclo cellulare. Disregolazioni comuni sono a carico
di geni coinvolti nella risposta allo stress ossidativo e nei processi
biosintetici degli steroli, indicando una possibile alterazione funzionale della membrana. I nostri risultati suggeriscono inoltre una possibile implicazione di miRNA nella disregolazione genica in FSHD-1 e
FSHD-2.
Infine, in entrambi i sistemi differenziativi, non è stato notato un
gradiente di disregolazione di geni in 4q35. Quindi, le cellule
FSHD-1 FSHD-2 in momenti diversi del differenziamento miogenico mostrano una deregolazione globale dell’espressione genica
piuttosto che una alterazione dell’espressione di geni della regione
4q35. Benché la deregolazione genica osservata interessi in
FSHD-1 e FSHD-2, con poche eccezioni, differenti processi biologici, le conseguenza sembrano essere simili. Effettivamente, difetti
nella progressione del ciclo cellulare, nella sintesi e degradazione
delle proteine, nella risposta allo stress ossidativo, nella funzionalità della membrana cellulare e la disregolazione di alcuni miRNA,
possono alterare una corretta miogenesi. Benché i nostri dati non
permettano di distinguere nella patogenesi della FSHD tra altera-
(1) Dipartimento di Medicina Sperimentale, Seconda Università di Napoli - Via
Costantinopoli, 16 - 80138 Napoli
(2) Servizio di Cardiomiologia e Genetica Medica, Seconda Università di Napoli
(3) IRCSS “C. Mondino” , Unità di Neuropsichiatria infantile, Università di Pavia
(4) Dipartimento di Neuroscienze, Scienze Psichiatriche e Anestesiologiche,
Università di Messina
(5) Neuropsichiatria infantile, Università Cattolica, Roma
(6) Dipartimento di Neuroscienze, Ospedale Bambin Gesù di Roma
(7) Dipartimento di Neuroscienze, Università di Padova
(8) Dipartimento di Neurologia, Università di Pisa
(9) IRCSS Medea, Bosisio Parini (Lecco)
Le Distrofie NeuroMuscolari (DNM) sono patologie degenerative che
comportano livelli progressivi di disabilità, incidono significativamente sulla qualità di vita dei pazienti e richiedono un coinvolgimento nell’assistenza da parte dei loro familiari. Se da una parte
questo coinvolgimento può facilitare l’adattamento del paziente alla
patologia, migliorandone la collaborazione nei programmi terapeutici e la risposta alle terapie, dall’altra può essere molto impegnativo
per le famiglie, soprattutto se il sostegno professionale è limitato.
Con il termine “carico familiare” si indicano le conseguenze pratiche
e psicologiche legate all’assistenza e alla convivenza con un congiunto affetto da una malattia di lunga durata. Tra le prime, vi sono
difficoltà lavorative, problemi economici, riduzione dei rapporti sociali e delle attività ricreative.
Tra le conseguenze psicologiche, senso di colpa per aver trasmesso al congiunto la malattia, tensione e irritabilità, tristezza, sensazione di non riuscire a reggere più a lungo. Non di rado, queste
condizioni sottendono disturbi psichiatrici minori, per i quali i familiari raramente chiedono aiuto. Gli studi sulle famiglie delle persone con patologie di lunga durata hanno evidenziato l’importanza
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
zioni primarie e secondarie, i due quadri di alterazione genica globale suggeriscono fortemente per entrambi le forme di FSHD una
non corretta localizzazione nucleare della regione 4q o di altre regioni cromosomiche.
analizzati con la valutazione clinica in un ampia coorte di soggetti
per ottenere dati che siano statisticamente significativi. A questo
scopo, abbiamo creato un questionario per analizzare in modo sistematico la storia clinica dei soggetti portatori del difetto molecolare e una scheda clinica per ottenere la quantificazione funzionale
della debolezza muscolare che permetta di assegnare un punteggio
al livello di disabilità che può variare da 0 (soggetti senza segni di
debolezza muscolare) a 15 (pazienti severamente colpiti in tutti i
distretti muscolari).
Dal 2008, il Registro Italiano dell’FSHD (www.fshd.it) ha raccolto
dati clinici e molecolari relativi a 751 soggetti portatori del difetto
molecolare associato all’FSHD. La severità del quadro clinico dell’FSHD è stata definita numericamente attraverso l’FSHD score, valore
ottenuto mediante la valutazione funzionale di sei gruppi muscolari.
Per individuare fattori che possano spiegare l’ampia variabilità d’espressione clinica della malattia osservata abbiamo deciso di correlare l’FSHD score con il numero di unità ripetute D4Z4, l’età e il
sesso nei 751 soggetti coinvolti nello studio. L’analisi dei nostri dati
ha evidenziato che:
- il 76% dei soggetti portatori da 1 a 3 unità ripetute D4Z4 ha ricevuto FSHD score =5 e solo in questo gruppo il difetto genetico ha
penetranza completa;
- il 30 % dei pazienti, più giovani di 45 anni, ha un FSHD score =5;
al contrario, il 57% dei pazienti di età superiore ai 45 anni hanno
un FSHD score =5. Tale dato indica che l’età influisce in modo significativo sull’espressione clinica della malattia;
- il 29% dei soggetti più giovani di 40 anni non mostra segni di debolezza muscolare. Questa alta percentuale di soggetti sani è mantenuta in tutte le classi di età (22% tra 41 e 60 anni, 18% tra 61 e
90 anni).
Inoltre sono stati studiati i polimorfismi delle sequenze fiancheggianti gli elementi D4Z4 in 358 casi indice. I nostri studi dimostrano
che tali sequenze non influenzano l’espressione della malattia.
ABSTRACT N. 75
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 13
TUPLER ROSSELLA GINEVRA
GUP08004
454.000
Durata (anni): 2
Anno d’inizio: 2009
CRITERI CLINICI E DI LABORATORIO PER LA DIAGNOSI
DELLA FSHD E LA COSTITUZIONE DI UN REGISTRO NAZIONALE PER LA MALATTIA
Greco Francesca (1), Frambolli Ilaria (1), Vercelli Liliana (2), Ricci
Giulia (3), Scionti Isabella (1), Borsato Carlo (4), Cao Michelangelo
(4), Servida Maura (5), Peverelli Lorenzo (5), Colantoni Luca (6), Di
Leo Rita (7), Pastorello Ebe (8), Ricciardi Leopoldo (9), Volpi Leda
(3), Govi Monica (1), Morandi Lucia (10), Trevisan Carlo Pietro (8),
Siciliano Gabriele (3), Galluzzi Giuliana (6), Ricci Enzo (11), Di Muzio Antonio (9), Rodolico Carmelo (7), Tomelleri Giuliano (12), Palmucci Laura (2), Angelini Corrado (4), Santoro Lucio (13), Tupler
Rossella Ginevra (1,14)
(1) Università di Modena e Reggio Emilia, Dipartimento Scienze Biomediche,
Modena, Italy - via G Campi 287, 41100 Modena, Italy
(2) Università di Torino, Dipartimento di Neuroscienze, Torino, Italy
(3) Università di Pisa, Dipartimento di Neuroscienze, Pisa, Italy
(4) Università di Padova, Dipartimento di Neuroscienze, Padova, Italy
(5) IRCCS Fondazione Ospedale Maggiore Policlinico Mangiagalli Regia Elena,
Centro Dino Ferrari, Università di Milano, Dip di Neurologia, Milano, Italy
(6) IRCCS Fondazione Santa Lucia, Roma, Italy
(7) Università di Messina, Dipartimento di Neuroscienze, Messina, Italy
(8) Università di Padova, Dipartimento di Scienze Neurologiche e Psichiatriche,
Padova, Italy
(9) Unità per le Malattie Neuromuscolari, Università G. D’Annunzio, Clinica
Neurologica, Chieti, Italy
(10) Istituto Neurologico C. Besta, Milano, Italy
(11) Università Cattolica, Dipartimento di Neuroscienze, Roma, Italy
(12) Università di Verona, Dipartimento di Scienze Neurologiche e della Visione, Verona, Italy
(13) Università di Napoli Federico II, Dipartimento di Scienze Neurologiche,
Napoli, Italy
(14) Program in Gene Function and Expression, University of Massachusetts
Medical School, Worcester, USA
ABSTRACT N. 76
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 8
COMI GIACOMO PIETRO
GUP10006
163.600
Durata (anni): 2
Anno d’inizio: 2011
RETE CLINICA E DI LABORATORIO DELLE DISTROFIE DEI
CINGOLI PER STABILIRE UN REGISTRO NAZIONALE
Nigro Vincenzo (2,3), Angelini Corrado (4), Mongini Tiziana (5),
Mora Marina (6), Toscano Antonio (7), Tomellieri Giuliano (8),
Siciliano Gabriele (9), Magri Francesca (1), Comi Giacomo Pietro (1)
La Distrofia muscolare Facio-Scapolo-Omerale (FSHD), la terza più
comune miopatia ereditaria, è caratterizzata da un’elevata variabilità del quadro clinico e della progressione dei sintomi.
La FSHD è ereditata in maniera autosomica dominante, anche se
sono frequenti i casi de novo. La patogenesi della FSHD non è stata
ancora chiarita ma la malattia è stata associata alla delezione di un
elemento ripetitivo di DNA (D4Z4) nella regione 4q35. Nei pazienti
FSHD si osserva generalmente un numero di ripetizioni D4ZA inferiore ad 11 (<35 Kb) mentre, nei soggetti sani, questo è compreso
tra 11 e 150 (50-300 Kb). Il numero di ripetizioni è dunque considerato diagnostico per la malattia ma diverse osservazioni sono
emerse a complicare la valutazione dei pazienti FSHD e la definizione di una correlazione genotipo-fenotipo. La grande variabilità nell’insorgenza e nell’espressione della malattia sembra essere maggiore dell’atteso e si osservano soggetti con delezione ma assenza
di sintomi, oltre a pazienti eterozigoti composti per la delezione
FSHD e pazienti con alleli D4ZA tra 38 e 45 kb, considerati generalmente alleli borderline presenti anche nella popolazione normale. E’
stata inoltre ipotizzata recentemente l’associazione della malattia
con specifiche sequenze nella regione subtelomerica 4qter suggerendo la presenza di elementi che potrebbero essere coinvolti nella
manifestazione della FSHD.
È interessante notare che da quando l’analisi molecolare è diventata il principale strumento diagnostico per la FSHD, sono emerse numerose informazioni a complicare la valutazione dei pazienti FSHD.
Infatti, la variabilità clinica della FSHD appare molto maggiore dell’atteso con la presenza di individui portatori del difetto genetico
che non presentano segni della malattia. Di conseguenza è difficile
stabilire con precisione una correlazione tra il numero degli elementi ripetuti D4Z4 e la severità della malattia. Come risultato, al momento attuale non sono disponibili strumenti prognostici.
Per poter generare informazioni utili alla prognosi nella FSHD abbiamo deciso di correlare il difetto molecolare rilevato nei soggetti
(1) Laboratorio di Biochimica e Genetica, Dipartimento di Scienze Neurologiche, Università degli Studi di Milano Fondazione I.R.C.C.S. Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico, Via Francesco Sforza, 35, 20122 Milano
(2) Dipartimento di Patologia Generale, Seconda Universita’ degli Studi di Napoli, Napoli
(3) Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM), Napoli
(4) Dipartimento di Neuroscienze, Università di Padova, Padova
(5) Dipartimento di Neuroscienze, AOU S. Giovanni Battista di Torino, Torino
(6) Divisione di Malattie Neuromuscolari e Neuroimmunologia, Fondazione
IRCCS Istituto Neurologico C. Besta, Milano
(7) Dipartimento di Neuroscienze, Psichiatria e Anestesiologia, Messina
(8) Dipartimento di Scienze Neurologiche, Verona
(9) Dipartimento di Scienze Neurologiche, Università di Pisa, Pisa
Le distrofie muscolari dei cingoli (Limb Girdle Muscular Dystrophies,
LGMD) sono un gruppo eterogeneo di patologie muscolari caratterizzate dallo sviluppo di ipostenia muscolare a distribuzione prevalentemente cingolare con esordio in età adulta. A tutt’oggi sono state descritte 15 forme autosomico dominanti e 8 forme autosomico
recessive, ma il 27% delle LGMD rimane privo di una diagnosi molecolare.
D’altra parte i progressi nel campo molecolare hanno dimostrato
l’importanza della possibilità di formulare correlazioni genotipo-fenotipo ai fini di una consulenza genica e di definire i processi patogenetici.
Questo progetto si propone l’obiettivo di ottenere una dettagliata
definizione clinica e molecolare di un vasto gruppo di pazienti italiani affetti da LGMD, in previsione della creazione di un registro
nazionale.
Poiché queste forme risultano essere relativamente rare, il progetto
verrà condotto attraverso una collaborazione di 8 centri italiani specializzati nello studio delle malattie neuromuscolari.
Ci si propone di studiare la progressione di queste miopatie dei cin-
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
goli in uno studio osservazionale della durata di 3 anni. Obiettivo
dello studio è la selezione di circa 320 pazienti, affetti da LGMD con
conferma genetica, definendone la storia naturale e i principali parametri di valutazione.
Verrà inoltre indagata la eterogeneità molecolare di questo gruppo
di patologie migliorando l’accuratezza diagnostica attraverso l’analisi proteica su muscolo e lo studio genomico; verranno inoltre definite correlazioni genotipo-fenotipo.
Nel complesso il progetto fornirà dettagliati dati clinici e molecolari
di una ampia coorte di pazienti permettendo di definire correlazioni
genotipo-fenotipo, di stabilire lo spettro di variabilità clinica, morfologica e di imaging muscolare, di definire la gravità di ciascun sottotipo, esplorare l’importanza di modificatori genici per la variabilità
clinica, di identificare eventuali nuovi geni-malattia.
I risultati di questo studio genetico ed osservazionale e la creazione di un registro di casi italiani costituiscono inoltre un punto di
partenza fondamentale per la selezione di pazienti ed il loro arruolamento in trial terapeutici, dal momento che gli approcci terapeutici recentemente proposti (mini-disferline, exon-skipping) necessitano di un’accurata tipizzazione genetica e di dati accurati di
storia naturale.
era pari all’1.2%, di ACR 0.3%, FV 0.5%, TVS 2.0%, pause 3.0%,
blocchi AV avanzati del 3.5%. Anche se sono state riscontrate correlazioni significative per molteplici parametri cardiologici, gli unici
2 predittori indipendenti di MI e di aritmie potenzialmente letali risultavano essere l’intervallo HV > 70 msec (HR 5.198; p = 0.01) e
l’inducibilità di TVS sincopale e di FV al SEF (HR 4.072; p = 0.03).
Conclusioni. L’incidenza di aritmie potenzialmente letali in questa
popolazione omogenea di pazienti affetti da DM1 è rilevante e potrebbe essere utile una strategia cardiologia invasiva e non-invasiva
per selezionare i pazienti a rischio e per prevenire la MI. I risultati
dello studio RAMYD potrebbero fornire le basi per incrementare l’aspettativa di vita di questi pazienti.
ABSTRACT N. 78
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 5
ABSTRACT N. 77
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 7
GUP07013
197.370
892.400
Durata (anni): 2
Anno d’inizio: 2008
Bernardi Paolo (1), Bonaldo Paolo (2), Ferlini Alessandra (3), Gelfi
Cecilia (4), Maraldi Nadir Mario (5)
BELLOCCI FULVIO
Durata (anni): 2
GGP08107
VERSO UNA TERAPIA MITOCONDRIALE DELLE DISTROFIE
MUSCOLARI DEL COLLAGENE VI
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
BERNARDI PAOLO
(1) Dipartimento di Scienze Biomediche Sperimentali, Università di Padova
(2) Dipartimento di Istologia, Microbiologia e Biotecnologie Mediche, Università
di Padova
(3) Dipartimento di Medica Sperimentale e Diagnostica, Università di Ferrara
(4) Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biomediche, Università di Milano
(5) Dipartimento di Scienze Anatomiche Umane e Fisologia dell’Apparato Locomotore, Università di Bologna
Anno d’inizio: 2008
LO STUDIO RAMYD (VALUTAZIONE DEL RISCHIO ARITMICO
NELLA DISTROFIA MIOTONICA TIPO I): LA FASE 2
Dello Russo Antonio (2), Pace Manuela (3), Mangiola Fortunato (3),
Nigro Giovanni (4), Melacini Paola (5), Bongiorni Maria Grazia (6),
Tondo Claudio (2), Calò Leonardo (8), Casella Michela (2), Messano
Loredana (3), Pelargonio Gemma (1), Bartoletti Stefano (2), Silvestri Gabriella (9), Modoni Anna (9), Morandi Lucia (10), Politano
Luisa (4), Nigro Gerardo (4), Moltrasio Massimo (3), Zachara Elisabetta (7), Bellocci Fulvio (1)
Obiettivi specifici di questo progetto erano: (1) stabilire le vie di
segnale intracellulari compromesse nel muscolo dalla carenza di
ColVI; (2) capire attraverso quali meccanismi sia generata la disfunzione mitocondriale; (3) studiare il ruolo del poro di transizione della permeabilità (PTP) nella patogenesi delle distrofie muscolari del ColVI; (4) valutare le conseguenze della disfunzione
mitocondriale sul metabolismo energetico; (5) capire i meccanismi molecolari della perdita di massa muscolare in assenza di
ColVI; (6) definire la “firma” proteomica e trascrittomica dei modelli di miopatia del ColVI; (7) sviluppare nuovi modelli animali di
malattia del ColVI; (8) valutare un nuovo inibitore delle ciclofiline
(CyP) derivato dalla ciclosporina (Cs) A (Debio 025) che è in grado di inibire il PTP ma non ha attività immunosoppressiva. Lo
scopo finale era gettare le basi per un trial clinico delle distrofie
muscolari del ColVI.
Abbiamo scoperto che topi privi di ColVI hanno una autofagia
anomala con formazione difettiva dell’autofagosoma. La persistenza di mitocondri malfunzionanti (per l’aumentata probabilità
di apertura del PTP) amplifica il danno, ma la risposta autofagica
normale può essere ristabilita sia da opportune manipolazioni
della dieta, il che suggerisce una nuova strategia “non invasiva”
che potrebbe essere sfruttata nella malattia dell’uomo; che dalla
CsA (che inibisce anche il PTP).
Un passo avanti decisivo è stata la dimostrazione che i topi
Col6a1-/- Ppif-/- (cioè privi sia di ColVI che di CyPD) venivano
guariti sia dai difetti mitocondriali che da quelli ultrastrutturali e
dall’aumento della apoptosi. La CyPD è un regolatore “positivo”
del PTP (cioè ne favorisce l’apertura) ed è uno dei bersagli mitocondriali della CsA, e gli effetti della sua ablazione genetica dimostrano che questa proteina è un ottimo bersaglio per la terapia. Questo è dimostrato anche dal trattamento con il Debio 025
(che a differenza della CsA non inibisce la calcineurina), che nei
topi Col6a1-/- ha lo stesso effetto terapeutico della CsA. Questo
dato è molto importante perché rappresenta la base di un possibile trial nei pazienti e perché ha dimostrato in modo inoppugnabile il ruolo dei mitocondri nella patogenesi delle distrofie muscolari del ColVI. Pensiamo di avere centrato in pieno il nostro obiettivo principale con il primo trial clinico pilota con CsA di 4 pazienti affetti dalla distofia muscolare congenita di Ullrich e 1 dalla
miopatia di Bethlem.
Il trattamento a breve termine ha migliorato la performance mitocondriale e i segni di apoptosi, ed ha promosso la rigenerazione
muscolare – dati che rappresentano un inizio molto incoraggiante
per trial futuri con inibitori delle CyP.
(1) Istituto di Cardiologia, Laboratorio di Elettrofisiologia Università Cattolica
del Sacro Cuore, Roma
(2) Dipartimento di Aritmologia, Centro Cardiologico Monzino, Milano,
tel 02-58002340; [email protected]
(3) UILDM sezione Laziale, Roma
(4) Dipartimento di Patologia e Medicina Cardiovascolare, Seconda Università
di Napoli, Napoli
(5) Dipartimento di Scienze Cardiache Toraciche e Vascolari, Università di Padova
(6) Istituto di Cardiologia, Ospedale di Cisanello, Pisa
(7) Unità per lo scompenso cardiaco, Ospedale San Camillo, Roma
(8) Divisione di Cardiologia, Ospedale Casilino, Roma
(9) Istituto di Neurologia, Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma
(10) Istituto Neurologico Besta, Milano
Introduzione. La distrofia miotonica di tipo 1 è la distrofia muscolare più frequente nell’età adulta e coinvolge anche il cuore, presentando un’incidenza elevata di morte improvvisa (MI) legata a blocchi di conduzione e ad aritmie ventricolari maligne. Lo scopo del nostro studio preliminare è stato quello di determinare l’incidenza cumulativa a 2 anni di MI, arresto cardiaco resuscitato (ACR), fibrillazione ventricolare (FV), tachicardia ventricolare sostenuta (TVS),
disfunzione severa del nodo del seno o blocco AV di grado avanzato
ed il ruolo di parametri invasivi e non come fattori predittivi.
Metodi. Abbiamo analizzato 339 pazienti nell’ambito della popolazione di pazienti arruolati nello studio multicentrico RAMYD (Risk of
Arrhythmias in MYotonic Dystrophy). I pazienti sono stati studiati
con una valutazione completa non invasiva (anamnesi, ECG a 12
derivazioni, ECG delle 24 ore ed ecocardiogramma). Secondo indicazioni convenzionali e specifiche indicazioni non convenzionali i pazienti sono stati sottoposti a studio elettrofisiologico (SEF) ed eventualmente ad impianto di pacemaker (PM), defibrillatore (ICD) o registratore di eventi (LR).
Le visite cardiologiche sono state effettuate ogni 6 mesi ed il followup è stato calcolato dall’arruolamento all’ultima visita. Al fine di ottenere analisi univariate e multivariate della sopravvivenza sono
stati utilizzati il metodo di Kaplan Meier con il test del log-rank e i
modelli di regressione di Cox.
Risultati. Su 339 pazienti, 99 sono stati sottoposti a SEF. Sono stati
impiantati 50 PM, 17 ICD e 20 LR in 71 pazienti (in 16 casi è stato
richiesto un upgrade del dispositivo). L’incidenza cumulativa di MI e
di aritmie potenzialmente letali è stata del 9.2%. L’incidenza di MI
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
ABSTRACT N. 79
mediante vescicole a doppia membrana—gli autofagosomi, che circondano porzioni del citosol per trasportarle al lisosoma. La nucleazione degli autofagosomi, una delle prime fasi del processo, coinvolge il “complesso centrale dell’autofagia”, un apparato multimolecolare che comprende una proteina legante Beclin 1, Ambra1; l’inattivazione di Ambra1 porta a proliferazione incontrollata durante
lo sviluppo neurale e a morte dell’embrione (Fimia et al., Nature
447, 2007). Abbiamo recentemente scoperto che la fosforilazione di
Ambra1, da parte della chinasi Ulk1, ed il legame di Ambra1 alla dineina sono fasi cruciali nella regolazione della nucleazione degli autofagosomi (Di Bartolomeo et al., J. Cell Biol. 191, 2010). Ambra1
lega anche il pool mitocondriale di Bcl-2—che esercita funzioni sia
anti-apoptotiche che anti-autofagiche, ed è quindi un regolatore
molecolare che decide fra morte e sopravvivenza cellulare.
L’autofagia regola proliferazione, morte e differenziamento cellulare
e la rimozione di componenti cellulari danneggiati mediante autofagia e lisosoma è essenziale per l’omeostasi tissutale. Si ritiene che
l’autofagia svolga un ruolo di soppressione tumorale rimuovendo
mitocondri danneggiati, responsabili dell’accumulo di ROS, da cellule stressate.
Alterazioni dell’autofagia sono coinvolte anche in malattie neurodegenerative e lisosomiali, disfunzioni del sistema immunitario e traumi cerebrali.
Tuttavia, il ruolo del processo nelle distrofie muscolari è ancora poco
chiaro. Recenti scoperte ottenute su topi mutanti per il collagene VI,
un modello della miopatia di Bethlem e della distrofia muscolare congenita di Ullrich, indicano che persistenza di organuli alterati e morte
cellulare spontanea, due caratteristiche di queste patologie, dipendono da difetti dell’autofagia e che la sua riattivazione può ristabilire la
sopravvivenza delle miofibre ed attenuare il fenotipo distrofico (Grumati et al., Nat. Med. 16, 2010).
Questo progetto è un approccio integrato mirato a i) svelare i meccanismi della regolazione autofagica, ii) chiarire il ruolo dell’alterata autofagia nelle distrofie muscolari, iii) modulare l’autofagia in un modello animale distrofico, mediante strategie genetiche, farmacologiche o
dietetiche, iv) effettuare un’indagine comparativa dell’autofagia su
campioni da pazienti affetti da distrofie muscolari od altri disordini
neuromuscolari. La fattibilità di questo approccio è supportata da nostri risultati preliminari sui topi mutanti per il collagene VI, che indicano come un’inefficace autofagia svolga un ruolo critico nello sviluppo del fenotipo miopatico e che strategie finalizzate alla riattivazione
del processo possano contrastare la degenerazione muscolare.
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
MERLINI LUCIANO
GUP08006
23.550
Durata (anni): 1
Anno d’inizio: 2009
TERAPIA MITOCONDRIALE CON CICLOSPORINA A IN PAZIENTI AFFETTI DA DISTROFIA MUSCOLARE CONGENITA DI
ULLRICH
Armaroli Annarita (1), Sabatelli Patrizia (2), Gnudi Saverio (3), Michelini Maria Elena (4), Bleve Cosimo (4), Merlini Luciano (1)
(1) Sezione e UO di Genetica Medica, Dipartimento di Medicina Sperimentale e
Diagnostica Università di Ferrara - Via Fossato di Mortara 74, 44100 Ferrara
(2) IGM-CNR, c/o IOR, Bologna
(3) Modulo Dipartimentale di Medicina Generale, Istituto Ortopedico Rizzoli,
Bologna
(4) Chirurgia Pediatrica, Ospedale S. Anna, Ferrara
Le distrofie muscolari sono malattie genetiche progressive per cui
non esiste terapia. Siamo riusciti a scoprire il motivo per cui le fibre
muscolari degenerano e muoiono in un modello murino di due distrofie muscolari dell’uomo causate da carenza di collagene VI: la
Distrofia Muscolare Congenita di Ullrich (UCMD) e la Miopatia di
Bethlem (BM). La mancanza di collagene VI ha un grave effetto all’interno delle fibre muscolari dove causa un corto circuito nei generatori di energia della cellula, i mitocondri. Il corto circuito è dovuto
all’apertura di una canale, il cosiddetto “Poro di Transizione della
Permeabilità” (PTP), che può essere bloccato da un farmaco, la ciclosporina A (CsA). Trattando i topolini con la CsA abbiamo bloccato
il corto circuito e curato la malattia, e siamo riusciti a dimostrare
che anche le cellule dei pazienti affetti da UCMD e BM in coltura rispondono al trattamento con la CsA [9-11]. Forti di questi risultati
abbiamo effettuato uno studio pilota della durata di un mese con
CsA su 5 pazienti affetti da malattie del collagene VI con risultati incoraggianti in quanto nella biopsia muscolare effettuata dopo il mese di trattamento oltre alla correzzione della disfunzione mitocondriale erano diminuite le cellule necrotiche e aumentate invece
quelle in rigenerazione [12]. Successivamente 3 dei 5 pazienti hanno proseguito il trattamento per un anno dimostrando un lieve ma
statisticamente significativo incremento di forza muscolare. Nel secondo anno di trattamento il recupero di forza si è mantenuto.
Uguale incremento di forza si è ottenuto in ulteriori 2 pazienti affetti
da UCMD dopo un anno di trattamento. Tranne il paziente più giovane gli altri 4 però hanno mostrato un lento ma continuo deterioramento della funzione respiratoria tanto da consigliare il ricorso alla ventilazione meccanica non invasiva in tre di loro. La CsA sembra
quindi avere nei pazienti con UCMD un diverso effetto sui muscoli
degli arti e su quelli respiratori.
ABSTRACT N. 81
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 9
CECCONI FRANCESCO
Totale
532.500
Num Centri: 3
GGP10225
Durata (anni): 2
169.000
Durata (anni): 2
Anno d’inizio: 2009
Bruno Claudio (1), Mercuri Eugenio (2), Bertini Enrico (3), Comi
Giacomo P. (4), Pegoraro Elena (5), Toscano Antonio (6), Nigro
Vincenzo (7), Berardinelli Angela L. (8), Mongini Tiziana (9)
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Telethon grant N.
GUP08005
CARATTERIZZAZIONE CLINICA, MORFOLOGICA E MOLECOLARE DI PAZIENTI ITALIANI CON MIOPATIA CONGENITA
ABSTRACT N. 80
Responsabile
BRUNO CLAUDIO
(1) Neuromuscular Disease Unit, IRCCS Stella Maris Foundation
Via dei Giacinti, 2 56128 Calambrone, Pisa
(2) Departments Neuropediatrics, Policlinico Gemelli, Università Cattolica Sacro
Cuore, Rome
(3) Unit of Molecular Medicine, Bambino Gesù Children’s Hospital, Rome
(4) Department of Neurological Science, University of Milan, Milan
(5) Department of Neurosciences, University of Padova, Padova
(6) Department of Neurosciences, Psychiatry and Anesthesiology, University of
Messina, Messina
(7) Centro Interdipartimentale di Ricerca, II Università degli Studi di Napoli
(8) Department of Child Neurology, IRCCS Mondino Foundation, Pavia
(9) Centro per le Malattie Neuromuscolari, Department of Neurosciences, S.
Giovanni Battista University, Turin
Anno d’inizio: 2010
RUOLO DELL’AUTOFAGIA NELLE MALATTIE MUSCOLARI
Di Bartolomeo Sabrina (1,2), Grumati Paolo (3), Bonaldo Paolo (3),
Bertini Enrico Silvio (4), Cecconi Francesco (1,2)
(1) Dulbecco Telethon Institute, Department of Biology, University of Rome Tor
Vergata - Via della Ricerca Scientifica, 00133 Rome; Tel:+390672594230;
Fax:+390672594222; email: [email protected]; [email protected]
(2) Department of Experimental Neuroscience, IRCCS Santa Lucia Foundation,
Rome, Italy
(3) Department of Histology, Microbiology and Medical Biotechnology, University of Padua, Italy
(4) Department of Neurosciences, Ospedale Bambino Gesù, Unit of Molecular
Medicine for Neuromuscular and Neurodegenerative Disorders
Le Miopatie Congenite sono un gruppo di Malattie Neuromuscolari
che colpiscono primitivamente il muscolo scheletrico, e presentano
eterogeneità clinica, genetica e caratteristiche alterazioni alla biopsia muscolare.
Sebbene negli ultimi anni ci sia stato un notevole aumento delle conoscenze genetiche e dei meccanismi alla base di queste patologie,
molti casi rimangono ancora parzialmente caratterizzati.
L’obiettivo del progetto, uno studio multicentrico aperto condotto
nell’ambito di una collaborazione che coinvolge 9 Centri Italiani specializzati nello studio delle malattie neuromuscolari, è quello di otte-
L’autofagia è un processo evolutivamente conservato, cruciale nel
ricambio dei componenti cellulari, sia in condizioni normali che in risposta alla deprivazione di nutrienti. Essa consente la degradazione
di porzioni di citoplasma, proteine a lunga vita ed interi organuli,
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
nere una definizione clinica, morfologica e molecolare in un vasto
gruppo di pazienti affetti da miopatia congenita.
Nel primo anno, una estesa revisione dei dati clinici e delle biopsie
muscolari disponibili ha permesso di identificare circa 200 pazienti
affetti da miopatia congenita. Di questi, sono stati collezionati 176
DNA per l’analisi genetica.
Sulla base della recente classificazione morfologica-genetica proposta
da North, 80 pazienti (45.5%) risultano appartenere al gruppo delle
miopatie con cores, 41 pazienti (23.3%) presentano miopatia nemalinica, 33 pazienti (18.7%) hanno una miopatia con disproporzione delle fibre e 22 pazienti (12.5%) appartengono al gruppo delle miopatie
miotubulari/centronucleari. La strategia dell’analisi genetica si è basata sull’analisi dei dati clinici e morfologici e sulla frequenza relativa di
ogni specifica mutazione genetica in quel particolare sottogruppo. A
tutt’oggi, mutazioni patogeniche in differenti geni sono state identificate in 26 pazienti (~20% dei pazienti in analisi). Nel secondo anno,
intendiamo completare la caratterizzazione genetica di tutti i pazienti
identificati, migliorare la conoscenza del fenotipo clinico, identificare
possibili correlazioni genotipo-fenotipo ed eventuali nuove forme cliniche non associate ad alterazioni dei geni noti.
E’ stato implementato un nuovo ergometro (Salvadego et al. 2010)
che consente al soggetto di eseguire esercizi incrementali dinamici
utilizzando masse muscolari di volume relativamente ridotto (il quadricipite di un solo arto), eliminando in tal modo le limitazioni cardiovascolari alla performance aerobica. L’ergometro sarà utile in
studi futuri da condurre su pazienti con miopatie metaboliche. Abbiamo infine valutato, in una paziente con malattia di Pompe, gli effetti sulla tolleranza all’esercizio di una terapia enzimatica sostitutiva (Marzorati et al. submitted).
ABSTRACT N. 83
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 2
GUP08007
117.800
260.000
Durata (anni): 1
Anno d’inizio: 2011
Donati Maria Alice (2), Morandi Lucia Ovidia (3), Moglia Arrigo (4),
Danesino Cesare (4), Parenti Giancarlo (1), Fecarotta Simona (1),
Agovino Teresa (1), Andria Generoso (1)
GRASSI BRUNO
Durata (anni): 2
GUP09017
TERAPIA CON CHAPERONES FARMACOLOGICI IN ASSOCIAZIONE CON LA TERAPIA ENZIMATICA SOSTITUTIVA IN PAZIENTI AFFETTI DA MALATTIA DI POMPE
ABSTRACT N. 82
Responsabile
ANDRIA GENEROSO
(1) Dipartimento di Pediatria, Università “Federico II”, Napoli - Via S. Pansini 5,
80131 Napoli. Tel.: 0817462673; Fax: 0817463116; e-mail: [email protected]
(2) Dipartimento di Neuroscienze, AOU “Anna Meyer”, Firenze
(3) UO Malattie Neuromuscolari, IRCCS Istituto Neurologico “C. Besta”, Milano
(4) Dipartimento di Scienze Neurologiche, Istituto Neurologico Nazionale “C.
Mondino”, Università di Pavia, Pavia
Anno d’inizio: 2009
NUOVI METODI DI VALUTAZIONE FUNZIONALE DI PAZIENTI
CON MIOPATIE METABOLICHE. EFFETTI DI UN PROGRAMMA
DI ALLENAMENTO
Marzorati Mauro (2), Porcelli Simone (2,3), Belletti Michele (1,2),
Salvadego Desy (1), Morandi Lucia (4), Grassi Bruno (1,2)
La malattia di Pompe (PD) o Glicogenosi tipo II (OMIM 232300) è
una miopatia metabolica, causata dal deficit dell’enzima lisosomiale
alfa-glucosidasi acida (GAA). Il deficit di GAA provoca accumulo generalizzato di glicogeno nei tessuti e distruzione dei muscoli cardiaci
e scheletrici, con un’ampia variabilità fenotipica. L’unico trattamento approvato per i pazienti con PD è la terapia enzimatica sostitutiva (ERT) con GAA umana ricombinante. Tuttavia, nonostante sia
stata dimostrata l’efficacia della ERT sul coinvolgimento cardiaco e
sulla funzione muscolare nelle forme infantili classiche, l’efficacia
della ERT sulla miopatia scheletrica nei pazienti a esordio tardivo è
variabile. Nel presente studio proponiamo un nuovo approccio terapeutico basato sull’uso combinato della terapia di stimolazione enzimatica (EET) con chaperones farmacologici e della ERT. Abbiamo
recentemente dimostrato il razionale di quest’approccio in studi
condotti in vitro e in un modello animale di PD (Porto e coll. Mol
ther. 2009; 17: 964-71). Programmiamo di trattare 12-14 pazienti
affetti da PD, seguiti in quattro centri italiani coinvolti nella cura di
pazienti con malattie metaboliche, con una combinazione di ERT e
NB-DNJ (Miglustat, Zavesca), una piccola molecola chaperone, già
approvata per uso clinico per altre due malattie da accumulo lisosomiale. Ci proponiamo di verificare se la combinazione di questi approcci può aumentare l’efficacia della ERT nella PD. Come end-point
a breve termine di questo studio della durata di un anno valuteremo l’attività enzimatica della GAA su spot di sangue ottenuti a tempi differenti dopo la somministrazione isolata di ERT o di ERT in
combinazione con NB-DNJ, i livelli plasmatici di CK (prima e dopo
l’inizio della terapia combinata) e l’escrezione urinaria del tetrasaccaride di glucosio (prima e dopo l’inizio della terapia combinata). I
risultati di questo studio potranno fornire la prova di principio che
approcci terapeutici combinati sono più efficaci nel correggere il deficit enzimatico della PD. Inoltre questo modello potrebbe essere
esteso ad altre malattie da accumulo lisosomiale, in cui la ERT è disponibile, ma ha efficacia limitata.
(1) Dipartimento di Scienze Mediche e Biologiche, Università degli Studi di Udine - Piazzale M. Kolbe 4, 33100 Udine; tel. 0432-494335, fax 0432-494301, email [email protected]
(2) Istituto di Bioimmagini e Fisiologia Molecolare, CNR, Segrate (MI)
(3) Facoltà di Scienze Motorie, UNI-TEL San Raffaele, Roma
(4) UO Patologia Muscolare e Neuroimmunologia, Fondazione Istituto Neurologico “Carlo Besta”, Milano
Le miopatie mitocondriali (MM) ed il deficit di miofosforilasi (malattia di McArdle, McA) sono malattie genetiche caratterizzate da alterazioni del metabolismo energetico e ridotta tolleranza all’esercizio,
che possono influire in maniera significativa sulla qualità di vita. In
un precedente Progetto finanziato da Telethon-UILDM il nostro
gruppo ha utilizzato, in MM e McA, due metodi non-invasivi specificamente rivolti alla valutazione funzionale del metabolismo energetico ossidativo del muscolo scheletrico: A) Indici di ossigenazione
ottenuti mediante spettroscopia nel quasi-infrarosso (NIRS), come
stima della capacità di estrazione di O2 del tessuto. B) Cinetiche di
adeguamento del consumo di O2 (V’O2) polmonare durante transizioni tra riposo ed esercizio. I metodi consentono di identificare e
di quantificare, in MM e McA, le conseguenze funzionali del difetto
metabolico (Grassi et al. 2007, 2009).
Il principale obiettivo del presente progetto era quello di valutare in
MM e McA gli effetti di un programma di allenamento domiciliare
aerobico di intensità moderata (A): 12 settimane, 4 sessioni/settimana, 1 ora/sessione (esercizi al cicloergometro, ad una frequenza cardiaca (FC) pari al 70% del valore picco).
Fino ad oggi 5 MM e 4 McA hanno completato A. A ha determinato,
in MM (ma non in McA), un aumento di V’O2 “picco”. Sia in MM che
in McA A non ha modificato la gettata cardiaca picco, mentre ha lievemente aumentato il picco di estrazione muscolare di O2. Allo
stesso carico di lavoro sub-massimale FC è risultata più bassa dopo
A. Nei pazienti con cinetiche di V’O2 particolarmente lente, A ha ottenuto cinetiche più rapide. In MM A ha diminuito l’ampiezza della
“componente lenta” delle cinetiche di V’O2. Questi risultati preliminari dimostrano che i metodi utilizzati consentono di identificare alcuni miglioramenti funzionali in seguito ad A.
Durante il secondo di due esercizi successivi a carico costante
sub-massimali, in McA è stato descritto un fenomeno di “second
wind”, con: FC, gettata cardiaca e “perceived exertion” significativamente più basse (vs. il primo esercizio); estrazione muscolare
di O2 lievemente aumentata; scomparsa della componente lenta
della cinetica di V’O2 (Porcelli et al. 2011). Queste osservazioni
dimostrano che in McA un esercizio “di riscaldamento” migliora in
maniera significativa la tolleranza allo sforzo durante un successivo esercizio sottomassimale.
ABSTRACT N. 84
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
ZORZATO FRANCESCO
GGP08020
70.000
Durata (anni): 2
Anno d’inizio: 2008
INFLUSSO DI CALCIO ACCOPPIATO ALL’ECCITAZIONE DEL
MUSCOLO SCHELETRICO INDUCE TRASLOCAZIONE NULCREARE DI NFTAC1 ED AUMENTA IL RILASCIO DI IL6 DA
MIOTUBI ISOLATI DA PAZIENTI AFFETTI DA CENTRAL CORE
DISEASE
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21-02-2011
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
Treves Susan (1,2), Jeannet Pierre Yves (3), Vukcevic Mirko (2),
Levano Soledad (2), Girard Thierry (2), Urwyler Albert (2), Fischer
Dirk (4), Voit Thomas (5), Jungbluth Heinz (6), Lillis Sue (6), Muntoni Francesco (7), Quinlivan Ross (8), Sarkozy Anne (9), Bushby
Kate (9), Zorzato Francesco (1,2)
episodi letali tipo MH in risposta ad alotano e stress da calore. La dimostrazione che l’ablazione di CASQ1 porta episodi letali tipo MH ed
EHS convalida l’idea che la CASQ1 possa rappresentare un valido
candidato per l’analisi di linkage in famiglie con MH ed EHS, in cui
sono escluse le mutazioni del RyR1. Dal momento che nell’uomo la
MH è spesso associata alla central core disease (CCD), una miopatia
caratterizzata da debolezza muscolare e presenza di nuclei privi di
attività mitocondriale, stiamo attualmente anche studiando se gli
animali CASQ1-null sviluppano con l’età una miopatia. Abbiamo confrontato i muscoli EDL di animali adulti (4-6 mesi) e vecchi (14, 20 e
31 mesi). In topi adulti, la mancanza di CASQ1 è accompagnata da
un significativo aumento del volume mitocondriale (8.21±0.30% vs
3.41±0.13%), aumento dell’espressione di PCG-1alfa (coinvolto nella mitocondriogenesi), e di stress ossidativo (19.6±0.43 vs 3.2±0.24
microg GSSG/g di tessuto e la diminuzione del GSH/GSSG). A 14
mesi i topi CASQ1-null mostrano già un calo significativo della forza
rispetto agli animali WT, come dimostrato dal grip test
(0.031±0.003 N/g vs 0.067±0.006 N/g) e da misure di forza nei
muscoli dissezionati (168.52±59.34 mN/cm2 vs 98.59±19.50
mN/cm2). Infine, con l’aumentare dell’età (20-31 mesi) il muscolo
scheletrico mostra un progressivo degrado strutturale in cui molte fibre (25-55%) perdono la caratteristica striatura e/o presentano aree
di eccessiva contrattura. In questa fase il contenuto di PGC-1alfa è
ridotto e spesso i mitocondri sono danneggiati o mancanti in aree
estese. Queste aree somigliano alle alterazioni descritte come cores
in altri modelli di MH e CCD. Questi risultati suggeriscono la progressione di una condizione patologica, probabilmente iniziata da un’anormale proliferazione mitocondriale e stress ossidativo.
(1) Dipartimento Medicina Sperimentale e Diagnostica, Università di Ferrara, via Borsari 46, 44100 Ferrara Italy
(2) Departments of Anesthesia and Biomedizin, Basel University Hospital;Switzerland
(3) Unité de Neuropédiatrie CHUV - BH11, Lausanne, Switzerland
(4) Department of Neuropediatrics, University Children’s Hospital and Department of Neurology Basel University Hospital, Switzerland
(5) Institut de Myologie, Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière, UPMC, Paris,
France
(6) Guy’s & St Thomas’ NHS Foundation Trust, Paediatric Neurology, London, UK
(7) Dubowitz Neuromuscular Centre, UCL Institute of Child Health, London, UK
(8) Wolfson Centre of Inherited Neuromuscular Disease, Robert Jones & Agnes
Hunt Orthopaedic Hospital NHS Trust, Oswestry
(9) Institute of Human Genetics, Newcastle University, Newcastle upon Tyne
La depolarizzazione prolungata del sarcolemma del muscolo scheletrico è accoppiata ad un influsso di calcio nel mioplasma (ExitationCoupled Calcium Entry, ECCE). Tale evento è mediato dall’interazione tra il recettore delle diidropiridine (DHPR) localizzato nei tubuli T
ed il recettore della rianodina localizzato nella membrana delle cisterne terminali del reticolo sarcoplasmatico. Abbiamo misurato l’influsso di calcio accoppiato all’eccitazione (ECCE) in miotubi isolati
dal muscolo schletrico di pazienti aventi mutazioni nel gene codificante il recettore della rianodina associate all’ipertemia maligna e
alla “Central Core” Disease, CCD). I nostri dati dimostrano che mutazioni nel recettore della rianodina aumentano l’influsso di calcio
accoppiato all’eccitazione (ECCE), e che l’aumento della concentrazione mioplasmatica di calcio causata da ECCE è associato ad una
attivazione la NO sintetasi ed al trasferimento nel nucleo del fattore
di trascrizione NFATc1. Abbiamo inoltre dimostrato che l’attivazione
dei geni sotto il controllo di NFATc1 è responsabile dell’aumento
della secrezione di IL-6 dai myotubi isolati da pazienti affetti da
Central Core Disease (Treves et al, J. Cell Sci. 123: 4170-4182,
2010; Treves et al, e Hum. Mol Gen 2011, in press).
ABSTRACT N. 86
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 3
PROTASI FELICIANO
GGP08153
484.900
Durata (anni): 3
128.000
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2010
Desaphy Jean-François (1), Liantonio Antonella (1), Pierno Sabata
(1), Gramegna Gianluca (1), Dinardo Maria Maddalena (1), Camerino
Giulia M. (1), Costanza Teresa (1), Scaramuzzi Antonella (1), Carbonara Roberta (1), LoMonaco Mauro (2), Conte Camerino Diana (1)
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Telethon grant N.
GGP10101
CANALOPATIE DA CLORO EREDITARIE DEL MUSCOLO SCHELETRICO E DEL RENE: DAL GENOTIPO AL FENOTIPO E NUOVI
APPROCCI FARMACOTERAPEUTICI
ABSTRACT N. 85
Responsabile
CONTE CAMERINO DIANA
(1) Sezione di Farmacologia, Dip. Farmacobiologico, Università degli Studi di
Bari - Facoltà di Farmacia, via Orabona - 4 campus, 70125 Bari. Tel/Fax: 080
544 28 01. E-mail: [email protected]
(2) Dipartimento di Neuroscienze, Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma
Anno d’inizio: 2008
LE CALSEQUESTRINE NELL’OMEOSTASI DEL CALCIO E LORO
POTENZIALE RUOLO IN MIOPATIE SCHELETRICHE UMANE
EREDITARIE
Questo progetto mira all’identificazione di farmaci per il trattamento
di pazienti affetti da malattie genetiche dei canali al cloro (canalopatie), quali la Miotonia Congenita (MC) inerente il muscolo scheletrico (aim#1), la sindrome di Bartter (BS) e l’ipertensione sale-dipendente (SSH) riguardante i reni (aim#2). Tali malattie sono dovute a mutazioni/polimorfismi di geni codificanti per i canali al cloro
della famiglia CLC, i quali controllano l’eccitabilità muscolare e il
riassorbimento dei sali nel rene. La farmacoterapia di queste patologie è attualmente sintomatica con un limitato profilo beneficio/effetti collaterali, mentre ligandi specifici per i canali al cloro
mancano (Conte Camerino et al. Neurother. 2007). La situazione è
recentemente peggiorata con il ritiro dal mercato della mexiletina, il
farmaco di prima scelta nella MC. Riguardo BS/SSH, abbiamo descritto le proprietà strutturali chiave per il blocco o l’attivazione dei
canali renali ClC-K da parte da vari ligandi [Liantonio et al. PNAS
USA 2008]. Aim#1: abbiamo studiato due mutazioni in CLCN1,
F167L e G190S, che sono state associate costantemente con la presenza (G190S) o l’assenza (F167L) di debolezza transitoria in pazienti MC. Le mutazioni sono state espresse in cellule di mammifero
per condurre studi di patch-clamp. Mentre F167L determina solo
leggere alterazioni delle correnti al cloro, G190S induce un drammatico shift della voltaggio-dipendenza determinando la riduzione
delle correnti al cloro a potenziale fisiologico. Lo studio di F167L
prosegue per definire la relazione genotipo/fenotipo. Abbiamo verificato che l’acetazolamide (ACTZ), utilizzato empiricamente da alcuni pazienti MC, determina un shift negativo di 10-20 mV dell’attivazione delle correnti al cloro hClC-1. Aim#2: abbiamo somministrato
dei bloccanti dei canali ClC-K, quali derivati del benzofuran MT-189
e RT-93, ai ratti per studiarne le proprietà farmacocinetiche e farmacodinamiche. I due farmaci mostrano una buona biodisponibilità
e sono in grado di aumentare il volume delle urine senza perdita di
Paolini Cecilia (1), Quarta Marco (2), Tomasi Mirta (3), Canato Marta (2), Toniolo Luana (2), La Rovere Rita (1), Fulle Stefania (1), Nori Alessandra (3), Sorrentino Vincenzo (4), Reggiani Carlo (2), Protasi Feliciano (1)
(1) IIM & CeSI – Dept. of Neuroscience & Imaging, University G. d’Annunzio,
Chieti, Italy - CeSI Centro Scienze dell’Invecchiamento - Via Colle dell’Ara 66013 Chieti Scalo (CH) - tel. +39-0871-541423 - email: [email protected]
(2) Dept of Biomedical Sciences, University of Padova, Italy
(3) Dept. of Anatomy and Physiology, University of Padova, Italy
(4) Molecular Medicine Section, Dept. of Neuroscience, University of Siena, Italy
Nell’uomo l’ipertermia maligna (MH) e il colpo da calore da sforzo/ambientale (EHS) si manifestano con crisi simili, potenzialmente
mortali, innescate rispettivamente da anestetici volatili e da intenso
esercizio fisico e/o alte temperature. Molte famiglie (70-80%) con
diagnosi di suscettibilità a MH, e alcuni con EHS, sono stati legati a
mutazioni nel gene per il recettore della rianodina di tipo-1 (RyR1).
Il RyR1 è un canale per il rilascio del Ca2+ del reticolo sarcoplasmatico (SR) del muscolo scheletrico e una proteina chiave nell’accoppiamento eccitazione-contrazione (EC). Tuttavia, mutazioni nel gene
RyR1 non sono state trovate in tutte le famiglie MH, suggerendo che
ci devono essere geni alternativi. Nel nostro laboratorio abbiamo caratterizzato un innovativo modello knockout privo dell’isoforma del
muscolo scheletrico della calsequestrina (CASQ1), una proteina legante Ca2+ che modula l’attività del RyR1 ed è localizzata nel lume,
e abbiamo analizzato se questi topi presentano un fenotipo tipo
MH/EHS. L’ablazione della CASQ1 causa nei topi maschi knockout un
aumento notevole del tasso di mortalità spontanea e suscettibilità ad
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21-02-2011
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
sali. Il trattamento non modifica l’espressione genica dei canali ClCK nè l’osmolarità della midollare interna, mentre aumentano la
down-regulation dell’aquaporina-2 indipendentemente dalla vasopressina. La loro limitata capacità a superare la barriera sangue/orecchio interno in un modello in vitro suggerisce limitati effetti
collaterali auditivi. Quindi i bloccanti dei canali ClC-K mostrano un
elevato potenziale terapeutico per i pazienti ipertensivi portatori di
polimorfismi. Studi di struttura/attività sono in corso per sviluppare
ligandi ad alta affinità per i canali ClC-K mutati/polimorfici associati
a BS/SSH. La comprensione della relazione genotipo/fenotipo potrà
aiutare i medici nella diagnosi e nella scelta del migliore trattamento. Gli studi preclinici poseranno i fondamenti scientifici per l’utilizzo
di farmaci empirici e il disegno di trial clinici con nuove molecole
utili per MC/BS/SSH.
mento ad opera delle MMP. Abbiamo individuato due mutazioni
puntiformi in grado di ridurre il processamento in vitro. Il nostro
obbiettivo è di realizzare un distroglicano resistente al taglio e
vedere se questo mutante è in grado di dar luogo, oltre che una
normale mielinizzazione, un miglioramento nelle neuropatie ereditarie.
ABSTRACT N. 88
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
ABSTRACT N. 87
FELTRI MARIA LAURA
Totale
376.200
Telethon grant N.
Num Centri: 1
380.200
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2007
Florio Francesca (1), Musner Nicolò (1), Saccucci Stefania (1), Taveggia Carla (2), Feltri M. Laura (1), D’Antonio Maurizio (1), Wrabetz Lawrence (1)
GGP08021
Durata (anni): 3
GGP07100
TRAFFICO INTRACELLULARE E CONTROLLO DI QUALITÀ DELLA GLICOPROTEINA P0 NELLA NEUROPATIA CMTB1
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
WRABETZ LAWRENCE
Anno d’inizio: 2008
(1) Department of Genetics and Cell Biology, San Raffaele Scientific Institute,
DIBIT, via Olgettina 58, 20132 Milano – e-mail: [email protected]
(2) INSPE, San Raffaele Scientific Institute, DIBIT, via Olgettina 58, 20132 Milano
LAMININE E LORO RECETTORI NELLE NEUROPATIE EREDITARIE
Myelin Protein Zero codifica per la principale proteina strutturale
della mielina, ed e` necessario per la formazione e il mantenimento
della stessa da parte delle cellule di Schwann nel nervo. Nell’uomo,
più di 100 mutazioni in P0 sono associate con neuropatie ereditarie.
Per esempio, la delezione della serina in posizione 63 (P0S63del)
causa una neuropatia di Charcot-Marie-Tooth di tipo 1B, e l’introduzione di questa mutazione in topi transgenici produce una simile
neuropatia demielinizzante. La proteina P0S63del non viene incorporata nella mielina, ma viene invece ritenuta nel reticolo endoplasmico (ER) dove provoca un unfolded protein response (UPR), il che
indica l’acquisizione di una funzione tossica (Wrabetz et al, J. Neurosci., 26:2358-2368, 2006; Pennuto et al, Neuron, 57: 393-405,
2008). La morte delle cellule di Schwann e` piuttosto limitata nei
nervi S63del, il che suggerisce un meccanismo tossico diverso. L’analisi trascrittomica di nervi S63del adulti mostra che l’espressione
di P0S63del induce l’over-espressione di fattori di trascrizione quali
Sox2, Sox4, c-Jun ed Id2, che normalmente sono espressi solo nelle cellule di Schwann pro-mielinizzanti dei nervi neonatali. L’espressione sostenuta di questi fattori nelle cellule di Schwann potrebbe
essere la causa dell’ipomielinizzazione che si osserva nei nervi
S63del. Al fine di esplorare l’ipotesi che l’inappropriata espressione
di questi geni possa interferire con la mielinizzazione, abbiamo trasdotto degli espianti mielinizzanti di gangli delle radici dorsali (DRG)
con costrutti lentivirali che esprimono Sox2, Sox4 o Id2. I risultati
preliminari suggeriscono che questi fattori potrebbero avere un ruolo di regolatori negativi della normale mielinizzazione. Paradossalmente, abbiamo anche trovato che l’ablazione genetica di Id2 o
Sox2 in nervi S63del peggiora il fenotipo della neuropatia. Quindi e
possible che l’over-espressione di questi fattori in nervi malati possa svolgere una funzione protettiva.
Pavoni Ernesto (1), Court A. Felipe (1,2), Zambroni Desirée (1),
Colombelli Cristina (1), Merli Alberto (1), Sorokin Lydia (3), Wrabetz Lawrence (1), Feltri M. Laura (1)
(1) Division of Genetics and Cell Biology, San Raffaele Scientific Institute, via Olgettina 58, 20132 Milan, Italy. Tel: +39/0226434782 e-mail: [email protected]
(2) Department of Physiological Sciences, P. Universidad Catòlica de Cile, Santiago, Cile
(3) Institute of Physiological Chemistry and Pathobiochemistry, University of
Munster, Munster, Germany
In molti tipi cellulari, il complesso del distroglicano lega le laminine
extracellulari al citoscheletro. Nelle cellule muscolari i componenti di
questo complesso sono il bersaglio di molte distrofie muscolari. Allo
stesso modo abbiamo postulato che le anomalie descritte in diverse
neuropatie ereditarie (Charcot-Marie-Tooth 4F causata dalla deficienza della periaxina e le distrofie muscolari congenite con il coinvolgimento del sistema nervoso periferico: MDC-1A, Fukuyama/MDC1C, MDC1D causate dalla perdita della laminina-2 e delle
glicosiltransferasi fukutina/FKRP e LARGE rispettivamente) condividono la patogenesi basata sulla disfunzione del complesso del distroglicano. Nelle cellule di Schwann, il distroglicano lega tre differenti proteine distrofina simili per formare complessi con specifiche
funzioni in diversi compartimenti cellulari. Abbiamo osservato che la
formazione dei tre complessi può essere modulata dinamicamente
mediante il taglio del distroglicano ad opera delle metalloproteinasi
(MMP) 2 e 9, questo processo fisiologico viene utilizzato dalle cellule
di Schwann per rimodellare i compartimenti cellulari in risposta a
stimoli meccanici o metabolici.
Il taglio favorisce la formazione del complesso distroglicano-utrofina/DP116 mentre il distroglicano non tagliato lega il complesso con
DRP2. In condizioni fisiologiche in vivo, è possibile sbilanciare l’equilibrio tra i due compartimenti utilizzando inibitori o attivatori delle MMP, inoltre nei topi privi dei geni della MMP-2 e -9 si osserva un
aumento sia della lunghezza dell’internodo sia del compartimento
caratterizzato dal distroglicano non tagliato. Noi proponiamo che
queste variazioni influiscono sul ruolo del distroglicano nella mielinizzazione e nella regolazione della lunghezza dell’internodo.
Viceversa, nelle neuropatie ereditarie il taglio del distroglicano è
eccessivo e ciò da origine a compartimenti anormali e internodi
più corti, come si osserva nei topi Dy2j/2j modello murino della
MDC1A. Inotre nelle culture mielinizzanti dei gangli delle radici
dorsale di topi Dy2j/2j, l’inibizione della proteolisi del distroglicano
ripristina i normali compartimenti e la lunghezza dell’internodo.
Questi esperimenti mostrano che la regolazione del taglio può essere un meccanismo generale per determinare la composizione
del complesso di proteine in condizioni fisiologiche, mentre sbilanciamenti di questa regolazione danno luogo a processi patologici
ma allo stesso tempo possono divenire bersagli per il trattamento
delle malattie.
L’interazione tra il beta distroglicano e le MMP-2 e -9 costituisce
perciò un punto focale per sviluppare una strategia rivolta verso la
modulazione del processamento. Il principale sito di taglio del beta
distroglicano ad opera delle MMP-2/9 è stato recentemente localizzato tra gli amminoacidi His-715 e Leu-716. Noi stiamo cercando
dei mutanti del beta distroglicano in grado di ridurre il processa-
ABSTRACT N. 89
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
PREVITALI STEFANO
GGP08037
267.200
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2008
RISTABILIRE LE INTERAZIONI TRA CELLULE E MATRICE EXTRACELLULARE PER CONTRASTARE LA DEGENERAZIONE TISSUTALE E FAVORIRE I PROCESSI DI RIPARAZIONE NELLE
NEUROPATIE EREDITARIE
Domi Teuta (1), Porrello Emanuela (1), Velardo Daniele (1), Capotondo Alessia (2), Biffi Alessandra (2), Cossu Giulio (2), Ruegg
Markus (3), Comi Giancarlo (1), Previtali Stefano (1)
(1) INSPE and Division of Neuroscience - San Raffaele Scientific Institute, Via
Olgettina 60, 20132 Milano
(2) Division of Regenerative Medicine, San Raffaele Scientific Institute, Milan
(3) Biozentrum, University of Basel, Switzerland
La distrofia muscolare congenita (CMD) è caratterizzata da una pro-
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
gressiva distrofia muscolare e da una neuropatia dismielinizzante
che causano una grave disabilità fin dall’infanzia. La forma più frequente consegue a mutazioni del gene LAMA2 che codifica per la
catena alfa2 della laminina2, l’isoforma di laminina prevalente nella
membrana basale del tessuto muscolare e del nervo periferico. Nonostante siano note le caratteristiche cliniche e i meccanismi patogenetici che portano alla degenerazione neuromuscolare della CMD,
non sono note terapie utili che possano arrestare la malattia. La sovraespressione della laminina2 o di una proteina detta mini-agrina,
capace di legare i recettori della laminina2 ad altre laminine, sono
in grado di migliorare le caratteristiche istologiche e le abilità motorie di modelli murini di CMD. Al fine di facilitare la possibile traslazione nell’uomo di questa terapia, abbiamo deciso di utilizzare dei
carrier cellulari, i mesoangioblasti, per sintetizzare la mini agrina in
muscoli e nervi dei modelli murini di CMD. I mesoangioblasti sono
stati infettati con vettori lentivirali che codificano per la mini agrina,
e abbiamo verificato che sia in vitro che in vivo sono in grado di
sintetizzare la mini-agrina. Infatti, i mesoangioblasti iniettati negli
animali sono in grado di fondersi con i miotubi dell’animale affetto e
cominciano a produrre mini-agrina che si distribuisce sulla loro superficie. I topi trattati hanno presentato un miglioramento delle attività motorie e del tessuto muscolare rispetto ai topi CMD non trattati. Col tempo però le capacità motorie di questi topi sono peggiorate, anche se in modo minore rispetto a topi CMD non trattati.
Studi successivi hanno mostrato che il trattamento non è in grado
di migliorare la neuropatia, che quindi peggiora, e si osservano infiltrati infiammatori nel tessuto muscolare.
Rab7 CMT2B compromettono la crescita dei neuriti e il differenziamento neuronale.
La CMT2B insorge nella terza decade di vita, quindi nei pazienti affetti da tale patologia lo sviluppo non è compromesso. Ciò suggerisce che i mutanti di Rab7 colpiscano selettivamente la rigenerazione dei neuroni negli ultimi stadi. Questi risultati indicano che strategie per controllare e diminuire l’attività di Rab7 nei neuroni potrebbero essere una terapia mirata per la CMT2B.
ABSTRACT N. 91
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 5
Totale
Num Centri: 1
Le neuropatie ereditarie demielinizzanti costituiscono un insieme
di malattie conseguenti ad un danno della guaina (mielina) che
circonda i nervi. Ne conseguono debolezza muscolare, alterata
sensibilità e dolore. Molte neuropatie colpiscono i bambini e tutte
le generazioni di una famiglia, alcune sono severe e accorciano
l’aspettativa di vita. Sono stati identificati molti dei geni che provocano le neuropatie ereditarie, e si è scoperto che i diversi difetti
agiscono con meccanismi differenti. Per questo motivo non è ancora disponibile una cura, ma soprattutto è difficile immaginare
una terapia comune che possa essere di beneficio a tutte queste
malattie. Recentemente il Coordinatore di questo studio (Taveggia) ha scoperto un fattore di crescita che aumenta proprio la produzione della mielina nei nervi. Non solo, l’azione di questo fattore può essere aumentata o diminuita usando dei farmaci che sono
già in uso in sperimentazioni cliniche per altre patologie umane. Il
Coordinatore ha riunito vari gruppi che lavorano nello stesso Istituto, il San Raffaele di Milano, e che da anni si occupano di neuropatie ereditarie scoprendo alcuni geni e il loro meccanismo di
azione, creando modelli animali, raccogliendo biopsie nervose di
pazienti e infine riprogrammando cellule provenienti da queste
biopsie per trasformarle in cellule staminali adulte.
Usando queste risorse, il gruppo intende testare i farmaci che aumentano o diminuiscono il fattore pro-mielinizzante in modelli animali di queste neuropatie ed in modelli cellulari. Tali studi verranno eseguiti anche nelle cellule staminali derivate dalle biopsie
umane, per valutarne l’efficacia e diminuirne eventuali effetti tossici. Ci aspettiamo che questi studi ci indichino se questi farmaci,
già in uso nell’uomo, possano essere di beneficio per diverse neuropatie ereditarie.
GGP09045
165.000
Anno d’inizio: 2010
(1) Division of Neuroscience, San Raffaele Scientific Institute, Milan - via Olgettina 58, 20132 Milano; e-mail: [email protected]; telefono 02 26434439;
fax 02 26436164
(2) Division of Genetics and Cell Biology, San Raffaele Scientific Institute, Milan
(3) Dulbecco Telethon Institute
BUCCI CECILIA
Durata (anni): 3
442.900
Durata (anni): 1
Feltri Maria Laura (2), Previtali Stefano (1), Wrabetz Lawrence (2),
Bolino Alessandra (1,3), Taveggia Carla (1)
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Telethon grant N.
GPP10007
MODULAZIONE DELLA NEUREGULINA-1 PER IL TRATTAMENTO DI NEUROPATIE DEMIELINIZZANTI
ABSTRACT N. 90
Responsabile
TAVEGGIA CARLA
Anno d’inizio: 2009
BASI MOLECOLARI DELLA NEUROPATIA CHARCOT-MARIETOOTH DI TIPO 2B
Cogli Laura, Lecci Raffaella, Bramato Roberta, Progida Cinzia, Bucci
Cecilia
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biologiche ed Ambientali (Di.S.Te.B.A.),
Università del Salento - via prov.le Lecce-Monteroni, 73100, Lecce, Italia
Le neuropatie ereditarie sensoriali mostrano una grande eterogenicità clinica e genetica. La malattia di Charcot-Marie-Tooth (CMT) è
la più importante tra i disordini neuromuscolari ereditari, con un’incidenza di 1:2500. Ad oggi sono stati identificati più di 30 loci associati alle diverse forme della patologia. È nota essere una neuropatia ereditaria sensoriale e motoria (HMSN) e un disordine neurodegenerativo che causa debolezza muscolare e atrofia in piedi, gambe, mani e avambracci. Esistono diverse forme di CMT. La CharcotMarie-Tooth di tipo 2B (CMT2B) è una neuropatia periferica assonale (non-demielinizzante) caratterizzata da debolezza dei muscoli distali e atrofia, leggera perdita sensoriale e velocità di conduzione
nervosa normale o quasi normale. Quattro mutazioni missenso in
Rab7 (piccola GTPasi conservata dal lievito all’uomo, espressa in
tutti i tessuti e che controlla il trasporto ai compartimenti degradativi endocitici) causano la Charcot-Marie-Tooth 2B: Leu129Phe,
Lys157Asn, Ans161Thr e Val162Met. Queste mutazioni colpiscono
amminoacidi altamente conservati.
Abbiamo dimostrato che le proteine Rab7 mutanti che causano la
CMT2B presentano una Koff per i nucleotidi più alta rispetto alla
proteina wt (in misura maggiore per il GDP) e, di conseguenza, una
più bassa attività GTPasica. Inoltre, all’interno della cellula, tali proteine mutanti sono maggiormente legate al GTP e possono recuperare la funzione di Rab7 quando espresse in cellule silenziate per
Rab7.
Avendo in precedenza dimostrato che il mutante dominante negativo di Rab7 (T22N) stimola la crescita dei neuriti in cellule PC12, abbiamo deciso di vedere se i mutanti CMT2B influenzino la crescita
dei neuriti. Abbiamo quindi espresso i mutanti della proteina Rab7
che causano la CMT2B in cellule PC12 e Neuro2A e abbiamo rilevato
una forte inibizione della crescita dei neuriti più lunghi di 50 micrometri. Inoltre l’inibizione della crescita dei neuriti causata dall’espressione dei mutanti CMT2B è stata accompagnata da una minore
espressione dei marcatori del differenziamento neuronale GAP43 in
cellule PC12 e NeuN in cellule Neuro2A. L’espressione del mutante
costitutivamente attivo di Rab7 (Rab7 Q67L) aveva un effetto simile
a quello dei mutanti associati alla CMT2B. Questi dati, che devono
essere confermati in cellule neuronali, indicano che i mutanti di
ABSTRACT N. 92
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 8
VITA GIUSEPPE
GUP10008
170.300
Durata (anni): 2
Anno d’inizio: 2011
NUOVE MISURE DI OUTCOME NELLA MALATTIA DI CHARCOTMARIE-TOOTH
Vita Giuseppe (1), Fabrizi Gian Maria (2), Gemignani Franco (3),
Padua Luca (4), Pareyson Davide (5), Quattrone Aldo (6), Santoro
Lucio (7), Schenone Angelo (8)
(1) Dipartimento di Neuroscienze, Scienze Psichiatriche e Anestesiologiche,
Università di Messina - Tel: 0902212793; Fax: 0902212789; email: [email protected]
(2) Dipartimento di Scienze Neurologiche, Neuropsicologiche, Morfologiche e
Motorie, Università di Verona
(3) Dipartimento di Neuroscienze, Università di Parma
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21-02-2011
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
ni locomotorie potrebbe fornire delle misure di outcome oggettive importanti, possibilmente con una maggiore sensitività ai cambiamenti
indotti da eventuali terapie o dal progredire della malattia.
Dato che, agli stadi iniziali, la malattia di CMT può non colpire drasticamente il cammino, risulta interessante analizzare anche task
locomotori più impegnativi, quali il cammino sulle punte e sui talloni, la salita e discesa dalle scale, la stabilizzazione posturale dopo il
sit-to-stand.
Obiettivi del presente progetto sono i seguenti:
- studiare, tramite tecniche di Analisi strumentale del Movimento
(AM), un gruppo di pazienti con malattia di CMT;
- analizzare la correlazione tra i risultati ottenuti dall’AM e i dati clinici, demografici e genetici;
- valutare l’affidabilità e la sensitività dei dati ottenuti dall’AM come
misure di outcome per trial terapeutici e studi sulla storia naturale
della malattia.
Descrizione del progetto:
Si tratta di uno studio osservazionale longitudinale su un gruppo di
100 soggetti con malattia di CMT. Le performance locomotorie, misurate strumentalmente, verranno correlate con le caratteristiche
demografiche, cliniche e genetiche, avendo come riferimento di
controllo i dati acquisiti su 50 soggetti sani. Le valutazioni verranno
effettuate alla baseline e verranno poi ripetute ad 1 e 2 anni di distanza, per valutare la sensitività al cambiamento degli indici associati ai disturbi locomotori. In un sottogruppo di almeno 20 pazienti
con CMT verrà effettuato uno studio di test-retest reliability a distanza di 4-6 settimane. Si ipotizza che gli indici biomeccanici presentino una sensitività al cambiamento maggiore delle scale cliniche
standard (CMTNS, CMTES, walk-12, ONLS).
Risultati attesi
Il progetto intende sviluppare una procedura strumentale che potrà
essere utilizzata come misura di outcome affidabile e sensibile in
futuri trial clinici.
I dati di Analisi del Movimento su 100 soggetti con malattia di CMT
costituiranno un data set rilevante per studi sulla storia naturale
della malattia, consentendo il monitoraggio del decorso delle alterazioni locomotorie in correlazione con l’età e i sintomi clinici.
(4) Fondazione Don Carlo Gnocchi ONLUS - Centro Santa Maria della Pace, Roma
(5) Fondazione I.R.C.C.S., Istituto Neurologico “Carlo Besta”, Milano
(6) Dipartimento di Scienze Mediche, Università “Magna Graecia”, Catanzaro
(7) Dipartimento di Scienze Neurologiche, Università “Federico II”, Napoli
(8) Dipartimento di Neuroscienze, Oftalmologia e Genetica, Università di Genova
L’obiettivo dello studio è quello di validare il 6-minute walk test
(6MWT) e lo StepWatchTM Activity Monitor (SAM), due strumenti
che riflettono l’attività motoria della vita quotidiana, con altre misure di outcome già validate in una coorte ampia e rappresentativa di
pazienti con malattia di Charcot-Marie-Tooth (CMT).
La CMT è la più frequente malattia neuromuscolare ereditaria. Finora sono stati effettuati pochi trial clinici e studi di storia naturale
nella CMT tipo 1A. Recentemente sono state identificate e validate
alcune misure di outcome. Due strumenti che molto probabilmente
riflettono in modo più obiettivo ed accurato le prestazioni motorie
dei pazienti nella vita quotidiana, ma non ancora validate nei pazienti CMT, sono il 6MWT ed il SAM. Entrambi sono stati impiegati
per valutare la capacità funzionale in molte malattie neurologiche
ed in alcune malattie neuromuscolari.
Lo studio sarà svolto in 12 mesi su 200 pazienti CMT (CMT1A,
CMT1B, CMT-X-linked). Il progetto sarà articolato nelle seguenti fasi: 1) addestramento dei medici di ciascuno dei centri partecipanti e
valutazione della inter- ed intra-rater reliability del 6MWT e del
SAM; 2) valutazioni cliniche con il 6MWT, il SAM, il CMTNS, il test
dei 10 metri, la misurazione con il miometro della forza dei muscoli
distali degli arti superiori ed inferiori, la scala di qualità di vita SF36 all’inizio dello studio e dopo 6 e 12 mesi; 3) analisi provvisoria a
6 mesi; 4) analisi finale dei dati. Tenendo conto della progressione
lenta di malattia, se l’analisi finale dei dati non mostrerà risultati significativi, verrà proposta una continuazione dello studio fino a 24
mesi anche in assenza di un ulteriore contributo finanziario.
Lo studio permetterà di validare due nuove misure di outcome disponibili per futuri trial clinici e di selezionare gli strumenti più adeguati per individuare i cambiamenti significativi in una malattia con
un decorso lentamente progressivo.
La prof.ssa M. Reilly (Londra) parteciperà al progetto, come collaboratore esterno, consentendo una correlazione tra i dati ottenuti
con il SAM con quelli conseguiti con uno strumento simile, il SenseWear Pro 3 Armband. ACMT-RETE, associazione nazionale di volontariato Onlusper la malattia di Charcot Marie Tooth, fornirà tutto
l’appoggio utile nel favorire il reclutamento e la partecipazione allo
studio e nel diffondere le informazioni relative allo studio.
ABSTRACT N. 94
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
ABSTRACT N. 93
Num Centri: 4
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 4
GUP10010
283.775
GUP09013
124.500
Durata (anni): 2
Anno d’inizio: 2010
STUDIO MULTICENTRICO PER VALUTARE EFFICACIA E SICUREZZA DI UN PROTOCOLLO RIABILITATIVO COSTITUITO DA
ESERCIZI AL TREADMILL, STRETCHING E DI PROPRIOCEZIONE IN PAZIENTI AFFETTI DA NEUROPATIA DI CHARCOT-MARIE-TOOTH TIPO 1A
FERRARIN MAURIZIO
Durata (anni): 3
SCHENONE ANGELO
Anno d’inizio: 2011
Monti Bragadin Margherita (1,2), Maggi Giovanni (3), Grandis Marina (1), Padua Luca (2), Pareyson Davide (4), Fabrizi Gianmaria (5),
Saporiti Riccardo (1), Scorsone Debora (6), Crimi Emanuele (6),
Schenone Angelo (1)
SVILUPPO DI UN PROTOCOLLO STRUMENTALE DI ANALISI
DEL MOVIMENTO PER L’ANALISI MULTITASKING DELLE FUNZIONI LOCOMOTORIE NELLA MALATTIA DI CHARCOT-MARIE-TOOTH NELL’ETA’ EVOLUTIVA E NELL’ADULTO: CARATTERIZZAZIONE DELLA RELIABILITY E RESPONSIVENESS
TRAMITE STUDIO MULTICENTRICO
(1) Dipartimento di Neuroscienze, Oftalmologia e Genetica, Università di Genova - Largo Daneo 2, Genova, Italia
(2) Fondazione Don Carlo Gnocchi, Onlus - Centro Santa Maria della Pace, Roma
(3) Dipartimento Medicina Specialistica, Ospedale San Martino, Genova
(4) Fondazione I.R.C.C.S., Istituto Neurologico “Carlo Besta”, Milano
(5) Dipartmento di Scienze Neurologiche e della Visione, Università di Verona
(6) Dipartimento di Medicina interna e Specialità mediche (DIMI), Università di
Genova
Rabuffetti Marco (1), Pareyson Davide (2), Padua Luca (3), Forni
Marco (4), Schenone Angelo (5), Beghi Ettore (6), Bovi Gabriele
(1), Ferrarin Maurizio (1)
(1) Polo Tecnologico, IRCCS Fond. Don Carlo Gnocchi Onlus, Milano - via Capecelatro, 66 - 20148 Milano, Italy
(2) Clinica delle neuropatie degenerative centrali e periferiche, Fondazione
IRCCS Istituto Neurologico C. Besta, Milano
(3) Centro S. Maria della Pace, Fond. Don Carlo Gnocchi Onlus, Roma
(4) Polo Riabilitativo del Levante Ligure, Fond. Don Carlo Gnocchi Onlus, Roma
(5) Dip. di Neuroscienze, Oftalmologia e Genetica, Sezione di Neurologia, Università di Genova, Genova
(6) Laboratorio Malattie Neurologiche, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri, Milano
La neuropatia di Charcot-Marie-Tooth tipo 1A (CMT1A) è una delle
più frequenti malattie ereditarie del sistema nervoso.
Questo studio ha in programma di valutare l’efficacia e la sicurezza
di un protocollo riabilitativo innovativo, costituito da esercizi al
treadmill (tappeto mobile) e da esercizi di allungamento muscolare
e di propriocezione. Abbiamo in programma l’arruolamento di 92
pazienti, che verranno trattati con il protocollo in studio, in maniera
randomizzata, controllata e in singolo cieco. Per arruolare un elevato numero di soggetti, abbiamo organizzato uno studio multicentrico che riunisce quattro dei gruppi più attivi in Italia nella gestione di
pazienti con CMT.
I soggetti con CMT sono altamente motivati a partecipare a progetti
riabilitativi anche perchè a tutt’oggi non esiste una terapia medica
per la CMT1A. Con questo progetto ci aspettiamo di rispondere alle
seguenti domande: è il treadmill ben tollerato ed efficace in pazienti
con CMT1A quando confrontato con prtocolli riabilitativi standard?
Razionale
La malattia di Charcot-Marie-Tooth (CMT) è la più frequente neuropatia ereditaria ed è geneticamente eterogenea. Le forme CMT1A e
CMTX1 sono le più comuni. L’esordio dei sintomi normalmente avviene in età giovanile e poi segue un decorso degenerativo progressivo.
Ad oggi non sono emerse terapie efficaci. In aggiunta alle valutazioni
cliniche e neurofisiologiche, una valutazione strumentale delle funzio-
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
ABSTRACT N. 96
Quanto deve durare un protocollo riabilitativo e con frequenza va ripetuto? Quali sono le misure più sensibili per valutare l’efficacia di
un trattamentoriabilitativo?
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
ABSTRACT N. 95
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
DE BIASI SILVIA
Totale
332.200
Telethon grant N.
Num Centri: 3
GGP06241
250.000
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2006
STUDIO IN VIVO E IN VITRO SULLA INTERAZIONE TRA MECCANISMI INFIAMMATORI ED ECCITOSSICI E SUL RUOLO
DELLA PROTEINA P38MAP CHINASI NELLA PATOGENESI
DELLA SCLEROSI LATERALE AMIOTROFICA
GGP06063
Durata (anni): 3
TORTAROLO MASSIMO
Anno d’inizio: 2006
RUOLO DI ALTERAZIONI DELLA PROTEOLISI NELLA DEGENERAZIONE DEI MOTONEURONI IN MODELLI IN VIVO E IN VITRO DI SCLEROSI LATERALE AMIOTROFICA FAMILIARE.
COINVOLGIMENTO DI PROTEASOMA, IMMUNOPROTEASOMA,
E DEL SISTEMA AUTOFAGOSOMA/LISOSOMA
Gensano Francesco, Lidonnici Dario, Peviani Marco, Spaltro Gabriella,
Daleno Cristina, Battaglia Elisa, Bendotti Caterina, Tortarolo Massimo
Laboratory of Molecular Neurobiology, Department of Neuroscience, Mario Negri Institute for Pharmacological Research, Milano - Via La Masa 19 20156 Milano, Italy. Tel: 0239014206; Fax: 023546277
Bendotti Caterina (2), Poletti Angelo (3), Marino Marianna (2), Crippa Valeria (3), Sau Daniela (3), Onesto Elisa (3), Bolzoni Elena (3),
Galbiati Mariarita (3), Fontana Elena (1), Carra Serena (4), De Biasi
Silvia (1)
La sclerosi laterale amiotrofica è una malattia neurodegenerativa caratterizzata dalla selettiva perdita dei motoneuroni. Si presenta principalmente in forma sporadica ma il 10% dei pazienti la eredita come malattia genetica. In un quinto di questi pazienti sono state riscontrate
mutazioni nel gene della superossido dismutasi (SOD1). L’eziologia della malattia non è nota ma si pensa che una interazione tra neuroni e
cellule gliali sia necessaria per avviare il processo patologico. Infiammazione ed eccitotossicità sono considerate alterazioni chiave nell’indurre la morte dei motoneuroni. Entrambe sono regolate e possono regolare p38MAPK, una chinasi che è stata associata alla morte neuronale in varie malattie neurodegenerative. Abbiamo precedentemente dimostrato l’aumento dell’espressione dei recettori per TNFalpha (TNFRs), l’attivazione di p38MAPK e la diminuita espressione della subunità
AMPA GluR2 nei motoneuroni di topi transgenici SOD1G93A prima dello
sviluppo della malattia. Questi dati suggeriscono che una interazione
tra TNFalpha (TNF) e la tossicità AMPA - mediata, con il coinvolgimento
di p38MAPK, può svolgere un ruolo nell’innescare la morte dei motoneuroni e la patologia. Lo scopo del progetto è stato quello di utilizzare
topi transgenici SOD1G93A e colture primarie di motoneuroni e glia ottenute da questi animali per: a) testare se l’espressione di SOD1G93A
nei motoneuroni e nella glia possa attivare il sistema TNF/p38MAPK in
vitro inducendo morte motoneuronale e indagarne il meccanismo; b)
studiare il legame funzionale tra TNF, p38MAPK, recettori AMPA e morte dei motoneuroni; c) verificare se l’inibizione di p38MAPK e/o TNF nei
topi transgenici, utilizzando diverse metodiche tra cui la terapia genica,
possa impedire la morte neuronale e rallentare il progredire della malattia.Gli studi in vitro hanno mostrato che in cocolture di astrociti e
neuroni spinali, l’espressione di SOD1G93A induce la morte selettiva
dei motoneuroni. La perdita di queste cellule, che mostrano alti livelli di
TNF intracellulari, viene impedita dall’inibizione della sintesi di TNF ma i
livelli di TNF nel terreno di coltura delle cellule SOD1G93A risultano invariati. L’eliminazione di TNF extracellulare è stato infatti inefficace nell’impedire la perdita dei motoneuroni SOD1G93A ma la mancanza del
recettore TNFR2 negli astrociti transgenici (TNFR2 KO) è risultato protettivo. TNFR2-IgG2 usato come agonista di questo recettore è risultato tossico per i motoneuroni in colture neuronali isolate, in assenza di
astrociti, indicando un ruolo dell’interazione tra TNFR2 astrocitario e
TNF di membrana neuronale nella morte motoneuronale osservata, attraverso un reverse signalling. La morte di queste cellule è inoltre impedita da inibitori di p38MAPK ma come questi due processi siano tra
essi legati non è chiaro. Ad oggi, in questo modello cellulare, non sono
stati evidenziati il coinvolgimento di GluR2 o di fenomeni eccitotossici
nella degenerazione dei motoneuroni. Riguardo gli studi in vivo, abbiamo testato se antagonizzando il TNF circolante, grazie alla somministrazione intracerebroventricolare di TNFR2 solubile, si potesse ottenere un miglioramento dei sintomi e della sopravvivenza in topi
SOD1G93A ma i risultati sono stati negativi, confermando i dati in vitro. Verranno mostrati inoltre dati riguardanti la sopravvivenza e la
progressione di malattia di topi transgenici SOD1G93A che sono anche
knock-out per i diversi recettori del TNF.
(1) Dip. Scienze Biomolecolari e Biotecnologie, Università di Milano - via Celoria 26, 20133 Milano
(2) Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri, Milano
(3) Ist. Endocrinologia; Centro di Eccellenza sulle Malattie Neurodegenerative,
Università di Milano
(4) Department of Cell Biology, Section for Radiation and Stress Cell Biology,
University Medical Center Groningen, Groningen, The Netherlands
La Sclerosi Laterale Amiotrofica, sia nella forma familiare (fSLA) che
in quella sporadica (sSLA), è una malattia neurodegenerativa ad
eziologia ignota che colpisce selettivamente i motoneuroni, ed è caratterizzata da accumulo di aggregati di proteine anomale la cui formazione ed alterata degradazione sono rilevanti per la neurodegenerazione. Scopo del nostro progetto è studiare l’implicazione di
due vie proteolitiche intracellulari, la via ubiquitina-proteasoma
(UP) e la via autofagia-lisosoma (AL), nello sviluppo delle lesioni
spinali della SLA e la loro rilevanza nella perdita di motoneuroni.
Poiché alcune forme di fSLA presentano mutazioni della superossido
dismutasi 1 (SOD1), gli esperimenti sono stati eseguiti in vivo su
topi transgenici che esprimono SOD1 umana wild type (wt) o mutata (m, SOD1G93A) e in vitro sulla linea di motoneuroni NSC34 trasfettata con mSOD1.
Abbiamo precedentemente dimostrato che: A) i topi SOD1G93A sviluppano una progressiva disfunzione neuromuscolare seguita da paralisi e morte; i loro motoneuroni accumulano aggregati contenenti
ubiquitina e SOD1 e mostrano alterata degradazione di mSOD1 accompagnata da diminuzione di subunità costitutive e aumento di
subunità inducibili del proteasoma, correlato ad una risposta infiammatoria locale dovuta ad attivazione gliale; B) i motoneuroni NSC34
trasfettati con mSOD1 mostrano formazione di aggregati e difetti
del proteasoma. Questi dati suggeriscono quindi che la via degradativa UP è alterata nei modelli di SLA esaminati e che, per ripristinare la funzionalità del proteasoma, i motoneuroni devono eliminare
le proteine misfolded o prevenendone la aggregazione o stimolandone il turn over mediante altre vie degradative.
Per testare questa ipotesi abbiamo quindi studiato il ruolo di una
piccola proteina heat shock (HspB8) che agisce come chaperone e
facilita la rimozione di proteine misfolded. I risultati mostrano che
nei topi SOD1G93A la HspB8 è sovraespressa nei motoneuroni spinali che accumulano mSOD1 e che nei motoneuroni NSC34 la
HspB8 diminuisce l’aggregazione e aumenta la solubilità di mSOD1
anche con blocco del proteasoma. Mediante immunoprecipitazione
si è inoltre dimostrato che mSOD1 interagisce con il complesso
HspB8/Bag3/Hsc70/CHIP, capace di attivare selettivamente la rimozione autofagica di proteine misfolded. Quindi la HspB8 aumenta la
rimozione di mSOD1 mediante autofagia. L’attivazione di autofagia
avviene anche nel midollo dei topi SOD1G93A, nei cui motoneuroni
si osservano autofagosomi.
Abbiamo infine esteso lo studio anche ad un altro modello di SLA, dimostrando che la HspB8 esercita un effetto simile su una versione
tronca di TDP-43, un’altra proteina implicata nella patologia in esame.
Complessivamente i risultati indicano pertanto che la modulazione
farmacologica dell’espressione di HspB8 nei motoneuroni può avere
importanti implicazioni per chiarire i meccanismi molecolari coinvolti
sia in fSLA che in sSLA.
ABSTRACT N. 97
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
CARRI’ MARIA TERESA
GGP07018
258.700
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2007
STUDIO DI NUOVE STRATEGIE PER RIPARARE IL DANNO MITOCONDRIALE MOTONEURONALE NELLA SLA FAMILIARE
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
Cozzolino Mauro (1), Ferri Alberto (1,5), Crosio Claudia (1,4), Valle
Cristiana (3), Nencini Monica (1), Pesaresi Maria Grazia (1,2), Amori
Ilaria (1), Casciati Arianna (1), Moreno Sandra (6), Sepe Sara (6),
Iaccarino Ciro (1,4), Fiorenzo Paolo (1), Carri’ Maria Teresa (1,2)
(1) Molecular Neuroanatomy and Pathogenesis Unit, IRCCS Foundation Neurological
Institute “C. Besta” - Via L. Temolo 4, 20126 Milano, Phone:+390223942606/2606;
fax: +390223942619; email: [email protected]
(2) Molecular Biology Lab, “Mario Negri” Institute of Pharmacological Research
Milano, Italy
(1) Fondazione Santa Lucia IRCCS, CERC, Via del Fosso di Fiorano 64, 00143
Rome, Italy
(2) Dept. of Biology, University of Rome, Tor Vergata, Rome, Italy
(3) Institute for Cell Biology, CNR, Monterotondo Scalo, Italy
(4) Dept. of Physiological, Biochemical and Cell Science, University of Sassari,
Italy
(5) Institute for Neuroscience CNR, Rome, Italy,
(6) Department of Biology-LIME, University of Rome ‘Roma Tre’, Rome, Italy
Il prodotto principale del gene SMN, la proteina SMN, ha un ruolo
importante nell’assemblaggio degli spliceosomi e nella maturazione
dei pre-mRNA. Il ruolo ubiquitario della proteina FL-SMN non spiega
come la riduzione dei livelli di tale proteina porti alla selettiva degenerazione dei motoneuroni nella SMA. Il nostro gruppo ha identificato una nuova isoforma della proteina SMN, denominata a-SMN
(SMN assonale), la quale è espressa selettivamente negli assoni dei
motoneuroni del midollo spinale (Setola et al, PNAS 2007). A differenza di FL-SMN, a-SMN è in grado di indurre crescita degli assoni
di neuroni in coltura in modo tempo-dipendente.
Per definire il ruolo di a-SMN nell’ omeostasi dei motoneuroni abbiamo generato due modelli sperimentali, uno cellulare e uno animale. Partendo da cellule NSC34, come prima cosa abbiamo prodotto dei cloni cellulari caratterizzati dall’espressione stabile e tetraciclina-dipendente di a-SMN. Abbiamo selezionato per l’analisi cloni
cellulari con minimi livelli basali e con elevata espressione di aSMN, messaggero e proteina, in seguito all’aggiunta di tetraciclina.
Le modificazioni cellulari indotte dall’espressione di a-SMN sono attualmente esaminate mediante trasfezione dei cloni selezionati con
costrutti fluorescenti codificanti per proteine mitocondriali, citoscheletriche e sinaptiche. Tali cloni condizionali sono anche utilizzati per
studiare la stabilità della proteina a-SMN. I nostri dati suggeriscono
che la proteina a-SMN viene degradata piu’ rapidamente rispetto a
FL-SMN, principalmente attraverso la via del proteasoma.
Infine, abbiamo condotto analisi di espressione genica con la tecnica dei microarray per identificare i geni selettivamente modificati in
seguito all’over-espressione di a-SMN. I risultati ottenuti sostengono l’idea che a-SMN determina un aumento dell’espressione di specifici m-RNA e dei relativi prodotti proteici coinvolti nei processi di
crescita assonale.
Abbiamo inoltre generato un topo transgenico caratterizzato dall’over-espressione ubiquitaria di a-SMN. A tal proposito sono stati prodotti due differenti tipi di plasmidi contenenti il cDNA umano sotto il
controllo di un promotore ad espressione ubiquitaria e di un promotore specifico per i motoneuroni. Abbiamo ottenuto due topi fondatori che trasmettono il transgene con frequenza mendeliana: nella
progenie il messaggero di a-SMN è presente nel cervello e nel midollo spinale ma non nel fegato. Stiamo attualmente valutando l’espressione della proteina a-SMN in questi animali attraverso esperimenti di wb e analisi morfologiche.
Questi esperimenti dovrebbero fornire informazioni sui meccanismi
cellulari messi in moto da a-SMN nell’indurre assonogenesi e sul
ruolo svolto in vivo dalla proteina nell’omeostasi dei motoneuroni.
I topi transgenici che over-esprimono a-SMN sono anche essenziali
per stabilire la potenziale funzione compensatoria di tale proteina in
seguito a incroci con i modelli animali per la SMA attualmente disponibili.
L’obiettivo generale di questo progetto è stato di studiare nuovi approcci per intercettare il danno mitocondriale, una delle cause precoci
di danno motoneuronale in pazienti affetti da SLA familiare legata a
mutazioni nel gene che codifica per la SOD1 Cozzolino et al, Antioxid
Redox Signal. 2008 Mar;10(3):405-43; Carrì, Lancet Neurol. 2008
Feb;7(2):118-9; Bendotti and Carrì, Antioxid Redox Signal. 2009
Jul;11(7):1519-22).
Più precisamente, gli obiettivi erano:
1. studiare se il danno mitocondriale indotto dalle SOD1 mutate (mutSOD1) possa essere prevenuto aumentando le capacità di tampone
redox in questi organelli. Abbiamo dimostrato che la formazione di aggregati di mutSOD1 è principalmente conseguente alla formazione di
ponti disolfuro tra le cisteine. La rimozione della Cys111 riduce l’aggregazione e la capacità delle mutSOD1 di associarsi ai mitocondri e
danneggiare cellule motoneuronali immortalizzate (Cozzolino et al, J
Biol Chem. 2008 Jan 11;283(2):866-74; Cozzolino et al, Antioxid Redox Signal. 2009 Jul;11(7):1547-58). In accordo con questi dati, abbiamo sfruttato la capacità delle glutaredoxine (Grx) di ridurre disolfuri
misti nel citosol o nell’IMS (Grx1) oppure nella matrice mitocondriale
(Grx2) per prevenire l’aggregazione delle mutSOD1.
Abbiamo osservato che l’iperespressione di Grx1 accresce la solubilità
delle mutSOD1 nel citosol ma non previene né l’apoptosi in cellule
neuronali in coltura (6) né migliora il decorso della patologia in topi
transgenici G93A-SOD1 (dati non pubblicati). Al contrario, l’iperespressione di Grx2 accresce la solubilità delle proteine mutanti nei mitocondri, interferisce con la frammentazione mitocondriale modificando il pattern di espressione dei proteine coinvolte nel dinamismo mitocondriale, preserva la funzionalità mitocondriale e protegge completamente le cellule dall’apoptosi (Ferri et al, Hum Mol Genet. 2010 Nov
15;19(22):4529-4).
2. studiare se interferire con l’attivazione della neuroinfiammazione
possa migliorare il fenotipo patologico dei topi SLA. In linea di principio questa strategia potrebbe consentire il ripristino della funzionalità
mitocondriale neuronale, poiché la morte motoneruonale nell’ALS è un
processo “non-cell autonomous” in cui gli astrociti hanno un ruolo nella progressione della malattia e abbiamo dimostrato che il trattamento
con citochine infiammatorie accresce drammaticamente la frazione di
mutSOD1 associata ai mitocondri e peggiora il deficit mitocondriale
motoneuronqale (Cozzolino et al, Antioxid Redox Signal. 2008
Mar;10(3):405-4).Per prevenire l’attivazione della risposta neuroinfiammatoria, abbiamo generato topi transgenici che iperesprimono
una forma dominante negativo di IkBa (IkBaAA) selettivamente negli
astrociti. Questi topi sono stati incrociati con i topi transgenici G93ASOD1. Nonostante una efficiente inibizione del pathway di NF-kB, tuttavia, i topi doppio transgenici che esprimono mutSOD1-G93A ubiquitariamente e IkBaAA in astrociti non mostrano beneficio in termini di
esordio e progressione dei sintomi (Ferri et al, Neurobiol Dis. 2008
Dec;32(3):454-60).
Nell’insieme, i nostri dati indicano che la morte dei motoneuroni nell’ALS può essere efficientemente contrastata migliorando la funzionalità mitocondriale, ma non può essere prevenuta inibendo un singolo
pathway infiammatorio, molto probabilmente perché in presenza di
uno stimolo tossico persistente vengono attivati altri pathways.
ABSTRACT N. 99
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 2
BATTAGLIA GIORGIO STEFANO
232.400
Anno d’inizio: 2009
(1) Dip. di Sanità Pubblica e Biologia Cellulare, Università di Roma Tor Vergata
- Edificio E Nord, II Piano, Lab 259, Via Montpellier, 1 00133, Roma, Italia
(2) Fondazione Santa Lucia, Laboratorio di Neuroembriologia, Roma, Italia
GGP07223
Durata (anni): 2
198.100
Durata (anni): 3
Compagnucci Claudia (1,2), Pedrotti Simona (1,2), Sette Claudio
(1,2)
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Telethon grant N.
GGP09154
REGOLAZIONE DELLO SPLICING ALTERNATIVO DEL GENE
SMN2 DA PARTE DELLA PROTEINA DI LEGAME ALL’RNA
SAM68 E SUE IMPLICAZIONI NEL RECUPERO DELLA PROTEINA SMN IN CELLULE SMA
ABSTRACT N. 98
Responsabile
SETTE CLAUDIO
Anno d’inizio: 2008
L’Atrofia Muscolare Spinale (SMA) e’ una patologia neuromuscolare
che costituisce la prima causa genetica di mortalita’ infantile. Si tratta
di una malattia autosomica recessiva, la cui causa genetica e’ ben caratterizzata. La patologia e’ determinata da mutazioni nel gene SMN1,
che causano una diminuzione nei livelli di proteina Survival Motor
Neuron (SMN) e la degenerazione dei neuroni motori alfa del midollo
spinale. Sebbene i pazienti affetti dalla SMA possiedono il gene SMN2,
esso differisce da SMN1 per una singola sostituzione nucleotidica nel-
GENERAZIONE DI MODELLI SPERIMENTALI IN VITRO E IN
VIVO PER LO STUDIO DEL RUOLO DELLA PROTEINA A-SMN
NEL PROCESSO DI ASSONOGENESI
Locatelli Denise (1), Terao Mineko (2), D’Errico Paolo (1), Capra Silvia (1), Garattini Enrico (2), Battaglia Giorgio (1)
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
l’esone 7 che determina l’esclusione di tale esone dall’mRNA maturo e
la produzione di una proteina SMN instabile. La regolazione dello splicing dell’esone 7 di SMN2 rappresenta pertanto, un valido approccio
terapeutico per la correzione di questo difetto genetico.
Il nostro progetto si propone di studiare i meccanismi molecolari
che regolano lo splicing di SMN2 e di identificare approcci molecolari che consentano il recupero dell’inclusione dell’esone 7 nell’mRNA
maturo. Di recente abbiamo identificato la proteina di legame all’RNA Sam68 come un nuovo regolatore dello splicing di SMN2 e abbiamo dimostrato che l’inibizione di questa funzione nei fibroblasti
SMA recupera l’espressione di SMN (Pedrotti et al., EMBO J 2010).
Abbiamo poi esaminato se la modulazione della funzione di Sam68
fosse possible in un contesto neuronale e, dato il potenziale valore
terapeutico delle Cellule Staminali Neurali (CSN) nella medicina rigenerativa, abbiamo valutato la funzione di Sam68 in questa tipologia cellulare. A tal fine abbiamo ottenuto CSN da embrioni murini
wild type e Sam68-/- ed abbiamo analizzato le loro caratteristiche
molecolari e cellulari.
I risultati mostrano che le CSN Sam68-/- hanno un potenziale differenziativo alterato rispetto alle CSN wild type, che permette loro di
differenziare piu’ efficientemente come neuroni. Inoltre, incrociando
topi mutati per Sam68 con modelli murini SMA, abbiamo ottenuto
CSN SMA che sono eterozigoti per Sam68. L’introduzione di un allele
dominante-negativo di Sam68 mediante infezione retrovirale mostra
un effetto positivo sulla inclusione dell’esone 7 nell’mRNA endogeno
di SMN2. Infine, stiamo producendo un topo transgenico che esprime
il dominante negativo di Sam68 nei motoneuroni, sotto il controllo
del promotore HB9. Questi esperimenti ci permetteranno di determinare il potenziale valore terapeutico dell’inibizione della funzione di
Sam68 in modelli murini di SMA e la possibilita’ di usare CSN Sam68/- e la tecnologia delle cellule staminali come un approccio terapeutico basato sulla regolazione dello splicing alternativo in vivo.
questi dati e l’analisi d’espressione genica eseguita con i microarray
confermano l’avvenuta riprogrammazione dei fibroblasti wild-type e
SMA in uno stato pluripotente.
In seguito le iPSCs sono state differenziate in NSCs. Il primo passaggio per indirizzare le iPSCs verso un fenotipo neuronale, è stato quello di coltivarle in terreno neuronale. Il fenotipo delle cellule
differenziate è stato analizzato mediante analisi morfologiche, d’espressione genica e proteiche. Durante la prima settimana le cellule si sono differenziate verso un fenotipo NSC risultando positive
per la nestina a sostegno del fatto che stavano assumendo un fenotipo neuroepiteliale, e formando rosette neurali. Inoltre queste
cellule coesprimevano anche PAX 6 e altri specifici markers neuroectodermici. Le NSC saranno utilizzate per esperimenti di trapianto in modelli murini di SMA. Questo studio contribuirà allo sviluppo di approcci terapeutici cellulo-mediati per la cura della SMA e
di altre malattie del motoneurone.
ABSTRACT N. 101
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 1
Università degli Studi di Milano - Dipartimento di Scienze Neurologiche, via F.
Sforza 35 Milano
GGP09107
257.900
Anno d’inizio: 2010
Nizzardo Monica, Simone Chiara, Falcone Marianna, Donadoni Chiara, Nardini Martina, Salani Sabrina, Magri Francesca, Riboldi Giulietta, Del Bo Roberto, Corti Stefania, Comi Giacomo Pietro
CORTI STEFANIA
Durata (anni): 3
399.200
Durata (anni): 3
SVILUPPO DI UN APPROCCIO TERAPEUTICO PER L’ATROFIA
MUSCOLARE SPINALE CON DISTRESS RESPIRATORIO DI TIPO 1 (SMARD1) MEDIATO DA CELLULE STAMINALI NEURONALI E MOTONEURONI DIFFERENZIATI DA CELLULE STAMINALI PLURIPOTENTI INDOTTE
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Telethon grant N.
GGP10062
Telethon grant N.
ABSTRACT N. 100
Responsabile
COMI GIACOMO PIETRO
Responsabile
L’Atrofia Muscolare Spinale con insufficienza respiratoria (SMARD1) è
una forma autosomica recessiva di malattia del motoneurone che insorge in età infantile per la quale attualmente non esiste una terapia
efficace. Il quadro clinico è caratterizzato da progressiva ipostenia
muscolare soprattutto dei muscoli distali e da insufficienza respiratoria per interessamento della muscolatura diaframmatica.
Questa patologia è causata da mutazioni a livello del gene che codifica per la proteina immunoglobulin micro-binding protein 2
(IGHMBP2). Recentemente abbiamo dimostrato che il trapianto di
motoneuroni derivati da cellule staminali migliora il fenotipo della
malattia nei topi nmd, un modello animale di SMARD1. In questo pregetto ci proponiamo di sviluppare questa strategia terapeutica utilizzando cellule staminali umane -le cellule staminali pluripotenti indotte
(iPSC)-differenziate in cellule staminali neurali (NSC) e motoneuroni.
Nel nostro laboratorio abbiamo generato iPSCs da fibroblasti di soggetti sani, con metodi non-virali in modo che le cellule siano prive di
vettori o sequenze transgeniche, e le abbiamo differenziate in NSC e
motoneuroni. Ci proponiamo ora di migliorare ulteriormente il protocollo di fferenziamento ed analizzare le cellule differenziate con analisi genomiche, proteomiche e funzionali. Nel nostro progetto definiremo i protocolli di trapianto ottimali in topi transgenici SMARD1, includendo protocolli immunosoppressivi. Definiremo la sopravvivenza, il
differenziamento e la funzionalità delle cellule trapiantate nei topi
SMARD1. Determineremo la capacità terapuetica del trapianto cellulare e i meccanisimi molecolari ad esso associati.
Questo progetto contibuirà allo sviluppo di strategie terapeutiche
per la SMARD1 e per altre malattie genetiche del motoneurone.
Anno d’inizio: 2009
APPROCCIO NEUROPROTETTIVO MEDIATO DA CELLULE STAMINALI NEURONALI COME STRATEGIA TERAPEUTICA PER
L’ATROFIA MUSCOLARE SPINALE
Simone Chiara (1), Falcone Marianna (1), Ronchi Dario (1), Riboldi Giulietta
(1), Menozzi Giorgia (2), Bonaglia Clara (1), Nizzardo Monica (1), Bresolin Nereo (1,2), Corti Stefania (1)
(1) Dipartimento di Scienze Neurologiche, Università degli Studi di Milano - via
F. Sforza 35, 20122 Milano
(2) IRCCS E. Medea
L’ Atrofia Muscolare Spinale (SMA) è una delle più comuni cause genetiche di mortalità infantile. Attualmente non esiste una cura per
questa patologia. In un recente lavoro abbiamo descritto come il
trapianto di cellule staminali neuronali (NSC) murine sia in grado di
migliorare il fenotipo della SMA in un modello murino. Questi dati
dimostrano per la prima volta il potenziale terapeutico delle NSC
per tale patologia.
In questo progetto ci proponiamo di analizzare il potenziale terapeutico della NSC umane (hNSCs) derivate da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) come strumento sia di sostituzione cellulare che di neuroprotezione. La genesi delle iPSCs dalle cellule somatiche adulte (come i fibroblasti cutanei) spesso richiede vettori che
si integrano nel genoma, ponendo limiti al loro utilizzo sia nella ricerca di base che nelle possibili applicazioni cliniche. Abbiamo generato iPSCs da fibroblasti primari di un paziente affetto da SMA1, dal
padre non affetto e da un individuo sano non imparentato attraverso un metodo non virale.
Abbiamo eseguito una trasfezione usando un costrutto precedentemente descritto in letteratura nel quale tutti i sei fattori di riprogrammazione (OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, c-Myc, and KLF4) sono
stati clonati in un vettore oriP/EBNA1 usando IRES2 per la coespressione. Questi plasmidi possono essere trasfettati senza vettori
virali e sono poi rimossi dalle cellule in assenza di selezione con antibiotici portando alla formazione di iPSC prive di vettori e sequenze
esogene. I subcloni delle iPSC presentavano una morfologia simile
alle colonie cellulari di cellule staminali embrionali umane (ES) e un
cariotipo normale; esprimevano fattori di trascrizione staminale e
markers di superficie specifici delle cellule ES e differenziavano in
cellule dei tre foglietti embrionali in vitro e in teratomi in vivo. Tutti
ABSTRACT N. 102
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
POLETTI ANGELO
GGP07063
141.300
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2007
MORTE DEI MOTONEURONI NELL’ATROFIA MUSCOLARE SPINALE E BULBARE: DAI MECCANISMI MOLECOLARI AI POTENZIALI APPROCCI TERAPEUTICI
Rusmini Paola (1,2), Crippa Valeria (1,2), Sau Daniela (1,2), Guareschi Stefania (1,2), Poletti Angelo (1,2)
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
a lungo termine è capire qual è il meccanismo attraverso cui il testosterone converte il recettore in una molecola nociva. Noi abbiamo
precedentemente mostrato che la fosforilazione del recettore mutato
ad opera della cinasi AKT blocca il legame al ligando. Ciò risulta in
una ridotta localizzazione nucleare, ridotto accumulo della proteina e
ridotta aggregazione. Inoltre, abbiamo mostrato che il fattore di crescita insulino-simile 1 attenua la progressione della malattia in topo
con un meccanismo che coinvolge la modifica del recettore da parte
di AKT. É importante sottolineare che abbiamo espresso il fattore di
crescita solo nel muscolo, dimostrando che è possible agire sul muscolo per migliorare la progression della malattia in topo. Ora vogliamo investigare come tale modifica del recettore viene regolata all’interno della cellula. La nostra ipotesi è che tale modifica e` influenzata da diversi fattori. Abbiamo dati preliminari che mostrano che il recettore è influenzato da modifiche quali metilazione e palmitoilazione, e che queste altre modifiche sono correlate alla fosforilazione del
recettore ad opera di AKT.
(1) Dipartimento di Endocrinologia, Fisiopatologia e Biologia Applicata (DEFIB),
Università degli Studi di Milano - via Balzaretti 9, 20133 Milano (Italy) e-mail:
[email protected]
(2) “Centro di Eccellenza per lo studio delle Malattie Neurodegenerative”
(CEND), Università degli Studi di Milano
L’atrofia muscolare spinale e bulbare (SBMA) è una malattia del
motoneurone, legata al cromosoma X, causata da un tratto poliglutaminico (poliQ) allungato nel recettore degli androgeni (AR), che
porta alla perdita progressiva dei motoneuroni nel bulbo e nel midollo spinale. In SBMA, la proteina mutata ARpoliQ acquisisce funzioni neurotossiche in seguito all’interazione con il ligando fisiologico testosterone (T). Il T induce l’attivazione di AR, la sua dimerizzazione e la traslocazione nel nucleo. Il meccanismo neurotossico di
ARpoliQ è probabilmente dovuto all’acquisizione di conformazioni
aberranti (misfolding) ed il legame con T porta all’aggregazione di
ARpoliQ. Tali aggregati contengono componenti del sistema Ubiquitina-Proteasoma (UPS) e Heat shock proteins (Hsps), suggerendo
un possibile coinvolgimento di UPS nella patologia.
Utilizzando motoneuroni immortalizzati esprimenti AR wt e mutato, come modelli di SBMA, abbiamo osservato che ARpoliQ inattivo e solubile
nel citoplasma, altera la funzionalità di UPS. Invece, gli aggregati di
ARpoliQ potrebbero costituire compartimenti intracellulari definiti in cui
la cellula sequestra proteine misfolded in attesa di essere degradate da
sistemi proteolitici alternativi, come l’autofagia.
L’analisi della distribuzione intracellulare del marker autofagico LC3 ha
confermato tali osservazioni. Infatti, in presenza di ARpoliQ attivato da
T, LC3 mostra una distribuzione puntinata, suggerendo un possibile
coinvolgimento dell’autofagia nella sua degradazione.
Per contrastare la tossicità di ARpoliQ, potenziandone la degradazione
mediante i due sistemi proteolitici, sono stati usati due diversi approcci.
Nel primo approccio sperimentale, è stata sovraespressa la small
HspB8. HspB8 diminuisce i livelli di ARpoliQ contrastando completamente l’aggregazione di ARpoliQ, senza alterare UPS, ma facilitando
l’eliminazione via autofagia. Infatti, l’HspB8 stimola la formazione di
LC3-II e aumenta il numero degli autofagosomi. L’azione dell’HspB8
su ARpoliQ è annullata dal silenziamento di LC3. HspB8 sembra agire formando un eterocomplesso con altre chaperone come Bag3,
Hsc70 e CHIP.
Nel secondo approccio per degradare ARpoliQ è stato utilizzato un
inibitore di Hsp90, 17-Allylamino-17-demethoxygeldanamycina (17AAG). 17-AAG si è già dimostrata efficace nel ridurre la tossicità di
ARpoliQ in topi SBMA. Nel nostro modello di SBMA la 17-AAG ha ridotto l’aggregazione di ARpoliQ stimolandone la degradazione senza
alterare l’attività dell’UPS. 17-AAG ha aumentato l’espressione, il
turnover e la puntinatura di LC3, sia in assenza che in presenza di T.
Inoltre, l’azione della 17-AAG è bloccata sia con l’inibizione farmacologica dell’autofagia (3-MA) che dal silenziamento di LC3, suggerendo un ruolo importante della 17-AAG nell’induzione dell’autofagia.
Questi risultati indicano che composti capaci di aumentare l’eliminazione di ARpoliQ via autofagia possono trovare applicazione nel
trattamento di SBMA.
ABSTRACT N. 104
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 11
Totale
Num Centri: 1
Le Malattie Mitocondriali (MM) in generale sono un gruppo di patologie in cui si ha un difetto della catena respiratoria mitocondriale
con ridotta produzione cellulare di energia e disfunzione di numerosi organi e apparati, in particolare del sistema nervoso centrale, del
muscolo e del cuore. Malgrado gli straordinari progressi registrati
negli ultimi anni nella comprensione dei meccanismi molecolari e
biochimici delle MM, le scelte terapeutiche sono tuttora fortemente
limitate e quasi sempre sintomatiche, in grado cioè di mitigare i sintomi ma di non risolvere i meccanismi di base in grado di scatenare
la sintomatologia che caratterizzano queste malattie. A rendere ancora più difficile questo settore è che, come spesso capita per altre
patologie rare, in genere i centri clinici e gli studi contano su pochi
casi, il che costituisce un enorme impedimento nel progresso dell’assistenza medica e delle prospettive terapeutiche. Questo limite
può essere superato creando registri di pazienti. Il nostro progetto
si pone come obiettivo quello di creare un network nazionale di
centri clinici con esperienza documentata nel settore di tali patologie che disegnerà e validerà un database clinico e laboratoristico in
cui particolare attenzione verrà dedicata anche alla storia naturale
della patologia.
Il progetto Telethon GUP09004 è iniziato nel Febbraio 2010. Sono
stati coinvolti undici centri nazionali con riconosciuta esperienza
nelle MM. Le fasi iniziali previste (“creazione di uno “steering committee” e di un “oversee committee”, sviluppo e validazione del registro in formato Excel) si sono chiuse con successo. Dopo aver discusso tematiche etiche, procedurali e statistiche, sono stati altresì
definiti i parametri clinici e laboratoristici che costituiranno il registro. Essi sono: codice paziente, codice familiare, sesso, data di nascita, regione di origine, etnia, storia familiare, diagnosi, anno di
diagnosi, anno di esordio della malattia, sintomo/i di esordio, carat-
GGP10037
190.300
Anno d’inizio: 2010
(1) Department of Neuroscience, Neurological Clinic, University of Pisa - Via
Roma 67, 56100 Pisa, Italy, Tel 050 993046, Email [email protected]
(2) Department of Neurosciences, University of Padua
(3) Bambino Gesù Children’s Hospital, Rome
(4) Department of Neurological Sciences, University of Bologna
(5) Department of Neurological Sciences, University of Milan
(6) Department of Paediatrics, University of Genoa
(7) Centre for Neuromuscular Diseases, Department of Neuroscience, University of Turin
(8) Department of Neurosciences, Università Cattolica, Rome
(9) Neurological Institute, University of Verona
(10) Department of Neurosciences, Psychiatry and Anesthesiology, University
of Messina
(11) Istituto Nazionale Neurologico C. Besta, Milan
(12) MITOCON ONLUS
PENNUTO MARIA
Durata (anni): 3
217.100
Durata (anni): 2
Mancuso Michelangelo (1), Angelini Corrado (2), Bertini Enrico (3),
Carelli Valerio (4), Comi Giacomo (5), Minetti Carlo (6), Mongini Tiziana (7), Servidei Serenella (8), Tonin Paola (9), Toscano Antonio
(10), Uziel Graziella (11), Santantonio Piero (12), Siciliano Gabriele
(1)
Progetti di Ricerca Telethon - Neuromuscular Diseases
Telethon grant N.
GUP09004
SVILUPPO E VALIDAZIONE DI UN NETWORK NAZIONALE
PER LA CREAZIONE DEL REGISTRO ITALIANO DELLE MALATTIE MITOCONDRIALI
ABSTRACT N. 103
Responsabile
SICILIANO GABRIELE
Anno d’inizio: 2010
INTERAZIONE GENETICA TRA IL SEGNALE INNESCATO DAL
FATTORE DI CRESCITA INSULINO-SIMILE 1 E GLI ANDROGENI NELLA PATOGENESI DELLA ATROFIA MUSCOLARE SPINALE E BULBARE
Scaramuzzino Chiara (1), Aggarwal Tanya (1), Fackelmayer Frank
(2), Pennuto Maria (1)
(1) Department of Neuroscience, Italian Institute of Technology, via Morego
30, Genoa 16163, Phone 01071781793. Fax 01071781230. e-mail: [email protected]
(2) Biomedical Research Institute, Ioannina, Greece
La atrofia muscolare spinale e bulbare (SBMA), nota anche come
malattia di Kennedy, è una malattia neuromuscolare ereditata geneticamente. La malattia è causata da una mutazione nel gene che
esprime il recettore degli androgeni. L’SBMA è caratterizzata dalla
perdita di motoneuroni dal midollo spinale e midollo allungato e da
debolezza, fascicolazioni e atrofia muscolare. Il recettore lega il testosterone, e ciò innesca la malattia poichè il testosterone induce dei
cambiamenti nel recettore che lo rendono tossico. Il nostro obiettivo
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
teristiche cliniche, decorso clinico, data e causa di decesso, punteggi alla scala New-castle, data ultima visita, biomarcatori ematici,
urinari e liquorali, caratteristiche neurooftalmologiche, neuroradiologiche, istologiche, analisi complessi respiratori mitocondriali, analisi molecolari (Southern blotting, long PCR, Real Time PCR, mutazioni geni nucleari, mutazioni nel DNA mitocondriale, aplogruppi mitocondriali), terapia. 145 pazienti sono stati inseriti dagli 11 Centri
partecipanti in una prima versione informatica di questo registro.
La fase in corso prevede la validazione del database progettato tramite la rivalutazione di tutti i casi seguiti dai centri coinvolti, fino ad
un numero stimato di circa 3000 pazienti, riversando i dati ottenuti
in un web-database.
La realizzazione di un tale registro nazionale di collaborazione tra
Centri italiani consentirà importanti studi epidemiologici così come
una migliore comprensione delle correlazioni fenotipo-genotipo e
della storia naturale delle MM, e costituirà un punto di partenza per
nuovi sviluppi atti a promuovere trials multicentrici ed a migliorare
il management clinico, terapeutico ed assistenziale di tali malattie.
(1) Unit of Molecular Neurogenetics - The C. Besta Neurological Institute
via Temolo 4 Milano 20126, Italy
(2) University of Parma, Italy
(3) University of Padova, Italy
L’enorme eterogeneità clinica, biochimica e molecolare delle malattie mitocondriali rende ogni proteina mitocondriale candidata a causare malattie. Ecco perché solo il 40% delle sindromi dell’adulto, e
ancor meno del bambino, sono diagnosticate geneticamente. Nuove
tecnologie e strumenti informatici offrono oggi la possibilità di analizzare rapidamente e a basso costo tutte le regioni codificanti dei
geni umani (esoma) in singoli individui o piccole famiglie. Proteine
mitocondriali mutate possono poi venire selezionate mediante programmi di predizione, banche dati specifiche, ed esperimenti in cellula o in vitro.
Il Consorzio Telethon stabilito nell’ambito del progetto GGP07019 si
è dedicato a (i) identificare nuovi geni mitocondriali malattia, che
sono stati caratterizzati (ii) in vitro e (iii) in vivo. Il Consorzio è formato da un centro di ricerca clinica (Zeviani, Coordinatore, Istituto
Neurologico Carlo Besta, Milano), e da due centri di sviluppo e studio di modelli in vivo, rispettivamente su Drosofila (Rodolfo Costa,
Università di Padova, Partner 1), e lievito (Ileana Ferrero, Università di Parma, Partner 2). Il Consorzio GGP07019 si articola in tre
Workpackages, WP. WP1 si è dedicato all’identificazione di nuovi
geni malattia mediante analisi di linkage e sequenzamento di geni
candidati, e, più recentemente, al sequenzamento esomico ad alta
efficienza di una vasta coorte di pazienti selezionati. Il risultato è
stato l’identificazione di numerosi nuovi geni malattia responsabili
di sindromi mitocondriali specifiche. WP2 si dedica all’analisi in vitro
di proteine malattia, iniziando con quelle identificate da WP1, ad
esempio Surf1, Mpv17, ETHE1, FASTKD2, SDHAF1, AIF, and TTC19,
ciascuna responsabile di difetti distinti della catena respiratoria o
del metabolismo del mtDNA.
L’analisi strutturale mediante elettroforesi su gel blu-nativo ci ha
permesso di caratterizzare le conseguenze molecolari dei difetti di
queste proteine e il loro stato fisico in condizioni normali e patologiche. Nel prossimo futuro intendiamo utilizzare la spettrometria
di massa per caratterizzare le proteine interagenti con Mpv17,
una proteina responsabile di deplezione epatocerebrale del mtDNA, di Sym1, il suo ortologo di lievito, e di TTC19, un possibile
fattore di assemblaggio del complesso III, la cui assenza causa
una malattia neurodegenerativa con grave deficit biochimico specifico. WP3 ha prodotto e studiato diversi modelli in vivo: topi e
moscerini knockout per Mpv17; un modello knockout per Mpv17
in zebrafish; e ceppi di lievito mutanti per Mpv17/Sym1 e per
SDHAF1, un fattore di assemblaggio del complesso II responsabile
di una grave leucoencefalopatia con deficit biochimico specifico.
Questo lavoro è tuttora in corso e intendiamo proseguirlo mediante l’estensione del progetto GGP07019 che è terminato nel dicembre 2010.Ogni volta che sarà possibile, i risultati di questo progetto verranno traslati su MitCare, un progetto-programma Telethon
dedicato allo sviluppo di terapie sperimentali per la cura delle malattie mitocondriali umane.
ABSTRACT N. 105
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
ZEVIANI MASSIMO
Responsabile
GPP10005
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 3
449.300
Durata (anni): 1
Anno d’inizio: 2011
STRATEGIE TERAPEUTICHE PER COMBATTERE LE MALATTIE
MITOCONDRIALI
Viscomi Carlo (1), Ghezzi Daniele (1), Di Meo Ivano (1), Tiranti Valeria (1), Rizzuto Rosario (2), Bernardi Paolo (2), Carelli Valerio (3),
Scorrano Luca (4,5), Bottani Emanuela (1), Zeviani Massimo (1)
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
Istituto Neurologico Carlo Besta - via Temolo 4 Milano 20126, Italy
University of Padova
University of Bologna, Italy
University of Geneva, Switzerland
Dulbecco Telethon Institute
Le Malattie Mitocondriali sono un gruppo di patologie genetiche caratterizzate dal malfunzionamento della Fosforilazione Ossidativa
(OXPHOS), la via metabolica che fornisce energia alla cellula mediante l’attività della catena respiratoria mitocondriale (CRM). Tredici proteine della CRM sono codificate dal mtDNA, il che accresce la
complessità genetica, biochimica e strutturale della OXPHOS e delle
relative alterazioni. L’eterogeneità delle malattie mitocondriali rende
difficile trovare terapie efficaci. Tuttavia, la comprensione di molti
meccanismi fisiopatologici di queste patologie ci offre parecchie opportunità per sviluppare strategie terapeutiche curative. Le alterazioni biochimiche più frequenti nelle malattie mitocondriali sono I
difetti di complesso I (CI), IV, o di entrambi. Il Consorzio Telethon
MitCare utilizzerà terapie geniche, cellulari, e farmacologiche usando composti approvati o sperimentali, in diverse condizioni e su sistemi di crescente complessità: linee cellulari, modelli animali e pazienti. Per realizzare questo programma, MitCare svilupperà due linee di ricerca. Nella linea 1 si sfrutterà una serie di linee cellulari di
pazienti con difetti biochimici specifici, che verranno esposte a farmaci che regolano la mitobiogenesi e i segnali calcio-dipendenti,
contrastano i radicali liberi e l’accumulo di sostanze tossiche sui mitocondri, o contrastano l’apoptosi.
Nella linea 2 si utilizzeranno numerosi modelli murini analoghi a patologie mitocondriali umane, per valutare gli effetti degli stessi
composti della linea 1, o l’espressione di geni o cellule in grado di
sostituire o correggere I difetti di CI e CIV.
ABSTRACT N. 107
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 3
GGP07019
389.000
Anno d’inizio: 2007
Dept Biology and Biotechnologies - La Sapienza University of Rome P.le A. Moro 5 - 00185 Rome. Tel 06 4461980. [email protected]
ZEVIANI MASSIMO
Durata (anni): 3
68.000
Durata (anni): 3
Montanari Arianna, De Luca Cristina, Francisci Silvia, Frontali Laura
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Telethon grant N.
GGP07164
FATTORI DELLA SINTESI PROTEICA MITOCONDRIALE CODIFICATI DAL NUCLEO POSSONO “CURARE” I DIFETTI RESPIRATORI DOVUTI A MUTAZIONI PATOGENETICHE NEI GENI
PER I tRNA MITOCONDRIALI
ABSTRACT N. 106
Responsabile
FRONTALI LAURA
Molte gravi malattie neurodegenerative sono causate da mutazioni
nei geni mitocondriali (mit) per tRNA che provocano una diminuzione della sintesi proteica mit e conseguenti difetti OXPHOS. Nonostante l’impegno di molti laboratori, finora non è stata trovata alcuna cura per queste gravissime patologie. Ciò è dovuto in gran parte
alla incompleta conoscenza dei meccanismi molecolari e all’assenza
di modelli di studio adatti.
Noi abbiamo messo a punto precedentemente un modello di lievito
per le patologie mit e abbiamo mostrato che molti aspetti molecolari e cellulari dei difetti possono essere studiati in lievito, che è l’uni-
Anno d’inizio: 2008
IDENTIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE DI GENI NUCLEARI RESPONSABILI DI MALATTIE MITOCONDRIALI
Ferrero Ileana (2), Costa Rodolfo (3), Viscomi Carlo (1), Ghezzi Daniele (1), Zordan Mauro (3), Arzuffi Paola (1), Goffrini Paola (2),
Zeviani Massimo (1)
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
co organismo eucariotico in cui può essere effettuata, con procedimento biolistico, la trasformazione mit. Abbiamo anche dimostrato
che diversi interattori dei tRNA (codificati dal nucleo), quali il fattore
di elongazione della sintesi proteica mit EF-Tu e le aminoacil-tRNA
sintetasi (aa-RS), se sovraespresse nelle cellule dei mutanti, possono “curare” i difetti dovuti alle sostituzioni di basi equivalenti a
quelle patogenetiche umane. Gli stessi risultati sono stati recentemente ottenuti sovra-esprimendo nei mutanti di lievito (ma anche
nelle cellule umane in coltura) geni ortologhi umani.
I nostri dati indicano che la soppressione ad opera delle aa-RS mit
non è probabilmente correlata all’attività enzimatica per se e potrebbe essere invece dovuta ad un effetto di stabilizzazione sulla
struttura del tRNA alterata dalla mutazione.
Attualmente utilizzando le conoscenze dettagliate (Herbert et al.
1988, Hsu et al. 2006, Tukalo et al. 2005) che esistono sulla struttura dei diversi domini delle leu-RS omologhe di uomo e di lievito
abbiamo il dominio principalmente coinvolto nell’attività soppressiva. In futuro cercheremo di ottenere la soppressione dei difetti respiratori con specifici peptidi che potrebbero avere un uso clinico
(brevetto RM 2010 A 000696).
TK2, riferibile all’espressione particolarmente bassa dell’enzima in
queste cellule; (iv) analizzato un modello cellulare di deficienza per
la fosforilasi dei nucleosidi purinici.
In cellule linfoblastoidi umane alte concentrazioni di deossiguanosina o del suo analogo araG attivano diversi check-point e inducono
apoptosi con diversa cinetica benché i due composti vengano attivati dagli stessi enzimi, particolarmente espressi in cellule linfoidi;
(v) silenziato con siRNA il trasportatore mt di nucleotidi SLC25A33 e
quantificato con esperimenti di flusso isotopico le alterazioni dell’esporto del dTTP dal mitocondrio.
ABSTRACT N. 109
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
GGP09019
287.500
263.000
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2009
Giorgi Carlotta (1), Agnoletto Chiara (1), Bononi Angela (1), Bonora
Massimo (1), De Marchi Elena (1), De Stefani Diego (2), Marchi Saverio (1), Missiroli Sonia (1), Patergnani Simone (1), Poletti Federica (1), Rimessi Alessandro (1), Romagnoli Anna (2), De Pinto Vito
(3), Rizzuto Rosario (1), Pinton Paolo (1)
BIANCHI VERA
Durata (anni): 3
GGP09128
COINVOLGIMENTO DI PROTEINE MITOCONDRIALI NELL’AUTOFAGIA: UNA POSSIBILE IMPLICAZIONE IN MALATTIE MITOCONDRIALI
ABSTRACT N. 108
Responsabile
PINTON PAOLO
Anno d’inizio: 2009
SBILANCIAMENTO DEI DEOSSINUCLEOTIDI, CONSERVAZIONE DEL DNA MITOCONDRIALE E MALATTIE MITOCONDRIALI
(1) Signal Transduction Lab/Dept. of Experimental and Diagnostic Medicine,
University of Ferrara, Via Luigi Borsari 46, 44100 Ferrara, email: [email protected]
(2) Dept. of Biomedical Sciences, University of Padova
(3) Dept of Biology, University of Catania
Ferraro Paola, Frangini Miriam, Franzolin Elisa, Miazzi Cristina, Pontarin Giovanna, Rampazzo Chiara, Reichard Peter, Bianchi Vera
In aggiunta alla funzione ben caratterizzata di produzione di energia, i mitocondri svolgono un ruolo cruciale nel promuovere l’apoptosi e l’autofagia in risposta a segnali specifici. L’ipotesi alla base di
questo progetto è che la comprensione dei meccanismi che regolano il controllo mitocondriale dell’autofagia possa avere un impatto
significativo nello sviluppo di nuove terapie per il trattamento di
una grande varietà di malattie genetiche.
Il grant si concentrerà su tre parti complementari e correlate, volte
a ottenere una più profonda comprensione del complesso rapporto
tra l’omeostasi mitocondriale e il processo dell’autofagia, con particolare attenzione alla sua importanza nelle malattie genetiche mitocondriali.
Risultati:
i) Analisi delle proteine mitocondriali e correlate ai mitocondri operanti nell’autofagia.
Abbiamo analizzato il ruolo di una componente fondamentale della
membrana mitocondriale esterna, ad esempio le proteine VDAC.
Molte evidenze suggeriscono che VDAC1 e VDAC2 hanno effetti opposti per quanto riguarda l’apoptosi, la prima agisce sensibilizzando, la seconda inibendo.
I risultati hanno mostrato chiaramente che il silenziamento dell’isoforma 2 di VDAC drasticamente inibisce l’autofagia indotta dalla
privazione dei nutrienti, o attraverso l’inibizione farmacologica di
mTOR con rapamicina. Al contrario, l’autofagia indotta da LiCl è rimasta inalterata, indicando l’assenza di difetti fondamentali nel
macchinario autofagico. Esperimenti di coimmunoprecipitazione
hanno mostrato una interazione selettiva di VDAC2 con mTOR ed i
componenti del complesso TORC1, fornendo così la base molecolare
per l’effetto regolatore sull’autofagia.
ii) Analisi dei segnali di Ca2+ nell’apoptosi e nell’autofagia.
Una serie di esperimenti hanno mostrato che VDAC1 è selettivamente coinvolto nel trasferimento al mitocondrio dei segnali Ca2+
apoptotici a bassa ampiezza. Infatti, il silenziamento di tutte e tre le
isoforme ugualmente riduce l’aumento del Ca2+ mitocondriale causato dalla stimolazione da parte di agonista, pur lasciando inalterati
i transienti citosolici. Al contrario, solo il silenziamento di VDAC1 riduce l’aumento di Ca2+ indotto da H2O2. Abbiamo quindi studiato
l’aspetto molecolare di questo effetto specifico, e mostrato attraverso esperimenti di coimmunoprecipitazione che solo VDAC1 ha una
diretta interazione molecolare con i canali sensibili all’IP3 (IP3R) del
reticolo endoplasmatico. Nel complesso, questi dati mostrano un
ruolo privilegiato di VDAC nella segnalazione Ca2+ tra reticolo e mitocondrio e forniscono una base molecolare per questa funzione
iii) Studio del processo autofagico in alcuni modelli di malattie mitocondriali.
Stiamo indagando se le alterazioni nel programma autofagico siano
comuni in diverse malattie genetiche mitocondriali.
Department of Biology, University of Padova, 35131 Padova, Italy - Dipartimento di Biologia, Via Ugo Bassi 58B, 35131 Padova Tel: 0498276282, Fax:
0498276280; email: [email protected]
Replicazione e riparazione del DNA nucleare e mitocondriale (mt) richiedono precursori, i deossinucleosidi trifosfati o dNTP, che devono
essere disponibili al momento giusto e in giuste proporzioni. Concentrazioni di dNTP sbilanciate o inadeguate riducono l’efficienza e
l’accuratezza della sintesi del DNA provocando mutazioni e alterazioni strutturali nei 2 genomi e deplezione del mtDNA. La regolazione dei pool di dNTP dipende da una rete di enzimi sintetici e catabolici, a localizzazione citosolica e mt, tutti codificati nel nucleo.
Il DNA nucleare si replica in fase S, il mtDNA anche in cellule postmitotiche. I dNTP vengono sintetizzati attraverso 2 vie, la via de
novo, citosolica, che fornisce i precursori usati in fase S per la replicazione del DNA nucleare, e la via di recupero composta di due serie parallele di chinasi, una citosolica l’altra mt, che producono
dNTP riciclando i deossinucleosidi. Enzimi catabolici partecipano alla
modulazione delle concentrazioni di dNTP invertendo l’azione di
quelli anabolici. Le sindromi da deplezione del mtDNA (o MDS) sono
malattie genetiche che colpiscono cellule differenziate con alta tessuto-specificità benché le mutazioni che le causano siano presenti
in tutto l’organismo. Noi studiamo in cellule coltivate in vitro i meccanismi alla base delle MDS associate a mutazioni in enzimi del metabolismo dei dNTP. In ricerche precedenti finanziate da Telethon
abbiamo messo a punto metodi per analizzare le interazioni dinamiche tra i pool dei dNTP citosolici e mt e abbiamo dimostrato che
nelle cellule proliferanti la sintesi de novo citosolica è la principale
fonte di dNTP per la replicazione di entrambi i genomi cellulari. Anche i fibroblasti quiescenti producono i dNTP de novo, ma a livelli
90% inferiori e la maggior parte dei dNTP prodotti è degradata ed
escreta nel terreno come deossinucleosidi.
Scopo del presente progetto è identificare la base metabolica per la
tessuto specificità delle MDS associate a mutazioni del metabolismo
dei dNTP. Nel corso del 1° anno abbiamo: (i) ottimizzato un classico
saggio basato sulla DNA-polimerasi adattandolo alla quantificazione
dei dNTP mt nelle cellule quiescenti; (ii) analizzato il turnover dei
dNTP in fibroblasti derivati da un paziente con MDS dovuta a mutazione di p53R2, la subunità minore della ribonucleotide reduttasi,
necessaria per la sintesi de novo in cellule quiescenti. Le cellule
mutanti presentano pool del dCTP e dGTP più piccoli a causa della
ridotta attività della reduttasi associata a un blocco del catabolismo; (iii) confrontato l’espressione di enzimi chiave della rete metabolica in fibroblasti quiescenti e in cellule muscolari C2C12 e analizzato in miotubi differenziati gli effetti sul mtDNA del silenziamento di p53R2 o della timidina chinasi mt, TK2. Il sistema in vitro ha
riprodotto l’elevata sensibilità del muscolo alla deficienza per la
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
Inoltre, stiamo approfondendo questa questione, studiando un
gruppo di linee cellulari transmitocondriali (cibridi) che portano diverse mutazioni dell’mtDNA che coinvolgono geni strutturali o tRNA.
Dipartimento di Pediatria Università Di Padova - Via Giustiuniani 3 35128 Padova
Il deficit di coenzima Q (CoQ) è praticamente l’unica malattia mitocondriale per cui esista una terapia efficace. La forma primitiva di
deficit di CoQ è causata da mutazioni nei geni COQ che codificano
gli enzimi necessari alla biosintesi del CoQ e può manifestarsi come
una malattia multisistemica con o senza interessamento renale, come miopatia, o come atassia cerebellare.
Esistono ance forme di deficit secondario di CoQ, associate a mutazioni in geni non direttamente coinvolti nel processo di biosintesi di
questa sostanza quali il DNA mitocondriale, la aprataxina, ETFDH o
BRAF.
Lo scopo del nostro progetto è identificare i geni coinvolti nella biosintesi del CoQ, di sviluppare dei sistemi per studiare le mutazioni
in questi geni, di studiare la regolazione del processo di biosintesi e
di ottimizzare i protocolli terapeutici per questa patologia.
Durante il primo anno del progetto abbiamo identificato due nuovi
geni coinvolti nel processo, COQ5 e COQ6. Abbiamo studiato il pattern di espressione di questi geni e la localizzazione subcellulare dei
loro prodotti proteici. COQ6 umano è in grado di complementare
ceppi di lievito con delezione del gene corrispondente, mentre
COQ5, nonostante l’elevato grado di conservazione, non complementa i mutanti di lievito, nemmeno quando il peptide di segnale
per il targeting mitocondriale è sostituito dalla sequenza della proteina di lievito.
I nostri collaboratori hanno identificato mutazioni in COQ6 in una
serie di pazienti con sindrome nefrosica associata a manifestazioni
neurologiche. Il fatto che COQ6 umano complementi il gene di lievito si è rivelato prezioso per confermare la patogenicità delle mutazioni identificate. Inoltre abbiamo dimostrato che in tutti i casi vi
era una attività residua (anche nel caso di una mutazione frameshift) a conferma del fatto che un deficit completo di questa sostanza è incompatibile con la vita
Negli eucarioti le proteine che sintetizzano il CoQ sono organizzate in
un complesso multi enzimatico che è stato studiato in parte nel lievito
ma mai nelle cellule di vertebrati. Siamo stati in grado di identificare il
complesso biosintetico mediante elettroforesi con gel Blue-native. I
dati preliminari indicano che questo complesso si associa ai supercomplessi della catena respiratoria (CR), fornendo una spiegazione del fatto che difetti della CR possono provocare deficit secondario di CoQ.
Tale complesso contiene anche due putative chinasi che stiamo attualmente cercando di purificare in modo da studiare il loro ruolo nella
biosintesi di questa sostanza. Infine, abbiamo identificato e caratterizzato un paziente con deficit di CoQ e aploinsufficienza di COQ4 che ha
risposto alla terapia sostitutiva.
ABSTRACT N. 110
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
VERGANI LODOVICA
Responsabile
GGP10145
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
161.000
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2010
RUOLO DELLA DINAMICA MITOCONDRIALE E DELLA AUTOFAGIA NELLA SEGREGAZIONE DEL DNA MITOCONDRIALE
MUTATO
Malena Adriana (1), Holt Ian (2), Sandri Marco (3), Bettio Sara (1),
Vergani Lodovica (1)
(1) Dipartimento di Neuroscienze- Padova - Dipartimanto di Neuroscienze-c/o
VIMM Via Orus 2-35100 Padova 049-8216162-fax 049.8216163- [email protected]
(2) Wellcome Trust - Cambridge
(3) Dipartimento di Scienze Biomediche - Padova
Questo progetto si prefigge di ottenere una maggiore informazione
sulla relazione tra la segregazione di mtDNA e il meccanismo di
controllo di qualità mitocondriale (mtQCM), inteso come una integrazione di fusione-fissione e mitofagia.
L’identificazione di composti che promuovono la segregazione del
mtDNA normale nelle cellule potrebbe indicare un possibile trattamento farmacologico al problema della eteroplasmia del mtDNA,
determinando un positivo progresso nel campo delle malattie associate al mtDNA dove attualmente esiste poco se non alcun efficace
trattamento farmacologico.
Specifici obiettivi:
i) determinare se una elevata fissione mitocondriale o una diminuita
fusione promuove la selezione del mtDNA normale.
ii) Analizzare l’effetto dell’inibizione della fissione mitocondriale sulla segregazione del mtDNA in differenti tipi cellulari, incluso quello
che è stato precedentemente visto favorire il mtDNA normale sul
mutato.
iii) determinare se ROS o autofagia influenzano il livello di mtDNA
mutato o normale con lo scopo di trovare composti che promuovono la selezione del mtDNA normale.
Razionale: Una selettiva selezione delle molecole di mtDNA mutate
è stata ampiamente documentata ma le basi molecolari sono poco
conosciute.
Descrizione del progetto: Cibridi eteroplasmici, derivati da linee tumorali di osso, polmone e muscolo saranno:
i) transfettati con costrutti che portano “short interfering RNA (shRNA)” o geni come Drp1, hFIS1, mitofusina 1 che modulano la dinamica mitocondriale;
ii) monitorati per la morfologia mitocondriale, marker di autofagia,
contenuto di mtDNA e percentuale di mutazione. Nelle cellule in coltura autofagia e omeostasi dei ROS sarà modulata applicando: i) sia
attivatori che inibitori dell’autofagia, ii) shRNA di proteine implicate
nel’autofagia ( beclin1, parkin1, BNIP3, NIX); iii) pro- e anti-ossidanti. Il loro effetto sul livello di mtDNA mutato verrà determinato.
Dati preliminari: Sono disponibili cibridi eteroplasmici per la mutazione A3243G .
Nel nostro laboratorio è stato dimostrato che alterando il bilancio
tra la fusione e la fissione mitocondriale viene influenzata la segregazione delle molecole di mtDNA mutato sul wild type, suggerendo
che il livello di mtDNA normale può essere manipolato dall’alterazione dell’espressione di fattori codificati dal nucleo coinvolti nella
fissione mitocondriale e nel mtQCM.
ABSTRACT N. 112
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 4
Totale
Num Centri: 1
GGP09207
243.700
Anno d’inizio: 2010
(1) Laboratorio di Neurogenetica, CERC-IRCCS Santa Lucia, Roma - Laboratorio di Neurogenetica, CERC-IRCCS Santa Lucia, Via del Fosso di Fiorano 64,
00143 Roma. Tel: 06-501703308; fax: 06-501703312; email:
[email protected]
(2) Dipartimento di Neuroscienze, Università di Roma “Tor Vergata”, Roma
(3) Laboratorio di Medicina Molecolare e Neurogenetica delle Malattie Neurodegenerative, Dipartimento di Medicina Molecolare, IRCCS Stella Maris, Calambrone (Pisa)
(4) Istituto di Neuropsichiatria Infantile, Università di Pisa, Pisa
(5) Laboratorio di Genetica Medica, Dipartimento di Scienze Ginecologiche,
Ostetriche e Pediatriche, Università di Bologna, Bologna
(6) Laboratorio di Genetica Medica, Dipartimento di Patologia Umana ed Ereditaria, Università di Pavia, Pavia
SALVIATI LEONARDO
Durata (anni): 3
345.000
Durata (anni): 2
Babalini Carla (1), Carosi Laura (1), Montieri Pasqua (1), Patrono
Clarice (1), Varlese Marialaura (1), Gaudiello Fabrizio (1), Miele Marialuisa (1), Tessa Alessandra (3), Nesti Claudia (3), Fattori Fabiana
(3), Pippucci Tommaso (5), Magini Pamela (5), Julia Pereira Baptista (5), Roberto Ciccone (6), Annalisa Vetro (6), Angelo Nuzzo (6),
Ivan Limongelli (6), Orsetta Zuffardi (6), Marco Seri (5), Filippo Maria Santorelli (3,4), Antonio Orlacchio (1,2)
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Telethon grant N.
GGP10121
IDENTIFICAZIONE DI NUOVI GENI-MALATTIA NELLA PARAPLEGIA SPASTICA EREDITARIA
ABSTRACT N. 111
Responsabile
ORLACCHIO ANTONIO
Anno d’inizio: 2009
BASI GENETICHE E TERAPIA DEL DEFICIT DI COENZIMA Q
Obiettivi generali. Gli strumenti clinici e genetici condivisi dal gruppo di ricerca saranno utilizzati per scoprire nuovi geni causativi di
forme non diagnosticate ed a trasmissione mendeliana di paraplegie
Desbats Marian, Casarin Alberto, Pertegato Vanessa, Doimo Mara,
Giorgi Gianpietro, Trevisson Eva, Cerqua Cristina, Salviati Leonardo
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
ABSTRACT N. 114
spastiche ereditarie (HSP).
Obiettivi specifici. Abbiamo progettato di caratterizzare famiglie con
forme non diagnosticate di HSP sia dal punto di vista clinico che
molecolare, mappare nuovi loci genetici, identificare nuovi geni HSP
mediante ibridazione genomica comparativa su microarray (arrayCGH) e analisi di risequenziamento dell’esoma e di correlare lo
spettro clinico con le scoperte genetiche.
Contesto. Le HSP a trasmissione mendeliana includono un vasto ed
eterogeneo gruppo di disturbi neurologici ereditari caratterizzati da
spasticità progressiva, ipostenia e danno della via corticomotoria principalmente agli arti inferiori. Sono state riportate forme autosomiche
dominanti (AD), autosomiche recessive (AR) e, più raramente, forme
ad ereditarietà legate al cromosoma X. Ad oggi, sono stati localizzati
circa 50 geni/loci HSP, ma solo 20 geni sono stati clonati. Di conseguenza, è prevedibile un’ulteriore eterogeneità clinica e genetica.
Descrizione del progetto.
L’obiettivo principale di questa proposta è quello di identificare nuovi geni responsabili delle forme non diagnosticate di HSP ad ereditarietà mendeliana. Al fine di raggiungere quest’ obiettivo, abbiamo
istituito un gruppo di ricerca per caratterizzare sia dal punto di vista
clinico che molecolare le famiglie con forme di HSP non diagnosticate; mappare nuovi loci attraverso metodologie di analisi “whole-genome”; eseguire l’analisi “array-CGH” e il risequenziamento dell’esoma al fine di identificare mutazioni patogene (riarrangiamenti genomici o mutazioni puntiformi) in famiglie SPG-associate già mappate dai partecipanti (i loci SPG12, SPG29, SPG38 ed una nuova
forma di ARHSP con assottigliamento del corpo calloso) così come
in 30 piccoli nuclei familiari con HSP non diagnosticata. In seguito,
intendiamo validare le mutazioni identificate con approcci molecolari più tradizionali e correlare i genotipi ai fenotipi clinici.
Produzione anticipata. L’identificazione di nuovi geni HSP offre la
possibilità di studiare la loro funzione e di comprendere i meccanismi patogenetici, un prerequisito per sviluppare metodi terapeutici.
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Totale
Num Centri: 2
Totale
Num Centri: 1
(1) Laboratory of Cell Signaling, Fondazione Santa Lucia, Via del fosso di fiorano 64, 00143, Rome, Italy. phone: 0039 06 501703168; e-mail: [email protected]
(2) Department of Biology, University of Tor Vergata, Rome, Italy
(3) Istituto Superiore di Sanita’, Telethon Proteomics Service, Rome, Italy
(4) Research Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences, 1090 Vienna, Austria
(5) Mass Spectrometry and Proteomics Unit, Fondazione Santa Lucia, Rome,
Italy
L’Atassia Telangiectasia (A-T) è una malattia genetica autosomica
recessiva rara caratterizzata da progressiva atassia cerebellare,
compromissione del sistema immunitario ed alta incidenza di sviluppo di linfomi e leucemie. A-T è geneticamente associata alla perdita
di funzione della serina/ treonina chinasi ATM(Atassia Telangiectasia
Mutata) che svolge un ruolo centrale nella risposta cellulare al danno
del DNA (Shiloh Y. Nat Rev Cancer. 3:155-167, 2003). Recentemente e’ stata descritta da diversi laboratori una nuova funzione di ATM
come modulatore della stabilità proteica regolata dalla via ubiquitina/proteasoma dipendente attraverso meccanismi molecolari ancora
ampiamente da chiarire. Lo scopo di questo progetto è proprio sviluppare diversi approcci genetici e farmacologici per comprendere il
contributo di ATM all’ubiquitinazione delle proteine.
Abbiamo identificato ATM come un nuovo modulatore dell’apoptosi
indotta da stimolo dei recettori di morte. In particolare abbiamo
identificato ATM come un modulatore essenziale della stabilità della
proteina FLIP, un noto inibitore di questa risposta apototica (Stagni
V et al. Blood 111:829-37, 2008). Nel corso di questo progetto, abbiamo dimostrato che l’attività di ATM svolge un ruolo essenziale
nella sensibilizzazione indotta da chemioterapici all’apoptosi TRAILdipendente e abbiamo quindi identificato ATM come un trasduttore
comune all’apoptosi indotta da recettori di morte e da danno al DNA
(Stagni V et al. Carcinogenesis 31: 1956-63, 2010). Presenteremo
in questa sede dati sperimentali che supportano una nuova funzione di ATM come modulatore dell’attività della E3 ubiquitina ligasi
ITCH, necessaria per l’ubiquitinazione e degradazione di FLIP in risposta al danno del DNA. Inoltre, il significato di questo nuovo
pathway molecolare nella risposta al danno del DNA verrà ampiamente discusso (Manuscript in preparation).
Inoltre mediante diversi approcci basati su tecniche di proteomica e
spettrometria di massa abbiamo confrontato il profilo di proteine
ubiquitinate in cellule deficienti o meno per l’espressione di ATM in
modo da ottenere un quadro d’insieme delle alterazioni nell’A-T dei
profili di ubiquitinazione.
GGP08057
235.800
Anno d’inizio: 2007
Santini Simonetta (1,2), Stagni Venturina (1,2), Mingardi Michele
(1), Giaccari Danilo (1,2), Camerini Serena (3), Giambruno Roberto
(4), Marzano Valeria (5), Urbani Andrea (5), Crescenzi Marco (3),
Barilà Daniela (1,2)
LIBERI GIORDANO
Durata (anni): 3
293.100
Durata (anni): 3
RUOLO DELLA CHINASI MUTATA NELL’ATASSIA TELANGIECTASIA (ATM) NEL CONTROLLO DELLA QUALITÀ E DELLA STABILITÀ DI ALTRE PROTEINE
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Telethon grant N.
GGP07252
Telethon grant N.
ABSTRACT N. 113
Responsabile
BARILÀ DANIELA
Responsabile
Anno d’inizio: 2008
CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DEI PROCESSI METABOLICI CONTROLLATI DALLA PROTEINA SEN1/SETX E DIFETTIVI NELLE SINDROMI NEURODEGENERATIVE AOA2 E ASL4
Alzu Amaya, Bermejo Rodrigo, Begnis Martina, Lucca Chiara, Liberi
Giordano
The F.I.R.C. Institute of Molecular Oncology Foundation, Via Adamello 16,
20139, Milan, Italy. Phone: +39-02-57430-3306; Fax: +39-02-574303-310;
e-mail: [email protected]
Le sindromi neurodegenerative AOA2 e ASL4 sono entrambe causate da mutazioni nel gene Senataxina (SETX). In particolare,
AOA2 e’ una rara forma d’Ataxia causata dalla progressiva degenerazione del cervelletto che porta, tra le manifestazioni cliniche
rilevanti, alla perdita della coordinazione muscolare. ASL4 e’ invece una forma giovanile di sclerosi laterale amiotrofica causata
dalla degenerazione dei motoneuroni e che impedisce il movimento dei muscoli. Sia i meccanismi molecolari che portano alle
patologie neurodegenerative quando SETX e’ mutato sia i ruoli
cellulari della Senataxina sono per lo più ignoti. SETX contiene
alcuni motivi amminoacidici caratteristici di DNA elicasi e conservati in tutti i membri della stessa famiglia che include anche la
proteina Sen1 del lievito S.cerevisiae. Studi in lievito indicano
che l’inattivazione di SEN1 causa una profonda deregolazione
della trascrizione mediata dalla RNA Pol II.
I nostri dati indicano che il genoma di mutanti sen1 e’ molto instabile. Inoltre, mutanti sen1 mostrano un fenotipo di letalità sintetica quando combinati con mutanti in fattori richiesti per il
mantenimento della stabilita’ del genoma in fase S, tra i quali le
DNA elicasi della ricombinazione Srs2 e Sgs1.
I nostri dati indicano inoltre che Sen1 e’ caricata sulle origini di
replicazione e si muove con la forcella replicativa in fase S e che,
in assenza di sen1, la mancata coordinazione tra la replicazione e
trascrizione del DNA è causa d’instabilità genomica.
ABSTRACT N. 115
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
FOIANI MARCO
GGP08066
316.800
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2008
HDACS COLLEGANO LA RISPOSTA DA DANNO AL DNA, IL
PROCESSAMENTO DELLE ROTTURE DEL DNA A DOPPIO FILAMENTO E L’AUTOFAGIA
Shubassi Ghadeer (1), Robert Thomas (1), Vanoli Fabio (1), Chiolo
Irene (1,2), Bernstein Kara (3), Rothstein Rodney (3), Botrugno
Oronza (4), Parazzoli Dario (5), Oldani Amanda (5), Minucci Saverio
(4,6), Foiani Marco (1)
(1) Fondazione IFOM (Istituto FIRC di Oncologia Molecolare), IFOM-IEO Campus, via Adamello 16, 20139, Milan Italy
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
Inoltre, ATM agisce come sensore di specie reattive dell’ossigeno
(ROS) e promuove difese antiossidanti proteggendo le cellule dall’accumulo incontrollato dei ROS. La neuropatologia A-T può quindi
dipendere sia da alterazioni nella risposta ai danni al DNA che dall’accumulo intracellulare dei ROS.
Per poter generare un modello in vitro della patologia A-T, abbiamo
utilizzato varie linee neuronali staminali umane derivate da cervelli
fetali ed immortalizzate (ihNSC), caratterizzate da self-renewal e
capacità in vitro di differenziare in neuroni, oligodendrociti e astrociti. Attraverso questo modello è quindi possibile studiare l’impatto
dell’assenza di ATM, ottenuta tramite shRNA, sui processi di differenziamento/maturazione neurale e risposta al danno al DNA.
Rispetto al controllo (shCon), le cellule staminali neurali difettive
per ATM (shATM) mostrano un’attenuata risposta al danno al DNA
ed una ridotta attivazione della via apoptotica caspasi-dipendente
durante il normale processo di differenziamento. Tali cellule mostrano inoltre un ridotto differenziamento in oligodendrociti Galc+,
mentre non presentano difetti a livello neuronale considerando i
neuroni MAP2/beta-tubulinIII+. Inoltre, gli oligodendrociti proveniente dalle ihNSC-shATM risultano essere molto più sensibili all’accumulo di ROS, indotto dall’inibizione della sintesi di GSH, rispetto
agli oligodendrociti derivanti dalle ihNSC-shATM.
Molto interessante, ihNCS-shATM terminalmente differenziate in
neuroni e glia risultano essere iper-sensibili nei confronti dei danni
al DNA (DSB) indotti dall’ET743 (che interferisce direttamente nella
trascrizione di alcuni geni), e dalla Camptotecina (che induce l’inibizione della topoisomerasi1 e la formazione di siti di blocco della trascrizione), sottolineando il ruolo di ATM nella risposta ai danni al
DNA insorti durante la fase di trascrizione in cellule neuronali postmitotiche.
Nell’insieme, l’assenza di ATM attenua la risposta sia ai danni al
DNA che della via apoptotica, oltre a iper-sensibilizzare neuroni ed
oligondrociti nei confronti dell’accumulo dei ROS e dei DSBs indotti
a livello di geni trascrizionalmente attivi. In fine, queste nostre evidenze sottolineano l’utilità delle ihNCS nello studio e nell’identificazione dei meccanismi correlati con altre patologie dipendenti dall’assenza o dal malfunzionamento di proteine coinvolte nel DDR, come NBS1 e Mre11, responsabili della Nijmegen Breakage Syndrome
e dell’ A-T Like Disorder, rispettivamente.
(2) LBNL, Dept. of Genome Biology, Berkeley, CA, USA
(3) Dept. of Genetics & Development, Columbia University Medical Center, New
York, USA
(4) European Institute of Oncology, IFOM-IEO campus, Milan, Italy
(5) Cogentech, Milan, Italy
(6) DSBB-Università degli Studi di Milano, Milan, Italy
L’acetilazione delle proteine è mediata da acetilasi (HATs, histone
acetyl transferases) e deacetilasi (HDACs, histone deacetylases)
che influenzano le dinamiche della cromatina, il turnover delle proteine e la risposta da danno al DNA. ATM e ATR mediano il checkpoint da danno al DNA: la prima riconosce rotture a doppio filamento (DSBs, double strand breaks), mentre la seconda rileva la presenza di DNA a singolo filamento (ssDNA, single-stranded DNA) coperto dalle proteine RFA. Non è chiaro come l’acetilazione moduli la
risposta da danno al DNA. Nel presente studio, mostriamo che l’inibizione delle HDAC contrasta l’attivazione di Mec1 (ATR), il processamento dei DSBs e la formazione di nucleofilamenti ssDNA-RFA.
Inoltre, la proteina ricombinativa Sae2 (CtIP) è acetilata e degradata in seguito all’inibizione delle HDACs. Le HDACs Hda1 e Rpd3 e la
HAT Gcn5 rivestono ruoli fondamentali nei processi sopra citati. Abbiamo altresì scoperto che l’inibizione delle HDACs attiva la degradazione di Sae2 mediante autofagia e che il processo autofagico è
coinvolto nella sensibilità dei mutanti hda1 e rpd3 al danno al DNA.
La rapamicina, che stimola l’autofagia inibendo Tor, causa anche la
degradazione di Sae2. Proponiamo che Rpd3, Hda1 e Gcn5 controllino la stabilità genomica, coordinando il checkpoint dipendente da
ATR e il processamento dei DSBs con l’autofagia.
ABSTRACT N. 116
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
D’ADDA DI FAGAGNA FABRIZIO
Responsabile
GGP08183
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
107.800
Durata (anni): 2
Anno d’inizio: 2008
CONTROLLO DELL’ATTIVITÀ DI ATM DA PARTE DEL MACCHINARIO DELL’INTERFERENZA DA RNA
ABSTRACT N. 118
D’Adda di Fagagna Fabrizio
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
IFOM Foundation - Via Adamello 16, 20139, Milan, Italy
Responsabile
Telethon grant N.
La risposta al danno al DNA (DNA damage response – DDR) è un
processo che arresta la proliferazione di cellule esposte ad eventi
genotossici per preservare la stabilità del genoma. ATM è una protein chinasi cruciale coinvolta nella segnalazione del DDR. Abbiamo
recentemente messo a punto un sistema che permette di studiare il
potenziale contributo dell’RNA nella regolazione del DDR. Attraverso
un breve trattamento di permeabilizzazione della membrana cellulare siamo in grado di esporre brevemente cellule vive all’RNAsi A.
Abbiamo osservato che questo trattamento ha un impatto sulla regolazione del DDR. Il ruolo di prodotti dal macchinario dell’interferenza di RNA e’ stato testato ed i risultati saranno discussi.
Totale
Num Centri: 2
Totale
Num Centri: 1
GGP10066
218.300
Anno d’inizio: 2007
(1) Genetics Biology and Biochemistry, University of Torino, Italy
(2) Neurobiology Sector, SISSA/ISAS, Trieste, Italy
(3) CRICM, UPMC/Inserm UMR_S 975, CNRS UMR 7225 (ex Inserm U679),
Equipe 1 (Pr Brice), GHU Pitié-Salpêtrière, Paris
(4) IIT, Genova, Italy
(5) Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi (NICO), Neuroscience Institute
of Turin (NIT), University of Turin, Italy
(6) MBC, Torino, Italy
DELIA DOMENICO
Durata (anni): 3
223.900
Durata (anni): 3
Mancini Cecilia (1), Roncaglia Paola (2), Stevanin Giovanni (3),
Durr Alexandra (3), Brussino Alessandro (1), Cagnoli Claudia (1),
Krmac Helena (2), Limongi Tania (4), Montarolo Francesca (5),
Hoxha Eriola (5), Turco Emilia (1,6), Messana Erika (1), Altruda
Fiorella (1,6), Gustincich Stefano (2), Tempia Filippo (5), Brusco Alfredo (1)
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Telethon grant N.
GGP07110
CARATTERIZZAZIONE FUNZIONALE DELLA MUTAZIONI MISSENSE IN SCA28, SVILUPPO DI UN MODELLO MURINO E
SCREENING DI GENI CANDIDATI PER ATASSIA CEREBELLARE
ABSTRACT N. 117
Responsabile
BRUSCO ALFREDO
Anno d’inizio: 2010
COMPRENSIONE DEI MECCANISMI NEURODEGENERATIVI
CAUSATI DA ALTERAZIONI DI GENI CHE MEDIANO LA RISPOSTA DEL DANNO AL DNA
L’atassia spinocerebellare autosomica dominante, SCA28 è causata
da mutazioni nel gene AFG3L2 (18p11.2). AFG3L2 ed il suo paralogo SPG7 (la cui perdita di funzione causa una forma recessiva di
paraplegia spastica) codificano per metalloproteasi ATP-dipendenti
appartenenti alla superfamiglia AAA (ATPases Associated with a variety of cellular Activities), che formano un complesso esamerico
sulla membrana mitocondriale interna.
Lo screening di 366 casi familiari di SCA di origine caucasica negativi per le più comuni espansioni di triplette, ci ha permesso di identificare sei mutazioni missense in AFG3L2 in nove famiglie diverse
(9/366, 2.6%) e di caratterizzare il fenotipo, identificando come segni tipici di SCA28 l’atassia associata ad anomalie oculomotorie (oftalmoplegia, nistagmo o ptosi).
In un’analisi di espressione whole genome abbiamo confrontato l’e-
Carlessi Luigi, Morelli Federica, Lecis Daniele, Delia Domenico
Dep. Oncologia Sperimentale, Fondazione IRCCS Istituto Nazionale Tumori, Via
Amadeo 42, 20133 Milano Tel +39 02-23902641 e-mail: [email protected]
Le sindromi neurodegenerative ereditarie causate da mutazioni in
geni coinvolti nel riparo del DNA (DDR) sono circa venti, la principale delle quali è l’Atassia Telangiectasia (A-T). La sindrome A-T è
causata da mutazioni inattivanti ATM, la protein-chinasi richiesta
per sia per iniziare che per propagare il segnale di risposta in seguito a lesioni della doppia elica di DNA (double-strand breaks; DSBs).
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
spressione genica di quattro pazienti (linee linfoblastoidi) con le
mutazioni p.T654I, p.M666V, p. M666T and p.G671R e sei controlli
sani.
Sono risultati differenzialmente espressi 117 geni: 60 hanno mostrato un aumento di espressione (range: 1,5-16) e 57 una riduzione (range: 0,7-0,1). I geni sono stati raggruppati in gruppi sulla
base della loro funzione: (1) crescita cellulare e metabolismo; (2)
proteine di membrana e adesione cellulare; (3) proteine di risposta
allo stress ossidativo; (4) attivatori di apoptosi; (5) proteine correlate al calcio. È particolarmente suggestiva l’aumento di espressione di geni coinvolti nello stress ossidativo, precedentemente correlato alla neurodegenerazione ed in patologie come Parkinson ed
Alzheimer.
In una seconda parte del progetto, abbiamo studiato i livelli di
espressione dei tre componenti murini della m-AAA (Spg7, Afg3l1, ed
Afg3l2) mediante ibridazione in situ in diverse regioni del cervello di
topo. I tre geni sono espressi nel cervello in modo ubiquitario, con un
aumento di espressione nei neuroni con grandi corpi cellulari (cellule
cerebellari del Purkinje e dei nuclei profondi). Il rapporto di mRNA
Afg3l1:Spg7:Afg3l2 è circa 1:3:5, dimostrando che Afg3l2 è il gene
maggiormente espresso, probabilmente perché è l’unico in grado di
formare sia omocomplessi che eterocomplessi con Spg7 o Afg3l1.
Abbiamo infine generato un modello murino knock-in di SCA28, con
la mutazione c.1997T>G (p.Met666Arg), scelta perchè trovata nel
paziente con fenotipo più grave. Le cellule ES in cui è stata introdotta la mutazione sono state micro-iniettate in femmine di topo
pseudo gravide, producendo dieci chimere. A settembre 2010 sono
nati tre topi Afg3l2M666R/+ (un maschio e due femmine): ai primi
test (a 30 e 60 gg) non sono stati evidenziati difetti, confermando
un possibile esordio più tardivo rispetto al topo Afg3l2 -/-, ed in linea con quanto visto nel modello Afg3l2-/+ , che ha un esordio dei
sintomi a 4 mesi.
Grazie a questo progetto, potremo comprendere meglio i meccanismi coinvolti in SCA28 e potremo individuare potenziali obiettivi per
approcci terapeutici.
L’analogia clinica tra pazienti e modello murino si estende anche al
genotipo omozigote che, nel modello, sviluppa una sindrome neurologica molto severa che progredisce a letalità a P16.
Il danno d’organello prodotto dalla deplezione o dalla ridotta presenza di AFG3L2 comprende la morfologia ed il metabolismo, caratterizzati da frammentazione mitocondriale, creste alterate, difetti di
OXPHOS ed aumentata produzione di ROS.
Il processo dinamico di fissione-fusione mitocondriale e’ stato studiato in fibroblasti embrionali murini Afg3l2 knockout. I dati sperimentali mostrano che l’assenza di AFG3L2 produce un aumento del
processamento di OPA1 e la conseguente frammentazione mitocondriale. E’ stata inoltre esclusa l’attività di una ulteriore metalloproteasi, i-AAA, che potrebbe operare un taglio proteolitico di OPA1
nelle cellule Afg3l2 knockout.
L’osservato aumento della frammentazione mitocondriale nelle cellule Afg3l2 knockout non è tuttavia prodotto da aumentata fissione,
in quanto il reclutamento di DRP1 (dynamin-related protein 1) dal
citoplasma verso la membrane esterna é inalterato. Il processo opposto, cioè la fusione mitocondriale, può essere stimolato nelle cellule prive di AFG3L2, ma l’equilibrio risultante tra i due processi é
chiaramente a favore della fissione. I dati attualmente in nostro
possesso indicano che l’alterazione dell’equilibrio fusione/fissione
nei mutanti Afg3l2 rappresenta un ulteriore componente del difetto
mitocondriale osservato nelle cellule neuronali.
ABSTRACT N. 120
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 2
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
GGP08138
304.600
465.700
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2009
Di Bella Daniela (1), Lazzaro Federico (2), Magri Stefania (1), Fracasso Valentina (1), Plumari Massimo (1), Muzi-Falconi Marco (2),
Taroni Franco (1)
CASARI GIORGIO
Durata (anni): 3
GGP09301
IL RUOLO DEL COMPLESSO PROTEASICO MITOCONDRIALE
M-AAA NELLA PATOGENESI DELLE DEGENERAZIONI SPINOCEREBELLARI
ABSTRACT N. 119
Responsabile
TARONI FRANCO
(1) S.O. Genetica delle Malattie Neurodegenerative e Metaboliche, Fondazione
IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta - via Celoria 11 20133 Milano ([email protected])
(2) Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie, Università degli Studi
di Milano
Anno d’inizio: 2008
SVILUPPO E NEURODEGENERAZIONE DI CERVELLETTO E MIDOLLO SPINALE SONO CONNESSI DA UN LEGAME MITOCONDRIALE: IL RUOLO DI AFG3L2 NELLA DINAMICA E METABOLISMO MITOCONDRIALE
Le atassie spinocerebellari dominanti (SCA) sono un gruppo eterogeneo di malattie neurologiche caratterizzate da disfunzione del
cervelletto. Abbiamo recentemente scoperto che mutazioni in eterozigosi nel gene AFG3L2 (ATPase family gene 3-like2) causano la
forma SCA28. Insieme a paraplegina, AFG3L2 è un componente del
complesso mitocondriale m-AAA, una metalloproteasi altamente
conservata coinvolta nel controllo di qualità delle proteine mitocondriali e nella loro maturazione. Il presente progetto si propone di
analizzare le basi molecolari e i meccanismi patogenetici che determinano i processi neurodegenerativi alla base dell’atassia spinocerebellare dominante SCA28 e di una forma di paraparesi spastica
ereditaria autosomica recessiva denominata SPG7 e causata da mutazioni nel gene che codifica il partner di AFG3L2 paraplegina.
Abbiamo osservato che AFG3L2 è espresso in modo elevato e selettivo nelle cellule cerebellari di Purkinje. L’analisi mutazionale in un
grande gruppo di pazienti con atassia ha dimostrato che le mutazioni in AFG3L2 causano ca. il 3% delle SCA di origine non definita.
Abbiamo utilizzato un modello cellulare di lievito privo del complesso m-AAA per studiare gli effetti funzionali e il ruolo patogenetico
delle mutazioni. Abbiamo analizzato 22 varianti di sequenza. La
maggior parte delle mutazioni sono localizzate nei domini funzionali
proteasico e ATPasico e coinvolgono residui aminoacidici altamente
conservati. In 3 casi, tuttavia, le varianti sono localizzate in una regione N-terminale poco conservata. Lo studio funzionale ha dimostrato che le mutazioni localizzate nei domini funzionalmente rilevanti causano un difetto respiratorio, una riduzione della capacità di
processare i substrati e un deficit dei complessi della catena respiratoria. In un gruppo di mutanti, la coespressione di paraplegina
non complementa il difetto respiratorio mentre la coespressione di
AFG3L2 selvatico causa una riduzione della crescita cellulare, suggerendo che queste mutazioni agiscono mediante un meccanismo
dominante negativo. Per la maggior parte delle mutazioni, tuttavia,
la coespressione di paraplegina comporta una reversione del difetto
respiratorio, suggerendo che in questi casi il meccanismo molecolare sia l’aploinsufficienza o un effetto dominante negativo debole.
Maltecca Francesca (1,2), Cassina Laura (1,2), Corti Laura (1),
Consolato Francesco (1), Quattrini Angelo (5), Rizzuto Rosario (6),
Scorrano Luca (3,4), Casari Giorgio (1,2)
(1) for Genomics, Bioinformatics and Biostatistics, San Raffaele Scientific Institute, Milan - Via Olgettina 58, 20132 Milano
(2) Vita-Salute San Raffaele University
(3) Dulbecco-Telethon Institute
(4) University of Geneva, Medical School, Geneva, Switzerland
(5) Division of Neuroscience, San Raffaele Scientific Institute, Milan
(6) Department of Biomedical Sciences, University of Padova, Padova, Italy
La proteina mitocondriale AFG3L2 forma, insieme con paraplegina,
complessi omo- ed etero-oligomerici, i complessi m-AAA, che si localizzano sulla membrane mitocondriale interna. I complessi m-AAA
hanno funzioni multiple, svolgendo: attività di controllo qualità attraverso la degradazione di proteine misfolded, attività di supporto
per il corretto assemblaggio dei complessi respiratori, controllo della morfologia mitocondriale attraverso l’attivazione proteolitica di
OPA1. L’assenza di complessi m-AAA o mutazione delle subunità
costitutiva di questi danneggia selettivamente le cellule neuronali;
infatti, mutazioni di paraplegina causano una forma recessive di paraplegia spastica ereditaria (SPG7), mentre mutazioni missense di
AFG3L2 sono responsabili di una forma dominante di atassia spinocerebellare (SCA28). Inoltre, mutazioni di AFG3L2 in omozigosi sono state recentemente associate ad una nuova e rara sindrome
neurologica infantile.
Abbiamo recentemente riportato che il modello murino Afg3l2
aploinsufficiente mostra un fenotipo sovrapponibile al quadro clinico
di SCA28, con difetti della coordinazione motoria dovuti a degenerazione specifica (dark cell degeneration, DCD) delle cellule di
Purkinje. La comparsa di mitocondri aberranti precede la DCD e
correla con l’esordio dei segni motori.
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
ABSTRACT N. 122
Poichè la coespressione di paraplegina può complementare l’effetto
delle mutazioni di AFG3L2, abbiamo analizzato la possibile cosegregazione di mutazioni in AFG3L2 e paraplegina in pazienti con sindromi spinocerebellari.
Abbiamo identificato 3 pazienti con mutazioni eterozigoti funzionalmente rilevanti in entrambi i geni. I nostri dati indicano che la presenza di una mutazione in paraplegina può influenzare il fenotipo
associato a mutazioni eterozigoti di AFG3L2. Inoltre, la cosegregazione di mutazioni in entrambi i componenti del complesso m-AAA
può determinare un quadro clinico complesso, espandendo così lo
spettro dei fenotipi associati a mutazioni di AFG3L2.
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 2
GGP08145
204.500
Anno d’inizio: 2007
(1) Sezione di Farmacologia, Dipartmento di Neuroscienze, Facoltà di Medicina,
Università di Napoli Federico II, Via Pansini 5, 80131 Napoli, Italia; Tel. 0817463310; Fax 081-7463323
(2) Div. di Neurologia, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Roma, Italia
(3) Dipartimento di Scienze per la Salute, Facoltà di Scienze del Benessere,
Università del Molise, Campobasso, Italia
(4) Dipartimento di Pediatria, II Università di Napoli, Napoli, Italia
(5) Cattedra di Neuropsichiatria Infantile; II Università di Napoli, Napoli, Italia
Anno d’inizio: 2008
STUDIO CLINICO E MOLECOLARE DELLA SINDROME DI JOUBERT E CONDIZIONI CORRELATE
Valente Enza Maria (1,2), Brancati Francesco (3), Travaglini Lorena
(4), Iannicelli Miriam (1), Dallapiccola Bruno (4), Bertini Enrico (4)
(1)
(2)
(3)
(4)
141.900
Durata (anni): 3
Miceli Francesco (1,2), Soldovieri Maria Virginia (1,3), Barrese Vincenzo (1), Miraglia del Giudice Emanuele (4), Bellini Giulia (4), Pascotto Antonio (5), Annunziato Lucio (1), Taglialatela Maurizio (1,3)
BERTINI ENRICO SILVIO
Durata (anni): 2
GGP07125
CONVULSIONI NEONATALI FAMILIARI BENIGNE E CORRENTE M: DALL’ANALISI MUTAZIONALE DEI GENI KCNQ2/3 AI
MECCANISMI MOLECOLARI DELLA LIBERAZIONE DI NEUROTRASMETTITORI E DI VOLTAGGIO-DIPENDENZA NEI CANALI
DEL POTASSIO
ABSTRACT N. 121
Responsabile
TAGLIALATELA MAURIZIO
CSS-Mendel Institute, Rome - Bambino Gesù Pediatric Hospital, Rome
University of Messina, Messina
University G. D’Annunzio, Chieti
Bambino Gesù Pediatric Hospital, Rome
Le Convulsioni Neonatali Familiari Benigne (BFNS), una rara forma
di epilessia idiopatica con trasmissione autosomico-dominante, sono caratterizzate dall’insorgenza, intorno al terzo giorno di vita post-natale, di convulsioni che scompaiono dopo poche settimane o
mesi, generalmente senza alterare lo sviluppo neurocognitivo del
bambino affetto.
I geni alterati nella BFNS codificano per Kv7.2 e Kv7.3, due subunità di canali del K+ voltaggio-dipendenti altamente omologhe.
Kv7.2 e Kv7.3 appartengono alla sottofamiglia dei canali del K+
Kv7, che include anche Kv7.1, alterato nella Sindrome del QT Lungo
(LQTS-2); Kv7.4, che risulta mutato in alcune forme di sordità autosomiche dominanti; e Kv7.5. Le subunità Kv7.2 e Kv7.3 formano
complessi eterotetramerici le cui proprietà funzionali sono analoghe
a quelle della corrente neurono-specifica e K+-selettiva denominata
corrente-M (IKM). Tale corrente svolge un ruolo fondamentale nel
controllo dell’eccitabilità neuronale contrastando il propagarsi di potenziali d’azione ripetuti.
Il presente progetto di ricerca ha obiettivi sia clinici che di ricerca di
base.
I nostri obiettivi clinici prevedono: 1) identificare nuove anomalie
genetiche in pazienti affetti da BFNS in loci noti; 2) espandere la
conoscenza clinica della BFNS, al fine di formulare correlazioni genotipo-fenotipo. Gli obiettivi di ricerca di base ci permetteranno di
migliorare le nostre conoscenze relative al coinvolgimento dei canali
formati da Kv7.2-3 nel controllo della liberazione presinaptica di
neurotrasmettitori ed il ruolo svolto da specifiche mutazioni responsabili di BFNS localizzate nel sensore di voltaggio delle subunità
Kv7.2-3 nel processo di gating di IKM.
A tale scopo, negli ultimi anni abbiamo descritto le conseguenze
funzionali causate da nuove mutazioni responsabili di BFNS; tra
queste la mutazione missenso D212G identificata in un caso sporadico di BFNS, e localizzata a livello del segmento S4 del canale
Kv7.2 causa la neutralizzazione dell’ unico residuo carico negativamente in S4. Studi elettrofisiologici hanno dimostrato come tale
mutante altera i processi di gating, causando una marcata destabilizzazione dello stato aperto del canale (Miceli F et al., Neurobiol.
Dis. 34, 501-10. 2009).
Allo scopo di comprendere con maggiori dettagli i meccanismi molecolari del processo di gating, abbiamo caratterizzato le variazioni delle correnti ioniche e di quelle di gating (Miceli F et al. Channels. 3, 277-286, 2009) causate dall’introduzione di mutazioni responsabili di BFNS (R207Q/W, D212G e R213W).
Mentre le due mutazioni D212G e R213W causavano principalmente una marcata riduzione della sensibilità al voltaggio delle
correnti macroscopiche ed una lieve riduzione della sensibilità al
voltaggio delle correnti di gating, la neutralizzazione del residuo
R207 causava una riduzione della sensibilità al voltaggio delle correnti macroscopiche ed un rallentamento delle cinetiche di attivazione/deattivazione. Dopo blocco delle correnti ioniche, nei canali
recanti le mutazioni R207Q/W, associate a miochimia muscolare,
si osservava una corrente uscente che aumentava a potenziali più
depolarizzanti, dovuta, probabilmente, alla formazione di un poro
accessorio nello stato attivo del sensore del voltaggio.
La sindrome di Joubert (JS) è una condizione autosomica recessiva
caratterizzata da ipotonia, atassia, ritardo psicomotorio, aprassia
oculomotoria e anomalie respiratorie, e dal tipico segno neuroradiologico del “dente molare” (MTS).
LA JS può associarsi a malformazioni in altri organi (soprattutto reni
e retina), identificando un ampio spettro di sindromi associate con il
MTS (Joubert Syndrome Related Disorders - JSRD). Ad oggi, 11 geni sono stati identificati, tutti codificanti per proteine ciliari. Mutazioni in questi geni sono responsabili di meno del 50% dei casi di
JSRD, ma possono anche causare altre ciliopatie come la nefronoftisi isolata (NPH) e la sindrome di Meckel (MS). Tale estrema variabilità clinica e genetica ha sinora limitato la diagnosi pre- e post-natale, la consulenza genetica, lo sviluppo di indici prognostici e di terapie appropriate.
Questo progetto biennale aveva come obiettivo il miglioramento
delle conoscenze sulle basi cliniche e genetiche delle JSRD, ed ha
portato ai seguenti risultati:
1) identificazione di due nuovi geni (INPP5E/JBTS1 and
TMEM216/JBTS2) causative di JSRD e MS, e caratterizzazione della
loro funzione nel cilio primario. In particolare, INPP5E codifica per
l’inositol polifosfato-5-fosfatasi E. Le mutazioni, localizzate prevalentemente nel dominio fosfatasico, portano ad una alterazione dell’attività fosfatasica, risultando in una prematura destabilizzazione
del cilio in risposta a stimoli.
TMEM216 invece codifica per una proteina con 4 domini transmembrana localizzata alla base del cilio primario, e la sua perdita di funzione causa alterata ciliogenesi e ancoraggio del centrosoma, con
concomitante iperattivazione di RhoA e Dishevelled. Questi risultati
implicano due nuove famiglie di proteine nella patogenesi delle ciliopatie.
2) delineazione delle correlazioni gene-fenotipo sia per questi che
per gli altri geni, a seguito di una analisi mutazionale effettuata in
un’ampia serie di pazienti ben caratterizzati clinicamente. Le associazioni più forti sono state riscontrate per il gene TMEM67 con il fenotipo JS con fibrosi epatica (COACH), il gene CEP290 col fenotipo
cerebello-oculo-renale, ed i geni RPGRIP1L e NPHP1 con il fenotipo
JS associato a NPH.
3) Infine, il progetto ha contribuito a delineare l’esistenza di varianti genetiche modificatrici che possano modulare l’espressione fenotipica di alcune ciliopatie. In particolare, abbiamo dimostrato che un
allele polimorfo del gene AHI1 è associato con un rischio sette volte
più elevato di sviluppare degenerazione retinica in pazienti con
NPH, ma non con JSRD.
I risultati dello studio hanno contribuito a sviluppare strategie efficienti di diagnosi molecolare pre- e post-natale, identificare indici
prognostici e specifici algoritmi diagnostici e di follow-up, con miglioramento della consulenza genetica e della gestione dei pazienti,
in particolare per manifestazioni associate come la patologia renale
ed i disturbi comportamentali.
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
ABSTRACT N. 123
Franco (1), Fornasiero Eugenio (3), Valtorta Flavia (3), Benfenati
Fabio (1,2)
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
GGP07278
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 3
(1) Department of Experimental Medicine, University of Genova - Viale Benedetto XV, 3 - 16132 Genova - tel. 010-3538183 - fax. 010-3538194 - email:
[email protected]
(2) Department of Neuroscience and Brain Technologies, The Italian Institute
of Technology
(3) Department of Neuroscience, Vita-Salute University S. Raffaele, Milano and
IIT Unit of Molecular Neuroscience
CARMIGNOTO GIORGIO
Responsabile
388.700
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2007
INTERAZIONE ASTROCITI-NEURONI NEL CONTROLLO DELL’ECCITABILITÀ E DEL CIRCOLO CEREBRALE IN MODELLI GENETICI E ACQUISITI DI EPILESSIA
Molti dei geni che predispongono ad epilessia e/o autismo (ASD)
sono coinvolti in funzioni sinaptiche. Le sinapsine (SynI, SynII, SynIII) sono una famiglia di proteine delle vescicole sinaptiche coinvolte nel rilascio di neurotrasmettitore e nella plasticità sinaptica.
Topi knockout (KO) per Syn I, II, I/II e I/II/III sono epilettici e I
geni SYN1/2 sono stati identificati tra i principali gene predisponenti
l’epilessia nell’uomo.
In questa ricerca abbiamo identificato una mutazione Q555X in
SYN1. Questa mutazione nonsense è stata rilevata in tutti I pazienti
appartenenti ad un’ampia famiglia Franco-Canadese segregante
epilessia e ASD. Ulteriori mutazioni in SYN1 (A51G, A550T e T567A)
sono state osservate nel 1.0% e 3.5% di individui Franco-Canadesi
affetti rispettivamente da ASD ed epilessia. La maggioranza di queste mutazioni sono concentrate nel dominio D della SynI ricco in
prolina e substrato di multiple cinasi. Tutti i mutanti nel dominio D,
se espressi in neuroni SynI KO, si sono rivelati inefficaci a correggere I difetti nella consistenza e traffico dei pool di vescicole sinaptiche, mentre la forma nativa della SynI ha corretto completamente il
fenotipo KO. Inoltre, la mutazione Q555X ha avuto un effetto drammatico sulla fosforilazione da parte di MAPK/Erk e sulla crescita
neuritica, mentre i mutanti missenso A550T e T567A hanno mostrato un carente targeting alle terminazioni presinaptiche. Questi risultati dimostrano che SYN1 è un nuovo gene che predispone ad epilessia e ASD e rinforzano l’ipotesi sulla patogenesi sinaptica di ambedue le malattie.
Per chiarificare la patogenesi dei fenotipi epilettico ed autistico in
topi mutanti per le Syns, abbiamo iniziato uno studio elettrofisiologico e comportamentale per analizzare: (i) la trasmissione eccitatoria/inibitoria e le attività epilettiformi indotte da 4AP in fettine acute
cortico-ippocampali di topi Syn KO mediante una combinazione di
patch-clamp e multielectrode arrays (MEAs); (ii) un ampio spettro
di comportamenti sociali come interazione e comunicazione sociale,
aggressività e memoria sociale. Registrazioni mediante patch-clamp
nella regione CA1 dell’ippocampo di topi tripli KO (TKO) per le Syns
hanno mostrato un’aumentata trasmissione glutamatergica, una diminuita trasmissione GABAergica ed una diminuita corrente tonica
GABAergica responsabile per lo stato depolarizzato dei neuroni di
CA1 che li rende più suscettibili al firing. Questi effetti sinaptici erano accompagnati da attività interictali ed ictali indotte dalla 4AP
molto più pronunciate nei topi TKO rispetto ai controlli. Inoltre topi
SynI e SynII KO hanno mostrato un diminuito interesse nell’esplorazione di ambiente e topi non familiari ed un deficit nel riconoscere
topi familiari dopo ripetute esposizioni sociali. I risultati dimostrano
che la delezione dei geni delle Syns genera uno sbilanciamento sinaptico che è associato allo sviluppo di parossismi epilettici e a specifici deficits nel comportamento sociale.
Losi Gabriele (1,2), Cammarota Mario (1,2), Chiavegato Angela
(1,2), Zonta Micaela (1,2), Brondi Marco (3,4), Uva Laura (5), DeCurtis Marco (5), Ratto GianMichele (3,4), Carmignoto Giorgio (1,2)
(1) Institute of Neuroscience-CNR, sez. di Padova - viale G. Colombo 3, 35121,
Padova
(2) Dip Scienze Biomediche, Università di Padova
(3) Institute of Neuroscience – CNR, sez. di Pisa
(4) NEST, Scuola Normale Superiore, Pisa
(5) Fondazione Istituto Neurologico Carlo Besta, Milano
Gli eventi cellulari che sostengono la generazione e propagazione di
crisi focali non sono sufficientemente compresi, anche per la mancanza di adeguati modelli sperimentali per lo studio di epilessie focali. In un nuovo modello sperimentale di crisi focali (CF) in fettine
di corteccia entorinale di ratto (EC), una regione di generazione di
queste crisi (Losi et al 2010), e nel cervello intero di cavia abbiamo
recentemente dimostrato un ruolo attivo degli astrociti nella generazione di CF (Gomez-Gonzalo et al. 2010). Abbiamo utilizzato lo
stesso modello per studiare come si propagano le scariche epilettiformi dal focus a regioni contigue e distanti. Utilizzando la microscopia confocale e simultanee registrazioni di patch-clamp, abbiamo
studiato le possibili interazioni tra astrociti e interneuroni GABAergici durante la propagazione delle CF. Abbiamo evidenziato come le
CF nei neuroni principali distanti dal focus siano precedute da una
fase di forte inibizione GABAergica. Le correnti inibitorie GABAergiche nei neuroni principali sono correlate con l’attività degli interneuroni fast-spiking (FS-IN). I risultati ottenuti in topi che esprimono
GFP in FS-INs contenenti parvalbumina (PV +) hanno confermato
che la propagazione delle CF ai neuroni piramidali è trattenuta da
una forte attività GABAergica generata principalmente da PV + FSINs. Solo dopo che l’intensa attività nei PV + FS-IN è stata compromessa da una forte depolarizzazione, i neuroni piramidali sono reclutati nella CF. Una intensa attività GABAergica caratterizza così la
rete neuronale durante la propagazione della CF. Una domanda
centrale è se gli astrociti durante la fase di preictal siano attivati da
questo intenso segnale GABAergico. Abbiamo evidenziato che circa
il 50% degli astrociti nella EC rispondono al GABA con ampie e rapide oscillazioni del Ca2+. Questa risposta astrocitaria è mediata da
recettori GABAB in quanto evocata allo stesso modo dall’agonista
selettivo baclofen e bloccata dall’antagonista CGP55485. Chiarire
l’interazione astrociti-interneuroni può potenzialmente svelare nuovi
meccanismi responsabili della generazione e propagazione delle
scariche focale.
Sia nelle fettine corticali che nel cervello intero di cavia abbiamo
inoltre osservato che l’innalzamento di Ca2 + negli endfeet astrocitari media la risposta motoria dei vasi sanguigni cerebrali alle scariche epilettiche. Questi risultati rivelano che gli astrociti sono centrali per il neurovascolar coupling sia nel cervello normale che in quello
epilettico. Gli aumenti di Ca2 + negli astrociti sono fortemente attivati dalle scariche ictali ma non da quelle interictali. La scarsa risposta agli eventi interictali rappresenta una nuova informazione
importante per interpretare i dati provenienti da tecniche diagnostiche di imaging cerebrale, come la risonanza magnetica funzionale,
utilizzati in clinica per localizzare l’attività neurale e ottimizzare l’utilizzo della neurochirurgia in epilessie intrattabili.
ABSTRACT N. 125
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Responsabile
BENFENATI FABIO
Anno d’inizio: 2010
Totale
414.500
Istituto Italiano di Tecnologia (IIT, Genoa - Via Morego 30 16123, Genova
GGP09134
Durata (anni): 3
132.000
Durata (anni): 3
Deidda Gabriele, Barberis Andrea, Cancedda Laura
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Num Centri: 2
GGP10135
RUOLO DELLE MUTAZIONI DEL RECETTORE GABAA NELLA
EPILESSIA IDIOPATICA GENERALIZZATA: UNO STUDIO SULLO SVILUPPO
ABSTRACT N. 124
Telethon grant N.
CANCEDDA LAURA
L’epilessia idiopatica generalizzata (IGE) è una rara forma di epilessia associata a mutazioni monogeniche del recettore GABAA. Mentre l’analisi funzionale delle mutazioni ha fornito prove in vitro su un
prevedibile calo della inibizione cellulare che andrebbe a favore il
fenotipo epilettico in vivo, altri realistici scenari sono da prendersi in
considerazione. Di fatto, la trasmissione GABAergica svolge un ruolo strumentale nello sviluppo fisiologico dei circuiti neuronali e i pazienti con IGE familiare esprimono le mutazioni non funzionali sul
Anno d’inizio: 2009
RUOLO DEI GENI DELLE SINAPSINE NELL’EPILESSIA ED AUTISMO
Fassio Anna (1), Baldelli Pietro (1,2), Greco Barbara (1,2), Onofri
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
recettore GABAA per tutta la vita, quindi anche durante lo sviluppo
del cervello. Quindi ipotizziamo che parte del fenotipo nei pazienti
con IGE familiare dipenda da un incorretto sviluppo neuronali a
causa di trasmissione GABAergica compromessa. Delucideremo
meccanismi dello sviluppo neuronale capaci di tradurre le mutazioni
sul recettore GABAA associate a IGE in difetti fenotipici di epilessia.
In particolare, stiamo attualmente sviluppando modelli di ratto di
due forme distinte di rara IGE familiare associata a mutazioni del
recettore GABAA. In primo luogo, valuteremo la maturazioni morfofunzionali dei circuiti neuronali e poi studieremo la correlazione di
queste con la propensione a sviluppare crisi epilettiche. Gli studi
proposti aiuteranno a far luce sui possibili effetti negativi delle mutazioni del recettore GABAA associate a IGE sullo sviluppo neuronale e conseguenti fenotipi epilettici. I nostri esperimenti espanderanno le conoscenze sullo progressione e sviluppo della IGE familiare e
potranno fornire una finestra per l’intervento terapeutico, prima che
i sintomi sono evidenti.
proteasoma dipendente di CDKL5. I nostri risultati evidenziano nuovi meccanismi di regolazione di CDKL5 nei neuroni e suggeriscono
come questa chinasi possa essere implicata in pathway di morte
neuronale.
ABSTRACT N. 127
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Totale
Num Centri: 5
Totale
Num Centri: 2
GGP10032
398.600
Anno d’inizio: 2010
Bacci Alberto (1), Fellin Tommaso (2), Franceschetti Silvana (3),
Arosio Daniele (4), Ratto Gianmichele (4), Carmignoto Giorgio (5),
De Curtis Marco (4), Mantegazza Massimo (4), Losi Gabriele (5)
LANDSBERGER NICOLETTA
Durata (anni): 3
479.700
Durata (anni): 3
DISFUNZIONE DEGLI INTERNEURONI IN EPILESSIE GENETICHE: COMPRENSIONE DEI MECCANISMI DELL’EPILESSIA
MIOCLONICA SEVERA DELL’INFANZIA (SMEI) IN UN MODELLO MURINO
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Telethon grant N.
GGP10138
Telethon grant N.
ABSTRACT N. 126
Responsabile
BACCI ALBERTO
Responsabile
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
Anno d’inizio: 2010
RUOLO DELLA FOSFORILAZIONE DI MECP2 E DELLE CHINASI
IMPLICATE NELLA SINDROME DI RETT E NELL’ENCEFALOPATIA EPILETTICA INFANTILE PRECOCE-2
Fondazione EBRI, Roma - via del Fosso di Fiorano 64 — 00143 Roma
Istituto Italiano di Tecnologia (IIT), Genova
Istituto Neurologico “Carlo Besta”, Milano
NEST-Scuola Normale Superiore Pisa
Dip. Scienze Biomediche Sperimentali Università di Padova
Il termine epilessia comprende diversi disturbi neurologici che hanno in comune il sintomo della crisi epilettica. Le epilessie senza una
causa riconoscibile (idiopatiche) possono avere una causa genetica.
Una forme di epilessia a causa genetica è l‘epilessia mioclonica severa dell’infanzia (SMEI), una rara malattia che esordisce con crisi
convulsive in febbre nel primo anno di età, e rapidamente evolve in
un grave quadro di encefalopatia evolutiva, caratterizzata da crisi
resistenti alla terapia farmacologica e deterioramento intellettivo.
Lo studio del DNA di questi giovani pazienti ha dimostrato un’alterazione di un canale della membrana delle cellule neuronali (il canale del sodio voltaggio-dipendente) che regola l’eccitabilità dei neuroni. Il meccanismo patogenetico che determina la espressione della malattia in conseguenza di questa alterazione della funzione neuronale è sconosciuto.
Recentemente è stato caratterizzato un modello sperimentale di
SMEI del topo, caratterizzato da epilessia grave evolutiva, causata
da una mutazione simile a quella osservata nell’uomo. Questo modello è disponibile presso i laboratori del Partner 1 e sarà utilizzato
da tutti i gruppi di ricerca coinvolti nel progetto. Sulla base di dati
preliminari, si verificherà se il difetto genetico è rappresentato preferenzialmente in una sotto-popolazione di cellule della corteccia
cerebrale che hanno una funzione inibitoria. Questa alterazione aumenterebbe l’eccitabilità della corteccia cerebrale e quindi potrebbe
essere responsabile dell’epilessia. Durante il progetto si valuterà
anche il ruolo delle crisi febbrili prolungate nel determinare il danno
cerebrale diffuso caratteristico di questa encefalopatia epilettica
evolutiva.
Lo studio dei meccanismi di patogenesi di questa malattia nel modello sperimentale SMEI potrebbero facilitare lo sviluppo di nuove
strategie farmacologiche per la prevenzione dell’evoluzione infausta
di questa rara e grave malattia dell’infanzia.
Rusconi Laura (2), Kilstrup-Nielsen Charlotte (2), Landsberger Nicoletta (1,2)
(1) San Raffaele Rett Research Center, Division of Neuroscience, San Raffaele
Scientific Institute, Via Olgettina 60, 20132 Milan. Tel 0226436278 e-mail:
[email protected]
(2) Lab. of Genetic and Epigenetic Control of Gene Expression, DBSF, Univeristy of Insubria, Busto Arsizio (Va)
La sindrome di Rett è un disturbo del neurosviluppo caratterizzato
da un periodo di normale sviluppo seguito da una rapida regressione che causa ritardo mentale, caratteristiche di tipo autistico e movimenti stereotipati delle mani. La forma classica della sindrome di
Rett è in genere causata da mutazioni nel fattore trascrizionale
MeCP2, mentre le cause genetiche delle diverse forme varianti devono essere ancora scoperte.
Mutazioni nel gene CDKL5 sono state associate principalmente alla
variante di Hanefeld della Rett, caratterizzata dall’insorgenza molto
precoce di crisi epilettiche farmaco-resistenti, ma anche ad altre
patologie neurologiche, come l’encefalopatia epilettica e la sindrome di West. Nonostante il chiaro coinvolgimento di CDKL5 in un
normale sviluppo del cervello, le sue funzioni restano ancora per lo
più oscure. Negli anni passati abbiamo dimostrato come la presenza
di CDKL5 nel nucleo sia regolata spazialmente e temporalmente nel
cervello murino. Inoltre, nelle cellule proliferanti, CDKL5 continua a
spostarsi tra nucleo e citoplasma sfruttando un meccanismo di
esportazione nucleare attivo. L’importanza di una corretta distribuzione sub-cellulare di CDKL5 sembra sottolineata dall’esistenza di
mutazioni patogenetiche che si accumulano costitutivamente nel
nucleo. Anche se recentemente è stato dimostrato che nel citoplasma CDKL5 regola la morfologia e la migrazione neuronale, è facile
ipotizzare che anche la frazione nucleare di CDKL5 svolga importanti funzioni. Infatti, diverse pubblicazioni hanno mostrato come
CDKL5 agisca nello stesso pathway molecolare di MeCP2; inoltre,
nei nuclei colocalizza e interagisce con la DNA metiltransferasi I. Infine, è stato dimostrato come CDKL5 si trovi in degli speckle nucleari coinvolti nella conservazione e/o modificazione di fattori di
splicing e sia capace di modulare lo splicing alternativo, per lo meno
in saggio con un minigene eterologo.
Considerando che una migliore comprensione dei meccanismi che
regolano l’attività e/o la distribuzione subcellulare di CDKL5 dovrebbe aiutare a capirne il ruolo nello sviluppo e nella maturazione, abbiamo avviato il nostro progetto analizzando la distribuzione cellulare della chinasi in colture primarie di neuroni ippocampali. Nei neuroni post-mitotici CDKL5 si trova sia nel nucleo che nel citoplasma
ma non continua a spostarsi tra I due compartimenti. Se, però, i
neuroni vengono stimolati con glutammato, CDKL5 si sposta rapidamente nel citoplasma sfruttando, anche in questo caso, un meccanismo di trasporto attivo. Questa rilocalizzazione è dovuta all’attivazione dei recettori del NMDA extra-sinaptici, recettori generalmente associati con un segnale di morte cellulare. Una persistente
stimolazione con il glutammato porta a un’importante degradazione
ABSTRACT N. 128
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
PIETROBON DANIELA
GGP06234
168.250
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2006
CONSEGUENZE FUNZIONALI DI MUTAZIONI ASSOCIATE AD
EMICRANIA EMIPLEGICA FAMILIARE DI TIPO 1 E MECCANISMI DELL’EMICRANIA
Vecchia Dania, Tottene Angelita, Urbani Andrea, Sessolo Michele,
Pietrobon Daniela
Dip. Scienze Biomediche Sperimentali, Univ Padova - V.le G Colombo 3, 35121
Padova. Tel. 049 8276052; Fax 049 8276049; [email protected]
La nostra ricerca si propone di capire come il guadagno di funzione
dei canali Ca2+ CaV2.1 (P/Q) prodotto dalle mutazioni associate al-
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
l’emicrania emiplegica familiare (FHM1) causino la malattia. Abbiamo mostrato precedentemente guadagno di funzione della corrente
CaV2.1 in neuroni cerebellari e corticali e facilitazione della cortical
spreading depression (CSD, il fenomeno che causa l’aura emicranica e puo’ iniziare il mal di testa) in topi knock-in (KI) con le mutazioni FHM1 R192Q e S218L; questi effetti erano di entità maggiore
nei topi con la mutazione S218L causante un fenotipo clinico più
grave della R192Q (Tottene et al, 2009 Neuron; van den Maagdenberg et al, 2010, Ann Neurol).
Nei topi R192Q KI abbaiamo anche mostrato 1) guadagno di funzione della neurotrasmissione eccitatoria alle sinapsi delle cellule piramidali corticali e, in contrasto, inalterata neurotrasmissione inibitoria alle sinapsi degli interneuroni fast-spiking (FS); 2) un legame
causale tra l’aumentato rilascio di glutammato e la facilitazione della CSD (Tottene et al, 2009 Neuron). Qui mostriamo che la mutazione S218L produce un maggiore aumento del rilascio di glutammato
alle sinapsi delle cellule piramidali rispetto alla R192Q, senza alterare il rilascio di GABA alle sinapsi di interneuroni FS. Mostriamo anche
che la neurotrasmissione eccitatoria nei topi FHM1 KI e’ meno suscettibile alla inibizione presinaptica accoppiata a G proteina, e che
la riduzione dell’inibizione presinaptica e’ simile nei topi omozigoti
R192Q e eterozigoti S218L. Inoltre mostriamo che la CSD non può
essere indotta in fettine corticali dopo aver bloccato i canali Ca P/Q o
i recettori NMDA; in contrasto il blocco dei canali Ca tipo N e R ha
soltanto un piccolo effetto sulla CSD. Abbiamo studiato il meccanismo della inalterata trasmissione inibitoria e della ridotta inibizione
presinaptica del rilascio di glutammato nei topi FHM1 KI. I dati sono
consistenti con le conclusioni che 1) l’inalterata trasmissione inibitoria e’ dovuta alla mancanza di un aumento significativo dell’influsso
di Ca2+ evocato da potenziale d’azione (PA) attraverso i canali P/Q
dei terminali sinaptici degli interneuroni FS, come conseguenza dell’espressione di una isoforma specifica di canale CaV2.1 poco influenzata dalla mutazione e anche della breve durata del PA negli interneuroni FS; 2) la ridotta inibizione presinaptica da parte di un
agonista GABAB e’ dovuta alla ridotta inibizione mediata da G proteina dei canali P/Q mutati.
I nostri dati indicano che alterazioni del bilancio eccitazione-inibizione in corteccia e iperattività neuronale dovuta a eccessiva eccitazione ricorrente possano essere alla base della vulnerabilità episodica alla CSD nei pazienti FHM1, e sostengono un modello in cui
il rilascio di glutammato dipendente dai canali CaV2.1 alle sinapsi
ricorrenti tra cellule piramidali e l’attivazione dei recettori NMDA
sono necessari per l’induzione e la propagazione della CSD coinvolta nell’emicrania.
trigemino, elementi chiave per convogliare gli stimoli dolorifici dalle
strutture del cranio al tronco encefalico. La sensitizzazione neuronale è un processo fine che coinvolge lo scambio di informazioni fra
neuroni gangliari e cellule non neuronali, incluse cellule satelliti. Data l’eterogeneità dei pazienti emicranici, non è ancora chiaro né se
fra due attacchi di emicrania essi tornino ad una normale funzionalità trigeminale, né cosa li predisponga all’emicrania. Studi precedenti hanno dimostrato che la mutazione del gene che codifica per
la subunità alfa dei canali del calcio di tipo CaV2.1 causa un tipo genetico di emicrania, l’emicrania emiplegica familiare di tipo 1
(FHM1). Questa mutazione conferisce un aumento di funzionalità
del canale, cioè un maggiore influsso di calcio nei neuroni. Grazie a
due progetti precedentemente finanziati dal Comitato Telethon, abbiamo dimostrato che il recettore canale P2X3 attivato da ATP è
iperfunzionale nei neuroni trigeminali di topi knock-in (KI) che
esprimono la mutazione caratteristica della FHM1. Inoltre, i recettori P2Y accoppiati a G-proteina e attivati dai nucleotidi sono maggiormente attivi nelle cellule satelliti gliali dei topi KI rispetto ai topi
controllo dopo esposizione ad agenti pro-algogenici, suggerendo
che il sistema purinergico giochi un ruolo nello sviluppo e nel mantenimento della sensitizzazione trigeminale associata ad emicrania.
Su queste basi lo scopo principale del presente progetto di ricerca è
capire cosa accade ai meccanismi di trasduzione del dolore dei neuroni sensoriali trigeminali in corso di emicrania, perché questi neuroni diventano iperattivi e come possiamo bloccarli. Il nostro progetto di ricerca traslazionale, che combina studi di base e clinici utilizzando campioni da topi KI e da pazienti FHM1, si propone di identificare la natura e i meccanismi (inclusi i messaggeri chimici, con
particolare attenzione verso il sistema purinergico) usati dai neuroni
trigeminali per interagire con le cellule satelliti e reclutare cellule
neuroimmunitarie per creare una stato di sensitizzazione latente
che faciliti l’innescarsi dell’attacco dolorifico acuto. Infine, ci proponiamo di verificare se certi biomarcatori dei pazienti FHM1 determinino o supportino il fenotipo di sensitizzazione dei topi KI e come
esso possa essere inibito.
ABSTRACT N. 130
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 3
ABSTRACT N. 129
NISTRI ANDREA
Totale
221.900
Telethon grant N.
Num Centri: 2
237.200
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2010
Roiter Ignazio (2), Artuso Vladimiro (2), Tagliavini Fabrizio (3), Tettamanti Mauro (1), Lucca Ugo (1), Forloni Gianluigi (1)
GGP10082
Durata (anni): 2
GGP10208
INSONNIA FATALE FAMILIARE: TRATTAMENTO PREVENTIVO
CON DOXICICLINA IN SOGGETTI A RISCHIO GENETICO DI
MALATTIA
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Responsabile
FORLONI GIANLUIGI
Anno d’inizio: 2010
(1) Dipartimento di Neuroscienze, Istituto di Ricerche Farmacologiche “Mario
Negri”, Milano - Via La Masa 19, 20156 Milano
(2) Dipartimento di Medicina Interna, Unità Operativa di Medicina Oderzo ASL
9 Treviso
(3) Fondazione IRCCS Istituto Neurologico “Carlo Besta”. Milano
INTERAZIONE FRA NEURONI SENSORIALI E CELLULE NEUROINFIAMMATORIE NEI GANGLI TRIGEMINALI COME BASE
PER LO SVILUPPO DEL DOLORE EMICRANICO
Fabbretti Elsa (1), Ceruti Stefania (2), Franceschini Alessia (1), Villa
Giovanni (2), Magni Giulia (2), Fumagalli Marta (2), Colombo Laura
(2), Verderio Claudia (3), van den Maagdenberg Arn (4), Abbracchio Maria Pia (2), Nistri Andrea (1)
L’insonnia fatale familiare (FFI) è una malattia genetica neurodegenerativa caratterizzata da disturbo del sonno, iperattivazione del sistema autonomico e anomalie motorie. FFI appartiene al gruppo
delle encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE) dette anche malattie da prioni. Le TSE sono malattie neurodegenerative trasmissibili caratterizzate da un fenotipo molto eterogeneo, i casi genetici
sono associati a mutazioni sul gene codifica per la proteina prion.
FFI è una malattia autosomica dominante associata alla mutazione
da acido aspartico ad asparagina sul codone 178 gene prion in combinazione con la presenza di metionina sul codone polimorfico 129
(D178/M129). La malattia è devastante e normalmente porta a
morte in meno di due anni, non ci sono ad oggi trattamenti efficaci.
In questo progetto ci proponiamo di effettuare un trattamento preclinico con doxiciclina (DOXY) in soggetti a rischio genetico di sviluppare FFI. La potenziale efficacia della DOXY nelle TSE deriva da
numerosi studi sperimentali e da due studi clinici osservazionali che
in Italia e in Germania hanno dimostrato effetti positivi con questo
farmaco nelle TSE e un’ottima tollerabilità. Sono stati genotipizzati
85 soggetti appartenenti ad una famiglia con membri affetti da FFI,
22 di questi sono risultati portatori della mutazione D178/M129.
Poiché la penetranza della malattia è elevata e la possibilità di cura
alla comparsa dei sintomi è piuttosto remota, un trattamento preventivo con DOXY è stato proposto ai soggetti portatori della mutazione nati tra il 1958 e il 1969. Sulla base dell’analisi storica della
mortalità nei soggetti FFI appartenenti a questa famiglia (38 casi) è
(1) Neurobiology Sector and Italian Institute of Technology Unit, International
School for Advanced Studies (SISSA), via Bonomea 265 - 34136 Trieste. Tel.
040-378778; Fax 040-3787 249; e-mail: [email protected]
(2) Laboratory of Molecular and Cellular Pharmacology of Purinergic Transmission, Department of Pharmacological Sciences, Università degli Studi di Milano,
Milan, Italy
(3) CNR, Institute of Neuroscience, Milan, Italy
(4) Leiden University Medical Centre, Departments of Human Genetics & Neurology, Leiden, The Netherlands
L’emicrania è una patologia debilitante ancora poco controllata farmacologicamente in diversi pazienti che vanno così gradualmente
incontro a cronicizzazione con rischio di danni cerebrali. La progressione dell’emicrania è il risultato di variazioni della soglia del dolore
e conseguente sensitizzazione centrale, cioè ipersensibilità a stimoli
sensoriali accompagnata da plasticità delle vie di trasduzione dell’impulso dolorifico.
Dato che il tessuto nervoso non ha sensibilità dolorifica, sembra che
nella genesi e nel mantenimento della patologia giochi un ruolo
chiave la sensitizzazione periferica dei neuroni sensoriali del ganglio
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
ABSTRACT N. 132
stato possibile stabilire che l’età più a rischio di sviluppare la patologia è fra i 50 e i 55 anni. Così in uno studio a doppio cieco 11 soggetti portatori della mutazione che riceveranno DOXY (100 mg/die)
saranno messi a confronto con i non portatori anch’essi appartenenti alla famiglia che riceveranno il placebo. Prima di iniziare il
trattamento e ogni due anni tutti i soggetti saranno sottoposti ad
un’analisi clinica approfondita per stabilire il loro stato di salute in
relazione alla FFI. Sebbene le dimensioni del campione siano limitate, l’analisi statistica ci consentirà nell’arco di dieci anni di valutare
l’efficacia del trattamento. Questo è il primo studio preventivo nella
FFI che è reso possibile dalla possibilità unica di trattare, in condizioni controllate, un numero sufficiente ampio di soggetti a rischio
di sviluppare la malattia appartenenti alla stessa famiglia.
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 2
(1) Centre for Integrative Biology, University of Trento - via delle Regole, 101,
38123 Trento, Italy tel +390461282740 fax +390461283091 email: [email protected]
(2) Dipartimento di Medicina Sperimentale e Diagnostica, Università degli Studi
di Ferrara
(3) Dipartimento di Biologia ed Evoluzione, Università degli Studi di Ferrara
GGP10120
502.400
Anno d’inizio: 2008
Covello Giuseppina (1), Bacchi Niccolò (1), Fontana Francesca (1),
Del Vescovo Valerio (1), Marchesi Elena (2), Mari Lara (3), Perrone
Daniela (3), Denti Michela Alessandra (1)
DI FEDE GIUSEPPE
Durata (anni): 3
183.400
Durata (anni): 3
SKIPPING ESONICO INDOTTO DA RNA ANTISENSO PER LA
TERAPIA GENICA DELLA DEMENZA FRONTO-TEMPORALE
CON PARKINSONISMO LEGATA AL CROMOSOMA 17 (FTDP17)
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Telethon grant N.
GGP08244
Telethon grant N.
ABSTRACT N. 131
Responsabile
DENTI MICHELA ALESSANDRA
Responsabile
Anno d’inizio: 2010
NUOVE PROSPETTIVE TERAPEUTICHE PER LA MALATTIA DI
ALZHEIMER BASATE SU UNA VARIANTE DI ABETA CHE INIBISCE L’AMILOIDOGENESI
La proteina citoscheletrica Tau, espressa nel sistema nervoso, ha
un ruolo importante nella neurogenesi, nel mantenimento degli assoni e nel trasporto assonico. L’accumulo di filamenti di proteina
Tau aberrante in specifiche aree del cervello è la principale causa di
malattie degenerative, generalmente denominate “Tauopatie”, tra
le quali la Demenza Frontotemporale con Parkinsonismo legata al
cromosoma 17 (FTDP-17). La FTDP-17 è una malattia genetica rara
che presenta quadri clinici e neuropatologici eterogenei ed è causata, nel 50% dei casi, da mutazioni che provocano l’inclusione erronea dell’esone 10 (E10) nell’RNA messaggero (mRNA) di Tau. Tale
inclusione è responsabile dell’accumulo della proteina Tau nei neuroni degli individui affetti da FTDP-17.
Questo progetto intende esplorare la possibilità di un approccio di
terapia genica per la correzione dell’mRNA di Tau da parte di molecole di RNA antisenso (as-RNA). Utilizzando tali molecole è possibile
mascherare le sequenze necessarie perché un esone venga incluso
nell’mRNA maturo. Mediante l’utilizzo di linee cellulari abbiamo saggiato la capacità delle diverse molecole di as-RNA di indurre l’esclusione dell’E10 nell’mRNA maturo di Tau. Saggi condotti sull’mRNA e
sulle proteine hanno mostrato che specifiche molecole di as-RNA
sono capaci di escludere l’E10 nell’mRNA maturo di Tau. La loro efficienza di azione è correlata alla concentrazione e alla sequenza
bersaglio. Analoghi risultati sono stati ottenuti sulle sequenze del
gene tau umano, utilizzando dei minigeni che mimano la condizione
del trascritto endogeno umani.
In base a questi risultati sono stati costruiti dei vettori virali in grado di far produrre alle cellule le molecole di as-RNA più efficaci. Per
ottenere effetti persistenti, infatti, tali as-RNA sono prodotti come
parti integranti di molecole U snRNA, trascritte da promotori specifici. Mediante l’utilizzo di specifiche linee cellulari, abbiamo saggiato
se i vettori fossero capaci di indurre l’esclusione dell’esone 10 nell’mRNA maturo di Tau. Per gli studi futuri atti a testare l’efficacia
terapeutica dei vettori virali nelle aree specifiche del cervello, sarà
utilizzato un modello animale di FTDP-17.
I risultati scientifici che si otterranno vogliono essere un contributo alla
ricerca scientifica verso una cura per le malattie neurodegenerative.
Diomede Luisa (2), Salmona Mario (2), Catania Marcella (1), Romeo Margherita (2), Moda Fabio (1), Kubis Adriana (1), Chiara Vimercati (1), Ruggerone Margherita (1), Tagliavini Fabrizio (1), Di
Fede Giuseppe (1)
(1) U.O. Neurology V - Neuropatology, Department of Neurodegenerative Diseases, Fondazione IRCCS “Carlo Besta” Neurological Institute, - Via Celoria 11
e Via Amadeo 42, 20133 Milan, Italy
(2) Department of Molecular Biochemistry and Pharmacology, Istituto di Ricerche Farmacologiche “Mario Negri”, Milan, Italy
Abbiamo recentemente identificato una mutazione sul codone 673
(A673V) del gene codificante la proteina precursore (APP) del peptide
amiloide beta (Ab), che provoca la comparsa di una forma precoce di
malattia di Alzheimer (AD) solo nei soggetti omozigoti, mentre quelli
eterozigoti non ne sono colpiti neanche in età avanzata (Di Fede et
al., Science 2009, 323:1473-1477). Studi in vitro hanno mostrato
che la mutazione A673V, corrispondente alla posizione 2 di Ab (A2V),
stimola la via amiloidogenica nel catabolismo dell’APP e aumenta la
tendenza di Ab a formare aggregati e fibrille amiloidi. Tuttavia, la coincubazione del peptide Ab mutato con il peptide wild-type (wt) conferisce instabilità agli aggregati di Ab, ed inibisce l’amiloidogenesi e la
neurotossicità indotta da Ab, giustificando l’assenza della malattia nei
soggetti eterozigoti.
Gli obiettivi del progetto sono: 1) definire le basi molecolari dell’effetto opposto della mutazione A673V sulla formazione di amiloide in stato di omo- ed eterozigosi; 2) sviluppare una strategia terapeutica per
l’AD basata su peptidi modificati, contenenti la mutazione A673V.
Il progetto prevede un approccio multidisciplinare che comprende: (i)
caratterizzazione di modelli cellulari e animali di AD che esprimono la
mutazione A673V in omo- ed eterozigosi; (ii) identificazione e screening di possibili agenti terapeutici mediante studi in silico e modelli
cell-free; (iii) identificazione di carriers in grado di veicolare gli agenti
anti-amiloidogenici nel cervello; (iv) test di efficacia degli agenti terapeutici su modelli animali di AD.
Abbiamo generato linee cellulari che esprimono in modo stabile APP
umana wt o con mutazione A673V, A673T (già identificata come polimorfismo in eterozigosi in un soggetto non affetto da demenza) e,
come controllo positivo, la doppia mutazione Svedese
(K670M/N671L), causa di una forma familiare di AD. Abbiamo inoltre
generato linee di C. elegans che esprimono l’Ab umana wt o con mutazione A2V o A2T a livello muscolare o neuronale.
Dati preliminari indicano che le linee cellulari che esprimono l’APP con
mutazione A673V producono livelli più elevati di Ab rispetto alle linee
trasfettate con APP wt. Inoltre le linee transgeniche di C. elegans che
esprimono Ab A2V o A2T a livello pan-neuronale presentano deficit
nelle attività locomotoria e faringea, che suggeriscono la presenza di
un fenotipo patologico. É in corso la generazione di modelli cellulari e
animali esprimenti la mutazione A673V in eterozigosi.
Per testare l’efficacia degli agenti anti-amiloidogenici abbiamo generato inoltre un modello murino che deriva dalla linea APP23, esprimente APP umana con la mutazione svedese su background knockout per l’APP murina, al fine di evitare l’interferenza dell’APP endogena. Questa linea (moAPP-/-/huAPPSw+/-) mostra i primi depositi di
Ab a livello intracellulare all’età di 5 mesi e depositi amiloidi extracellulari piuttosto consistenti a partire dall’età di 9-12 mesi.
ABSTRACT N. 133
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 2
DEL SAL GIANNINO
GGP07185
273.800
Durata (anni): 2
Anno d’inizio: 2008
RUOLO DELLA PROLIL-ISOMERASI PIN1 NELLA MALATTIA DI
HUNGTINTON
Grison Alice (3), Mantovani Fiamma (1,2), Comel Anna (1,2), Persichetti Francesca (3), Del Sal Giannino (1,2)
(1) Laboratorio Nazionale del Consorzio Interuniversitario per le Biotecnologie
(LNCIB), - Area Sciece Park, Padriciano, 99 34149 Trieste (ITALY) tel:
040398979 FAX: 040398990 e-mail: [email protected]
(2) Dipartimento di Biochimica Biofisica e Chimica delle Macromolecole, Università di Trieste, Trieste,
(3) Scuola Internazionale Superiore di Studi Avanzati (SISSA), Trieste
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
L’analisi biochimica ha dimostrato che il transgene è fortemente
espresso in tutti i tessuti testati. La sua concentrazione aumentava
costantemente durante l’invecchiamento sia nel fegato e ancor più
nel cervello. La concentrazione totale di ferro nel fegato non era influenzata dalla espressione del transgene, ma il ferro ferritinico, rilevato da colorazione con Blu di Prussia di PAGE, diminuiva nei topi
transgenici. L’espressione della ferritina mutante non sembrava alterare l’omeostasi sistemica del ferro. Analisi immunoistochimiche
hanno mostrato l’espressione del transgene nel fegato e nel cervello, dove sembrava di essere localizzata principalmente nei neuroni. L’intensità della colorazione aumentava con l’età, in accordo
con i dati biochimici. Più interessante, i topi hanno mostrato la
formazione e l’accumulo di aggregati di ferritina/ferro nel fegato e
nel cervello, che sono segni patologici della malattia. Il numero e
le dimensioni dei granuli aumenta con l’età in parallelo con l’accumulo di ferritina esogena. Iniziali analisi MRI hanno mostrato zone
di ipodensità nel cervello dei topi transgenici invecchiati (> 12
mesi di età), dati che suggeriscono un accumulo di ferro nei gangli basali. Un primo approccio per ridurre la quantità di ferro nell’organismo facendo ripetuti salassi ha prodotto una diminuzione
della concentrazione epatica di ferro, ma non ha avuto effetti sul
numero e le dimensioni dei granuli di ferro nel cervello e nel fegato. Altri approcci per modificare i livelli di ferro nel fegato e nel
cervello sono in studio. In conclusione, abbiamo prodotto topi
transgenici che ricapitolavano i segni patologici delle neuroferritinopatie umane. Su questi modelli animali stiamo attualmente studiando i meccanismi molecolari della malattia e provando la sperimentazione di nuove strategie farmacologiche per ridurre l’accumulo cerebrale di ferritina/ferro.
La malattia di Huntington è una patologia neurodegenerativa ereditaria di tipo dominante dovuta ad un’espansione di triplette CAG nel
gene che codifica per la proteina Huntingtina (Htt).
La manifestazione patologica più evidente della malattia di Huntington è una specifica e graduale perdita di neuroni prevalentemente
nel nucleo dello striato. Il meccanismo attraverso il quale la Huntingtina mutata (mutHtt) causa la malattia non è ancora stato del
tutto chiarito sebbene siano implicati stress ossidativo, disfunzioni a
carico dei mitocondri e alterazioni del programma trascrizionale.
Recentemente è stato evidenziato un importante ruolo di p53 nella
modulazione degli effetti citotossici causati dalla presenza della
Huntingtina mutata (Bae et al., Neuron. 2005).
Un importante regolatore di diverse vie di segnalazione cellulare,
tra cui quella di p53, è la prolil isomerasi Pin1 che svolge la sua attività enzimatica in seguito alla fosforilazione dei suoi substrati. In
particolare, Pin1 è essenziale per la modulazione dell’attività trascrizionale e dell’induzione di apoptosi da parte di p53 in risposta a
diversi tipi di stress cellulare (Mantovani et al., 2007).
Lo scopo di questo progetto è stato studiare il ruolo di Pin1 nel modulare l’attività di p53 in risposta agli effetti tossici della Huntingtina mutata.
Abbiamo osservato che nei lisati proteici derivanti da cervelli post
mortem di pazienti Huntington ed in cellule che sovra-esprimono
mutHtt, p53 è fosforilata sul sito di interazione di Pin1, Ser46. Di
conseguenza, l’espressione di mutHtt promuove l’interazione tra
p53 e Pin1 sia in vitro che nei cervelli dei topi Knock-In per mutHtt
(HdhQ111). La fosforilazione di p53 nel sito di Pin1 Ser46, svolge
un ruolo fondamentale nell’attivare la funzione apoptotica di p53 in
quanto l’isomerizzazione mediata da Pin1 induce la dissociazione di
p53 dal suo inibitore apoptotico iASPP (Mantovani et al., Nat Struct
Mol Biol. 2007).
Sorprendentemente abbiamo osservato che l’espressione di mutHtt
induce la dissociazione di p53 da iASPP. Inoltre, in assenza di Pin1,
p53 rimane associata ad iASPP e ciò previene la trascrizione dei
bersagli pro-apoptotici di p53. Di conseguenza, la morte neuronale
indotta da mutHtt può essere prevenuta riducendo l’espressione di
Pin1 tramite il silenziamento della proteina.
È degno di nota il fatto che anche l’inibizione farmacologica di Pin1
utilizzando due molecole, lo Juglone o il PiB, riduce la morte cellulare causata da mutHtt.
Inoltre, abbiamo dimostrato che l’inibizione della chinasi ATM, che è
attivata dall’espressione di mutHtt e fosforila Ser46, previene la
morte cellulare causata da mutHtt.
Questi risultati sono di particolare interesse perché suggeriscono
che l’uso di piccole molecole in grado di inibire l’attività di Pin1 oppure di agire sulle chinasi attivate dallo stress, possano rappresentare potenziali bersagli per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici
nel trattamento della malattia di Huntington.
ABSTRACT N. 135
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 5
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
GGP10099
585.800
Anno d’inizio: 2007
Dept. of Medicine, University of Verona, Verona; Italy
Neurologische Klinik, Ludwig-Maximilians-Universität, Munich, Germany
Dept of Neurology, Mount Sinai School of Medicine, New York, NY, USA
Dept of Neurology, University Hospital, Zürich, Switzerland
Dept. of Biochemistry, University of Torino, Torino; Italy
La corea-acantocitosi è una malattia ereditaria con trasmissione autosomica recessiva e fa parte del gruppo sindromico delle neuroacantocitosi. La corea-acantocitosi (ChAC) è caratterizzata da una
neurodegenerazione progressiva del tessuto striato associata alla
presenza nel circolo periferico di acantociti, globuli rossi (RBCs) con
morfologia anomala per la presenza di spicole distribuite sulla superficie cellulare. Nel presente progetto abbiamo studiato i RBCs di
pazienti affetti da ChAC (n=9) confrontandoli con RBCs di soggetti
normali (n=12). Abbiamo studiato il proteoma della membrana eritrocitaria ed abbiamo successivamente validato i dati proteomici
mediante immunoblot con anticorpi specifici per alcune delle proteine identificate. Dal momento che la ChAC presenta una frazione di
RBCs più densi, in cui sono presenti gli acantociti, abbiamo separato la popolazione eritrocitaria in due frazioni: la più leggera contenente i reticolociti (F1) e la più pesante o densa (F2) che contiene
gli acantociti. Le proteine della membrana dei RBCs così frazionate
sono state successivamente separate mediante elettroforesi mono e
bidimensionale (1DE, 2DE). Le mappe bidimensionali generate sono
state sottoposte ad analisi di immagine (Progenesis SameSpots,
Non Linear Dynamics, UK). Abbiamo considerato come differentemente espressi gli spot aumentati o ridotti di 2-volte rispetto il controllo normale, utilizzando l’ANOVA one-way test e considerando
P<0.05 come significativo. Abbiamo identificato 39 spot divergenti
nella frazione meno densa (F1) dei RBCs ChAC e 35 nella frazione
più densa (acantociti) di ChAC rispetto alle corrispondenti frazioni
eritrocitarie di controllo. Abbiamo osservato delle differenze negli
spot corrispondenti a proteine della membrana eritrocitaria legate
ad una differente mobilità nella corsa bidimensionale come verosimile espressione di modificazioni post-traduzionali delle proteine,
come le fosforilazioni, più che a differente abbondanza delle protei-
AROSIO PAOLO
Durata (anni): 3
104.600
Durata (anni): 3
Tomelleri Carlo (1), Danek Adrian (2), Walker Ruth (3), Bader Benedikt (2), Jung Hans H (4), Turrini Franco (1), De Franceschi Lucia
(5)
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Telethon grant N.
GGP07007
ANALISI DI MODIFICAZIONI FUNZIONALE E POST-TRADUZIONALI NEI GLOBULI ROSSI DI PAZIENTI AFFETTI DA NEUROACANTOCITOSI
ABSTRACT N. 134
Responsabile
DE FRANCESCHI LUCIA
Anno d’inizio: 2010
MODELLI ANIMALI DI NEUROFERRITINOPATIE PER LO STUDIO DEL RUOLO DEL FERRO NELLA NEURODEGENERAZIONE
Cremona Ottavio (2), Giorgio Marco (3), Grohovaz Fabio (2), Levi
Sonia (2), Arosio Paolo (1)
(1) Dipartimento Materno Infantile e Tecnologie Biomediche, Università di Brescia - Viale Europa 11, 25129 Brescia, Italy, Tel +39030394396, Fax:
+39030307251, email: [email protected]
(2) Università Vita-Salute & San Raffaele Scientific Institute, 20132 Milano
(3) Dipartimento di Oncologia Sperimentale, Istituto Europeo di Oncologia, Milano
Le Neuroferritinopatie sono rare malattie genetiche con una trasmissione autosomica dominante causata da mutazioni nel dominio
C-terminale della ferritina-L (FTL). Rappresentano esempi chiave di
patologie nei quali la disregolazione del ferro cerebrale è strettamente associata a neurodegenerazione. E’ da notare che alterazioni
nel metabolismo del ferro cerebrale sono state recentemente osservate anche in malattie neurodegenerative comuni, inclusi il morbo
di Parkinson e di Alzheimer. Abbiamo precedentemente dimostrato
che l’omeostasi del ferro è alterata nei modelli cellulari della malattia e che questa è la causa primaria della degenerazione cellulare.
Recentemente abbiamo generato modelli animali che esprimono il
mutante patogenico umano 498InsTC FTL sotto il promotore PGK.
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Pagina 86
PROGETTI DI RICERCA TELETHON
ABSTRACT N. 137
ne. La frazione densa di RBCs ChAC contenente gli acantociti è caratterizzata da differenze nella quota di proteine associata alla
membrana come le heat shock protein -70 (HSP70) e la peroxiredoxina-2, kinasi e fosfatasi come le serin-threonine protein kinasi o
la protein fosfatasi 2C che potrebbere essere coinvolte nelle modificazioni post-traslazionali delle proteine della membrana eritrocitaria osservate nella ChAC. Abbiamo quindi validato i dati di protemica con analisi immunoblot avvalendoci di anticorpi specifici diretti contro alcune delle proteine identificate. Tra le proteine di
membrana identificate in ChAC abbiamo osservato la presenza di
un alto livello di fosforilazione in tirosina a carico della proteina integrale banda 3. Abbiamo quindi valutato la via di trasduzione del
segnale che coinvolge la kinasi della famiglia del Src, Lyn, e la correlata kinasi Syk in RBCs ChAC. I target di Syk e Lyn sulla banda 3
sono rispettivamente: i residui tirosinici Y8-21 ed i residui Y359904. In RBCs da ChAC abbiamo osservato un aumento della quota
attiva di Lyn (P-Lyn9, mentre la quota attivata di fosfo-Syk era
marcatamente ridotta quasi non evidenziabile in RBCs ChAC. Questi dati suggeriscono una perturbazione delle vie di segnale LynSyk verso la banda 3 in favore dell’azione di Lyn con verosimile
coinvolgimento del residuo Y359 localizzato nella giunzione tra l’Nterminale del domain citoplasmatico di banda 3 ed il domain trans
membrana o del residuo 904 sul C-terminale della banda 3. Sulla
base dei seguenti dati ipotizziamo che la banda 3 abbia una maggiore mobilità nella membrana partecipando alla generazione di
acantociti in ChAC. Ulteriori studi sono necessari per valutare l’anomala attivazione di Lyn in ChAC RBCs.
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 3
(1) Neurogenetics Unit, CSS-Mendel Institute viale Regina Margherita 261 00198 Rome
(2) Dep of Medical and Surgical Pediatric Sciences, University of Messina
Questo progetto rappresenta il proseguimento di una linea di ricerca finanziata da Telethon dal 2002, quando il nostro gruppo ha
mappato il locus PARK6 e successivamente identificato mutazioni
nel gene PINK1, codificante per una kinasi mitocondriale, in famiglie con malattia di Parkinson a trasmissione autosomica recessiva.
Da allora, PINK1 è stata progressivamente caratterizzata come una
proteina con multiple funzioni neuroprotettive, in grado di prevenire
il danno mitocondriale e l’attivazione della via apoptotica, e di regolare la dinamica mitocondriale e la mitofagia attraverso la sua interazione con Parkin.
Nel corso del precedente progetto finanziato da Telethon, abbiamo identificato un nuovo meccanismo attraverso il quale PINK1
può svolgere la sua attività neuroprotettiva. Abbiamo dimostrato
che PINK1 è in grado di indurre autofagia basale e da deprivazione di nutrienti in linee cellulari dopaminergiche, e che questa attività dipende dalla sua interazione con Beclin1, una proteina chiave per l’attivazione della via autofagica (Michiorri et al, 2010).
L’autofagia è un importantissimo meccanismo cellulare deputato
ad eliminare proteine mal ripiegate, aggregati proteici e organelli
danneggiati, e rappresenta una fondamentale via neuroprotettiva.
Infatti, la soppressione dell’autofagia determina un marcato incremento di morte neuronale, mentre farmaci induttori di autofagia
sono in grado di ridurre gli aggregati proteici e la morte cellulare
in alcuni modelli di neurodegenerazione. Inoltre, abbiamo recentemente dimostrato che PINK1 interagisce anche in maniera diretta con Bcl-xL, una proteina partner di Beclin1 con spiccata azione
antiapoptotica e neuroprotettiva.
Questi dati identificano nuove funzioni di PINK1 e ne suggeriscono
un possibile ruolo chiave nella regolazione dei meccanismi alla base
della neuroprotezione. Il presente rinnovo di progetto si propone di
caratterizzare l’interazione tra PINK1 e Beclin1/Bcl-xL relativamente
ai domini proteici coinvolti, le regioni subcellulari dove le interazioni
hanno luogo, l’effetto di stress cellulari diversi e la possibile relazione con la proteina Parkin. Sarà inoltre valutato Il ruolo funzionale
delle interazioni sulle via autofagica ed apoptotica, sulla dinamica
mitocondriale e sul reclutamento mitocondriale ai terminali sinaptici, utilizzando vari modelli di neurodegenerazione in vitro.
Tali studi consentiranno di comprendere nuovi aspetti dell’attività
neuroprotettiva di PINK1 e l’effetto patogenetico delle mutazioni
identificate in pazienti parkinsoniani. Il progetto ha la potenzialità di
migliorare le conoscenze su un meccanismo protettivo primario
contro la morte cellulare, supportando nuove strategie terapeutiche
per la MP e altre malattie neurodegenerative.
GGP10224
319.500
Anno d’inizio: 2010
Gelmetti Vania (1), Arena Giuseppe (1), Torosantucci Liliana (1),
Valente Enza Maria (1,2)
GUSTINCICH STEFANO
Durata (anni): 3
180.000
Durata (anni): 2
PINK1, UNA PROTEINA MUTATA NELLA MALATTIA DI PARKINSON A TRASMISSIONE AUTOSOMICA RECESSIVA, INTERAGISCE CON LA PROTEINA PROAUTOFAGICA BECLIN1 E CON IL
SUO PARTNER ANTIAPOPTOTICO BCL-XL: CARATTERIZZAZIONE DEL RUOLO NEUROPROTETTIVO DI QUESTE INTERAZIONI
ATTRAVERSO LA REGOLAZIONE DI MULTIPLE VIE CELLULARI
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Telethon grant N.
GGP10140
Telethon grant N.
ABSTRACT N. 136
Responsabile
VALENTE ENZA MARIA
Responsabile
Anno d’inizio: 2010
DEFINIZIONE DELLA MALATTIA DI PARKINSON TRAMITE
PROFILO DI ESPRESSIONE GENICA DA SANGUE PERIFERICO
DI PAZIENTI AFFETTI DALLA FORME MONOGENETICHE
LRRK2 E PARKIN
Calligaris Raffaella (1), Roncaglia Paola (1), Banica Mihaela (2),
Cucca Alberto (2), Cattaruzza Tatiana (2), Krmac Helena (1), Antonutti Lucia (2), Goldwurm Stefano (3), Pizzolato Gilberto (2), Gustincich Stefano (1)
(1) Sector of Neurobiology, International School for Advanced Studies (SISSA)
- Via Bonomea 265, 34136 Trieste, Italy
(2) Department of Clinical, Technological and Translational Sciences, University
of Trieste, Italy
(3) Parkinson Institute, Istituti Clinici di Perfezionamento, Milan, Italy
La malattia di Parkinson (PD) è una malattia neurodegenerativa comune invalidante attualmente incurabile. Si manifesta principalmente
con quattro sintomi caratteristici quali il tremore, la rigidità, la bradicinesia e l’instabilità posturale. Viene generalmente diagnosticata a livello clinico sulla base di un esame medico e di risposta al trattamento farmacologico dei sintomi. La malattia presenta una lunga fase
presintomatica che comporta una continua perdita di neuroni dopaminergici della sostanza nera cerebrale. Un problema comune per
quanto riguarda le malattie neurologiche è che il sito di degenerazione non è accessibile per uno studio diretto durante la vita.
Sebbene l’eziologia della malattia di Parkinson non sia ancora del
tutto chiara, studi su geni mutati nel PD genetico e familiare (fPD),
come LRRK2 e Parkin, hanno contributo in maniera importante alle
nostre conoscenze attuali. Ciononostante, non risulta ancora chiaro
se diverse forme di casi genetici presentino meccanismi comuni di
neurodegenerazione e quale sia la loro relazione con il PD sporadico
(sPD) che colpisce la maggior parte delle persone.
In questo progetto studieremo i processi molecolari perturbati
nelle cellule del sangue di pazienti affetti dalla forme monogenetiche LRRK2 e Parkin della malattia di Parkinson per la definizione
della malattia.
Analizzeremo il sangue di pazienti affetti dalla forma genetica
LRRK2 con la mutazione G2019S e pazienti con la mutazione nel
gene Parkin attraverso profili di espressione genica. Identificheremo
quindi una serie di geni la cui espressione viene alterata nel PD. Il
nostro scopo finale è l’identificazione di nuovi spunti riguardo alla
relazione fra le diverse forme di fPD e delle loro similarità e differenze con l’sPD. Questo potrebbe rivelarsi di notevole importanza
per la diagnosi in pazienti presintomatici e per il monitoraggio degli
effetti di nuovi trattamenti terapeutici.
ABSTRACT N. 138
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
CHIEREGATTI EVELINA
GGP10109
187.500
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2010
MECCANISMI PATOGENETICI DEL MORBO DI PARKINSON
FAMILIARE: ALFA-SINUCLEINA E LA SUA FORMA MUTATA
A30P AGISCONO SULLA STRUTTURA DEI MICROFILAMENTI E
DEI FILAMENTI INTERMEDI. VIE DI SEGNALAZIONE ED EFFETTI SULLE DINAMICHE CITOSCHELETRICHE
Ronzitti Giuseppe, Difato Francesco, Blau Axel, Chieregatti Evelina
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
Gli obiettivi del nostro progetto includono: 1) studio genetico, clinico, vegetativo, neuroradiologico, neuropatologico e biochimico delle
tre famiglie ADLD italiane; 2) studi dei meccanismi patologici su fibroblasti e sangue umani da pazienti ADLD; 3) produzione e caratterizzazione di un modello murino transgenico condizionale di ADLD.
Abbiamo osservato che, in un paziente ADLD, la disfunzione vegetativa associata con la duplicazione di LMNB1 e’ caratterizzata da insufficienza cardiovascolare e noradrenergica cutanea, con preservate
funzione cardio-vagale e innervazione colinergica della ghiandola sudoripara. (Guaraldi P et al, 2010). Studi longitudinali di RM verranno
effettuati comparando soggetti portatori e non portatori della duplicazione di LMNB1. Stiamo inoltre definendo i confini della duplicazione attraverso a-CGH e studiando le cause genetiche della variante
ADLD senza duplicazione attraverso analisi dei meccanismi regolatori genetici. Gli effetti della duplicazione di LMNB1 sull’espressione di
RNA e proteina verranno valutati in sangue e fibroblasti umani da
paziente. Abbiamo sviluppato colture primarie di fibroblasti cutanei
da 3 pazienti ADLD con duplicazione, 1 paziente ADLD senza duplicazione e 9 volontari sani e stiamo studiando gli effetti della sovra
espressione di LMNB1 sulla struttura, funzioni e dinamiche nucleari
attraverso studi biochimici, immunoistochimici e di microscopia a
forza atomica e confocale. Abbiamo generato un topo transgenico
condizionale EGFP-loxP-hLMNB1 che sovra-esprime LMNB1 umana in
seguito a ricombinazione da Cre. La caratterizzazione fenotipica degli 8 fondatori ottenuti e’ in corso per selezionare linee transgeniche
piu’ rilevanti per studi neuropatologici e di RM successivi.
I risultati di questo studio, oltre a chiarire i meccanismi patogenetici
associati ad anomalie della LMNB1, ed individuare nuovi potenziali
bersagli terapeutici ed indicatori pre-sintomatici della malattia utili
per un trattamento precoce, potranno contribuire alla comprensione
di altre patologie centrali caratterizzate da analoghe alterazioni della sostanza bianca e del sistema nervoso vegetativo.
Dept. Neuroscience and Brain Technologies, IIT, Genova - Via Morego 30,
16163 Genova
Il morbo di Parkinson (PD) e’ una malattia degenerativa progressiva
caratterizzata da tremore, rigidità muscolare e difficoltà ad iniziare i
movimenti. PD può essere definito in termini biochimici come una
deficienza dello stato dopaminergico dovuta a degenerazione dei
neuroni dopaminergici. La strategia terapeutica e’ quella di risanare
la deficienza di dopamina nel cervello con mezzi farmacologici o con
impianti di cellule contenenti dopamina. Le cause della morte dei
neuroni nel PD sono ancora poco conosciute. Recentemente sono
state individuate delle mutazioni nel gene di alfa-sinucleina (Syn) in
diverse famiglie con PD a precoce manifestazione. Inoltre Syn e’
presente ad alti livelli nelle inclusioni intracellulari caratteristiche dei
neuroni di pazienti con PD. La patogenesi del PD familiare puo’ essere dovuta ad una perdita della funzione di Syn mutata, e una disfunzione nella sintesi di Syn puo’ avere un ruolo nel PD convenzionale. Questo porta alla domanda di quale sia la funzione fisiologica
di Syn. Syn e’ localizzata nelle terminazioni presinaptiche dei neuroni, in una posizione chiave per regolare la secrezione di neurotrasmettitori. Inoltre l’annullamento dell’espressione di Syn in topi o in
cellule neuronali in coltura induce alterazioni nella velocità di secrezione e l’aumento dell’espressione di Syn in cellule neuronali blocca
la secrezione. Noi stiamo studiando l’effetto di Syn su due diversi
elementi citoscheletrici, i microfilamenti ed i filamenti intermedi,
che hanno un ruolo chiave nella regolazione di funzioni sinaptiche
quali il rilascio di neurotrasmettitori e la rigenerazione neuronale.
Abbiamo dimostrato l’interazione di Syn con l’actina ed un effetto
sulla sua dinamica di polimerizzazione che è profondamente alterato in presenza della forma mutata di Syn. In neuroni in coltura infettati con le due forme di Syn stiamo studiando la localizzazione
subcellulare e la regolazione dinamica dell’interazione tra Syn e actina. Abbiamo inoltre messo a punto un sistema di microdissezione
dell’assone di neuroni in coltura per poter investigare l’effetto di
Syn sui tempi e sulla capacità di rigenerazione dei processi neuritici. Dopo aver chiarito la funzione fisiologica di Syn, studieremo se
le forme mutate di Syn hanno perso o cambiato la loro funzione. La
comprensione dei meccanismi precoci responsabili della disfunzione
dei neuroni e della loro conseguente degenerazione dara’ nuove indicazioni per una terapia piu’ efficace e di lunga durata.
ABSTRACT N. 140
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
ABSTRACT N. 139
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 3
GASPARINI LAURA
GGP10184
423.700
Durata (anni): 3
GGP07225
156.000
Durata (anni): 2
Anno d’inizio: 2007
CARATTERIZZAZIONE FUNZIONALE DELL’ICCINA, UNA NUOVA PROTEINA DI MEMBRANA COINVOLTA NEI PROCESSI DI
MIELINIZZAZIONE CENTRALE E PERIFERICA
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Responsabile
MINETTI CARLO
Gazzerro Elisabetta (1), Baldassari Simona (1), Fruscione Floriana
(1), Zara Federico (1), Biancheri Roberta (2), Nobbio Lucilla (3),
Scarfì Sonia (4), Corradi Anna (5), Minetti Carlo (1)
Anno d’inizio: 2010
LEUCODISTROFIA AUTOSOMICA DOMINANTE DELL’ETÀ
ADULTA: STUDIO TRASLAZIONALE DEI MECCANISMI GENETICI, MOLECOLARI E CELLULARI DI MALATTIA MEDIATI
DALLA PROTEINA LAMIN B1 E CORRELAZIONE CON PARAMETRI CLINICI E NEURORADIOLOGICI
(1) Muscular and Neurodegenerative Disease Unit, University of Genova and G.
Gaslini Institute, Genova, Italy
(2) Dept. of Neuroscience, G.Gaslini Institute, Genova, Italy
(3) Dept. of Neurology, University of Genova, Italy
(4) Dept. of Experimental Medicine, Biochemistry Section, University of Genova, Italy
(5) Dept. of Experimental Medicine, Neuroscience Section, University of Genova, Italy
Cortelli Pietro (2), Brusco Alfredo (3), Brussino Alessandro (3), Capellari Sabina (2), Di Gregorio Eleonora (3), Lacerenza Daniela (3),
Parchi Piero (2), Liguori Rocco (2), Lodi Raffaele (4), Vaula Giovanna (5), Contestabile Andrea (1), Ferrera Denise (1), Canale Claudio
(6), Gasparini Laura (1)
Le leucoencefalopatie dell’infanzia includono disordini che colpiscono selettivamente la sostanza bianca del cervello. La categoria più
numerosa tra le forme non diagnosticate è costituita dai casi con
ipomielinizzazione. Il nostro gruppo ha descritto una nuova malattia
autosomica recessiva “Ipomielinizzazione e Cataratta Congenita”,
HCC, in 5 famiglie non consaguinee con 10 pazienti affetti da cataratta congenita e diffusa ipomielinizzazione centrale e periferica.
Abbiamo definito che HCC è causata dal deficit di una nuova proteina a funzione sconosciuta da noi denominata iccina.
Scopo del grant Telethon è stato quello di definire i meccanismi d’azione di tale molecola. Come primo passo, abbiamo analizzato il pattern d’espressione d’iccina nel sistema nervoso centrale e periferico
(SNC, SNP). Infatti, l’identificazione del citotipo esprimente iccina
contribuisce a determinare il contesto fisiologico nel quale la proteina realizza la sua funzione. I nostri risultati indicano che nel SNC iccina è espressa in neuroni piramidali dell’ippocampo, e dei layers
II/III e V/VI della corteccia cerebrale. Nel SNP, la proteina è visualizzabile solo in fasi postnatali precoci sulla membrana neuronale, in
stretto contatto con cellule di Schwann mielinizzanti. Iccina è primariamente una proteina neuronale poiché colocalizza con marcatori
neuronali e non con antigeni oligodendrocitari o astrocitari.
Nel SNC, i trascritti di questa molecola sono elevati in topi neonati
in fasi precoci di sviluppo, quando la mielinizzazione è attiva, per
poi decadere del 75% in animali adulti. In modo analogo, in co-cul-
(1) Dept. Neuroscience and Brain Technologies, Italian Institute of Technologies, Via Morego 30, 16163 Genova, Italy
(2) Clinica Neurologica, Dept. Neurological Sciences, University of Bologna, Bologna
(3) Dept of Genetics, Biology and Biochemistry, University of Torino, Torino
(4) Department of Internal Medicine, Aging and Nephrological Diseases, University of Bologna
(5) Dept. Neurosciences, S.Giovanni Battista Hospital, Torino
(6) Nanobiotechnology Platform, Italian Institute of Technologies, Genova,
Italy
La leucodistrofia autosomica dominante (ADLD) e’ una malattia genetica rara associata con una sovra espressione della proteina nucleare Lamina B1 (LMNB1). Abbiamo identificato due famiglie ADLD
in cui i pazienti sono portatori di una duplicazione del gene LMNB1
ed una terza famiglia che presenta una variante associata con una
mutazione genetica ignota che altera i livelli di proteina LMNB1. Entrambe le varianti di ADLD si manifestano con disfunzioni vegetative e iperintensità T2 della sostanza bianca supra- ed intra-tentoriale all’analisi di risonanza magnetica (RM) senza alterazioni delle fibre a U e delle radiazioni ottiche.
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
ture di cellule di Schwann e neuroni dei Gangli Dorsali, i trascritti
d’iccina sono up-regolati nelle prime fasi della formazione della
guaina mielinica e quindi si riducono a 30 giorni quando il processo
è completo.
Allo scopo di studiare in dettaglio il ruolo in vivo d’iccina nella mielinizzazione, abbiamo creato un modello di topi knock-out. A 9 settimane di vita, in corteccia, gli animali iccina knock-out mostrano rigonfiamenti assonali, testimoniati da una forte immunopositività
per il precursore della proteina amiloide. Questo è un segno di neurodegenerazione dovuta a una difettosa funzione oligodendrocitaria.
Infine, il silenziamento d’iccina inibisce i processi d’adesione intercellulare in vitro, suggerendo che la molecola possa regolare le proprietà adesive cellula-cellula.
In conclusione, iccina è una proteina neuronale e come tale potrebbe essere parte del cross-talk neurone-glia. I neuroni utilizzano una
serie di molecole che controllano la differenziazione di quelle cellule
gliali a loro associate che forniscono poi un supporto assonale longterm. In questo processo, il contatto glia-assone mediato da proteine d’adesione è un prerequisito per una corretta mielinizzazione.
Di rilievo, da un punto di vista fisiopatologico, HCC è ora classificata
nel gruppo delle leucoecefalopatie ipomielinizzanti dovute a un primario difetto neuronale.
zialmente causativo di autismo in quanto alcuni dei geni che contenevano hanno una funzione o espressione che potrebbero suggerire un loro coinvolgimento nell’eziologia dell’autismo.
Contemporaneamente, campioni di linfociti B sono stati raccolti da
150 individui con i quali stiamo allestendo linee linfoblastoidi.
Stiamo inoltre effettuando l’analisi di espressione genica su soggetti autistici con nuove CNVs identificati mediante array-CGH utilizzando l’mRNA estratto da linee linfoblastoidi già allestite.
In conclusione, le nostre indagini su pazienti autistici effettuate
attraverso una combinazione di approcci diversi (array-CGH e
analisi di espressione genica) ci hanno permesso di identificare
nuove alterazioni genomiche potenzialmente causative di questa
malattia.
ABSTRACT N. 142
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
ABSTRACT N. 141
CICCONE ROBERTO
Totale
384.800
Telethon grant N.
Num Centri: 3
125.500
Durata (anni): 2
Anno d’inizio: 2007
Bertolin Cinzia (1), Vazza Giovanni (1), Vettori Andrea (1), Magri
Chiara (2), Barlati Sergio (2), Rampinelli Sabina (3), Perini Giulia
(4), Peruzzi Pio (5), Mostacciuolo Maria Luisa (1)
GGP08226
Durata (anni): 3
GGP07219
IDENTIFICAZIONE DEI GENI DI SUSCETTIBILITÀ IN FAMIGLIE CON ALTA RICORRENZA DI SCHIZOFRENIA E DISTURBO BIPOLARE
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Responsabile
MOSTACCIUOLO MARIA LUISA
Anno d’inizio: 2008
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
ARRAY-CGH AD ALTA RISOLUZIONE AD ANALISI D’ESPRESSIONE GENICA NELLO STUDIO DEI DISORDINI DELLO SPETTRO AUTISTICO
Ciccone Roberto (1), Fichera Marco (2), Prandini Paola (3), Della
Mina Erika (1), Trabetti Elisabetta (3), Di Benedetto Daniela (2),
Calì Francesco (2), Bulgheroni Sara (4), Bonaglia Maria Clara (5),
Brighenti Maurizio (6), Politi Pierluigi (7), Pignatti Pier Franco (3),
Riva Daria (4), Zuffardi Orsetta (1)
Dip.
Dip.
Dip.
Dip.
Dip.
di Biologia, Università di Padova - via G. Colombo 3, 35131 Padova
di Scienze Biomediche e Biotecnologie, Università di Brescia
di Salute Mentale, ASL14 Chioggia
di Neuroscienze, Università di Padova
Interaziendale di Salute Mentale, ULSS16 Padova
La Schizofrenia (SZ) ed il Disturbo Bipolare (BPD) sono patologie
multifattoriali, per le quali la componente genetica svolge un ruolo
preponderante.
Lo scopo principale del presente progetto è quello di identificare
loci e geni che conferiscono suscettibilità alla SZ e al BPD in un
campione di famiglie originarie della popolazione di Chioggia, che
per motivi geografici e socio-culturali può essere definita una “popolazione chiusa”. Si fa presente che in 16 famiglie di Chioggia è
stata svolta un’analisi genome-wide (GWS) che ha rilevato segnali
suggestivi di linkage nei cromosomi 1p, 1q, 4p e 15q [Vazza G et
al. Mol Psychiatry. 2007;12(1):87-93].
Il primo obiettivo del progetto è stato quello di incrementare il
campione. Sono stati raccolti campioni biologici, dati clinici e
informazioni genealogiche di 204 soggetti affetti, 41 parenti sani e
131 controlli provenienti dalla stessa popolazione da almeno quattro generazioni.
Si è poi proceduto con lo studio molecolare che ha riguardato sia
il DNA mitocondriale (mt-DNA) che nucleare.
Per quanto riguarda il DNA mitocondriale si è valutata l’associazione tra varianti nel mt-DNA e la presenza di SZ/BPD nei soggetti
indagati. A tale scopo sono stati determinati gli aplogruppi mitocondriali di 87 pazienti e la loro distribuzione; le frequenze così
ottenute sono state confrontate con quelle della popolazione italiana. I risultati non hanno permesso di rilevare differenze significative. E’ stato inoltre sequenziato l’intero genoma mitocondriale
di 27 pazienti al fine di ricercare la presenza di sostituzioni puntiformi causative. Tale indagine ha permesso di identificare complessivamente 215 variazioni (8 delle quali non note), tuttavia
nessuna di queste è in grado di spiegare l’elevata ricorrenza di
SZ/BPD nelle famiglie indagate (dati in pubblicazione).
Successivamente, 175 soggetti (di cui 127 casi familiari) sono stati genotipizzati con lo SNP array HapMap-370K (Illumina Infinium). Utilizzando il campione dei casi familiari è stato eseguito
un GWS con un approccio di tipo non parametrico (NPL). Mediante
tale indagine si sono confermati i picchi di linkage nei cromosomi
15q26 e 4p13 ed inoltre si è potuto rilevare un nuovo segnale di
linkage in 17q25.
Per definire quale fosse il contributo di ogni singola famiglia in
merito ai picchi di linkage, si è ritenuto di procedere con una cluster-analysis mediante la stima di alleli IBD. Questo tipo di indagine suddivide il campione in 2 gruppi distinti che correlano significativamente con le 2 zone della città da cui originano le famiglie
indagate (P=5.06e-05). Utilizzando questa informazione nell’analisi di linkage si è evidenziato che il segnale in 4p13 è supportato
dall’intero campione, mentre i loci 15q26 e 17q25 interessano singolarmente i 2 gruppi identificati.
(1) Dipartimento di Patologia Umana ed Ereditaria, Università di Pavia, Pavia Via Forlanini 14 - 27100 Pavia
(2) IRCCS Oasi Maria Santissima, Troina (EN)
(3) Dipartimento di Scienze della Vita e della Riproduzione, Università di Verona, Verona
(4) Neurologia dello sviluppo, Istituto Neurologico C. Besta, Milano
(5) Laboratorio di Citogenetica, IRCCS Eugenio Medea, Bosisio Parini (LC)
(6) Unità di Neuropsichiatria Infantile, ASL 20, Verona
(7) Dipartimento di Scienze Sanitarie Applicate e Psicocomportamentali, Università di Pavia, Pavia
L’autismo è caratterizzato dalla compromissione dell’interazione
sociale e della comunicazione verbale e non verbale, e da comportamenti ripetitivi e stereotipati. L’autismo è considerato una delle
malattie ereditarie complesse più diffuse. Varie evidenze suggeriscono che questa malattia ha forti basi genetiche ma pochissimi
geni causativi sono stati identificati. L’obiettivo del nostro progetto è quello di utilizzare la tecnica array-CGH ad alta risoluzione
per identificare alterazioni genomiche in pazienti affetti da autismo e per definire il loro ruolo patologico. Inoltre, l’analisi di
espressione genica su linee linfoblastoidi di questi individui viene
effettuata per capire il ruolo patologico di CNVs identificate mediante array-CGH.
In totale, 160 pazienti autistici sono stati testati tramite arrayCGH ad alta risoluzione (180K Agilent). Siamo stati in grado di selezionare 82 “nuove” CNVs (non riportate come polimorfiche) in
67 pazienti (15 pazienti avevano 2 CNVs). La dimensione di queste alterazioni genomiche variava da 11 kilobasi a 3,5 megabasi;
47 erano delezioni, 35 erano duplicazioni. Ogni CNV è stata studiata confrontandola con quelle riportate nel database dell’autismo e con i dati riportati in letteratura. In questo abbiamo distinto le CNVs già descritte in pazienti autistici da quelle che non lo
erano.
24 CNVs (16 delezioni e 8 duplicazioni) contenevano geni precedentemente riportati come associati ad autismo. Tra questi, 8/24
erano de novo CNVs, 8/24 non erano state studiate nei genitori, 8
erano ereditate da un genitore apparentemente sano. Tra i geni
già noti essere associati ad autismo, abbiamo identificato alterazioni genomiche a carico di GRPR, CNTNAP2, NRXN1, SYNGAP1,
AUTS2, DOCK8, DISC1, SOX11, CNTN4. Abbiamo inoltre identificato 50 CNVs non polimorfiche che abbiamo considerato poten-
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
ABSTRACT N. 144
Recenti GWAS riportano associazioni positive nei loci da noi evidenziati ed inoltre alcuni SNP appaiono essere direttamente coinvolti nella suscettibilità a sviluppare SZ e BPD [Terracciano A et
al. Mol Psychiatry. 2010 Jun;15(6):647-56; Cirulli ET et al. Eur J
Hum Genet. 2010 Jul;18(7):815-20; Otowa T et al. J Hum Genet.
2009 Feb;54(2):122-6].
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Totale
Num Centri: 2
Totale
Num Centri: 2
CATANIA MARIA VINCENZA
GGP07264
279.000
Durata (anni): 3
253.500
Durata (anni): 2
Anno d’inizio: 2010
MECCANISMI DI RIATTIVAZIONE DEL GENE FMR1 ED ANALISI DELLA PATOGENESI MOLECOLARE DELLA SINDROME X
FRAGILE: VERSO UNA TERAPIA FARMACOLOGICA
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Telethon grant N.
GGP10150
Telethon grant N.
ABSTRACT N. 143
Responsabile
NERI GIOVANNI
Responsabile
Neri Giovanni (1), Chiurazzi Pietro (1), Tabolacci Elisabetta (1), Moscarda Marco (1), Pirozzi Filomena (1), Lanni Stella (1), Goracci
Martina (1), Bagni Claudia (2), Zalfa Francesca (2), Pasciuto Emanuela (2), Pilo Boyl Pietro (2)
Anno d’inizio: 2007
COINVOLGIMENTO DEI RECETTORI METABOTROPICI DEL
GLUTAMMATO (mGLU) DEL GRUPPO I NELLA FISIOPATOLOGIA DELLA SINDROME DEL CROMOSOMA X FRAGILE
(1) Istituto di Genetica Medica, Facoltà di Medicina e Chirurgia, Università Cattolica, Roma - Largo Francesco Vito 1, 00168 Roma
(2) Dipartimento di Biologia Sperimentale e Scienze Biochimiche, Facoltà di
Medicina, Università di Roma “Tor Vergata”
Bonaccorso Carmela Maria (1,2), D’Antoni Simona (1), Spatuzza
Michela (1), Gloria Angelo (2), Barrancotto Giuseppina (2), Musumeci Sebastiano (2), Battaglia Giuseppe (3), Nicoletti Ferdinando
(3,4), Davidovic Laetitia (5), Bardoni Barbara (5), Catania Maria
Vincenza (1,2)
La sindrome del cromosoma X Fragile (FXS) rappresenta la forma più
frequente di ritardo mentale ereditario ed è dovuta a mutazioni che
inattivano FMR1, un gene localizzato sul cromosoma X che contiene
una sequenza ripetuta CGG nel promotore. L’espansione di questa
sequenza oltre le 200 triplette CGG (full mutation) induce modificazioni epigenetiche che a loro volta determinano l’inattivazione trascrizionale del gene FMR1 e l’assenza della corrispondente proteina
FMRP. Il gruppo del Coordinatore ha già dimostrato che FMR1 può essere riattivato trattando cellule di pazienti FXS con l’agente demetilante 5-azadesossicitidina. Adesso si propone di: 1) screenare decine
di composti potenzialmente riattivanti, in collaborazione col Broad Institute (Harvard e MIT) e la ditta Neuropharm (UK); 2) caratterizzare
le modificazioni epigenetiche critiche per la regolazione trascrizionale
del gene in pazienti FXS ed in rari maschi non affetti ma portatori di
una “full mutation” non metilata (UFM), che dimostrano come l’espansione della tripletta CGG di per sé non blocchi la trascrizione di
FMR1. L’analisi epigenetica comprenderà una nuova regione regolatrice a circa 600 basi a monte del promotore e includerà sia l’analisi
ChIP dei siti di legame per CTCF sia il dosaggio dei trascritti antisenso
prodotti nella regione; 3) analizzare lo status epigenetico di cellule
pluripotenti indotte (iPS) ottenute da fibroblasti di maschi FXS, controlli normali e portatori di UFM, in collaborazione col Dr. Guoping Fan
dell’Università di California a Los Angeles (UCLA).
Il gruppo del Partner si interessa da anni ai meccanismi cellulari e
molecolari che sottendono le anomalie delle spine dendritiche dei
pazienti FXS, avvalendosi di un modello murino (Fmr1 KO) della
sindrome. In questo progetto il Partner 1 indagherà uno dei meccanismi col quale FMRP regola la trascrizione genica nelle sinapsi, ovvero l’interazione con i microRNA (miRNA). I dati preliminari generati mostrano una interazione tra FMRP ed Ago2 che dipende dalla
presenza di RNA. Inoltre, impiegando un approccio basato sulla tecnologia microarray in collaborazione col Dr. Victor Ambros (Umass,
USA), il Partner 1 ha osservato che l’assenza di FMRP causa l’alterazione dei livelli di alcuni miRNA sinaptici che non si modificano nell’estratto di cervello totale. Il passo successivo consisterà nell’identificazione degli RNA messaggeri che interagiscono con i miRNA differenzialmente espressi, per caratterizzarne il potenziale effetto sulla morfologia delle spine dendritiche. Tali esperimenti potrebbero
portare all’identificazione di proteine sinaptiche che sarebbero utili
bersagli di trattamenti farmacologici in vivo.
(1) Institute of Neurological Sciences, ISN-CNR, Catania, Italy - via Gaifami
n°18, 95126 Catania, Italy
(2) IRCCS Oasi Maria SS, Troina (EN), Italy
(3) Dept. Neuroscience, Neuromed, Pozzilli (IS), Italy
(4) Dept. Pharmacology, Univ. of Roma “La Sapienza”, Roma, Italy
(5) CNRS UMR 6097, Univ. of Nice Sophia-Antipolis, Valbonne, France
La Sindrome del cromosoma X fragile (FRAX) è tra le principali
forme genetiche di ritardo mentale; è causata dall’assenza della
Fragile X Mental Retardation Protein (FMRP), una proteina che
lega gli RNA coinvolta nel trasporto, stabilità e traduzione degli
mRNA. FMRP è presente nei complessi ribonucleoproteici ed interagisce direttamente con altre proteine incluse alcune che legano gli RNA, come FXR1P ed FXR2P.
I recettori mGlu del gruppo I possono avere un ruolo importante
nel FRAX perché: (i) la loro attivazione stimola la traduzione di
mRNA a livello sinaptico, incluso l’RNA che codifica per FMRP;
(ii) la depressione a lungo termine e l’epileptogenesi indotte dalla loro attivazione e dipendenti dalla sintesi proteica sono aumentate nei topi Fmr1 knock out (KO); (iii) un ridotto numero di
recettori mGlu5 è associato alle proteine costitutive Homer in topi Fmr1 KO; e (iv) l’antagonista selettivo non competitivo per i
recettori mGlu5, MPEP, attenua il fenotipo patologico nei modelli
animali di FRAX.
Abbiamo usato topi controllo (WT) ed Fmr1 KO per studiare: 1)
l’espressione e la distribuzione regionale dei recettori mGlu1/5
mediante Western blot ed immunoistochimica; 2) l’espressione
di superficie e la distribuzione nei dendriti e negli assoni dei recettori mGlu5 in colture di neuroni ippocampali mediante microscopia confocale; 3) l’idrolisi dei polifosfoinositidi (PI) indotta
dall’attivazione dei recettori mGlu1/5; 4) il rilascio di glutammato in vivo in corteccia di topi WT e Fmr1 KO; 5) il profilo di
espressione delle proteine di sinaptosomi corticali mediante 2DPAGE; 6) la modulazione dell’interazione tra FMRP, FXR1P e
FXR2P da parte dei recettori mGlu1/5.
I nostri risultati indicano che: a) i recettori mGlu5 sono più
espressi in proteine sinaptiche di ippocampo e che i recettori
mGlu1 sono maggiormente espressi in proteine sinaptiche sia di
ippocampo che di cervelletto di topi Fmr1 KO; b) l’espressione di
superficie dei recettori mGlu5 è aumentata in colture di topi
Fmr1 KO rispetto ai WT e che essi sono localizzati nel soma e nei
dendriti nei neuroni WT mentre sono presenti anche negli assoni
negli Fmr1 KO; d) il rilascio di glutammato indotto da depolarizzazione è fortemente ridotto nei topi Fmr1 KO; e) le proteine sinaptiche di corteccia hanno un diverso profilo di espressione nei
topi WT ed Fmr1 KO; f) l’attivazione dei recettori mGlu5 riduce
l’interazione tra FMRP/FXR2P in WT e tra FXR1P/FXR2P in topi
Fmr1 KO.
I nostri dati suggeriscono che i recettori mGlu5 sono differentemente localizzati sulla superficie cellulare e diversamente distribuiti negli assoni e nei dendriti nei topi WT ed Fmr1 KO. Questo
risultato e la riduzione del rilascio di glutammato suggeriscono
che la mancanza di FMRP possa intaccare la funzione sinaptica a
livello sia pre- che postsinaptico. Inoltre, l’attivazione dei recettori mGlu del gruppo I può influenzare le diverse funzioni di
FMRP e delle proteine sue interattrici modulandone la reciproca
interazione.
ABSTRACT N. 145
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
BROCCOLI VANIA
GGP07181
231.000
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2007
IDENTIFICAZIONE DEI MECCANISMI MOLECOLARI DIPENDENTI DAL GENE ARX NEL CONTROLLO DELLO SVILUPPO DEL
CERVELLO E DELLA MIGRAZIONE NEURONALE: STUDIO DELLA
GENESI DELLE MALATTIE NEUROLOGICHE ARX DIPENDENTI
Colasante Gaia (1), Crispi Stefania (2), Calogero Raffaele (3), Golden Jeffrey (4), Broccoli Vania (1)
(1) Stem Cell and Neurogenesis Unit, Division of Neuroscience, San Raffaele
Scientific Institute, Via Olgettina 58, 20132, Milan, Italy
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
contribuire al fenotipo epilettico dei giovani topi dKO. I topi con la
rimozione condizionale di Rac1 nei neuroni mostrano una perdita di
interneuroni positivi per PV di solo -20%, e diventano epilettici da
adulti. (c) l’analisi elettrofisiologica dei circuiti ippocampali in sezioni di cervello mostra la maggiore sensibilità dei cervelli dKO all’induzione di crisi epilettiche a basse dosi di 4-aminopiridina rispetto
ai controlli, confermando l’alterazione dei circuiti nei dKO. Obiettivo
2 - Confronto tra topi Rac1N e Rac3KO. L’analisi comportamentale
di topi WT e Rac1N ha mostrato nei topi Rac1N difetti comparabili,
anche se più pronunciati, a quelli già osservati nei topi Rac3-KO
(Corbetta et al, 2008). Stiamo cercando differenze in altri aspetti
della memoria, paura, o ansia. Obiettivo 3 – Interazioni funzionali
tra le Rac e i complessi GIT durante lo sviluppo neuronale. In collaborazione con Angela Bachi, abbiamo usato la spettroscopia di massa per identificare nel cervello in via di sviluppo un pattern composito di complessi GIT/PIX/PAK, che include diverse isoforme per le
proteine ßPIX, aPIX, e PAK3, dove le ultime due possono essere alterate nel Ritardo Mentale. Benché la biochimica non riveli differenze nella composizione di questi complessi tra cervelli WT e mutati,
cercheremo differenze specifiche nell’ippocampo. In parallelo abbiamo dimostrato la forte riduzione di ramificazioni dendritiche in culture ippocampali in seguito a silenziamento di aPIX o di GIT2, che
suggerisce che i complessi aPIX/GIT2 sono importanti per la maturazione dendritica, un pre-requisito per il normale sviluppo delle
spine dendritiche.
(2) Gene Expression Core, Human Molecular Genetics laboratory, IGB-CNR, Via
Castellino 111, 80131 Naples, Italy
(3) Dept of Clinical and Biological Sciences, University of Turin, Turin, Italy
(4) Department of Pathology and Laboratory Medicine, The Children’s Hospital
of Philadelphia, USA
Arx è un repressore trascrizionale codificato da un gene legato al
cromosoma X; mutazioni in questo gene sono responsabili di gravi
patologie neurologiche come la sindrome di West, varie forme di ritardo mentale e di epilessia, e l’ XLAG, ossia una forma di lissecefalia associata a genitali anormali.
Durante lo sviluppo embrionale, Arx è espresso nel cervello in due
popolazioni neuronali: gli interneuroni GABAergici che si originano
dai gangli della base e migrano tangenzialmente verso la corteccia
cerebrale dove hanno la funzione di modulare l’attività dei neuroni
glutammatergici, e dai precursori dei neuroni glutammatergici in
corteccia. L’analisi dei cervelli di topi Arx knock- out (nostro modello per lo studio delle patologie) ha rivelato una severa diminuzione
del numero di interneuroni GABAergici, che arrivano nella corteccia
ed una riduzione nelle dimensioni di quest’ultima.
Per comprendere meglio i meccanismi molecolari responsabili di
questi difetti, abbiamo effettuato un’analisi del profilo trascrizionale,
paragonando il livello di espressione dei geni nei cervelli Arx mutanti ai cervelli di controllo. Abbiamo individuato, in questo modo, molti geni la cui espressione è alterata nei cervelli mutanti; tra questi,
nei gangli della base, ci siamo focalizzati su Ebf3 e
Rasgef1b, e abbiamo compreso che l’incremento nell’espressione di
questi due geni è responsabile, anche se non in modo esclusivo, sia
della diminuzione del numero di interneuroni che raggiungono la
corteccia sia dell’assenza della via di migrazione tangenziale nella
zona marginale della corteccia, tipici dei cervelli mutanti.
Nelle cortecce cerebrali mutanti, invece, l’ Inibitore delle Chinasi Ciclina Dipendenti (CKI) p57, è fortemente over-espresso; tale proteina è normalmente rintracciabile nei progenitori intermedi della
corteccia dove promuove l’uscita dal ciclo cellulare. Nei cervelli mutanti Arx è invece espressa in modo ectopico in tutta la zona ventricolare della corteccia cerebrale dove causa un precoce differenziamento dei progenitori corticali.
La comprensione dettagliata dei meccanismi molecolari attraverso i
quali Arx agisce in condizioni normali è essenziale per capire le cause delle patologie e per la messa a punto di eventuali cure.
ABSTRACT N. 147
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 1
GGP09078
291.900
Anno d’inizio: 2008
(1) Department of Cellular and Translational Biology, Consorzio Mario Negri
Sud, - Via Nazionale 8 /A 66030 S. Maria Imbaro (Chieti); tel. 0872570317
Fax 0872570416; [email protected]
(2) Department of Biology, University of Rome Tor Vergata Rome
DE CURTIS IVAN
Durata (anni): 3
222.400
Durata (anni): 3
Frascella Annalisa (1,2), Mosca Giovanna (1), Porcu Giampiero (1),
Bartocci Daniela (2), Di Giandomenico Daniele (1), Ragnini-Wilson
Antonella (1,2)
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Telethon grant N.
GGP08143
MALATTIE CORRELATE A DIFETTI NELLA FUNZIONE DELLE
MIOSINE DI CLASSE V: BASI MOLECOLARI DEL MECCANISMO DI RICONOSCIMENTO DEL CARGO
ABSTRACT N. 146
Responsabile
RAGNINI - WILSON ANTONELLA
Le miosine di classe V (MyoV) sono motori molecolari evolutivamente conservati, che trasportano vescicole secretorie e organelli
intracellulari. L’uomo codifica per tre isoforme di MyoV (MyoVa,
MyoVb e MyoVc).
La MyoVa è altamente espressa nel cervello e mutazioni nel gene
che la codifica sono associate con una rara malattia neurologica la
Griscelli sindrome di tipo 1 (GS1; OMIM 214450). La GS1 è caratterizzata da ritardo mentale associato a progressiva ipotonia muscolare e ad attacchi convulsivi che possono condurre a morte prematura. Le ragioni dei problemi neurologici sono ancora in discussione
(Rudolf R, et al., 2011. J Neurochem. 116:177-91) e l’identificazione di proteine che agiscono nel controllo del trasporto mediato da
MyoVa nei neuroni e il soggetto di questo progetto di ricerca.
In generale questo progetto ha due obiettivi: i) Comprendere come
i difetti nel trasporto intracellulare controllato da MyoVa conducano
alle manifestazioni neurologiche della GS1: e ii) porre le basi per l’identificazione farmaci utili per trattare le malattie che si basano su
disfunzioni genetiche della MyoVa.
Per chiarire la funzione di MyoVa nei neuroni innanzitutto abbiamo
identificato le proteine ortologhe a quelle che avevamo precedentemente caratterizzato nel lievito Saccharomyces cerevisiae perchè
legate alle vescicole secretorie e alla MyoV di lievito Myo2p (Casavola et al., 2008. Mol Microbiol. 67:1051-66): Ypt32p e Mlc1p.
Ypt32 è una piccola proteina G ortologa della proteina Rab11. Nei
neuroni dell’ippocampo Rab11 si associa con la MyoVb e vescicole
endocitiche che contengono ricettori AMPA in un processo richiesto
per l’apprendimento e memoria (Rudolf R, 2011). E’ ancora poco
chiara la funzione del complesso Rab11 e MyoVa, che pure si forma
nei neuroni dell’ippocampo. Si ritiene che anche questo complesso
svolga funzioni simili, ma non è chiaro con quali distinzioni di specificità (Rudolf R, 2011). Usando mutagenesi sito specifica abbiamo
mappato in vitro i siti di interazione di Rab11 con MyoVa umana
espressa nel cervello. L’insieme di questi studi ha portato alla definizione di un modello cellulare neuronale sul quale effettueremo gli
screening di librerie di siRNA per identificare nuove proteine capaci
Anno d’inizio: 2009
RUOLO DELLE GTPasi DELLA FAMIGLIA DI RHO NELLO SVILUPPO NEURONALE
Pennucci Roberta (1,2), Totaro Antonio (1,2), Tonoli Diletta (1,2),
Montinaro Valentina (1,2), Spaiardi Paolo (3), Micheletti Luisa
(1,2), Biella Gerardo (3), Consalez Giacomo (2), D’Adamo Patrizia
(2), De Curtis Ivan (1,2)
(1) Università Vita-Salute San Raffaele - Via Olgettina, 58 - 20132 Milano
(2) Istituto Scientifico San Raffaele - 20132 Milano
(3) Università degli studi di Pavia, Facoltà di Scienze - 27100 Pavia
Gli scopi del nostro progetto riguardano la caratterizzazione dei fenotipi indotti dalla rimozione genica delle GTPasi neuronali Rac1 e
Rac3 in topi knockout (KO), e l’analisi della funzione di complessi
effettori di Rac coinvolti nel Ritardo Mentale durante lo sviluppo
neuronale. Durante il primo anno, il progetto si è sviluppato come
segue: Obiettivo 1 – Analisi dei Meccanismi che causano evidenti
Difetti nel Cervello dei doppi KO (dKO). (a) Abbiamo trovato che né
la proliferazione dei precursori, né la morte o difetti di migrazione
cellulare spiegano la forte perdita di “mossy cells” (MCs) nell’ilo dell’ippocampo di topi dKO (-70%). Stiamo analizzando i possibili effetti sul differenziamento locale delle MCs. (b) Dall’analisi dell’espressione delle Rac in situ e della sinapsinaI-Cre, abbiamo identificato gli interneuroni GABAergici come possibili target del dKO. Infatti, abbiamo trovato un forte difetto di interneuroni GABAergici
positivi per Lhx6 (-50%) in corteccia ed ippocampo dei topi dKO,
dovuto soprattutto alla perdita (-90% nell’ippocampo) degli interneuroni positivi per la parvalbumina (PV). Stiamo valutando l’ipotesi che il difetto origini dalla migrazione aberrante di questi interneuroni dall’eminenza ganglionica mediale, dove essi nascono prima di
migrare verso la corteccia e l’ippocampo. Questo difetto potrebbe
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21-02-2011
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
ABSTRACT N. 149
di regolare il trasporto di Rab11 e GluR1 ai dendriti in cellule di
neuroblastoma SH-SY5Y differenziate.
Mlc1p codifica per una catena leggera essenziale delle miosine che,
interagendo con la MyoV di lievito Myo2p, controlla la citochinesi
(Casavola et al., 2008). Usando criteri strutturali (Amata et al.,
2008. Biochemistry 47:12332-45), abbiamo identificato due proteine con sequenze ortologhe a quella di Mlc1p codificate da cellule
umane. La caratterizzazione genetica e biochimica di una di esse in
lievito ci ha permesso di concludere che la funzione essenziale per
la citocinesi esercitata da Mlc1p è conservata nel C-terminale del
suo ortologo umano. siRNA e tecnologie di microscopia ad alta velocità e analisi delle immagini ad alto contenuto (HT/HCA) sono in atto per stabilire la funzione degli ortologhi umani di Mlc1p in funzione dei processi di trasporto controllati da MyoVa in cellule HeLa e di
neuroblastoma SH-SY5Y differenziate.
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Totale
Num Centri: 2
Totale
Num Centri: 1
(1) Medical Genetics, Department of Molecular Biology, University of Siena,
Viale Bracci 2, 53100 Siena, Italy Phone: 0577 233303; Fax: 0577 233325; email: [email protected]
(2) San Raffaele Scientific Institute, Dibit, 20132 Milano, Italy
GGP08258
99.700
Anno d’inizio: 2009
Meloni Ilaria (1), Broccoli Vania (2), Amenduni Mariangela (1), De
Filippis Roberta (1), Ricciardi Sara (2), Mari Francesca (1), Ariani
Francesca (1), Renieri Alessandra (1)
TONGIORGI ENRICO
Durata (anni): 3
293.100
Durata (anni): 3
SINDROME DI RETT CONGENITA: MODELLI CELLULARI E MURINI PER LO STUDIO DEL RUOLO DI FOXG1 NELLA NEUROGENESI
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Telethon grant N.
GGP09117
Telethon grant N.
ABSTRACT N. 148
Responsabile
RENIERI ALESSANDRA
Responsabile
Mutazioni in FOXG1 causano la variante congenita della sindrome di
Rett (RTT). FOXG1 codifica per un repressore trascrizionale che svolge un ruolo essenziale nello sviluppo della porzione ventrale del telencefalo. Durante lo sviluppo del cervello Foxg1 è implicato nella regolazione dell’arealizzazione corticale e della proliferazione delle cellule progenitrici. La sua espressione persiste però anche nel cervello
adulto suggerendo un possibile ruolo anche nei neuroni postmitotici.
Mutazioni in FOXG1 e in MECP2 (il gene responsabile della RTT classica) causano fenotipi simili; è quindi possibile che le due proteine
interagiscano, o quanto meno partecipino a vie di segnalazione comuni. Lo studio del ruolo di FoxG1 nei neuroni potrebbe quindi aiutare a definire i meccanismi alla base non solo della Rett congenita,
ma dei disordini dello spettro Rett in generale. Per tale motivo abbiamo deciso di studiare la potenziale interazione tra FoxG1 e
MeCP2. Esperimenti di immunoprecipitazione su cellule 293T e neuroni primari non hanno evidenziato una interazione diretta, suggerendo che FoxG1 possa svolgere funzioni specifiche, indipendentemente da MeCP2. E’ comunque possibile che le due proteine partecipino a vie di segnalazione comuni senza interagire direttamente.
Solo pochissimi geni bersaglio di FoxG1 sono stati ad oggi identificati. Per identificare tali geni e verificare se esistano geni comuni al
network di MeCP2, abbiamo deciso di confrontare i profili di espressione genica nel cervello di topi Foxg1 mutanti e di controlli sani. A
tal fine, abbiamo isolato tessuto cerebrale da topi eterozigoti
Foxg1+/- e da controlli al giorno postnatale 20. Da tale tessuto è
stato estratto RNA di qualità e quantità appropriate. Stiamo attualmente raccogliendo il tessuto fetale e mettendo a punto le condizioni sperimentali per l’analisi del profilo di espressione tramite la piattaforma Agilent “Whole Mouse Genome 4x44K”.
E’ stato dimostrato di recente che è possibile riprogrammare fibroblasti umani in iPS (cellule staminali pluripotenti indotte) e differenziare poi queste cellule in neuroni. Questa tecnologia offre l’opportunità unica di ricapitolare in vitro la formazione di un tessuto in
condizioni sia normali che patologiche. Abbiamo quindi deciso di ottenere iPS da fibroblasti di pazienti con mutazioni in FOXG1 e controlli normali e differenziarle in neuroni. Abbiamo già riprogrammato ad iPS i fibroblasti di una prima paziente (mutazione p.W255X); i
cloni sono in fase di caratterizzazione morfologica e molecolare. Abbiamo inoltre raccolto i fibroblasti di una seconda paziente (#968,
mutazione p.S323fsX325); le cellule sono pronte per la riprogrammazione. Abbiamo infine completato la ricerca di mutazioni nella
nostra casistica di pazienti e identificato una ulteriore paziente con
mutazione in FOXG1 (#989; mutazione p.Q46X). Stiamo iniziando
adesso l’analisi di un nuovo gruppo di pazienti, al fine di identificare
ulteriori pazienti mutate da includere nello studio.
Anno d’inizio: 2008
APPROCCI FARMACOLOGICI PER IL RIPRISTINO DEI LIVELLI DI BDNF IN MODELLI CELLULARI ED ANIMALI DELLA SINDROME DI RETT
Vaghi Valentina, Bittolo Tamara, Baj Gabriele, Tongiorgi Enrico
BRAIN Centre for Neuroscience, Dipartimento di Scienze della Vita, Università
di Trieste - via L. Giorgieri 10, 34127 Trieste, tel. 0405583895, fax
0405583133, e-mail: [email protected]
La sindrome di Rett (RTT) è la principale causa di ritardo mentale
nelle bambine. La RTT è causata da mutazioni in un gene situato
sul cromosoma X, denominato MECP2, che in condizioni normali
regola l’espressione di numerosi geni. Recentemente è stato scoperto che il Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) è uno dei
geni regolati da MECP2 e risulta essere espresso a livelli ridotti
rispetto al nomale in modelli animali della RTT. Il BDNF è un fattore neurotrofico molto importante nella sopravvivenza, maturazione e plasticità neuronale durante lo sviluppo. In particolare il
BDNF risulta coinvolto nella specificazione negli aspetti dell’architettura dei neuroni che risultano alterati nella RTT. Due recenti
studi hanno dimostrato che in modelli animali di RTT, è possibile
invertire il decorso della malattia mediante manipolazioni genetiche che inducono l’espressione forzata di alti livelli di BDNF. Dato
che la terapia genica presenta notevoli difficoltà pratiche abbiamo ritenuto opportuno intraprendere un progetto che individui un
approccio farmacologico verso la cura della RTT.
L’idea si basa sul fatto che in modelli animali di RTT sono presenti dei livelli residui dell’mRNA codificante per il BDNF e che sono
noti numerosi farmaci, utilizzati per lo più per la terapia della depressione che aumentano la sintesi del BDNF. In questo progetto
abbiamo analizzato l’espressione residuale dei diversi trascritti
del BDNF in cervelli umani RTT e in due modelli di RTT. Mediante
la PCR quantitativa, abbiamo determinato l’espressione residuale
dei trascritti del BDNF in cervelli umani di soggetti normali e affetti da RTT di età comparabile usando tessuti delle aree di
Broadmann 1-5 che includono le cortecce somatosensoriali e motorie e che risultano essere le più colpite dalla malattia. Inoltre,
abbiamo determinato i livelli dei trascritti del BDNF nella corteccia e nell’ippocampo di topi normali e in topi transgenici con delezione del gene MeCP2 (MeCP2 - tm 1.1 Bird/J) a differenti stadi
post-natali. Infine, per stabilire un modello cellulare della malattia abbiamo silenziato l’espressione di MeCP2 nella linea cellulare
di neuroblastoma umano SHSY-5Y mediante short-hairpin interfering RNA. Con questa linea cellulare abbiamo misurato l’espressione dei trascritti di BDNF e abbiamo condotto un’analisi farmacologica sistematica della traduzione di ciascun trascritto di BDNF
per determinare quali composti possano essere usati per stimolare la sintesi del BDNF.
La stimolazione dei recettori serotoninergici e noradrenergici con
specifici agonisti, che si può ottenere anche mediante trattamento con l’antidepressivo desipramina, è risultata essere la più efficace nell’aumentare la sintesi del BDNF. Prossimamente testeremo farmaci già esistenti sul mercato farmaceutico usando il modello cellulare ed il modello animale della sindrome di Rett. In caso di successo prevediamo un rapido trasferimento alla clinica in
quanto utilizzeremo preferibilmente farmaci già approvati per l’uso nell’uomo.
ABSTRACT N. 150
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 4
PIZZORUSSO TOMMASO
GGP09196
482.200
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2009
RETT E VALIDAZIONE DI TERAPIE IN MODELLI PRECLINICI:
UNO STUDIO GENOMICO, MORFOFUNZIONALE E COMPORTAMENTALE NEI MODELLI ANIMALI E NEL PAZIENTE
Battini Roberta (4), Biagi Laura (4), Calcagno Eleonora (7,8), Cioni
Giovanni (3), De Vivo Luisa (2), Giustetto Maurizio (7,8), Landi Sil-
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033-132 Abstract-11_ITA.qxd:telethon 021-234 Abstract
21-02-2011
15:54
Pagina 92
PROGETTI DI RICERCA TELETHON
via (2), Lonetti Giuseppina (1), Lunardi Giulia (1), Tosetti Michela
(4), Morello Noemi (7,8), Pini Giorgio (5), Putignano Elena (2), Ratto Gian Michele (2), Sala Carlo (6), Zanchi Alice (6), Pizzorusso
Tommaso (1,9)
teine Gli funziona come un inatteso e critico check-point trascrizionale del segnale di Hh (Canettieri et al., Nature Cell Biol. 12:13242, 2010).
Abbiamo anche identificato Nanog come un nuovo gene bersaglio di
Hh nelle CS neurali. Il fattore di trascrizione Nanog conrolla la staminalità cellulare agendo come un determinante cruciale dell’autorinnovamento di CS embrionali e della riprogrammazione verso la
pluripotenza di cellule somatiche adulte, agendo insieme con la perdita dell’oncosoppressore p53. Noi mostriamo che Nanog è sovraepresso nelle CS del cervelletto postnatale ed agisce come un mediatore critico dell’autoreplicazione indotta da Hh. Infatti Gli1 e Gli2 si
legano a specifiche sequenze regolatorie del promotore di Nanog in
CS umane e di topo. La perdita di p53, un evento chiave nel promuovere la staminalità, attiva il segnale di Hh, contribuendo all’attivazione di Nanog. Tuttavia, anche se Hh inibisce p53, non richiede
p53 per regolare Nanog. I nostri dati rivelano un meccanismo per la
funzione di Hh nel controllo della staminalità cellulare che rappresenta una componente cruciale di un circuito integrato che determina le decisioni del destino cellulare coinvolte nel mantenimento delle CS neurali (Po et al., EMBO J. 29:2646-58, 20103).
(1) Ist. Neuroscienze CNR, Pisa - via Moruzzi, 1 56100 Pisa
(2) NEST Scuola Normale Superiore, Pisa
(3) Divisione Neuropsichiatria Infantile, Università di Pisa e IRCCS Stella
(4) Dipartimento di Neuroscienze dell’Età Evolutiva, IRCCS Stella Maris
(5) U.O. Neuropsichiatria Infantile, ASL5 Ospedale Versilia
(6) Ist. Neuroscienze CNR, Milano
(7) Università degli Studi di Torino Dip. Anatomia, Farmacologia e Medicina Legale
(8) National Institute of Neuroscience, Torino
(9) Dip. Psicologia, Università di Firenze
La sindrome di Rett (RS) è un disordine progressive dello sviluppo
privo di trattamento efficace che si manifesta nelle bambine durante il primo sviluppo postnatale. La grande maggioranza delle pazienti RS porta mutazioni del gene MeCP2. La mancanza di opzioni
terapeutiche risulta dalla mancanza di informazioni riguardo ai meccanismi che portano dalla mutazione di MeCP2 all’induzione delle alterazioni cellulari e di sistema che determinano i sintomi della RS. Il
nostro progetto intende affrontare questo problema studiando le alterazioni cellulari e molecolari indotte dalla mutazione di MeCP2 in
modelli animali in coltura ed in vivo utilizzando tecniche ad alta risoluzione di imaging in vivo a due fotoni della dinamica delle spine
dendritiche e dell’attività neuronale. Analizzando gli effetti delle
manipolazioni dei livelli di MeCP2 nelle colture neuronali sulla crescita assonale, e sulla formazione e plasticità dei contatti sinaptici,
intendiamo individuare alterazioni che possano essere implementate in saggi capaci di valutare l’efficacia di trattamenti farmacologici
per la RS. In parallelo agli studi in vitro ed in vivo sugli animali, utilizzeremo tecniche di imaging non invasivo di avanguardia per effettuare un analisi delle pazienti RS in differenti fasi della malattia
con lo scopo di trovare biomarkers della patologia. Durante il primo
anno di studi abbiamo sviluppato strumenti importanti per la valutazione degli effetti della mutazione di MeCP2 su singole popolazioni
neuronali e per l’imaging nei pazienti. Inoltre, abbiamo scoperto alterazioni molecolari e morfologiche tipo cellulare specifiche nella
corteccia dei mutanti MeCP2.
ABSTRACT N. 152
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 2
Totale
Num Centri: 1
L1-CAM, una proteina di adesione espressa dai neuroni, è critica sia
durante lo sviluppo che nel cervello maturo, svolgendo ruoli chiave
nella migrazione cellulare, crescita, guida e fascicolazione degli assoni, mielinizzazione e plasticità sinaptica. Più di 100 mutazioni del
gene di L1-CAM sono responsabili di una patologia eterogenea indicata dall’acronimo, CRASH (ipoplasia del corpo calloso, ritardo mentale, afasia, paraplegia spastica e idrocefalo), assai variabile in gravità anche per la diversa penetranza delle mutazioni. La comprensione della patologia richiede quindi una conoscenza profonda delle
forme nativa e mutate della proteina in termini di espressione, trasporto intracellulare, distribuzione e funzionalità. Oltre 10 anni or
sono Kallunki et al. dimostrarono che L1-CAM è espressa sotto il
controllo di REST/NRSF, il repressore che governa il fenotipo neuronale. Per ristudiare il problema abbiamo usato cloni del modello
neuronale PC12, caratterizzati sia da bassi che da alti livelli di REST, rispettivamente. Insieme alla conferma della repressione sulla
espressione di L1-CAM abbiamo trovato che alto REST induce lo
splicing degli esoni 2 e 27 di L1-CAM. Al momento stiamo studiando
la funzione delle due forme in termini di adesione, motilità e crescita dendritica, nonché il meccanismo del nuovo effetto di REST.
Contemporaneamente le PC12 a REST basso ed alto sono state trasfettate con varie forme di L1-CAM, nativa e mutate nel territorio
extracellulare: H210Q, I219T, C264Y, E309K and P491L (dono di U.
Cavallaro). Abbiamo inoltre iniziato lo studio della distribuzione e
degli effetti funzionali di questi mutanti. Successivamente abbiamo
in programma di estendere il lavoro a neuroni ippocampali in cultura. Gli stessi neuroni, ottenuti però da topi KO per L1-CAM (dono di
M. Schachner), sono stati trasfettati dopo 12 giorni in vitro con forme nativa e mutate (H210Q; I219T; E309K) di L1-CAM.
L’immunocitochimica ha rivelato che dopo 3 giorni dalla trasfezione
la forma nativa mostrava livelli e distribuzione (soprattutto nei dendriti distali) analoghi a quella dei neuroni wt. Tre giorni nono stati
quindi scelti per la caratterizzazione per patch clamping, nei neuroni
KO, delle forme mutate e nativa di L1-CAM. L’eccitabilità di membrana e la trasmissione sinapticasono state studiate tanto in neuroni eccitatori che inibitori. Una diminuzione significativa della frequenza di
firing massimale in risposta a correnti depolarizzanti, presente negli
interneuroni inibitori KO, fu eliminata dalla trasfezione della L1-CAM
GGP07118
237.600
Anno d’inizio: 2009
(1) Scientific Institute San Raffaele, Milan, Italy. - via Olgettina 58, 20132, Milan. Tel 02 26432770; email [email protected]
(2) Department of Neuroscience and Brain Technologies, Italian Institute of Technology, Via Morego 30, 16163 Genova, Italy
(3) Department of Experimental Medicine, Section of Physiology, University of
Genoa, Viale Benedetto XV, 3, 16132 Genova, Italy
GULINO ALBERTO
Durata (anni): 3
442.300
Durata (anni): 3
Mikulak Joanna (1), Tagliavacca Luigina (1), Racchetti Gabriella (1),
Valente Pierluigi (2), Medrihan Lucian (2,3), Lipiello Pellegrino (3),
Baldelli Pietro (2,3), Meldolesi Jacopo (1)
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Telethon grant N.
GGP09066
LA MALATTIA L1-CAM (SINDROME CRASH): ESPRESSIONE DI
L1-CAM E SUO RUOLO A LIVELLO SINAPTICO; FARMACOLOGIA DELLA SUA VIA DI SEGNALAZIONE INTRACELLULARE
ABSTRACT N. 151
Responsabile
MELDOLESI JACOPO
Anno d’inizio: 2007
REGOLAZIONE DELLA VIA DI SEGNALAZIONE DI HEDGEHOG
NELLO SVILUPPO DELLE CELLULE NERVOSE E NELLE CELLULE
STAMINALI
Po Agnese (1), Canettieri Gianluca (1), Ferretti Elisabetta (2), Di
Marcotullio Lucia (1), De Smaele Enrico (2), Gulino Alberto (1)
(1) Department of Molecular Medicine, Sapienza University of Rome, viale Regina Elena 324, 00161 Rome; [email protected]
(2) Department of Experimental Medicine, Sapienza University of Rome
La comprensione dei segnali che controllano il comportamento delle
cellule staminali (CS) nello sviluppo e rigenerazione del tessuto
neurale è necessaria per finalità patogenetiche e terapeutiche. La
via di segnalazione di Hedgehog (Hh) svolge un ruolo critico nello
sviluppo neurale e nel controllo delle CS. Tuttavia i geni bersaglio di
Hh nelle CS sono poco conosciuti. Analogamente, la regolazione dei
fattori di trascrizione Gli1 e Gli2, effettori di Hh, è largamente sconosciuta. Noi abbiamo dimostrato che Gli1 e Gli2 sono proteine acetilate e che la loro deacetilazione mediata da HDAC1 ne promuove
l’attività trascrizionale e sostiene un circuito positivo attraverso il
quale Hh aumenta i livelli di HDAC1. Questo meccanismo è interrotto dalla degradazione di HDAC1 da parte di un complesso E3 ubiquitin-ligasico composto da Cul3 e REN, un gene precedentemente
identificato come antagonista di Hh (Di Marcotullio et al., Proc Natl.
Acad. Sci. USA 101:10833-38, 2004). Mentre un’alta e bassa
espressione di HDAC1 e REN, rispettivamente, nei progenitori neurali correla con un attivo segnale di Hh, la perdita di HDAC1 inibisce
la crescita dei progenitori neurali che dipende da Hh. In accordo
con questi dati, l’abrogazione della acetilazione di Gli1 stimola la
proliferazione cellulare. Questi dati identificano un circuito integrato
mediato da HDAC e ubiquitinazione, in cui l’acetilazione delle pro-
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
nativa. Quest’effetto inatteso di L1-CAM suggerisce un nuovo ruolo
della proteina, che appare coinvolta nella maturazione funzionale
dell’eccitabilità di membrane nei neuroni inibitori in sviluppo.
Goitre Luca, Balzac Fiorella, Degani Simona, Braggion Stefano, Cutano Valentina, Martino Chiara, Retta Saverio Francesco
Centro per le Biotecnologie Molecolari - Dipartimento di Genetica, Biologia e
Biochimica - Università di Torino - Via Nizza 52 - 10126 Torino
ABSTRACT N. 153
KRIT1 è un gene associato alla patogenesi delle Malformazioni Cavernose Cerebrali (CCM), una malattia cerebrovascolare umana caratterizzata da capillari dilatati e fragili che predispongono a epilessia, deficit neurologici ed emorragie intracerebrali.
Analisi genetiche hanno suggerito che le funzioni di KRIT1 devono
essere alterate significativamente affinché si possa sviluppare la malattia. Tuttavia le funzioni molecolari e cellulari di KRIT1 e i meccanismi patogenetici delle CCM non sono ancora chiari.
Combinando tecnologie di knockout e knockdown genico con analisi
biochimiche, molecolari e cellulari abbiamo scoperto che KRIT1 gioca
un ruolo importante nei meccanismi molecolari coinvolti nel mantenimento dell’omeostasi intracellulare delle Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS) e nella prevenzione dei danni ossidativi cellulari.
In particolare, la perdita di KRIT1 è associata a un aumento significativo dei livelli intracellulari di ROS e alla conseguente aumentata
suscettibilità delle cellule a danni ossidativi. D’altra parte, il ripristino
dell’espressione di KRIT1 in cellule KRIT1-/- determina una drastica
riduzione dei livelli di ROS. La modulazione dei livelli intracellulari di
ROS dipendente dalla perdita/riespressione di KRIT1 correla strettamente con la modulazione dell’espressione dell’enzima antiossidante
SOD2 e del fattore trascrizionale FoxO1, un regolatore cruciale delle
difese cellulari contro lo stress ossidativo.
Inoltre, il mantenimento di bassi livelli intracellulari di ROS dipendente da KRIT1 facilita la riduzione dell’espressione della ciclina D1
necessaria per la transizione delle cellule dallo stato proliferativo a
quello quiescente, suggerendo che KRIT1 gioca un ruolo nel mantenimento della quiescenza cellulare attraverso la regolazione dei livelli
intracellulari di ROS. Consistentemente, l’aumento dell’espressione
della ciclina D1 e la ridotta capacità delle cellule di uscire dal ciclo
proliferativo causate dalla perdita di funzione di KRIT1 possono essere revertite mediante trattamento delle cellule con composti antiossidanti.
Considerati assieme, i risultati ottenuti suggeriscono che KRIT1 limita l’accumulo di ossidanti intracellulari, e i conseguenti danni ossidativi molecolari e disfunzioni cellulari, attraverso la regolazione di
FoxO1 e SOD2.
Oltre a contribuire significativamente alla caratterizzazione delle
funzioni molecolari e cellulari di KRIT1, i nostri studi suggeriscono
che la patogenesi delle CCM possa derivare da un’alterazione dei
meccanismi di difesa da eventi locali di stress ossidativo in distretti
sensibili della microvascolatura cerebrale, aprendo così la via a nuove ricerche mirate all’analisi dei livelli di proteine antiossidanti e di
biomarkers di danno ossidativo in campioni istopatologici e nel sangue di pazienti CCM, e all’uso di topi eterozigoti KRIT1+/- come
modelli animali per l’analisi del ruolo dello stress ossidativo nella
patogenesi delle CCM e la formulazione di nuove strategie terapeutiche.
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
SERINI GUIDO
Responsabile
GGP09175
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
295.800
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2009
CARATTERIZZAZIONE DEI MECCANISMI CELLULARI ATTRAVERSO I QUALI LA NEUROPILINA CONTROLLA LA FUNZIONE
DELLE INTEGRINE: IMPLICAZIONI PER LO SVILUPPO VASCOLARE
Sandri Chiara, Caccavari Francesca, Valdembri Donatella, Serini
Guido
Laboratory of Cell Adhesion Dynamics, Department of Oncological Sciences,
IRCC, Institute for Cancer Research and Treatment, University of Turin, School
of Medicine, - Strada Provinciale 142 Km 3.95 - 10060, Candiolo (TO), Tel. 0119933508; Fax 011-9933524; E-mail: [email protected]
Nei vertebrati lo sviluppo embrionale dell’albero vascolare è contrallato dall’angiogenesi, in cui le cellule endoteliali (EC) modificano le
interazioni con la matrice extracellulare (ECM) in risposta a fattori
guida (Serini G et al. 2004. Physiology 19:348-354; Serini G et al.
2003. Nature 424:391-397). Le integrine sono recettori per la ECM
regolati conformazionalmente. Abbiamo dimostrato come durante
l’angiogenesi embrionale circuiti autocrini repulsivi di semaforine di
classe 3 (SEMA3) forniscano al sistema vascolare la plasticità necessaria per il suo rimodellamento inibendo le integrine (Serini G.
2003). Le neuropiline (Nrp) e le plexine A/D sono rispettivamente la
subunità legante e trasducente dei recettori delle SEMA3. Le SEMA3, Nrp1, le plexine e le vie traduttive attraverso cui controllano
le integrine costituiscono dunque una nuova classe di geni candidati
per le malattie umane congenite cardiache.
Abbiamo scoperto come Nrp-1, indipendentemente da SEMA3 e
VEGF-A 165, regoli il traffico e la funzione dell’integrina alfa5beta1
in conformazione attiva (Valdembri D et al. PLoS Biology 2009,
7:e1000025), che è essenziale per lo sviluppo vascolare. Più recentemente, abbiamo studiato la piccola GTPasi R-Ras, che è preferenzialmente espressa dalle EC, stimola l’adesione all’ECM ed è un bersaglio della trasduzione a valle di VEGF-A e SEMA3 (Serini G,
2004). Infatti, il dominio citoplasmatico delle plexine ha un’attività
R-Ras GTPase-activating protein che inattiva R-Ras ed è necessaria
per l’inibizione delle integrine da parte di SEMA3A (Serini G, 2004;
Serini G, 2003). Tuttavia, i meccanismi attraverso cui R-Ras regola
l’adesione delle EC non sono noti. Abbiamo identificato RIN2, una
proteina legante Rab5, come un nuovo interattore di R-Ras. RIN2 e
R-Ras colocalizzavano nei siti adesivi nascenti e negli endosomi
precoci Rab5+. Abbiamo osservato come RIN2, attraverso i domini
leganti Rab5 e Ras, sia richiesta per la stimolazione dell’adesione
all’ECM da parte di R-Ras. RIN2 ed R-Ras erano anche necessari per
l’induzione di adesione da parte di Rab5. Inoltre, costrutti di delezione di RIN2, privi del dominio legante Rab5 o Ras, avevano un effetto dominante negativo sull’adesione cellulare ed impedivano la
colocalizzazione di R-Ras e Rab5 sugli endosomi precoci. Estendendo osservazioni precedenti secondo cui Rac è attivato a seguito di
endocitosi Rab5-dipendente, abbiamo rivelato come nelle EC RIN2,
R-Ras, Rab5 e Rac colocalizzino sugli endosomi precoci e come
RIN2 sia richiesto per l’attivazione di Rac basale e stimolata da RRas. Abbiamo poi osservato come sia il dominio legante Rab5 che
quello legante Ras di RIN2 siano richiesti per l’attivazione di Rac. RRas promuove dunque l’adesione all’ECM attraverso una via di segnalazione che, via RIN2 e Rab5, stimola l’attivazione di Rac.
ABSTRACT N. 155
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 1
Durante l’embriogenesi, la mancata fusione del tubo neurale comporta l’insorgenza dei difetti del tubo neurale (DTN) che, nell’uomo,
rappresentano le più frequenti malformazioni congenite del Sistema
Nervoso Centrale (1-2/1000 nati vivi). L’eziologia è multifattoriale
con l’interazione sia di fattori ambientali che genetici (Bassuk and
Kibar, 2009). La via di segnale della Polarità Cellulare Planare
(PCP), detta via Wnt non-canonica (Veeman et al, 2003), svolge un
ruolo nel coordinare la forma, il movimento e la polarizzazione cellulare nell’ambito del piano di un epitelio ed è stata ben studiata
GGP06222
241.000
Anno d’inizio: 2008
(1) U.O. Neurochirurgia, Istituto G. Gaslini, Genova - L.go G. Gaslini 5, 16148
Genova, tel:+390105636712, fax:+390103993159, email: [email protected]
(2) Department of Obstetrics and Gynecology, CHU Saint-Justine Research
Center, Montreal, Canada
RETTA SAVERIO FRANCESCO
Durata (anni): 3
267.000
Durata (anni): 3
Merello Elisa (1), De Marco Patrizia (1), Kibar Zoha (2), Cama Armando (1), Piatelli GianLuca (1), Capra Valeria (1)
Progetti di Ricerca Telethon - Neurological Diseases
Telethon grant N.
GGP08051
I GENI FRIZZLED-3 E FRIZZLED-6 NELLA PATOGENESI DEI
DIFETTI DEL TUBO NEURALE (DTN) NELL’UOMO
ABSTRACT N. 154
Responsabile
CAPRA VALERIA
Anno d’inizio: 2006
CARATTERIZZAZIONE DELLE FUNZIONI CELLULARI DI
KRIT1, UN GENE ASSOCIATO ALLA PATOGENESI DELLE
MALFORMAZIONI CAVERNOSE CEREBRALI
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
nella Drosophila in cui sono stati identificati un gruppo di geni principali che comprendono: Fz, Dsh, Stbm/Vang, Fmi, Pk and Dgo (Simons and Mlodzik 2008; Vladar 2009). La recente scoperta di otto
nuove mutazioni in VANGL1 e sette in VANGL2 associate a DTN nell’uomo (Kibar et al, 2007; 2009; 2010) è la prova dell’efficacia d’uso dei modelli murini per l’identificazione di geni candidati (Kibar et
al, 2001) ed è di esempio per proseguire l’analisi di altri geni PCP in
pazienti affetti da DTN. A questo proposito, i geni Frizzled (Fz) codificano per recettori transmembrana multipasso (7 domini TM) per le
proteine Wnt e sono coinvolti nell’embriogenesi del sistema nervoso
(Wang et al, 1996; 2002). Embrioni di topo doppi mutanti Fz3-//Fz6-/- hanno craniorachischisi (tubo neurale totalmente aperto)
(Wang et al, 2006). Per verificare l’esistenza di un’associazione tra i
geni FZD e i DTN nell’uomo, abbiamo sequenziato i geni FZD3 e
FZD6 in 554 pazienti. Abbiamo identificato tre mutazioni missenso
in FZD3 (T4S, L199M, I545V) e otto mutazioni missenso (H140Y,
A388D, R405Q, R511C, R511H, G604R, S620T, A664E) oltre ad una
nonsenso de novo (C615X) in FZD6. Mentre le varianti di FZD3 erano individuate esclusivamente in DTN aperti, le mutazioni di FZD6
erano osservate con la stessa proporzione (50%) sia nelle forme
aperte che in quelle chiuse. Tranne per tre varianti di FZD6 (H140Y,
G604R, A664E), identificate con bassa frequenza in popolazioni
non-Europee, le altre varianti erano paziente-specifiche dal momento che non sono state riportate dalle banche dati di polimorfismi. Tutte le varianti erano in eterozigosi ed esclusive di ogni singolo paziente, anche se R405Q e A664E erano presenti ciascuna in
due individui non imparentati. Quattro mutazioni in FZD6, H140Y,
A388D, R511C/H e una, L199M, in FZD3 coinvolgono aminoacidi altamente conservati durante l’evoluzione e tramite analisi in silico
(PolyPhen, Panther) alterano la funzionalità proteica. In particolare,
la sostituzione A388D giace nel quinto dominio TM di FZD6 in cui la
Ala 388 è parte del motivo “LLAG”, assolutamente conservato nell’evoluzione. Da notare, infine, che la mutazione C615X codifica per
una proteina FZD6 tronca, mancante degli ultimi 51 aminoacidi nella porzione C-terminale, ed era portata da un paziente affetto da
una grave forma chiusa di DTN, con meningocele toracico anteriore,
idromielia, lipoma intradurale, scoliosi e anomalie costali e vertebrali multiple. Dai risultati ottenuti emerge un coinvolgimento dei
geni FZD3/6 nella patogenesi dei DTN e tale studio supporta ulteriormente il ruolo dei geni appartenenti alla PCP nell’insorgenza di
queste complesse malformazioni.
le cellule post-mitotiche e la loro propensione a stimolare il processo di ricombinazione omologa nelle cellule che infettano. Abbiamo
recentemente osservato che, nelle cellule non permissive, il DNA di
AAV, a causa della sua struttura a singolo filamento, viene riconosciuto dalle proteine cellulari che riconoscono il DNA danneggiato,
in particolare dai membri del complesso MRN e dalle proteine associate a questo. Il risultato finale di questa interazione e’ l’inibizione
della trasduzione. L’assenza di queste proteine nei neuroni, nei cardiomiociti ed in altre cellule post-mitotiche spiega lo squisito tropismo di AAV verso questi tipi cellulari in vivo. In particolare, nel cuore post-natale, i livelli di queste proteine diminuiscono rapidamente
dopo la nascita, concomitantemente con la fuoriuscita permanente
dei cardiomiociti dal ciclo cellulare.
Più recentemente, abbiamo affrontato il problema di comprendere
quali siano i fattori cellulari che determinano il tropismo di AAV mediante un approccio di high-throughput screening utilizzando una library di siRNA contro tutto il genoma umano. I risultati di questo
studio hanno permesso l’identificazione di più di 900 proteine cellulari che inibiscono AAV e di 400 che, al contrario, sono indispensabili
per la sua replicazione. Il knock down di molte delle proteine inibenti
di fatto induce danno al DNA cellulare e induce un checkpoint, un’osservazione nuovamente in linea con l’esistenza di un interplay tra
AAV e la risposta cellulare al danno. Inoltre, l’interazione del genoma di AAV con le proteine della ricombinazione omologa spiega l’alta
efficienza di gene targeting che si osserva utilizzando vettori AAV recanti sequenze di DNA identiche a quelle del genoma cellulare.
ABSTRACT N. 157
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
GIACCA MAURO
Totale
223.000
Num Centri: 1
Anno d’inizio: 2009
(1) Laboratorio di Terapia Genica e Molecolare, Istituto di Fisiologia Clinica CNR
- Area della Ricerca CNR, via Moruzzi 1, 56125 Pisa
(2) Scuola Normale Superiore, Pisa
Il metodo ideale per la terapia genica è sostituire il gene mutato
con una copia funzionale. I vettori virali più promettenti per la terapia genica sono quelli basati sul Virus Adeno-Associato (AAV), un
virus non patogeno a DNA a singolo filamento (ssDNA). A tutt’oggi,
l’applicazione più importante di vettori AAV in trial clinici di terapia
genica riguarda la fibrosi cistica. Crediamo che una conoscenza più
profonda della biologia di AAV possa dare un grande contributo per
l’applicazione terapeutica dei vettori AAV. I due motivi principali che
limitano l’uso di vettori AAV per studi di terapia genica sono:
l‘eccessiva variabilità dell‘efficienza di trasduzione che può dipendere dal tipo delle cellule e la mancanza di metodi sicuri ed efficienti
di purificazione e di produzione di vettori AAV. I metodi più usati
per produrre i vettori di AAV sono molto complicati e molto costosi.
Di conseguenza, trovare un sistema eucariotico più semplice in cui
AAV si replica e si incapsida, offre non solo un’occasione eccellente
per approfondire la biologia di AAV, ma può anche essere molto importante per mettere a punto metodi alternativi per la produzione di
vettori AAV. Recentemente, è stato dimostrato che il lievito Saccharomyces cerevisiae può essere uno strumento genetico molto utile
per la ricerca virologica. Inoltre, è stato dimostrato che i vettori
AAV non integrano nel sito AAVS1 situato nel cromosoma 19 come
il tipo selvaggio di AAV fa, ma in maniera random nel genoma. Di
conseguenza, se vogliamo usare i vettori di AAV in terapia genica,
c’è un rischio di mutagenesi inserzionale che può determinare attivazione di oncogeni con implicazioni cliniche importanti. Poiché i
meccanismi molecolari responsabili dell’ integrazione di vettori AAV
non sono noti, noi esploreremmo la possibilità per studiare questo
processo in lievito. Nel complesso questi risultati avranno un grande impatto per capire le potenzialità terapeutiche di AAV. Durante il
primo anno, abbiamo ottenuto risultati interessanti sulla produzione
del genoma a ssDNA di AAV, sull’effetto delle sequenze “inverted
terminal repeats” (ITRs) nell’integrazione del DNA di AAV e sull’assemblaggio del capside di AAV in lievito. Abbiamo dimostrato che il
lievito può produrre il ssDNA di AAV da un plasmide soltanto quando la proteina virale Rep68 è espressa attraverso un meccanismo
che somiglia al “plasmid rescue” del genoma di AAV che avviene in
cellule di mammifero. Inoltre, abbiamo scoperto che in lievito la
GGP07176
Durata (anni): 3
181.500
Durata (anni): 3
Backovic Ana (2), Cervelli Tiziana (1), Galli Alvaro (1)
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Telethon grant N.
GGP09166
IL LIEVITO SACCHAROMYCES CEREVISIAE COME AMBIENTE
CELLULARE PER STUDIARE LA REPLICAZIONE, L’INTEGRAZIONE E L’INCAPSIDAZIONE DEL VIRUS ADENO-ASSOCIATO
ABSTRACT N. 156
Responsabile
GALLI ALVARO
Anno d’inizio: 2007
MODIFICAZIONE GENICA MIRATA TRAMITE VETTORI AAV:
DETERMINANTI MOLECOLARI CHE REGOLANO LA TRASDUZIONE DEI VETTORI AAV, L’INTEGRAZIONE SITO-SPECIFICA
E LA CORREZIONE DEL GENE INDOTTA DAL VETTORE
Zentilin Lorena, Mano Miguel, Lovric Jasmina, Ippodrino Rudy, Dapas Marina, Zotti Michela, Giacca Mauro
Molecular Medicine Laboratory, International Centre for Genetic Engineering
and Biotechnology - ICGEB, Padriciano 99 34149 Trieste
I vettori virali basati sul virus adeno-associato (AAV) hanno progressivamente acquisito molta popolarità nella comunità scientifica
che si occupa di terapia genica, grazie ad una serie di proprietà che
essi presentano. Tra queste, la capacità di trasdurre ad alta efficienza tessuti non replicanti quali il cervello, il cuore, la retina ed il
muscolo scheletrico, di esprimere i propri transgeni per periodi di
tempo molto prolungati in assenza di infiammazione, e di poter essere prodotti in laboratorio a titoli molto elevati. Queste caratteristiche hanno consentito il loro utilizzo in più di una sessantina di sperimentazioni cliniche di terapia genica per diverse malattie ereditarie monogeniche e quali strumenti terapeutici per alcune malattie
multifattoriali ad alta prevalenza, quali il morbo di Parkinson e lo
scompenso cardiaco. Negli ultimi anni, abbiamo sviluppato all’ICGEB di Trieste una facility per la produzione di vettori AAV per la
sperimentazione preclinica. Questa facility ha finora generato diverse centinaia di vettori in grado di trasdurre cDNA, shRNA e microRNA, che sono stati utilizzati in una estesa serie di applicazioni in
modelli di piccolo e grande animale.
Nonostante il loro utilizzo clinico e preclinico, e’ ancora molto lacunosa la biologia molecolare di questi vettori, con particolare riferimento alle interazioni che determinano il loro specifico tropismo per
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
presenza delle ITRs diminuisce l’integrazione “random” favorendo la
integrazione omologa del gene. Inoltre, abbiamo costruito molti
vettori per esprimere le proteine del capside (VP1, VP2 e VP3). In
particolare, la più alta produzione di proteina VP3 è ottenuta quando l’espressione è modulata dal promotore naturale di AAV p40. La
sintesi della proteina meno abbondante VP1 è stata indotta dal promotore del lievito Gal1. Il livello di produzione di proteine del capside è stato ottimizzato variando il tempo di induzione come pure la
quantità di induzione dell’agente (galattosio) nel mezzo della crescita. Il rapporto ottimale è un presupposto fondamentale per la formazione dei capside e una incapsidazione ulteriore del genoma. I
risultati preliminari indicano che il lievito può formare i capsidi di
AAV che contengono le tre proteine nel loro rapporto ottimale.
E-caderina, suggerendo che il trattamento delle aree palmo plantari
con proteine ricombinanti selezionate o strategie di terapia genica
potrebbero controllare la progressione cutanea della malattia.
ABSTRACT N. 159
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Totale
Num Centri: 3
Totale
Num Centri: 2
GGP06252
274.930
Anno d’inizio: 2008
Fleischhauer Katharina (1), Andreani Marco (2), Carcassi Carlo (3)
CAMERINO GIOVANNA
Durata (anni): 3
291.700
Durata (anni): 2
NUOVI PARAMETRI IMMUNOGENETICI PER MIGLIORARE LA
CURA DELLE MALATTIE GENETICHE MEDIANTE IL TRAPIANTO ALLOGENICO DI CELLULE STAMINALI EMATOPOIETICHE
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Telethon grant N.
GGP08201
Telethon grant N.
ABSTRACT N. 158
Responsabile
FLEISCHHAUER KATHARINA
Responsabile
(1) Fondazione San Raffaele del Monte Tabor, via Olgettina 58, 20132 Milano
(2) Fondazione IME (Istituto Mediterraneo di Ematologia) - Roma
(3) Policlinico Universitario, Dipartimento di Scienze Mediche, Internistiche
“Mario Aresu” - Cagliari
Anno d’inizio: 2006
CARATTERIZZAZIONE DELLA PROTEINA R-SPONDINA1,
COINVOLTA NELLA DETERMINAZIONE DEL SESSO E NELLA
DIFFERENZIAZIONE E CARCINOGENESI DELLA PELLE
Il trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche (TCSE) è
l’unica opzione terapeutica definitiva per numerose malattie genetiche del sistema ematopoietico per le quali ad oggi non è ancora disponibile la terapia genica (La Nasa G et al. Ann N Y Acad Sci 1054,
186-195, 2005). Le principali cause di fallimento del trapianto sono
il rigetto e la malattia del trapianto contro l’ospite (“graft versus host disease; GvHD”) (Welniak LA et al. Annu Rev Immunol 25, 139170, 2007). In questo contesto, il polimorfismo dei geni correlati alla risposta immunitaria (RI) è un fattore fondamentale per lo sviluppo di complicanze immunologiche (Petersdorf EW. Curr Opin Immunol 18, 559-564, 2006). I dati emergenti suggeriscono che ogni
persona possiede un preciso “profilo immunologico”, costituito dalle
variazioni genetiche inter-individuali, che ne determina l’entità e la
specificità della RI agli antigeni.
L’obiettivo finale di questo progetto è quello di migliorare la cura
delle malattie genetiche attraverso la messa a punto di un “Pannello di geni RI-correlati”, coinvolti nella determinazione del rischio immunologico legato al TCSE per la b-talassemia. I 3 partners di questo progetto multicentrico sono Centri di eccellenza per il TCSE da
donatore familiare o non-consanguineo per questa malattia, e forniscono una casistica di 147 trapianti familiari e 53 non-consanguinei
per un’analisi retrospettiva.
Nel primo anno del progetto i seguenti obbiettivi sono stati raggiunti: 1) Lo sviluppo di un database clinico che include tutti i principali
dati dei pazienti trapiantati. 2) L’analisi di 6 polimorfismi nella regione 3’untranslated (UTR) del gene HLA-G, una molecola con proprietà immuno-modulanti: 14 bp insertion/deletion (ins/del), +3003
T/C, + 3010 C/G, +3027 A/C, +3035 T/C, +3142 C/G. Questi loci
sono risultati essere in forte linkage disequilibrium fra di loro, distribuiti in 7 aplotipi differenti. L’analisi statistica condotta fra questi
aplotipi e gli endpoint clinici quali rigetto, sopravvivenza libera da
talassemia, GvHD acuta, ha dimostrato un trend soltanto per la
GvHD, con un effetto protettivo dell’aplotipo più frequente UTR-2
(+14bp ins, +3003 T, + 3010 C, +3027 C, +3035 C, +3142 G;
p=0.19) e del genotipo 14pb ins/ins (p=0.06). 3) L’analisi di 11 antigeni minori d’istocompatibilità (mHag), che ha dimostrato un’associazione significativa fra la presenza di un’incompatibilità mHag e
il rigetto del trapianto (p=0.03). 4) L’analisi dei polimorfismi delle
citochine (TNF-a, IL-6, IFN-g, IL-10 e TGF-b), che ha dimostrato
un’associazione significativa fra il genotipo IL-10 -1082 G/G e il rigetto del trapianto (p=0.046).
Nel secondo anno l’analisi molecolare verrà estesa ai “Killer immunoglobulin-like receptors” (KIR) ed ai loro ligandi HLA-BW4, C1 e
C2, nonché ai “Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) presenti
nel genoma. Questo ci permetterà di approfondire ed ampliare il
“Pannello di geni RI-correlati”.
Guerra Liliana (1), Panacchia Laura (1), Bondanza Sergio (1), Maurelli
Riccardo (1), Dellambra Elena (1), Paterna Patrizia (1), Radi Orietta
(2), Parma Pietro (2), Valentini Stella (2), Camerino Giovanna (2)
(1) Lab di Ingegneria dei Tessuti e Fisiopatologia Cutanea, Istituto Dermopatico dell’Immacolata - IRCCS - Via dei Monti di Creta 104, 00167 Roma, Italy
(2) Dipartimento di Patologia Umana ed Ereditaria, Sez. Biologia Generale e
Genetica Medica, Università di Pavia, Pavia
Mutazioni di RSPO1 causano nell’uomo inversione del sesso XX, ipercheratosi palmo plantare e predisposizione al carcinoma squamo cellulare della pelle (Parma P et al. Nat Genet. 2006; 38:1304-9).
In collaborazione con il gruppo di M.C. Chaboissier (Nice) abbiamo
dimostrato che i topi XX Rspo1-/- mostrano inversione del sesso. Le
R-spondine e i geni Wnt codificano per proteine secrete che attivano il pathway canonico della b-catenina. Abbiamo proposto un modello di determinazione del sesso basato sui livelli relativi di Sox9 e
b-catenina e dimostrato che 1) la funzione trascrizionale della b-catenina è attivata specificamente nella gonade femminile, 2) Rspo1 è
essenziale per l’attivazione ovarica della b-catenina e Wnt4 contribuisce solo parzialmente a questo pathway e 3) l’espressione ectopica di Sox9 nella gonade XX previene l’attivazione della b-catenina
(Chassot AA et al. Hum. Mol. Genet. 17(9):1264-77, 2008).
Abbiamo valutato se mutazioni meno severe di quelle descritte nei
primi pazienti potessero interferire con la determinazione del sesso
o con la differenziazione della pelle e causare fenotipi parziali. L’analisi mutazionale e di delezione mediante aCGH del gene RSPO1 in
pazienti con inversione del sesso XX (maschi XX e pazienti XX con
genitali ambigui) suggerisce che le mutazioni di RSPO1 non rappresentino una causa prevalente di inversione del sesso XX non sindromica. Abbiamo anche dimostrato che le duplicazioni del gene (valutate mediante Q-PCR e aCGH) non sono una causa frequente di inversione del sesso XY.
Abbiamo realizzato un modello in vitro del fenotipo dermatologico
allestendo colture cellulari di cheratinociti e fibroblasti dalla pelle
affetta e normale di un paziente e di controlli sani. I cheratinociti
della pelle lesa del paziente non sono in grado di differenziare e
mostrano un fenotipo caratterizzato da alterazioni morfologiche
delle cellule epiteliali, dissociazione tra cellule e invasione del substrato di collagene. Il profilo trascrizionale e l’analisi di western
blot dei cheratinociti plantari coltivati indicano che i processi di
differenziazione e adesione sono alterati nel paziente. I fibroblasti
plantari del paziente e del controllo non mostrano differenze in
coltura durante i primi passaggi in vitro, ma il potenziale proliferativo dei fibroblasti del paziente appare significativamente aumentato rispetto al controllo.
Gli esperimenti in vitro di 1) co-culture di cheratinociti e fibroblasti,
normali ed affetti e 2) il trattamento con diverse dosi di proteina
RSPO1 ricombinante, finalizzati a “curare” il fenotipo dei cheratinociti del paziente, suggeriscono che RSPO1 non sia in grado di ristabilire la capacità di differenziazione di queste cellule. Dato che studi
di espressione nel topo indicano che Rspo1 è espressa durante lo
sviluppo embrionale, è possibile che il fenotipo nei pazienti mutati
sia causato dall’assenza della proteina durante la differenziazione
della pelle. D’altra parte, il trattamento con dosi più alte di RSPO1
ricombinante producono un effetto sull’espressione di b-catenina e
ABSTRACT N. 160
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 5
MURO ANDRES FERNANDO
GGP10051
435.900
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2010
ELABORAZIONE DI NUOVI APPROCCI DIAGNOSTICI E TERAPEUTICI ALLA SINDROME DI CRIGLER NAJJAR DI TIPO I
95
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21-02-2011
15:54
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
Bortolussi Giulia (1), Zentilin Lorena (1), Baj Gabriele (2), Giraudi
Pablo (3), Dapas Marina (1), Bellarosa Cristina (3), Giacca Mauro
(1), Tiribelli Claudio (3), Muro Andres (1)
nee di epatoma. In contrasto con il ruolo proposto in vivo, l’ overespressione di TfR2 non attiva il promotore di HAMP. Al contrario
TfR2 riduce l’ attivazione di HAMP mediata da HJV. In analogia con
il processo descritto per TfR1, TfR2 rilascia una forma solubile (sTfR2) nel mezzo di cultura delle cellule trasfettate. Il sito di clivaggio
di TfR2 e la/e proteasi responsabili non sono noti. Il clivaggio è
bloccato dalla pepstatina A e dall’ inibitore della furina CMK. Il rilascio di TfR2 è inibito da olo-Tf in modo dose-dipendente, suggerendo che il legame recettore-ligando interferisca con il clivaggio proteolitico probabilmente attraverso una modifica del folding della
proteina, come descritto per TFR1. sTfR2 è rilasciato dalla superficie
cellulare: il blocco dell’ endocitosi da parte di una forma mutata di
dinamina aumenta il rilascio, mentre il blocco del trafficking intracellulare da parte della brefeldina-A inhibisce il rilascio. Il mezzo
condizionato di cellule che esprimono TfR2 riduce l’ attivazione di
HAM sia basale che secondaria ad HJV, un effetto che l’espressione
di TfR2 è in grado di recuperare. L’iniezione di cDNA di sTfR2 nell’embrione di zebrafish riduce la trascrizione di Hamp in vivo. Questi
risultati e dati della letteratura suggeriscono un doppio ruolo per
TfR2 solubile e di membrana nell’ omeostasi del ferro, con un effetto
competitivo sulla regolazione di HAMP, in analogia a quanto descritto
per HJV. Nelle cellule eritroidi immature TfR2 lega il recettore dell’
eritropoietina (Forejtnikovà H Et al. Blood 2010;116(24):5357-67)
suggerendo un ruolo potenziale per sTfR2 nella eritropoiesi ed un
nuovo link tra eritropoiesi ed espressione di epcidina. Ci proponiamo
di caratterizzare la presenza/funzione di sTfr2 in vivo in modelli recentemente sviluppati di topi knock out per Tfr2 (Roetto A et al.
Blood 2010;115(16):3382-9).
(1) ICGEB-Trieste - Area Science Park - Padriciano, 99 - 34149 - Trieste - Italy
(2) BRAIN - Univ. Di Trieste
(3) Centro Studi Fegato - Trieste
La sindrome di Crigler-Najjar (CNS) è una rara malattia autosomica
recessiva causata dal mancato funzionamento dell’enzima glucuroniltransferasi (UGT1a1), che provoca un’iperbilirubinemia non coniugata
molto grave con prognosi letale se non trattata tempestivamente con
fototerapia. La bilirubina non coniugata ad alte concentrazioni provoca danno neurologico, tuttavia il trattamento fototerapico diventa
inefficacie nell’età adulta e l’unica alternativa valida è il trapianto di
fegato. In questo studio abbiamo generato un modello murino della
malattia introducendo una delezione di una base che introduce un codone di stop nell’esone 4 del gene dell’UGT1A. I topi mutanti, sviluppano un grave ittero, con un’intensa colorazione giallastra della pelle,
già 2 giorni dopo la nascita e muoiono tutti entro gli 11 giorni. Il danno neurologico nei topi mutati colpisce maggiormente il cervelletto
che si presenta meno sviluppato rispetto ai fratelli wt e in particolare
lo strato germinale esterno (EGL) è più sottile. La cito-architettura e
la numerosità cellule del Purkinje è profondamente influenzata dalla
tossicità da bilirubina non coniugata: le cellule del Purkinje sono meno numerose (40% di riduzione) e il loro albero dendritico è ridotto.
Al fine di curare l’iperbilirubinemia i topi mutanti a 2 giorni di vita sono stati trattati con una singola dose di AAV9 CMV-hUGT1a1. Con tale terapia genica abbiamo ottenuto il 100% della sopravvivenza dei
topi mutanti, che hanno raggiunto l’età adulta e le loro capacità motorie erano indistinguibili di quelle dei fratelli wt.
Dopo 5 mesi dal trattamento i topi sono stati sacrificati e le analisi
istologiche condotte sui cervelletti hanno mostrato che lo strato
molecolare (MCL) e lo strato delle cellule del Purkinje (PCL) era stato completamente preservato. Il numero delle cellule del Purkinje e
la loro arborizzazione dendritica era paragonabile ai controlli wt. I
livelli di bilirubina nei topi mutanti trattati erano significativamente
diminuiti rispetto ai valori dei mutanti non trattati, anche se non
hanno raggiunto quelli dei topi wt. Inoltre, dopo 5 mesi le particelle
genomiche virali erano ancora presenti nel fegato e nel muscolo,
anche se l’mRNA e la proteina hUGT1a1 erano rilevabili solo nel
muscolo scheletrico. Le analisi di attività di glucuronidazione hanno
mostrato che dopo il trattamento con AAV i topi mutanti hanno mostrato attività enzimatica solo nel muscolo scheletrico confermando
quello che era stato osservato in RT-PCR e Western blot.
In conclusione, i nostri risultati mostrano che i topi mutanti da noi
generati riproducono strettamente i maggiori tratti della sindrome
di Crigler-Najjar di tipo I.
Inoltre, questo topo mutante è un modello murino molto interessante per lo sviluppo di terapie geniche sicure ed efficaci per i pazienti affetti da malattie genetiche del fegato, al fine di migliorare le
loro condizioni di vita, offrendogli terapie alternative e permanenti
diverse dal trapianto di fegato.
ABSTRACT N. 162
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 1
Premesse e razionale. L’Emocromatosi Ereditaria (EE) è un disordine
geneticamente eterogeneo del metabolismo del ferro caratterizzato da
un progressivo accumulo del metallo con conseguente danno a patologie d’organo (Pietrangelo A, N Engl J Med 350: 2383-2397, 2004). Se
non trattata, la malattia porta a cirrosi epatica, diabete, miocardiopatia, ipogonadismo ed artrite. Il trattamento strandard dell’EE è la salassoterapia. Però questo approccio presenta alcune limitazioni: non è
in grado di far regredire il diabete di tipo 1, la cirrosi conclamata, l’artrite distruttiva o l’ipogonadismo; l’atralgia è spesso non sensibile al
trattamento: alcuni pazienti sono intolleranti,o non-aderenti al programma terapeutico o presentano controindicazioni cliniche al salasso.
Per tale motivi è auspicabile sviluppare nuove strategie/strumenti in
grado di rimuovere/prevenire l’accumulo di ferro e coadiuvare/sostituire la salassoterapia. Recenti progressi scientifici nel campo
del metabolismo del ferro sembrano ora offrire nuove possibilità per il
trattamento dell’EE. La base patogenetica di tutte le forme di EE è la
carenza di un ormone prodotto dal fegato, l’epcidina, che normalmente limita l’ingresso del ferro dall’ntestino e dai macrofagi tissutali nel
torrente circolatorio bloodstream (Pietrangelo, Gastroenterology 139:
393-408, 2010). Recentemente il nostro gruppo ed altri ricercatori
hanno dimostrato che le proteine morfogenetiche dell’osso (BMPs) sono i principali regolatori della trascrizione del’epcidina e che la carenza
di BMP6 determina una grave forma di emcoromatosi nel topo (Andriopoulos et al., Nat Genet 41: 482-487, 2009)(Meynard et al., Nat
Genet 41: 478-481, 2009). Studi preliminari del nostro laboratorio,
inoltre, indicano che la somministrazione di BMP6 in topi emocromatosici può aumentare l’espressione endogena di epcidina suggerendo
che l’uso di agonisti dell’epcidina può essere una terapia alternativa
per la cura dell’ EE.
Obiettivi: Sviluppare nuove strategie per curare l’EE attraverso la normalizzazione dei livelli deficitari dell’ormone epcidina. Scopi specifici:
a) Definire i meccanismi molecolari che sottendono alla regolazione
dell’epcidina da parte del ferro circolante attraverso la via del segnale
BMP/SMAD; b) studiare biologia e ruolo delle diverse BMP nell’EE; c)
GGP08089
256.200
Anno d’inizio: 2010
Centro Interdipartimentale di Ricerca Epatologica Avanzata “Mario Coppo” Dip
Medicine e Specialità Mediche, Policlinico , Via del Pozzo 71, 41124 Modena;
email [email protected]; tel. 059-4224356; fax 059-4223041
CAMASCHELLA CLARA
Durata (anni): 3
306.300
Durata (anni): 3
Corradini Elena, Vecchi Chiara, Sabelli Manuela, Montosi Giuliana,
Garuti Cinzia, Pietrangelo Antonello
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Telethon grant N.
GGP10233
NUOVE STRATEGIE PER CURARE L’EMOCROMATOSI EREDITARIA ATTRAVERSO LA STIMOLAZIONE DELLA PRODUZIONE
EPATICA DI EPCIDINA, L’ORMONE DEL FERRO
ABSTRACT N. 161
Responsabile
PIETRANGELO ANTONELLO
Anno d’inizio: 2008
EMOCROMATOSI: DAI GENI ALLA CLINICA E RITORNO
Camaschella Clara (1), Pagani Alessia (1), Nai Antonella (1), Roetto
Antonella (2), Silvestri Laura (1)
(1) Vita Salute University and Division of Genetics and Cell Biology, San Raffaele Scientific Institute, Milano
(2) University of Turin, Torino
L’emocromatosi ereditaria (HH, MIM #235200) è una patologia recessiva eterogenea causata da mutazioni in HFE, TfR2, HJV, HAMP.
L’HH di tipo 3 (MIM #604250) è di insorgenza precoce, ma scarsamente progressiva e dovuta a mutazioni nel recettore 2 della transferrina (TfR2), una proteina transmembrane di tipo II, omologa al
recettore della transferrina (TfR1), ma non regolata da ferro. TFR2
è molto espresso negli epatociti e negli eritroblasti immaturi ed è
stato proposto come sensore epatico della saturazione della transferrina (olo-Tf). Il legame di olo-Tf con TfR2 stailizza il recettore
sulla superficie cellulare. Abbiamo studiato la funzione di TfR2 in vitro mediante un promotere luciferasi-HAMP in presenza di HJV in li-
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15:54
Pagina 97
PROGETTI DI RICERCA TELETHON
determinare l’effetto in vivo delle BMP nel prevenire o far regredire
l’accumulo di ferro in modelli animali di EE.
Descrizione del progetto: Lo scopo del progetto è di chiarire innanzi
tutto se e come il ferro circolante e/o il ferro tissutale regolano l’espressione delle BMPs ed in quale organo questo avvenga. Indi, ci proponiamo di studiare il ruolo di diverse BMP nella regolazione dell’epcidina utilizzando una linea cellulare umana emocromatosica da noi recentemente scoperta (Vecchi, C., et al. Hepatology 51(2): 654-659, 2010)
ed analizzare l’esprsssione epatica di diverse BMP nell’EE umana e murina. Infine, useremo diverse BMP esogene per prevenire, ritardare o
far regredire il fenotipo emocromatosico in modelli murini di EE.
Aspettative: Questo progetto migliorerà la nostra comprensione del
ruolo delle BMPs e dell’epcidina nel metabolismo del ferro e nella patogenesi dell’EE e, auspicabilmente, offrirà nuovi elementi per sviluppare
strumenti terapeutici alternativi/coadiuvanti della salassoterapia per
curare l’EE e altre malattie associate ad un difetto di epcidina sierica.
Andolina Diego (2), Ventura Rossella (3), Giacovazzo Giacomo (2),
Pascucci Tiziana (1)
(1) Lab. Neurobiologia del Comportamento, Fondazione Santa Lucia, Roma Via del Fosso di Fiorano 64, 00143 Roma. Tel: 06-501703075;
Fax:06501703319; Mail: [email protected]
(2) Dipartimento di Psicologia, Università “Sapienza”, Roma
(3) Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biomediche, Università di L’Aquila
La Fenilchetonuria (PKU; McKusick 2610600) è un difetto genetico
che porta a grave ritardo mentale negli uomini. La PKU è causata
da una deficienza dell’enzima fenilalanina idrossilasi (PAH), necessario a convertire la fenilalanina (PHE) in tirosina, risultando in iperfenilalaninemia plasmatica. Alti livelli di PHE circolante durante lo
sviluppo postnatale provocano gravi disturbi cognitivi e neurologici.
Quindi, a partire dai primi periodi di vita, i soggetti iperfenilalaninemici sono sottoposti ad una dieta PHE-ristretta, che richiede l’esclusione di molti cibi naturali e il supplemento con spiacevoli composti
sintetici per evitare deficienze nutritive. Poiché la compliance al
trattamento dietetico risulta difficile, molti pazienti PKU subiscono le
conseguenze neuropsicologiche causate dalla loro iperfenilalaninemia solo parzialmente controllata. Inoltre, anche i pazienti PKU che
aderiscono alla dieta mostrano alcune alterazioni cognitive e comportamentali. Tutto ciò punta verso l’urgente necessità di trovare
terapie alternative al trattamento dell’iperfenialalninemia durante lo
sviluppo. La recente creazione di un modello murino genetico di
PKU ha riacceso la speranza di sviluppare trattamenti che vadano
oltre la semplice riduzione dei livelli di PHE plasmatica mirando agli
effetti neuropatologici dell’iperfenilalaninemia. I topi PAHenu2
(ENU2), creati da una mutazione indotta chimicamente, sono caratterizzati da un fenotipo biochimico strettamente somigliante alla
PKU umana non trattata, quale ridotta attività dell’enzima PAH, livelli di PHE plasmatica 10-20 volte maggiori rispetto a quelli normali, ipomielinizzazione tipica in PKU e deficit comportamentali.
Nostri precedenti studi sui topi ENU2 avevano dimostrato che alti livelli di PHE interferiscono con l’attività cerebrale dell’enzima tritpofano idrossilasi riducendo la disponibilità di serotonina (5-hydroxytryptamine, 5-HT), cruciale per la maturazione della connettività
neuronale nella corteccia preFrontale (pFC), intorno alla terza settimana postnatale, periodo critico per la maturazione corticale. Il 5idrossi-triptofano (5-HTP), il prodotto della triptofano idrossilasi, è
noto come il miglior trattamento in grado di aumentare i livelli cerebrali di 5-HT.
Perciò abbiamo valutato gli effetti della somministrazione di 5-HTP
tra il quattordicesimo ed il ventunesimo giorno postnatale sul profilo comportamentale (motorio e cognitivo) e morfologico (morfologia
dendritica dei neuroni piramidali del V strato delle regioni prelimbica/infralimbica della pFC) dei topi ENU2 adulti.
Nei topi ENU2 adulti il trattamento precoce con 5-HTP recupera il
deficit cognitivo nei test di riconoscimento spaziale e dell’oggetto
insieme ad un aumento della maturazione delle spine dei neuroni
piramidali della pFC. Nell’insieme, i nostri risultati supportano l’ipotesi che il ritardo mentale nella PKU dipende da una ridotta disponibilità di 5-HT cerebrale durante periodi critici dello sviluppo corticale
e punta al supplemento di 5-HTP come uno strumento terapeutico
aggiuntivo altamente promettente nel guarire i pazienti PKU.
ABSTRACT N. 163
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
CALABRESI LAURA
Responsabile
GGP07132
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
189.000
Durata (anni): 2
Anno d’inizio: 2007
CARATTERISTICHE GENETICHE, BIOCHIMICHE E CLINICHE
DEL DEFICIT DI LCAT IN ITALIA
Franceschini Guido (1), Simonelli Sara (1), Calandra Sebastiano
(2), Calabresi Laura (1)
(1) Center E. Grossi Paoletti, Department of Pharmacological Sciences, University of Milano - Via Balzaretti 9, 20133 Milano, Tel. 02-50319906, Fax 0250319900, email: [email protected]
(2) Department of Biomedical Sciences, University of Modena and Reggio Emilia
Mutazioni nel gene dell’LCAT causano due rare malattie: il deficit familiare di LCAT (FLD) e il “fish-eye disease” (FED). Nei soggetti FLD
omozigoti l’LCAT è assente o inattivo, con conseguente assenza di colesterolo esterificato nel plasma. Nei soggetti FED omozigoti, l’LCAT
non è in grado di esterificare il colesterolo contenuto nelle HDL ma
può esterificare il colesterolo in VLDL e LDL. Clinicamente gli omozigoti
FLD presentano opacità corneale, anemia, proteinuria e insufficienza
renale che può richiedere dialisi o trapianto, mentre i FED presentano
solo opacità corneale. Nell’ambito di questo e di un precedente progetto Telethon (GGP02264) abbiamo identificato 26 famiglie italiane con
deficit di LCAT. L’analisi genetica ha identificato 28 mutazioni nel gene
LCAT. La casistica raccolta, 19 portatori di due alleli mutati e 64 eterozigoti, rappresenta la più ampia mai raccolta da un singolo gruppo e ci
ha consentito di caratterizzare il profilo lipidico/lipoproteico dei portatori, con particolare attenzione alle alterazioni del sistema HDL e del
trasporto inverso del colesterolo.
Il profilo lipoproteico dei portatori di mutazioni nel gene LCAT risulta
aterogeno, soprattutto negli omozigoti, ma il rischio cardiovascolare
associato a queste due patologie è ancora discusso. Al fine di valutare
le condizioni cardiovascolari dei portatori da noi identificati abbiamo
condotto una valutazione dello spessore del complesso medio-intimale
(IMT) delle arterie carotidi mediante ultrasonografia. Lo studio è stato
condotto su 40 portatori (12 omozigoti e 28 eterozigoti), confrontati
con 80 soggetti sani di pari sesso ed età. I valori di IMT medio e di
IMT massimo dei portatori risultano essere significativamente inferiori
ai valori misurati nei soggetti controllo (IMT medio: 0.59 mm; 95%
CI, 0.55-0.62 nei portatori e 0.65 mm; 95% CI, 0.63-0.68 nei controlli; P=0.011; IMT massimo: 0.92 mm; 95% CI, 0.83-1.02 nei portatori
e 1.11 mm; 95% CI, 1.04-1.19 nei controlli; P=0.007), suggerendo
che un enzima LCAT funzionale non sia indispensabile per l’ateroprotezione mediata dalle HDL.
ABSTRACT N. 165
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 1
PASCUCCI TIZIANA
GGP09254
66.100
Durata (anni): 2
310.100
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2009
Russo Roberta (1,2), Esposito Maria Rosaria (1,2), Asci Roberta (1),
Piscopo Carmelo (1,2), Gambale Antonella (1), Andolfo Immacolata
(1,2), De Falco Luigia (1), Troiano Annaelena (1), De Maggio Ilaria
(1,2), Iolascon Achille (1,2)
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Telethon grant N.
GGP09044
ANEMIA DISERITROPOIETICA CONGENITA DI TIPO II: CORRELAZIONE GENOTIPO-FENOTIPO, MECCANISMI MOLECOLARI, MODELLO ANIMALE. NUOVE CONOSCENZE NELL’AMBITO
DELL’ERITROPOIESI E DEL SOVRACCARICO DI FERRO
ABSTRACT N. 164
Responsabile
IOLASCON ACHILLE
(1) CEINGE – Advanced Technologies, S.c.a.r.l. Via Gaetano Salvatore, 486
80145 Naples (Italy) - [email protected]
(2) Department of Biochemistry and Medical Biotechnologies, University Federico II of Naples, Naples
Anno d’inizio: 2009
MANIPOLAZIONE DELLA TRASMISSIONE DELLA SEROTONINA SUI DEFICIT COMPORTAMENTALI E NEUROCHIMICI PRODOTTI DALLA FENILCHETONURIA
L’anemia diseritropoietica congenita di tipo II (CDAII) è una malattia autosomica recessiva caratterizzata da eritropoiesi inefficace. In
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033-132 Abstract-11_ITA.qxd:telethon 021-234 Abstract
21-02-2011
15:54
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
seguito all’identificazione del gene malattia, SEC23B (Schwarz,
2009), un primo studio condotto su 25 pazienti di origine italo-francese, ha portato all’identificazione di 7 nuove mutazioni, nonché alla dimostrazione dell’esistenza di una correlazione genotipo-fenotipo: il genotipo composto da una mutazione missenso e una nonsenso tende a produrre un fenotipo più grave di quello associato a 2
mutazioni missenso (Iolascon, 2010). In un secondo studio abbiamo analizzato 28 pazienti e identificato 19 nuove varianti; è stato
altresì fornito uno strumento per migliorare la diagnosi molecolare,
definendo la frequenza delle mutazioni in ogni esone (Russo, 2010).
Ad oggi, 5 studi hanno descritto 53 differenti mutazioni in 86 pazienti (47 italiani e 39 europei non italiani [NIE]). Nel nostro ultimo
studio abbiamo calcolato le frequenze alleliche relative delle mutazioni di SEC23B in pazienti italiani rispetto a quelli NIE, dimostrando
che la mutazione R14W ha una frequenza più elevata nei casi italiani. Abbiamo provato che l’elevata ricorrenza di questa mutazione in
Italia è dovuta ad un effetto fondatore (in sottomissione).
Il gene SEC23B codifica per un componente del complesso COPII,
coinvolto nel trasporto delle proteine dal reticolo endoplasmatico al
Golgi. Nei mammiferi sono stati identificati per ciascuna delle 5 proteine del lievito coinvolte nella formazione del complesso, diversi
geni ortologhi: 2 isoforme di Sec23, Sar1, Sec31 e 4 isoforme di
Sec24. Abbiamo già dimostrato che, durante l’eritropoiesi normale,
ad una ipoespressione di SEC23A è associata una iperespressione di
SEC23B (Schwarz, 2009). Ciò suggerisce che i mutanti SEC23B potrebbero perturbare il complesso COPII selettivamente nella linea
eritroide. SEC31A, SAR1A e SEC24C sono altri geni COPII altamente espressi durante l’eritropoiesi (abs 3009, 51° Congresso ASH).
In 111 pazienti raccolti nel nostro ambulatorio, 23 casi (21%) sono
risultati negativi per le screening mutazionale di SEC23B. Questi
dati suggeriscono l’evidenza di eterogeneità genetica e supportano
l’ipotesi che altri geni associati alla patologia potrebbero esistere.
Sebbene la maggior parte delle mutazioni siano il risultato di eventi
sporadici, 4 (R14W, E109K, R497C, I318T) costituiscono oltre il
50% degli alleli mutati. Usando un approccio in silico di predizione
della struttura proteica, abbiamo dimostrato che queste 4 mutazioni
inducono sempre lo stesso cambiamento conformazionale in 2 domini di SEC23B: il beta-sheet e il gelsolin-like, importanti per le interazioni con i componenti Sec31 e Sar1. Prese insieme queste
informazioni potrebbero permettere di identificare altri geni potenzialmente coinvolti nella patogenesi della CDAII.
Attualmente stiamo generando mutanti con 3 delle mutazioni più
frequenti (R14W, I318T, R497C) per effettuare saggi funzionali in
vitro; la E109K, la più frequente in assoluto, sarà utilizzata per la
generazione di un modello murino.
blasti di pazienti che nel modello cellulare si osserva un profilo trascrizionale abnorme a carico degli stessi geni. Categorie di geni
iper-rappresentate includono quelle relative al metabolismo degli
aminoacidi e dei lipidi e regolazione delle attività delle chinasi. Abbiamo riscontrato anche geni che fanno parte del sistema di signaling Jak-STAT. Questi trascrittomi sono stati confrontati con quelli
ottenuti da cellule TF1 cells down-regolate per RPL5 e RPL11, ottenendo una firma molecolare di difetto di RP. Stiamo al momento testando cellule primarie CD34+ down-regolate per RPS19 e cellule
emopoietiche di pazienti.
Abbiamo anche confrontato il proteoma di cellule TF1 down-regolate
per RPS19 con cellule TF1 trasdotte con un siRNA scramble. L’analisi
DIGE ha rilevato una lista di proteine differenzialmente espresse, tra
cui diversi fattori traduzionali, alcune proteine coinvolte nel ciclo cellulare e altre nell’organizzazione del citoscheletro. Abbiamo così ottenuto un fenotipo dettagliato di cellule in corso di RS.
Abbiamo caratterizzato i pazienti italiani per RPS24, RPS26, RPL5,
RPL11, RPL35A [Quarello P et al Haematologica 2008, 93:1748;
Quarello P et al Haematologica 2010, 95:206; Boria I et al Hum Mutat 2010, 31:1269] e catalogato l’effetto di tutte le mutazioni note
[Campagnoli MF et al Hum Mutat 2008; 29:911]. Abbiamo creato il
DBA Gene Database [Boria I et al Hum Mutat 2010; 31:1269, Boria
I et al Hum Mutat 2008; 29:E263] (http://www.dbagenes.unito.it).
Abbiamo inoltre scritto una DBA EuroGentest Clinical Utility Gene
Card [Vlachos et al Eur J Hum Genet, in press].
Abbiamo identificato un ruolo di PIM1 (una chinasi che interagisce
con RPS19 sui ribosomi attivi [Chiocchetti A et al Haematologica
2005; 90:1453]) nell’induzione dell’apoptosi in cellule sottoposte a
RS. Abbiamo rilevato che il difetto di una RP e altri tipi di RS nelle
cellule TF1 e K562 determinano una riduzione dei livelli di PIM1. Di
conseguenza aumenta il p27Kip1, bersaglio di PIM1, con blocco della progressione in ciclo. Questo meccanismo potrebbe essere coinvolto nella patogenesi della DBA [Iadevaia V et al Oncogene 2010;
29:5490].
ABSTRACT N. 167
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 2
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 2
GGP07242
225.600
345.300
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2009
Balestra Dario (1), Baroni Marcello (1), Bussani Erica (2), Canella
Alessandro (1), Cavallari Nicola (1), Andrea Dal Mas (2), Fernandez
Eugenio (2), Ferraresi Paolo (1), Mattioli Chiara (2), Pagani Franco
(2), Pinotti Mirko (1)
DIANZANI IRMA
Durata (anni): 3
GGP09183
NUOVE STRATEGIE TERAPEUTICHE PER DIFETTI EREDITARI
DELLA COAGULAZIONE CAUSATI DA MUTAZIONI DI SPLICING
ABSTRACT N. 166
Responsabile
PINOTTI MIRKO
Anno d’inizio: 2007
(1) Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare, Università di Ferrara - Via
Fossato di Mortara 74, 44121 Ferrara. Tel. 0532-974424; Fax. 0532 974484;
e-mail: [email protected]
(2) Human Molecular Genetics, International Centre for Genetic Engineering
and Biotechnology, Padriciano, Trieste
DEFINIZIONE DELLA PATOGENESI DELL’ANEMIA DI DIAMOND-BLACKFAN
Aspesi Anna (1), Pavesi Elisa (1), Boria Ilenia (1), Ramenghi Ugo (2), Garelli
Emanuela (2), Quarello Paola (2), Carando Adriana (2), Ruoppolo Margherita
(3), Caterino Marianna (3), Iadevaia Valentina (4), Gustincich Stefano (5),
Santoro Claudio (1), Loreni Fabrizio (4), Dianzani Irma (1)
Lo splicing aberrante di mRNA indotto da mutazioni in siti donatori
per lo splicing (5’ss) è responsabile di forme severe di difetti dei
fattori della coagulazione VII (FVII) e IX (FIX, emofilia B), così come di molte altre malattie ereditarie.
I difetti di FVII/FIX possono causare gravi emorragie, talora fatali,
ed il loro trattamento è associato a gravi complicanze. Essi rappresentano modelli ideali per valutare approcci terapeutici innovativi
dato che anche livelli ridotti di fattore nei pazienti (>3%) possono
ripristinare l’emostasi.
CARATTERIZZAZIONE DI MECCANISMI DI SPLICING
Attraverso l’espressione di minigeni abbiamo definito il meccanismo
causativo di 15 mutazioni differenti a livello di 5’ss dei geni di FVII
e FIX. Esse inducono “exon skipping” e/o attivazione di siti criptici.
Abbiamo identificato un “Intronic Splicing Silencer (ISS)” coinvolto
nel processo di definizione dell’esone e quindi potenzialmente importante per la correzione dello splicing.
L’utilizzo di U1-snRNA, componenti chiave dello spliceosoma, opportunamente modificati per riconoscere il sito 5’ss mutato o l’adiacente ISS ha portato alla correzione del difetto, talora in modo
completo. Di rilievo, una U1-snRNA specifica per un singolo ISS è
stata in grado di ripristinare lo splicing compromesso da differenti
mutazioni ad un 5’ss del FIX.
RIPRISTINO DEI LIVELLI DI FVII/FIX IN MODELLI CELLULARI E
ANIMALI
(1) Dipartimento di Scienze Mediche, Univ. Piemonte Orientale - Via Solaroli
17, 18100 Novara
(2) Dip.Scienze Pediatriche, Univ. Torino
(3) Dip Biochimica e Biotecnologie Mediche, Univ. Federico II, Napoli
(4) Dip Biologia, Univ. Tor Vergata, Roma
(5) SISSA, Trieste
L’Anemia di Diamond-Blackfan, (DBA, MIM105650) è un’aplasia eritroide caratterizzata da anemia normocromica macrocitica con trasmissione autosomica dominante. Lo scopo del nostro progetto era
di svelare le cause molecolari della DBA partendo dall’ipotesi che
fosse dovuta ad un difetto di traduzione. Il difetto di RPS19 determina difetto nella biogenesi ribosomiale e l’attivazione di meccanismi di stress ribosomiale (RS) [Dianzani I, Loreni F. Haematologica
2008; 93:1601]. Abbiamo valutato il trascrittoma di fibroblasti ottenuti da pazienti con mutazioni in RPS19 e lo abbiamo confrontato
con quello di soggetti normali: abbiamo osservato che anche cellule
non emopoietiche presentano alterazioni di espressione [Avondo F
et al BMC Genomics 2009; 10:442]. Abbiamo identificato il trascrittoma di cellule eritroidi TF1 down-regolate per RPS19. Sia nei fibro-
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21-02-2011
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
Per studiare la correzione a livello proteico abbiamo selezionato la
mutazione 9726+5g/a nel FVII. Mediante l’uso di minigeni ibridi si è
dimostrato che l’U1-snRNA modificata U1+5A è in grado di ripristinare i livelli di mRNA corretto (50%) e la biosintesi di FVII con attività coagulante (>10% del wt). Il ripristino è stato osservato in cellule esprimenti l’U1+5a sia transientemente che stabilmente, e senza evidenziare significativi effetti su morfologia, proliferazione e ciclo cellulare.
Nel modello murino, l’iniezione idrodinamica di plasmidi esprimenti
la variante 9726+5g/a del FVII e la U1+5a ha indotto un significativo aumento dei livelli di FVII umano (8%), al di sopra della soglia
terapeutica. Sono in corso esperimenti con vettori adeno-associati
per valutare l’efficacia di correzione nel tempo.
Questi protocolli sono inoltre utilizzati per dimostrare in vivo la correzione mediata da U1-snRNA di altre mutazioni naturali nel FIX.
CORREZIONE DI UNA FORMA DOMINANTE MEDIANTE siRNA
Abbiamo definito le basi molecolari di una forma dominante di malattia di von Willebrand (VWD) causata da una delezione in eterozigosi nel gene del vWF. La co-espressione di vWF normale e deleto
(p.P1105_C1926delinsR) compromette la secrezione del vWF nonché la sua multimerizzazione e funzione (VWF collagen-binding 1.9
± 0.5% del wt-vWF). siRNAs diretti al “breakpoint” sul vWF mRNA
deleto hanno ridotto i suoi livelli di espressione, ripristinando così la
sintesi di multimeri ad alto peso molecolare funzionali (VWF collagen-binding 28.0 ± 3.3% del wt-vWF).
la capacità di sns5 di contrastare la trans-attivazione di geni endogeni. Un altro scopo del progetto è stato valutare la fattibilità e la
sicurezza dei protocolli di mobilizzazione mediante GCSF di progenitori ematopoietici CD34+ e di ottimizzare i protocolli di trasduzione
in condizioni GMP grade. Abbiamo condotto uno studio pilota su 5
pazienti talassemici, mostrando la possibilità di mobilizzare con
questo protocollo un buon numero di cellule CD34+ (8-12x106/Kg)
che risulta sufficiente sia per la trasduzione ex-vivo che per la criopreservazione di una riserva. Il protocollo è risultato essere sicuro
in quanto in nessuno dei casi si sono verificati effetti collaterali.
ABSTRACT N. 169
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
MAGGIO AURELIO
Totale
298.000
Num Centri: 3
Anno d’inizio: 2010
(1) University of Ferrara, Department of Biochemistry and Molecular Biology,
Section of Molecular Biology, Italy - via Fossato di Mortara 74-44121 Ferrara,
Tel. +39-053297443; Fax. 0532-974500; e-mail: [email protected]
(2) Weill Cornell Medical College, Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology, New York, USA
(3) Hadassah Hospital, Jerusalem, Israel
GGP08221
Durata (anni): 2
132.000
Durata (anni): 2
Bianchi Nicoletta (1), Borgatti Monica (1), Zuccato Cristina (1), Finotti Alessia (1), Breda Laura (2), Salvatori Francesca (1), Breveglieri
Giulia (1), Gardenghi Sara (2), Brognara Eleonora (1), Lampronti Ilaria (1), Fibach Eitan (3), Rivella Stefano (2), Gambari Roberto (1)
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Telethon grant N.
GGP10214
PRODUZIONE DI EMOGLOBINA IN CELLULE ERITROIDI DA
PAZIENTI CON BETA TALASSEMIA ALTERANDO PROCESSI
BIOMOLECOLARI IN GRADO DI REGOLARE L’ESPRESSIONE
DEI GENI PER LE GLOBINE
ABSTRACT N. 168
Responsabile
GAMBARI ROBERTO
Anno d’inizio: 2008
OTTIMIZZAZIONE DELL’EFFICIENZA DI VETTORI LENTIVIRALI PER LA TERAPIA GENICA DELLA BETA-TALASSEMIA
MAJOR
Obiettivi. L’obiettivo 1 è stato il reclutamento e la caratterizzazione
genetica di pazienti affetti da beta-talassemia. L’obiettivo 2 è costituito dall’analisi dei meccanismi molecolari alla base dell’attività degli induttori di emoglobina fetale (HbF) e il loro impiego in combinazione con la terapia genica utilizzando vettori lentivirali. L’obiettivo
3 è stato lo studio dell’espressione genica in soggetti HPFH (hereditary persistence of fetal hemoglobin) e in pazienti affetti da betatalassemia con alti livelli di HbF.
L’obiettivo 4 è stato l’analisi del network dei microRNA in cellule
isolate da pazienti HPFH e in progenitori eritroidi trattati con induttori di HbF. L’obiettivo 5 è stato l’applicazione di un approccio readthrough per la produzione di emoglobina adulta (HbA) in modelli
cellulari per la talassemia beta°39.
Risultati. I. Abbiamo dimostrato che trattando precursori eritroidi
(ErPC) isolati da pazienti affetti da beta-talassemia con mitramicina
(MTH, un noto induttore di HbF) e con il vettore lentivirale T9W si
ha induzione sia di HbF che di HbA con riduzione dell’eccesso l’alfaglobina, proponendo la combinazione terapia genica/induzione di
HbF (strategia GT/HbF) per il trattamento della beta-talassemia. II.
Abbiamo studiato l’espressione genica di pazienti HPFH per identificare molecole capaci di mimare i diversi livelli di mRNA associati all’induzione di HbF. Attraverso studi sui pazienti affetti da beta-talassemia con differenti livelli di HbF, abbiamo dimostrato una correlazione tra l’espressione del microRNA 210 e l’induzione di differenziamento eritroide e HbF in cellule eritroidi trattate con MTH. Abbiamo identificato nell’mRNA di raptor un possibile sito bersaglio del
microRNA 210. L’induzione di HbF per trattamento con MTH è associata con l’inibizione del pathway mTOC1. III. Abbiamo dimostrato
l’attività read-through per il codone di termine prematuro (PTC) beta°39 dopo trattamento con geneticina (G418) in cloni K562 trasfettati con vettori lentivirali recanti il gene per la beta-globina mutato. Questo risultato è stato confermato anche in precursori eritroidi isolati da pazienti talassemici omozigoti per la mutazione di non
senso beta°39, con un basso livello di HbA a causa di un meccanismo non-sense RNA decay (NMD) a carico dell’mRNA per la beta°39
globina mutata. Inoltre, per valutare l’attività read-through del
G418 abbiamo utilizzato ceppi di lieviti S. cerevisiae in cui il meccanismo NMD era attivato [NMD (+)] o inattivato [NMD (-)] per delezione del gene UPF1. Questi ceppi di lieviti sono stati trasfettati con
un plasmide avente un sistema reporter con due geni luciferasi Renilla e Firefly separati da un codone di senso [NS(-)] o nonsenso
[NS(+)]. I livelli di attività read-through sono stati calcolati come
rapporto tra l’attività nonsenso Firefly/Renilla normalizzata sull’attività senso Firefly/Renilla. L’incremento dei livelli di read-through è
stato osservato dopo trattamento dei ceppi di S. cerevisae con
G418.
Pecoraro Alice (1), Baiamonte Elena (1), Ferro Leda (2), Motta Valentina (1), Riviere Isabelle (2), Boulad Farid (2), Sadelain Michel
(2), Di Marzo Rosalba (1), Acuto Santina (1), Maggio Aurelio (1)
(1) UOC Ematologia II - A.O. Ospedali Riuniti “Villa Sofia- Cervello” - Palermo
Via Trabucco 180 - 90146 Palermo tel 0916802744 fax 0916880828 e-mail [email protected]
(2) Department of Medicine - Memorial Sloan-Kettering Cancer Center New York,
NY, USA
Le beta-talassemie sono anemie congenite ereditarie causate dalla
ridotta o assente produzione di catene beta-globiniche. L’unica cura
disponibile consiste nel trapianto allogenico di midollo osseo, ma è
possibile solo per i pazienti che trovano un donatore HLA-compatibile, e presenta un certo rischio di mortalità. La terapia genica rappresenta una promettente alternativa che può essere applicata teoricamente a tutti i pazienti. Condizioni necessarie sono un trasferimento genico efficiente nelle cellule staminali ematopoietiche ed
un’espressione del transgene beta-globinico a livelli terapeutici ed
eritroide specifica. Il primo trial clinico, che prevede l’uso di vettori
lentivirali (LV) ricombinanti per il gene della beta-globina umana è
già iniziato in Francia (Cavazzana-Calvo et al, Nature (2010)
467,318–322); tuttavia il rischio di oncogenesi inserzionale e gli effetti posizione rimangono aspetti da ottimizzare. Gli isolatori cromatinici, che agiscono sia da elementi di confine impedendo l’avanzamento dell’eterocromatina che da blocco dell’enhancer, possono essere inclusi nei vettori virali per la terapia genica al fine di renderli
più efficaci e sicuri. Lo scopo del progetto è stato quello di migliorare il potenziale terapeutico del TNS9.3, un LV ricombinante per il
gene beta-globinico candidato per un imminente trial clinico di fase
I, mediante l’inclusione dell’isolatore cromatinico di riccio di mare
sns5 allo scopo di ridurre gli effetti posizione (Palla et al, PNAS
(1997) 94,2272–2277; Acuto et al, BCMD (2005) 35,339-334; D’Apolito et al, Mol Ther (2009) 17,1434–14412-3-4). Sono stati clonati nel TNS9.3 gli isolatori cromatinici sns5 e cHS4 (400bp e 1,2kb) e
una sequenza controllo della stessa dimensione di sns5. I risultati,
ottenuti sia in vitro (cloni di cellule eritro-leucemiche di topo) che in
vivo (modelli murini di beta-talassemia C57BL6HbbTh3+/-) indicano che a differenza dell’intero isolatore cHS4, sns5 non abbassa il
titolo virale quando inserito nella 3’LTR e incrementa i livelli di
espressione del transgene beta-globinico mantenendoli elevati nel
tempo. Inoltre questo isolatore riduce la variabilità di espressione in
colonie di milza contenenti una singola copia di vettore. Sono in
corso studi di espressione e di microarray nelle CFU-S per valutare
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
ABSTRACT N. 170
(2) Dip. Emergenza e Trapianto di Organi, Università degli Studi di Bari, Bari
(3) Dip. Scienze e Tecnologie Biomediche, Università degli Studi di Milano, Milano
(4) Dip. Biologia e Genetica per le Scienze Mediche, Università degli Studi di
Milano, Milano
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
FOLLENZI ANTONIA
Totale
125.400
GGP09280
Telethon grant N.
Num Centri: 1
Durata (anni): 3
L’angioedema ereditario (HAE) è una malattia genetica rara causa
di edemi ricorrenti localizzati alla cute, alla mucosa del tratto gastrointestinale e alla laringe, che, nei casi più gravi, possono causare morte per asfissia. Il mediatore degli attacchi di angioedema è la
bradichinina, rilasciata quando fattori scatenanti, quali stress fisici e
psicologici, attivano il sistema di contatto. La carenza di C1-inibitore (C1-INH), che è alla base della malattia, è dovuta a mutazioni in
uno dei due alleli che codificano per questa proteina. I livelli funzionali di C1-INH nel plasma dei pazienti con HAE sono sempre inferiori alla metà del valore normale, ovvero al livello di espressione che
dovrebbe essere garantito dall’allele wild type, prevenendo in teoria
lo svilupparsi degli attacchi di angioedema. La patogenesi del HAE
è, quindi, solo parzialmente definita e i meccanismi che scatenano
gli attacchi ancora quasi completamente sconosciuti. Ciononostante, sta diventando sempre più chiaro che il sistema nervoso autonomo e il sistema immunitario cooperano durante l’infiammazione tramite vie simpatiche e parasimpatiche ed è stato recentemente dimostrato che cellule infiammatorie, quali i fagociti, rappresentano
una nuova fonte di catecolamine in grado di aumentare la risposta
infiammatoria. In quest’ambito, il tilt-test è un esame ampiamente
utilizzato per attivare il sistema nervoso simpatico e la cinetica dei
cambiamenti cardiovascolari e del sistema nervoso autonomo indotti dal tilt-test è stata descritta approfonditamente. E’ quindi probabile che in pazienti con carenza di C1-INH la stimolazione del sistema nervoso possa favorire il rilascio di bradichinina.
Alla luce di ciò, nel corso del II anno del presente progetto sono
stati raccolti campioni di sangue (PAXgene) da 5 pazienti affetti da
HAE e 5 donatori sani sia in condizioni basali che dopo tilt-test. L’RNA estratto è stato ibridato con i Bead-Chip della ditta Illumina. L’analisi dei dati è stata effettuata con il software Genespring GX. Dopo la normalizzazione, circa 1000 geni sono risultati significativamente up- o down-regolati (p<0,05, dopo correzione per multiple
testing di Benjamini-Hochberg). In particolare: 85 geni sono risultati specificamente modulati dallo stress in pazienti HAE e 116 nel
gruppo di controllo, mentre 9 sono risultati disregolati in entrambi i
gruppi. Inoltre, 122 geni sono risultati differenzialmente espressi
nei pazienti rispetto ai controlli, e, tra questi, 15 risultavano tra gli
85 specificamente modulati dallo stress. Questi dati sono in corso di
verifica mediante esperimenti di real-time RT-PCR semiquantitativa.
In conclusione i risultati preliminari degli esperimenti di microarray
hanno evidenziato 15 geni specificamente modulati dallo stress in
pazienti HAE: la validazione funzionale dei geni/pathway identificati
potrà far luce sui meccanismi scatenanti gli episodi di angioedema e
promuovere l’identificazione di nuovi potenziali target terapeutici.
Anno d’inizio: 2009
POTENZIALI EFFETTI TERAPEUTICI NELL’EMOFILIA A DELLE
CELLULE UMANE ENDOTELIALI DEI SINUSOIDI EPATICI, DEL
MIDOLLO OSSEO E DEL SANGUE DA CORDONE
Merlin Simone, Ranaldo Gabriella, Zanolini Diego, Prat Maria, Follenzi Antonia
Dipartimento di Scienze Mediche, Facoltà di Medicina, Chirurgia e Scienze della
Salute, Università del Piemonte Orientale “A. Avogadro” - Dipartimento di
Scienze Mediche, via Solaroli 17, Novara 28100
L’identificazione di cellule capaci di sintetizzare e rilasciare il FVIII è
fondamentale per lo sviluppo di nuove terapie per la cura dell’emofilia A. Studi recenti hanno dimostrato che le cellule endoteliali, in
particolare le cellule endoteliali dei sinusoidali epatici (LSEC), sono
una fonte importante di FVIII, anche se l’origine del FVIII, oltre che
nelle cellule endoteliali, non è completamente definito in quanto si
pensa che potenzialmente il FVIII potrebbe essere espresso anche
in altri tipi cellulari. Per determinare se altre cellule oltre le cellule
endoteliali, in particolare quelle derivate dal midollo osseo possano
produrre FVIII, in un modello murino emofilico abbiamo trapiantato
midollo osseo prelevato da donatori sani. Abbiamo monitorato le
cellule del donatore marcate geneticamente mediante un transgene
fluorescente e analizzato la produzione di FVIII, così come abbiamo
saggiato la correzione del fenotipo emorragico. I topi emofilici trapiantati sottoposti al saggio di sanguinamento che sono sopravvissuti hanno infatti dimostrato la correzione del fenotipo emofilico.
Abbiamo, inoltre, indotto danno epatico nei topi trapiantati per capire se fosse possibile reclutare cellule provenienti dal midollo osseo
al fegato in grado di differenziare in epatociti o cellule endoteliali e
abbiamo potuto confermare che questo fenomeno e alquanto raro
se non del tutto negativo. Utilizzando FVIII ricombinante purificato
abbiamo prodotto un anticorpo policlonale e abbiamo analizzato l’espressione di FVIII a livello proteico nelle cellule stromali mesenchimali (MSC) derivate da donatori di midollo osseo, e in cellule mononucleate da sangue periferico, midollo osseo e sangue di cordone
confermando i risultati ottenuti mediante l’analisi dell’RNA messaggero. Con il nuovo anticorpo abbiamo confermato l’espressione di
FVIII nel fegato umano normale e in particolare nelle LSEC e nelle
cellule del Kupffer (KC) oltre che negli epatociti. Infine, siamo stati
in grado di isolare cellule mesenchimali dal midollo osseo di topi sia
sani che emofilici ed abbiamo confermato l’espressione di FVIII nelle cellule isolate dai donatori sani e l’assenza di mRNA e proteina
nelle cellule isolate dai topi emofilici. Le cellule sono poi state trapiantate nei topi emofilici nel background NOD/SCID, modello murino ottimale per gli xenotrapianti. L’iniezione di KC sane (macrofagi
epatici), che in prevalenza provengono dal midollo osseo, o cellule
mesenchimali umane derivate da midollo osseo ha portato alla
comparsa di FVIII nel sangue dei topi emofilici e li ha protetti da
sanguinamento prolungato. L’identificazione di ulteriori tipi cellulari
che esprimono FVIII offrono nuovi possibilità per la comprensione
delle alterazioni fisiopatologiche nella sintesi e rilascio di FVIII e sviluppare nuove strategie terapeutiche per la cura dell’emofilia A.
ABSTRACT N. 172
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 3
Totale
Num Centri: 3
GGP08223
411.500
Anno d’inizio: 2006
(1) Università di Trieste, IRCCS Burlo Garofolo, Trieste - S.C. Laboratorio di
Genetica, IRCCS Burlo Garofolo, via dell’Istria, 65/1 – 34137 Trieste. Tel. 0403785275; Fax 040-3785540; e-mail: [email protected]
(2) Clinica Medica III, Dipartimento di Medicina Interna e Terapia Medica,
IRCCS Policlinico San Matteo, Università di Pavia, Pavia
(3) Dipartimento di Biochimica, Università di Pavia, Pavia
CICARDI MARCO
Durata (anni): 3
346.000
Durata (anni): 3
Balduini Carlo L. (2), Messineo Stefania (1), Balduini Alessandra
(3), Pecci Alessandro (2), Torti Mauro (3), Savoia Anna (1)
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Telethon grant N.
GGP06177
RUOLO DELLA MIOSINA NON MUSCOLARE IIA NELLA “MALATTIA ASSOCIATA A MYH9”
ABSTRACT N. 171
Responsabile
SAVOIA ANNA
Anno d’inizio: 2008
L’obiettivo di questo progetto multicentrico riguarda la comprensione degli aspetti clinici e patogenetici della malattia associata a
MYH9 (MYH9RD), una rara malattia autosomica dominante causata
da mutazioni nel gene MYH9 (miosina-9) e caratterizzata da macropiastrinopenia, aggregati nei leucociti, sordità, cataratta e insufficienza renale. Il progetto prevede lo studio dei seguenti aspetti:
Studi clinici. Il fenotipo clinico della MYH9RD è piuttosto variabile
con caratteristiche simili ad altre patologie rendendo difficile la diagnosi e la prognosi. In termini di criteri diagnostici, la miosina-9
mutata è sempre presente in aggregati che rappresentano, insieme
alla grandezza delle piastrine, un ottimo strumento per indirizzare
REGOLAZIONE DEI GENI COINVOLTI NELLA PATOGENESI DELL’ANGIOEDEMA EREDITARIO DA CARENZA DI C1 INIBITORE
Castellano Giuseppe (2), Caccia Sonia (3), Asselta Rosanna (4), Rimoldi Valeria (4), Montinaro Vincenzo (2), Sallustio Fabio (2), Divella Chiara (2), Zanichelli Andrea (1), Bonanni Erika (1), Duga
Stefano (4), Cicardi Marco (1)
(1) Dipartimento di Scienze Cliniche “Luigi Sacco”, Università degli Studi di Milano - Via G.B. Grassi 74, 20157 Milano, Tel. +390250319829, Fax
+390250319828, email [email protected]
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033-132 Abstract-11_ITA.qxd:telethon 021-234 Abstract
21-02-2011
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
verso una corretta diagnosi. E’ stata, inoltre, accertata una correlazione genotipo/fenotipo in cui gli individui con alterazioni del dominio motore presentano un fenotipo più grave rispetto a quelli con
difetti nella coda della miosina-9. Abbiamo, infine, valutato l’effetto
di alcuni farmaci innovativi. Il trattamento con ramipril e telmisartan or losartan porta in remissione completa della proteinuria i pazienti con glomerulonefrite mentre quello con eltrombopag, un agonista non peptidico del recettore della trombopoietina, induce un
aumento significativo delle piastrine.
Generazione di cellule che esprimono mutazioni MYH9. Per definire
la funzione del gene MYH9, abbiamo generato cloni di cellule staminali embrionali di topo che esprimono due mutazioni del gene MYH9
sotto il controllo del promotore Myh9 endogeno. In seguito alla caratterizzazione molecolare, abbiamo dimostrato che l’RNA mutato è
espresso allo stesso livello di quello normale mentre la miosina-9 è
ridotta nelle cellule che esprimono le mutazioni. Il differenziamento
in corpi embriodi e cardiomiciti non ha rivelato differenze fenotipiche tra i cloni mutati e i controlli. Stiamo definendo il protocollo per
differenziarli in megacariociti e sviluppare così modelli in vitro per
gli studi di fisiopatologia e farmacologia.
Studi funzionali. Nell’ambito degli studi funzionali, abbiamo compreso il ruolo fondamentale della myosina-9 nel processo d’inibizione
della formazione delle piastrine da parte del collagene di tipo I. Abbiamo, inoltre, determinato che come componente del citoscheletro, la miosina-9 controlla l’irreversibilità del processo di aggregazione delle piastrine che non risulta però alterato nei pazienti
MYH9RD.
esprimenti la proteina normale necessitano attivazione.
Le cellule CHO mutate sono capaci di aderire al fibrinogeno tanto
quanto le normali ma lo spreading è difettoso.
In conclusione, i nostri dati, ottenuti in un modello cellulare di trasfezione del difetto genetico, dimostrano che la GPIIb/IIIa mancante del
betaTD è espressa in una conformazione costitutivamente attivata ed
esercita un effetto dominante negativo sul recettore normale, con conseguente difetto a livello dell’outside-in signalling.
Questa nuova macrotrombocitopenia autosomica dominante associata
a disfunzione piastrinica aggiunge interessanti informazioni sul ruolo
dell’ integrina GPIIIa, e del suo betaTD, nella funzione piastrinica.
ABSTRACT N. 174
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 4
Totale
Num Centri: 1
GGP10155
124.300
Anno d’inizio: 2010
(1) Department of Internal Medicine, IRCCS Policlinico San Matteo Foundation
- University of Pavia, Pavia - Clinica Medica III, piazzale Golgi, 27100 Pavia, tel
0382-502183, fax 0382-526223, email [email protected]
(2) Medical Genetics Unit, Department of Gynaecological, Obstetric and Paediatric Sciences, University of Bologna, Bologna
(3) Laboratory of Genetics, Institute for Maternal and Child Health - IRCCS
“Burlo Garofolo”, Trieste
(4) Department of Paediatrics, Second University of Naples, Naples
GRESELE PAOLO
Durata (anni): 2
373.000
Durata (anni): 3
Seri Marco (2), Savoia Anna (3), Perrotta Silverio (4), Balduini Carlo L. (1)
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Telethon grant N.
GGP10089
UN NUOVO GENE RESPONSABILE DI PIASTRINOPENIA EREDITARIA: STUDI CLINICI, PATOGENETICI E FARMACOLOGICI
ABSTRACT N. 173
Responsabile
BALDUINI CARLO LUIGI
Anno d’inizio: 2010
IDENTIFICAZIONE DEI MECCANISMI RESPONSABILI DEL DIFETTO DELLA FUNZIONALITÀ PIASTRINICA E DELLA RIDOTTA MEGACARIOCITOPOIESI IN UNA NUOVA VARIANTE DI
MACROTROMBOCITOPENIA EREDITARIA DI GLANZMANN
(D673-E712DEL)
Finalità generale
Scoprire l’eziopatogenesi della Piastrinopenia 2 (THC2, OMIM
188000), caratterizzare le sue caratteristiche cliniche e laboratoristiche, identificare farmaci potenzialmente in grado di aumentare il
numero delle piastrine nei soggetti affetti.
Obiettivi specifici
1) Identificazione di criteri diagnostici: descrivere le caratteristiche
cliniche e laboratoristiche da utilizzare per la diagnostica differenziale tra THC2 e le altre piastrinopenie ereditarie.
2) Definizione dei meccanismi eziopatogenetici: caratterizzare le alterazioni molecolari e cellulari che sono responsabili della piastrinopenia.
3) Terapia: identificazione di farmaci potenzialmente in grado di migliorare la piastrinopenia dei soggetti con THC2.
Background/Razionale
Una diagnosi definita non è possibile in più del 40% dei pazienti con
piastrinopenia ereditaria in quanto la loro malattia non soddisfa i
criteri per alcuna forma nota (“nuove” forme). Fare diagnosi di una
specifica malattia è però importante sia per definire la prognosi del
pazienti che per scegliere l’approccio terapeutico più indicato. Infatti, alcune malattie hanno prognosi infausta a breve termine e richiedono perciò trattamenti aggressivi quali il trapianto di midollo.
Altre condizionano invece una prognosi più favorevole e richiedono
solo trattamenti di supporto. Dieci anni fa il nostro gruppo aveva
mappato sul cromosoma 10p11.2-12 il gene di una nuova piastrinopenia, ma, nonostante ripetuti tentativi, non erano state identificate
mutazioni. Solo recentemente abbiamo scoperto mutazioni in una
porzione regolatoria di un gene candidato (qui chiamato THC2). Dal
momento che sia il gene che la malattia sono poco conosciuti, definiremo le caratteristiche cliniche, patogenetiche ed i possibili approcci terapeutici per la nuova malattia.
Descrizione del progetto
Effettueremo la ricerca di mutazioni del gene THC2 in 237 soggetti
con piastrinopenia ereditaria di origine sconosciuta di una casistica
di 479 pazienti consecutivi, identificando così la frequenza relativa
della nuova malattia. Studi biochimici e funzionali chiariranno i difetti indotti dalle mutazioni, mentre indagini di biologia molecolare
caratterizzeranno i meccanismi patogenetici della malattia.
Per quanto riguarda la terapia, sulla base dei risultati positivi recentemente ottenuti in un’altra forma di piastrinopenia ereditaria, siamo fiduciosi di riuscire ad identificare con studi in vitro uno o più
principi farmacologici in grado di aumentare il numero delle piastrine nella nuova malattia.
Risultati attesi
-Significativo miglioramento delle capacità diagnostiche per i pazienti
con piastrinopenie ereditarie, considerato che sulla base di risultati
preliminari la nuova malattia sembra essere relativamente frequente;
Bury Loredana, Cecchetti Luca, Giannini Silvia, Corazzi Teresa, Appolloni Viviana, Gresele Paolo
Università di Perugia, Dip. Medicina Interna, Sez. Medicina Interna Cardiovascolare via E. Dal Pozzo pad X 06123 Perugia tel. 0755783989 email: [email protected] - [email protected]
Recentemente abbiamo descritto una famiglia con una nuova malattia ereditaria emorragica mucocutanea autosomica dominante
associata ad una mutazione del gene ITGB3, causa di una delezione
del647-686 e perdita parziale del beta Tail Domain (betaTD) dell’integrina GPIIIa (Gresele et al., Haematologica 2009.; 94:663-669),
precedentemente non descritta: una forma variante di Tromboastenia di Glanzmann (GT).
Caratteristiche di questa famiglia sono macrotrombocitopenia moderata, alterata aggregazione piastrinica in risposta a tutti gli agonisti, una lieve riduzione dell’ espressione della GPIIb/IIIa, normale
adesione ma ridotto spreading su fibrinogeno, binding del fibrinogeno e di PAC-1 leggermente aumentato in piastrine resting e una
FAK costitutivamente fosforilata.
Dato che una lieve riduzione della GPIIb/IIIa, come quella osservata nei portatori eterozigoti di GT, non è solitamente associata a difettosa funzionalità piastrinica, e che non sono state descritte in
precedenza delezioni del betaTD della GPIIIa, abbiamo deciso di
esprimere la mutazione in cellule CHO per valutare il suo impatto
sulla funzionalità e sul signalling della GPIIb/IIIa.
I cDNA codificanti per la GPIIb, GPIIIa normale e GPIIIa mutata
(del647-686) sono stati clonati in vettori di espressione e trasfettati
in cellule CHO.
La citometria a flusso e la microscopia a fluorescenza hanno dimostrato che la GPIIb/IIIa mutata è espressa nelle cellule CHO, anche se in
percentuale leggermente inferiore rispetto alla GPIIb/IIIa wild-type.
Le cellule CHO esprimenti l’integrina mutata legano spontaneamente il fibrinogeno e PAC-1 e aggregano spontaneamente in presenza
di fibrinogeno, diversamente dalle cellule CHO che esprimono la
GPIIb/IIIa normale le quali hanno bisogno di stimolazione con DTT
per espletare queste funzioni.
L’analisi in Western blotting ha mostrato una FAK costitutivamente
fosforilata in cellule CHO che esprimono la GPIIb/IIIa mutata, come
accade nelle piastrine dei nostri pazienti, mentre le cellule CHO
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
-Identificazione di farmaci da testare in trial clinici;
-Miglioramento delle conoscenze sui meccanismi molecolari della
produzione di piastrine.
modellamento del sistema redox, formulando l’ipotesi che l’attività
delle proteine NLR possa essere redox-sensibile.
Scopo: identificare una relazione funzionale tra l’aberrante secrezione di IL-1 e una alterazione dello stato redox nei soggetti con
mutazioni dei geni NLRP3 and NLRP12.
Metodi: sono stati studiati 8 pz con mutazioni NLRP3 (4 CINCA e 4
MWS), 4 pz con mutazione del gene NLRP12 (Asp294Glu), 4 pz con
artrite idiopatica giovanile sistemica e 10 controlli normali pari età.
I monociti dei pazienti sono stati piastrati con o senza stimoli PAMPs. Sono stati valutati i seguenti parametri: 1.secrezione di IL-1; 2.
produzione di ROS; 3. tipo ed entità della risposta anti-ossidante.
Risultati: 1. La cinetica di secrezione di IL-1beta dolo stimolo con
PAMPs è significativamente accelerata nei soggetti con mutazioni
NLRP3 e NLRP12 rispetto ai soggetti di controllo. La quantità totale
di IL-1beta secreta è aumentata nei pazienti CAPS, ma non nei pazienti con mutazioni di NLRP12. 2. Contrariamente ai soggetti normali o ai pazienti con AIG sistemica i monociti dei pazienti con mutazioni di NLRP3 e di NLRP12 mostrano una alta produzione basale
di ROS e una up-regolazione dei sistemi anti-ossidanti, che va incontro a rapido esaurimento dopo stimolazione dei TLR.
ii) Abbiamo studiato se l’iper-secrezione di IL-1b tipica dei pz con
mutazione di NLRP3 possa alterare la risposta dell’immunità adattiva con particolare riferimento all’asse IL-23/IL-17.
Metodi: Sono stati analizzati 8 pz CAPS, 22 pz con AIG sistemica e
12 soggetti normali. I livelli di IL-17 e IL-6 sono stati valutati con
metodica ELISA. L’espressione di CCR6 e CD161 sulle T memoria
sono stati valutati tramite citofluorimetria, La frequenza di cellule
TH17 è stata valutata dopo stimolazione con SEB. É stata inoltre
valutata la produzione di IL-1 e IL-23 da parte delle cellule dendritiche derivate dai monociti dopo stimolazione con ligandi dei TLR.
Risultati: I pazienti CAPS non trattati dimostrano un aumento significativo dei livelli di IL-17, così come della frequenza di Th17. I livelli di entrambi i parametri si normalizzano dopo trattamento antiIL1. Le cellule dendritiche dei pazienti CAPS mostrano una più alta
produzione di IL-1 e IL-23 rispetto ai controlli. I pazienti CAPS mostrano uno sbilanciamento di senso TH17 dell’immunità adattativa.
ABSTRACT N. 175
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
BENVENUTI FEDERICA
Responsabile
GGP10231
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
121.000
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2010
UNA CONNESSIONE TRA L’ALTERATA RISPOSTA AI RECETTORI DI TIPO TOLL NELLE CELLULE DENDRITICHE E LE MALATTIE AUTOIMMUNI NEI PAZIENTI AFFETTI DALLA SINDROME DI WISKOTT-ALDRICH
Prete Francesca, Labrada Mayrel, Petrovic Jelena, Benvenuti Federica
Cellular Immunology, ICGEB, Trieste - Area Science Park, Padriciano 99,
34149, Trieste
La sindrome di Wiskott-Aldrich è una complessa malattia genetica
che causa uno stato di immunodeficienza nei pazienti affetti. I pazienti oltre a fenomeni ricorrenti di anemia emolitica e eczemi presentano un’elevata suscettibilità a infezioni virali e batteriche e sviluppano malattie autoimmuni e linfomi con frequenza elevata. Il gene all’origine di questa malattia (WAS) codifica per una proteina regolatrice il citoscheletro di actina delle cellule ematopoietiche (WASP). Mutazioni a carico del gene che codifica WASp causano alterazioni funzionali a carico di linfociti e cellule della linea mieloide.
La nostra ricerca mira a comprendere nel dettaglio il ruolo delle cellule dendritiche nella patogenesi della malattia. In passato il nostro
gruppo ha dimostrato che le cellule dendritiche nelle sindrome di
Wiskott-Aldrich presentano alterazione nelle capacità di migrare e
interagire con i linfociti T in vivo, fornendo un importante base cellulare per comprendere l’inefficiente risposta a virus e patogeni. Recentemente abbiamo iniziato a caratterizzare un fenomeno nuovo
attraverso cui le cellule dendritiche contribuiscono all’alterazione
della risposta immune in questa sindrome. Le cellule dendritiche
plasmacitoidi (pDC), che sono le principali produttrici di interferone
alfa in seguito a infezioni virali, sono profondamente alterate in assenza della proteina. Oltre ad una riduzione nel numero totale delle
pDC abbiamo osservato un’alterato profilo di maturazione e secrezione di citochine in vivo in risposta ad agenti patogeni. Stiamo ora
studiando il meccanismo molecolare che collega la proteina WASp
all’alterata risposta dei recettori di tipo Toll nelle pDCs.
ABSTRACT N. 177
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
GATTORNO MARCO
Totale
302.600
Num Centri: 4
Anno d’inizio: 2007
Dipartimento di Scienze della Vita, Università di Trieste - Via Valerio, 28 - Edificio R I piano - 34127 Trieste
GGP09127
Durata (anni): 2
112.800
Durata (anni): 2
Decleva Eva, Menegazzi Renzo, Fasolo Alba, Sebastianutto Michele,
Dri Pietro
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Telethon grant N.
GGP07221
LA MALATTIA CRONICA GRANULOMATOSA: STUDI SUI MECCANISMI MOLECOLARI RESPONSABILI DEL DIFETTO DI ATTIVITÀ MICROBICIDA E PROPOSTA DI NUOVE STRATEGIE
TERAPEUTICHE PER IL TRATTAMENTO DELLA MALATTIA
ABSTRACT N. 176
Responsabile
DRI PIETRO
Anno d’inizio: 2009
La malattia granulomatosa cronica (CGD) è una sindrome ereditaria
caratterizzata da infezioni ricorrenti severe e spesso fatali provocate da batteri (S. aureus, S. marcescens, B. cepacia) e funghi
(Aspergillus sp., C. albicans). La CGD è causata dal difetto genetico
di NADPH ossidasi, un complesso enzimatico che genera specie
reattive dell’ossigeno (ROS), quali O2- e H2O2, ritenute cruciali nell’uccisione microbica. I fagociti dei pazienti CGD non producono
ROS e mostrano un marcato difetto nell’attività microbicida che
spiegherebbe le manifestazioni cliniche della malattia. Tale difetto
sarebbe anche legato al pH fagosomale, anormalmente basso, che
impedirebbe l’attivazione dei meccanismi microbicidi non ossidativi.
Gli obiettivi principali di questo progetto sono stati: (a) definire il
ruolo relativo dei meccanismi microbicidi ossidativi (ROS e sistema
mieloperossidasi (MPO)- H2O2-Cl-) e non ossidativi (pH fagosomale, flussi di K+ e H+) nell’attività antimicrobica dei neutrofili umani;
(b) individuare una nuova strategia terapeutica per correggere il difetto di attività microbicida dei neutrofili CGD e migliorare la resistenza alle infezioni.
(a) Abbiamo dimostrato che (i) la NADPH ossidasi è essenziale per
l’uccisione di certi microrganismi (S. aureus e C. albicans) ma non
di altri (E. coli) e ciò spiega perchè i pazienti CGD soffrono di infezioni causate da S. aureus e da funghi ma non da E. coli; (ii) l’alcalinizzazione del pH fagosomale e l’aumento dei flussi di K+ secondari all’attivazione dell’ossidasi non sono necessari per l’uccisione di
S. aureus e C. albicans, che dipende quasi esclusivamente dal sistema MPO-H2O2-Cl-; (iii) i flussi di H+ mediati dai canali protonici
EFFETTO DELLE MUTAZIONI DEL GENE CIAS-1 SUI MECCANISMI PATOGENETICI DELLE SINDROMI PERIODICHE AUTOINFIAMMATORIE DA DIFETTO DI CRIOPIRINA (CAPS). RICERCA DI NUOVI GENI E DI NUOVI APPROCCI TERAPEUTICI
Rubartelli Anna (2), Borghini Silvia (1), Chiesa Sabrina (3), Tassi
Sara (2), Caroli Francesco (3), Lasigliè Denise (1), Carta Sonia (2),
Delfino Laura (2), Martini Alberto (1), Ceccherini Isabella (3), Gattorno Marco (1)
(1) UO Pediatria II, Istituto G. Gaslini - Largo G. Gaslini 5, 16147, Genova
(2) Laboratorio Biologia Sperimentale, Istituto Tumori, Genova
(3) Laboratorio Biologia Molecolare, Istituto G. Gaslini, Genova
Le CAPS sono malattie autoinfiammatorie associate a mutazioni del
gene NLRP3, una proteina coinvolta nella secrezione di IL-1. Scopi del
progetto: i) comprendere i meccanismi legati alla ipersecrezione di
IL-1 nei pazienti CAPS; ii) definire l’influenza delle mutazioni di
NLRP3 sull’immunità adattativa, iii) definire l’impatto patogenetico
delle mutazioni NLRP3 sul metabolismo di cartilagine e osso; iv) identificare nuovi geni causativi nei pazienti con fenotipo CAPS, ma negativi per mutazioni di NLRP3.
Risultati del primo anno del Progetto:
i) Abbiamo dimostrato che la secrezione di IL-1 è controllata dal ri-
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
voltaggio dipendenti non sono indispensabili a preservare l’attività
della NADPH ossidasi: in loro assenza interverrebbe un meccanismo
di compensazione di carica di nuova individuazione, consistente nel
flusso di O2- verso il compartimento intracellulare, che impedirebbe
una depolarizzazione di membrana e un’acidificazione citosolica incompatibili con l’attività dell’ossidasi.
(b) Abbiamo usato clorochina e amantadina, farmaci lisosomotropici
con proprietà di basi deboli, per correggere il pH anormalmente acido nei fagosomi dei neutrofili CGD e vedere se questo trattamento
determinasse un miglioramento dell’attività candidacida e stafilocida.
Entrambi i farmaci contrastavano l’acidificazione fagosomale e ripristinavano la capacità candidacida; l’effetto sull’attività stafilocida era
meno evidente. Altre basi deboli (metilammina, ammonio cloruro) e
sostanze in grado di ostacolare l’acidificazione fagosomale si sono rivelate incapaci di migliorare l’attività microbicida delle cellule CGD
suggerendo che l’effetto di clorochina e amantadina non è legato alle
modificazioni del pH fagosomale. Gli studi sono stati estesi ad un
modello murino di CGD (topi knockout per la gp91phox). In analogia
con quanto visto nei neutrofili umani, la clorochina ristabiliva l’attività candidacida dei neutrofili dei topi CGD, di per sè quasi assente,
mentre l’effetto dell’amantadina non era significativo. La clorochina
è stata usata in vivo per verificare il suo effetto sulla sopravvivenza
di topi CGD infettati con C. albicans. I risultati di numerosi trial effettuati con diverse dosi di farmaco e di candida hanno dimostrato
un leggero aumento nella sopravvivenza degli animali trattati che,
comunque, non era statisticamente significativo.
C3NeF potesse curare la malattia. Al momento non esiste una cura
specifica per l’MPGN e la maggior parte dei pazienti inesorabilmente
progredisce verso l’insufficienza renale terminale. Sono stati provati
numerosi approcci farmacologici, incluso l’uso di steroidi, immunosoppressori e plasmaferesi. Il Rituximab, un anticorpo umanizzato
anti-CD20 è stato utilizzato con successo per ridurre la formazione
di autoanticorpi in malattie autoimmuni ed è stato suggerito come
una possibile opzione terapeutica nell’MPGN. Abbiamo trattato con
Rituximab una giovane paziente con MPGN II con proteinuria nel
range nefrosico. Nella paziente non abbiamo osservato alcun miglioramento del quadro clinico dopo Rituximab, nonostante un’importante riduzione dei livelli di C3NeF. Questi risultati non supportano un effetto terapeutico di Rituximab nell’MPGN II e suggerirebbero che, almeno nella nostra paziente, il C3NeF non gioca un ruolo
importante nella patogenesi della malattia.
ABSTRACT N. 179
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
NORIS MARINA
Totale
263.500
Telethon grant N.
Num Centri: 1
193.600
Durata (anni): 2
Anno d’inizio: 2010
Baldanzi Gianluca (1), Pighini Andrea (1), Rainero Elena (1), Bettio
Valentina (1), Chianale Federica (1), Mesturini Riccardo (1), Nichols
Kim (2), Rubio Ignacio (3), Parolini Ornella (4), Graziani Andrea (1)
GGP09075
Durata (anni): 3
GGP10034
SAP REGOLA LA DIACILGLICEROLO CINASI ALFA: IMPLICAZIONI PER LA RISPOSTA IMMUNITARIA IN PAZIENTI XLP
(MALATTIA LINFOPROLIFERATIVA LEGATA AL CROMOSOMA
X) E POSSIBILI APPROCCI FARMACOLOGICI PER LA TERAPIA DELL’XLP
ABSTRACT N. 178
Responsabile
GRAZIANI ANDREA
Anno d’inizio: 2009
(1) Dipartimento Medicina Clinica e Sperimentale, Università del Piemonte
Orientale A. Avogadro, Novara - via Solaroli 17, 28100 Novara, email: [email protected]
(2) Division of Oncology, Children’s Hospital of Philadelphia, Wood Building 4th
Floor, Oncology mailbox, 3615 Civic Center Boulevard, Philadelphia, PA 19104, USA
(3) Institute of Molecular Cell Biology-Center for Molecular Biomedicine, Jena,
Germany
(4) Centro Di Ricerca E. Menni, Fondazione Poliambulanza-Istituto Ospedaliero,
Brescia, Italy
ANOMALIE DEL COMPLEMENTO NELLA GLOMERULONEFRITE
MEMBRANOPROLIFERATIVA PRIMARIA
Noris Marina, Bresin Elena, Piras Rossella, Donadelli Roberta, Sorosina Annalisa, Alberti Marta, Valoti Elisabetta, Daina Erica, Remuzzi
Giuseppe
Centro di Ricerche Cliniche per le Malattie Rare “Aldo e Cele Daccò”, Istituto
Mario Negri Ranica Bergamo
Nei linfociti T, il legame del recettore delle cellule T (TCR) da parte
di antigeni contemporaneamente alla attivazione di altri recettori
co-stimolatori come CD28, determina l’attivazione delle cellule T, la
produzione di citochine e la loro differenziazione. Al contrario la stimolazione del solo TCR, pur attivando solo parzialmente le vie di
segnalazione intracelllulare, non è sufficiente per la piena attivazione dei linfociti T. In seguito a attivazione del TCR, l’entità e la cinetica di stimolazione della segnalazione mediata da diacilglicerolo determina la risposta cellulare all’antigene, regolando l’attivazione di
trasduttori chiave come Ras e PKC-theta.
La sindrome linfoproliferativa legata all’X (XLP) è caratterizzata da
una risposta cellulare incompleta dei linfociti T alla co-stimolazione
del TCR/CD28, da un difetto di apoptosi indotta da attivazione, da
una risposta immunitaria deregolata al virus di Epstein-Barr e dalla
suscettibilità ai linfomi.
XLP è causata dalla perdita di funzione di SAP, una proteina adattatrice composto da un dominio SH2 e da una sequenza di legame a domini SH3, che, interagendo con Fyn, promuove la fosforilazione in tirosina e l’attivazione di SLAM (CD150), un recettore transmembrana
omotipico espresso in linfociti T e B, cellule dendritiche e monociti. In
seguito a attivazione, SLAM attiva diverse vie di segnalazione, che
modulano la risposta delle cellule T alla stimolazione del TCR.
Numerose evidenze indicano che la diacilglicerolo cinasi alfa
(DGKa), che metabolizza il diacilglicerolo a acido fosfatidico e quindi
diminuendo la concentrazione di diacilglicerolo, agisce come regolatore negativo dell’attivazione dei linfociti T e del sistema immunitario e induttore di anergia: i) la delezione di DGKa causa sovra-attivazione della segnalazione di Ras, promuovendo un difetto di anergia, ii) DGKa è altamente indotta in cellule T anergiche, iii) la sovraespressione di DGKa o DGKz inibisce l’attivazione della segnalazione di Ras indotta da CD3/CD28, iv) l’inibizione farmacologica di
DGKa reverte l’incapacità delle cellule anergiche di essere attivate
in risposta alla stimolazione dal TCR, v) l’espressione DGKa è downregolata entro poche ore dalla attivazione delle cellule T.
Noi qui dimostriamo che la co-stimolazione del TCR sia con CD28 o
con SLAM, promuove una rapida inibizione dell’attività enzimatica di
DGKa che è reclutata alla membrana plasmatica. L’inibizione di
DGKa dipende da SAP, la cui sovra-espressione induce inibizione
L’obiettivo principale del progetto era di raccogliere, attraverso la
creazione di un Registro Italiano, dati clinici e campioni biologici da
pazienti con glomerulonefrite membranoproliferativa (MPGN) ben caratterizzati e di fare studi genetici e biochimici e correlazioni cliniche.
Finora il Registro include 93 pazienti (età 3-78 anni): 26 MPGN tipo
II, 28 tipo I e 2 tipo III; 17 pazienti con MPGN non definita; 10 con
GNC3 (glomerulonefrite con depositi di C3) e 10 con MPGN sovrapposta a microangiopatia trombotica (TMA). Livelli persistentemente
bassi di C3 sono stati osservati in 62/84 (74%) pazienti, i livelli di
CFH erano bassi in 10/38 (26%); C3NeF è risultato positivo in
29/67 (43%) pazienti. In un paziente positivo per C3NeF è stata
trovata anche una mutazione in CFI (vedi sotto).
Abbiamo fatto nei pazienti lo screening per i geni CFH, CFI e MCP
(ancora in corso).
Finora abbiamo identificato 6 diverse mutazioni in CFH in 8 pazienti
(5 non related e in 3 fratelli). Una delTA 3095-3096 ( p.Y1007Stop)
in omozigosi in un paziente con MPGN II e bassi livelli di CFH/C3.
Una c.262C>A (p.P88T) in omozigosi in 3 fratelli con MPGN I e bassi livelli di CFH/C3. Quattro mutazioni eterozigoti – p.R1210C,
p.Q1137L, p.W1183C e p.I216T – sono state trovate in un paziente
con MPGN II e in 3 pazienti con MPGN/TMA. Abbiamo inoltre valutato la presenza delle varianti V62 and/or H402 del CFH, associate
con MPGN, in 70 pazienti: 33 pazienti erano omozigoti e 17 eterozigoti per V62 (VV+VI: 94%); 12 pazienti erano omozigoti e 25 erano eterozigoti per H402 (HH+HY: 59%). Abbiamo identificato 3 diverse mutazioni in CFI in 3 pazienti unrelated: una mutazione eterozigote p.G57D in un paziente con MPGN non definita, bassi livelli
di C3 e positivo per C3NeF; una mutazione eterozigote p.R317W in
un paziente con MPGN/TMA e ipocomplementemia familiare; un
cambio p.R187Q eterozigote in un paziente con MPGN/TMA and livelli di C3 normali. Infine, abbiamo trovato 3 diverse mutazioni in
MCP: un cambio intronico (IVS11-35 G>C) in un paziente con MPGN II; una mutazione eterozigote p.A353V in un paziente con MPGN non definita; un cambio eterozigote p.A220T in un paziente con
GNC3 e bassi livelli di C3.
Abbiamo inoltre valutato il ruolo di C3NeF nella patogenesi dell’MPGN e se un approccio farmacologico finalizzato a ridurre i livelli di
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
ABSTRACT N. 181
DGKa in assenza di stimolazione delle cellule T. Infine abbiamo dimostrato che nelle cellule SAP-deficienti, la difettiva risposta cellulare dei linfociti T alla co-stimolazione di TCR/CD28, può essere almeno parzialmente revertita dal silenziamento di DGKa o dalla inibizione della sua attività enzimatica. L’inibizione di DGKa in cellule
SAP-deficienti ristabilisce parzialmente l’attivazione di Ras e di ERK
-1 / 2, il reclutamento membrana di PKC-theta, la stimolazione dell’attività trascrizionale di NFAT e la produzione di IL-2.
Questi dati indicano che l’inibizione di DGKa dipendente da SAP, sostiene la segnalazione mediata da diacilglicerolo regolando così l’attivazione delle cellule T, e può rappresentare una nuova strategia
farmacologica per il trattamento XLP.
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Totale
Num Centri: 2
Totale
Num Centri: 1
(1) Laboratorio Immunità Adattativa, Fondazione Humanitas per la Ricerca,
Istituto Clinico Humanitas, Rozzano - Via Manzoni 113, 20089 Rozzano (MI)
(2) Clinica Pediatrica, University of Brescia, c/o Spedali Civili, Brescia
GGP07200
212.700
Anno d’inizio: 2010
Kallikourdis Marinos (1), Trovato Anna Elisa (1), Anselmi Fabio (1),
Saruknhan Adelaida (1), Tassone Laura (2), Badolato Raffaele (2),
Viola Antonella (1)
GATTI MAURIZIO
Durata (anni): 3
284.800
Durata (anni): 3
LA PATOGENESI DELLA SINDROME WHIM: ANALISI DELLE
FUNZIONI DEL CXCR4 NELL’ATTIVAZIONE E NEL TRAFFICO
DEI LINFOCITI
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Telethon grant N.
GGP10170
Telethon grant N.
ABSTRACT N. 180
Responsabile
VIOLA ANTONELLA
Responsabile
Anno d’inizio: 2007
La sindrome WHIM è una malattia umana rara caratterizzata da sintomi quali neutropenia, mielocattessi, ipogammaglobulinemia, infezioni ricorrenti e verruche. E’ causata da mutazioni dominanti nel
recettore chemochinico CXCR4 che portano a troncamento del Cterminale. É stato dimostrato che questa mutazione ostacola nei
neutrofili il traffico intracellulare del recettore, con conseguente aumento della risposta alle chemochine e alla ritenzione dei neutrofili
nel midollo osseo, spiegando così l’insorgere della mielocattessi e
neutropenia. Tuttavia, restano inspiegabili i difetti, nei pazienti
WHIM, che sono legati all’immunità adattativa, come l’ipogammaglobulinemia, infezioni ricorrenti e verruche. Avendo precedentemente dimostrato che i recettori chemochinici CXCR4 e CCR5, oltre
alla loro funzione di migrazione, hanno un ruolo nell’aumentare la
stabilità della sinapsi immunologica (IS) tra le cellule T e cellule
presentanti l’antigene (APC), abbiamo ipotizzato che le mutazioni
associate alla WHIM possano influenzare il ruolo di CXCR4 nella stabilizzazione della IS portando ai sintomi osservati legati alla immunità adattativa. Abbiamo dimostrato che il CXCR4 mutato sulle cellule T di pazienti WHIM, pur perfetto nella sua capacità di essere reclutato alla IS e di migliorare la costimolazione delle cellule T, compromette significativamente la stabilità dei coniugati delle cellule TAPC in presenza di segnali chemochinici esterni. Inoltre, utilizzando
un modello di topo retrogenico, con time-lapse microscopy su fettine di linfonodo ex vivo, abbiamo dimostrato che le mutazioni WHIM
portano ad un deterioramento nella formazione delle interazioni TAPC di lunga durata nei linfonodi. Questi risultati possono spiegare
le risposte adattative difettose nei pazienti WHIM.
LA DROSOPHILA COME ORGANISMO MODELLO PER LO STUDIO DELLA NIJMEGEN BREAKAGE SYNDROME E DELLE MALATTIE AD ESSA CORRELATE
Bonaccorsi Silvia (1), Palumbo Valeria (1), Ciapponi Laura (1),
Cenci Giovanni (2), Gatti Maurizio (1)
(1) Dipartimento di Biologia e Biotecnologie, Sapienza, Università di Roma, P.le
A. Moro 5, 00185 Roma
(2) Dipartimento di Biologia di Base ed Applicata, Università dell’Aquila, 67010
Coppito, L’Aquila
La Nijmegen Breakage Syndrome (NBS) è una rara malattia genetica, caratterizzata da microcefalia, ritardo nella crescita e predisposizione al cancro. Le cellule dei pazienti NBS mostrano instabilità cromosomica, sensibilità alle radiazioni ionizzanti, danni telomerici e difetti nella progressione del ciclo cellulare. NBS è causata da mutazioni nel gene NBS1; la proteina NBS1 interagisce con
le proteine MRE11 e RAD50, formando il complesso MRN che, insieme alle chinasi ATM e ATR, media la risposta cellulare al danno
al DNA. Le mutazioni in ATM, MRE11 e ATR causano rispettivamente l’ataxia telangiectasia (AT), l’ataxia telangiectasia-like
(ATLD) e la Seckel syndrome.
I pazienti AT e ATLD presentano fenotipi simili, in gran parte sovrapposti a quelli dei pazienti NBS e ATR-Seckel. Tuttavia, mentre
i pazienti NBS e ATR-Seckel presentano microcefalia, i pazienti AT
e ATLD sono caratterizzati da degenerazione cerebellare e ataxia.
Un recente lavoro ha mostrato che una paziente eterozigote per
mutazioni in RAD50 presentava fenotipi cellulari e clinici simili a
quelli dei pazienti NBS (la malattia è stata quindi denominata
NBS-like disorder, o NBSLD). Le basi molecolari dei differenti fenotipi neurologici sono però attualmente sconosciute.
Il complesso MRN, ATR e ATM sono anche coinvolti nella via di segnalazione che controlla la struttura e la duplicazione dei centrosomi. E’ stato inoltre osservato che mutazioni in alcuni geni che
codificano per proteine centrosomali, quali la pericentrina (PCNT)
e Cep152, alterano le funzioni di ATR e causano la Seckel syndrome. Questi dati indicano che nelle cellule umane vi sono interazioni tra i centrosomi e i processi di riparazione del DNA.
Il genoma di Drosophila melanogaster contiene gli ortologhi di
MRE11, RAD50 e NBS1. Abbiamo dimostrato che i mutanti nulli
nei geni di Drosophila mre11, rad50 e nbs presentano alte frequenze di fusioni telomeriche (TF) e rotture cromosomiche (CB), e
muoiono alla transizione tra larva e pupa.
Recentemente abbiamo anche osservato che le mutazioni in
mre11, nbs e rad50 aumentano significativamente la frequenza di
cellule mitotiche con aberrazioni a carico dei centrosomi (CAB,
cellule diploidi con 0, 1, 3 o >3 centrosomi) rispetto al tipo selvatico. La frequenza di CAB nei mutanti nbs è significativamente più
elevata rispetto a quella osservata nei mutanti rad50, che presentano una frequenza di CAB più alta di quella dei mutanti mre11.
Questi aumenti in CAB non sono correlati con il danno al DNA,
perché i mutanti mre11 e rad50 hanno frequenze di CB e TF più
alte di quelle dei mutanti nbs.
Questi risultati indicano che nbs, mre11 e rad50 hanno ruoli differenti nell’induzione di CAB. Data la stretta connessione tra CAB e
microcefalie umane, i nostri risultati suggeriscono che le differenze cliniche tra NBS (forte microcefalia), NBSLD (microcefalia relativamente lieve) e ATDL (assenza di microcefalia) potrebbero essere dovute a differenze nella frequenza di CAB.
ABSTRACT N. 182
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
BIFFO STEFANO
GGP10012
263.400
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2010
MODULAZIONE DELL’ATTIVITÀ DEL FATTORE DI INIZIO 6
(EIF6) E SUO UTILIZZO TERAPEUTICO NELLE MALATTIE A
CAUSA RIBOSOMALE
Beugnet Anne, Pesce Elisa, Biffo Stefano
Stefano Biffo - San Raffaele Scientific Institute, Milan, & DISAV, Alessandria, Italy
La sindrome di Shwachman-Diamond è un’anomalia congenita su base ereditaria e genetica. Il gene responsabile della sindrome di Shwachman si chiama SBDS. La sindrome comporta insufficienza pancreatica esocrina, alterazioni ossee, disfunzioni del midollo osseo. I pazienti affetti hanno un rischio elevato di leucemia. Le cure disponibili
sono essenzialmente palliative, e non specifiche per questa malattia.
Lo scopo primario del nostro lavoro è trovare nuovi farmaci che possano curare la sindrome, attraverso il bersagliamento molecolare della azione di eIF6. eIF6 è una proteina dimostratasi in grado di modulare la funzione del gene SBDS, l’agente causativo della sindrome.
Inoltre vogliamo capire i meccanismi patofisiologici che causano la
SDS, in modo da svelare nuove strategie terapeutiche. Studi condotti
precedentemente nel nostro laboratorio hanno dimostrato che eIF6 è
un fattore limitante della traduzione, che la sua deplezione causa un
ritardo nella crescita cellulare ed un rallentamento della progressione
del ciclo cellulare tra G1 e S (Gandin V et al. Nature. 2008 Oct
2;455(7213):684-8). Abbiamo anche dimostrato che la attività di
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
PER STUDIARE LA PATOGENESI MOLECOLARE DELLA CARDIOMIOPATIA ARITMOGENA DEL VENTRICOLO DESTRO
eIF6 è controllata dal complesso RACK1-PKC. Inoltre la isoforma specifica di PKC implicata nel controllo di eIF6 è la PKC beta2. Partendo
da questi dati abbiamo costruito un saggio biochimico che ci consente
di identificare agonisti ed antagonisti di eIF6. Saranno presentati i
dati preliminari relativi a questo saggio e le strategie pianificate.
Beffagna Giorgia (1), Lorenzon Alessandra (1), Doliana Roberto (2),
Lembo Giuseppe (3), Sabatelli Patrizia (4), Carnevale Daniela (3),
Dazzo Emanuela (1), Bonaldo Paolo (5), Braghetta Paola (5), Rampazzo Alessandra (1)
ABSTRACT N. 183
(1) Department of Biology, University of Padova, Padova, Italy - Via Ugo Bassi
58/B, 35131 Padova
(2) Department of Molecular Oncology and Translational Research, CROIRCCS, Aviano, Pordenone, Italy
(3) Department of Angio-Cardio-Neurology, Neuromed Institute Pozzilli, Italy
(4) Unit of Bologna c/o IOR, Bologna, Italy 3 Division of Experimental Oncology
(5) Department of Histology, Microbiology, and Medical Biotechnology, University of Padova, Padova, Italy
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
POGGESI CORRADO
Responsabile
GGP07133
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
104.000
Durata (anni): 2
Anno d’inizio: 2007
ALTERAZIONI NELLE PROPRIETÀ DI CONTRAZIONE E RILASCIAMENTO DI SARCOMERI CARDIACI NELLA CARDIOMIOPATIA IPERTROFICA FAMILIARE (HCM): STUDIO A LIVELLO
DI SINGOLE MIOFIBRILLE
La Cardiomiopatia Aritmogena del Ventricolo Destro (ARVC) è una patologia degenerativa progressiva del miocardio, frequentemente coinvolta nella morte improvvisa giovanile. Nonostante le recenti scoperte
sulla determinazione genetica della malattia, gli eventi molecolari precoci che portano alla degenerazione dei cardiomiociti rimangono ancora poco conosciuti.
Lo scopo di questo progetto è di indagare i meccanismi patogenetici di
mutazioni nel gene DSC2 e DSG2 in vitro, mediante transfezioni con
cDNA wild-type e mutati in culture di cardiomiociti, e in vivo generando linee di topi transgenici.
Modelli sperimentali in vitro. Per valutare la potenziale patogenicità di
due mutazioni (p.E102K, p.I345T) e di una variazione frameshift
(p.A897KfsX4) nel gene DSC2 individuate in pazienti affetti da ARVC,
il cDNA normale e mutato della DSC2 è stato clonato in un vettore eucariotico di espressione per generare una proteina di fusione con la
GFP; i costrutti sono stati transfettati in cellule HL-1. Il segnale della
GFP rivela una predominante localizzazione nel citoplasma delle proteine alterate, che perdono la loro corretta localizzazione a livello delle
giunzioni cellulari. La variazione p.A897KfsX4 è stata trovata in 5 pazienti affetti da ARVC non imparentati tra loro (frequenza allelica
2.2%) e in 6 su 200 soggetti di controllo (frequenza allelica 1.5%). Risulta degno di nota che 4 dei 5 pazienti sono portatori anche di un’altra mutazione in un altro gene dei desmosomi. Perciò la variazione
p.A897KfsX4 può essere considerata come un polimorfismo raro, che
può influenzare l’espressione fenotipica della patologia in associazione
con un’altra mutazione.
Modelli sperimentali in vivo. Allo scopo di identificare il meccanismo
patogenetico coinvolto nell’ARVC sono stati generati topi transgenici
che sovraesprimono a livello cardiaco la DSG2 normale e con le mutazioni (G100R, N266S, Q558X), utilizzando il promotore della alphamiosina cardiaca (alpha-MyHC). Tutte le linee di topi transgenici che
sovra esprimono la DSG2 mutata mostrano il fenotipo clinico tipico
dell’ARVC. L’analisi istologica dei topi transgenici a 6 mesi ha evidenziato la progressiva perdita di cardiomiociti con sostituzione fibro-adiposa mentre la microscopia elettronica ha mostrato un ridotto numero
di desmosomi a livello dei dischi intercalari, degenerazione delle miofibrille e presenza di mitocondri danneggiati.
Esperimenti di immunofluorescenza su sezioni criostatate di tessuto
cardiaco eseguite utilizzando un anticorpo anti-FLAG hanno mostrato
una corretta localizzazione a livello dei dischi intercalari della DSG2
umana normale e con le mutazioni N266S e G100R. Al contrario, la
proteina di fusione DSG2-Q558X mostra prevalentemente una localizzazione a livello del citoplasma.
A livello molecolare, abbiamo analizzato l’espresione e la localizzazione di alcune proteine, dimostrando per la prima volta un cambiamento
nell’espressione e nella localizzazione della beta-catenina nei cuori di
topi transgenici che sovraesprimono la proteina mutata mediante
esperimenti di western-blot e immunofluorescenza. L’espressione delle
altre proteine delle giunzioni appare invariata, fatta eccezione per una
lieve diminuzione della placoglobina nei topi transgenici a 6 mesi se
comparata con i controlli.
Questa sovraespressione della beta-catenina può rappresentare un
potenziale meccanismo molecolare per la patogenesi della malattia.
Scellini Beatrice (1), Ferrara Claudia (1), Piroddi Nicoletta (1), Ferrantini Cecilia (1), Tesi Chiara (1), Cecchi Franco (2), Olivotto Iacopo (2), Poggesi Corrado (1)
(1) CIMMBA Università di Firenze - Dipartimento di Scienze Fisiologiche, Viale
Morgagni 63, 50134 Firenze
(2) Centro di Riferimento per le Cardiomiopatie AOU Careggi Firenze
Sono oltre 10 i geni le cui mutazioni sono responsabili di HCM. Si tratta di geni che codificano proteine sarcomeriche, in prevalenza proteine
del filamento spesso, miosina (beta-MyHC) e proteina C legante la
miosina (cMyBP-C). Nonostante numerosi studi sull’impatto funzionale
delle mutazioni responsabili di HCM, non è chiaro il meccanismo attraverso il quale le mutazioni causano la malattia. In questo progetto
vengono impiegate tecniche che consentono di misurare la forza generata da singole miofibrille cardiache per confrontare proprietà meccaniche e cinetiche di sarcomeri isolati da cuori di donatori con quelle
di sarcomeri isolati da pazienti HCM sottoposti a miectomia settale o
trapianto cardiaco. Vengono inoltre sviluppate tecniche per sostituire
in miofibrille cardiache tropomiosina (Tm) e troponina (Tn) endogene
con proteine esogene per studiare l’impatto funzionale di mutazioni
delle proteine del filamento sottile (Scellini et al Adv Exp Med Biol.
2010,682,163-174). Sono già stati riportati e in parte pubblicati risultati da miofibrille isolate da pazienti HCM con mutazioni di beta-MyHC
e cMyBP-C (Belus et al J Physiol. 2008,586,3639-3644; Ferrantini et al
J Cardiovasc Transl Res. 2009,2,441-451). I risultati indicano che tutte le mutazioni di entrambe le proteine causano un aumento della cinetica apparente dei cross-bridges con aumento del costo energetico
della generazione di forza. Qui vengono presentati i risultati ottenuti
da un paziente HCM omozigote affetto da mutazione di una proteina
del filamento sottile (cTnT K280N). Nelle miofibrille K280N la forza
massimale risulta ridotta mentre la sensibilità dei miofilamenti al Ca2+
è aumentata. La costante di velocità della generazione di forza in risposta a Ca2+-attivazione (kACT) è molto più rapida nelle miofibrille
K280N (1.7-2s-1) che nei controlli (0.7-1s-1). La sostituzione della
proteina mutata con Tn ricombinante umana normale riporta kACT
verso i valori di controllo (1s-1). La cinetica del rilasciamento in risposta a rimozione del Ca2+ risulta accelerata nelle miofibrille K280N,
evidenza di accelerato distacco dei cross bridges. I risultati suggeriscono che la mutazione della cTnT aumenta la cinetica apparente dei
cross-bridges e il costo energetico della contrazione in modo analogo
a quanto osservato con le mutazioni di miosina e proteina C. L’accelerato distacco dei cross bridges e il conseguente aumento del costo
energetico della contrazione rappresentano caratteristiche comuni alle
mutazioni responsabili di HCM indipendentemente dal tipo di mutazione e dalla proteina coinvolta. Un difetto energetico può svolgere un
ruolo centrale nella fisiopatologia dell’HCM e avere importanti implicazioni terapeutiche. Un’ulteriore caratteristica, condivisa dalle miofibrille
di tutti i pazienti HCM analizzati finora, è l’aumentata sensibilità al
Ca2+ dei miofilamenti. Questa alterazione può contribuire alla disfunzione diastolica e all’aumentato rischio aritmico dei pazienti HCM.
ABSTRACT N. 185
ABSTRACT N. 184
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
RAMPAZZO ALESSANDRA
Totale
175.000
Telethon grant N.
Num Centri: 1
Telethon grant N.
Totale
GGP07220
Durata (anni): 2
Num Centri: 3
Anno d’inizio: 2007
BAUCE BARBARA
GGP09293
246.900
Durata (anni): 2
Anno d’inizio: 2009
NUOVI GENI E ASPETTI CLINICO-PATOLOGICI IN FAMIGLIE
AFFETTE DA CARDIOMIOPATIA ARITMOGENA DEL VENTRICOLO DESTRO
SVILUPPO DI MODELLI SPERIMENTALI IN VITRO E IN VIVO
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
Rampazzo Alessandra (1), Basso Cristina (2), Bauce Barbara (3)
La tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica (CPVT) è una
patologia cardiaca ereditaria caratterizzata dall’insorgenza di alterazioni del ritmo cardiaco in seguito a sforzi fisici o a stress emotivo
acuto. Nonostante la patologia sia nota fin dagli anni ’70, solo recentemente si è iniziato a comprenderne le cause anche grazie alla scoperta del nostro gruppo che ha dimostrato il coinvolgimento di mutazioni a carico del gene RyR2 in molti pazienti affetti da CPVT. Questa
informazione si è rivelata fondamentale per la comprensione della
malattia e ha dimostrato che anomalie genetiche dei geni coinvolti
nel controllo dei flussi intracellulari di calcio nelle cellule cardiache
possono generare un substrato aritmogeno. L’obiettivo di questo progetto è stato di incrementare le conoscenze della fisiopatologia della
CPVT attraverso studi clinici e valutazioni in vivo ed in vitro.
Dal punto di vista clinico abbiamo rivolto lo studio alle correlazioni genotipo-fenotipo e alle manifestazioni cliniche della patologia. Abbiamo
raccolto campioni di DNA da 192 pazienti affetti e 515 familiari. La valutazione genetica e clinica dei familiari ha permesso di identificare ulteriori16 individui clinicamente affetti e 42 individui geneticamente affetti non penetranti. Al momento questa coorte di pazienti CPVT rappresenta la più estesa banca dati a disposizione in un singolo Centro.
Inoltre, grazie alla disponibilità del nostro modello murino di CPVT è
stato possibile dimostrare l’origine focale delle aritmie. L’insorgere delle aritmie ventricolari è differente in funzione della presenza o assenza
della mutazione a carico del gene RyR2 (l’origine al ventricolo destro è
tipica della tachicardia causata da RyR2-CPVT).
Studi di mappatura ottica ed esperimenti in vitro di biofisica su cellule
cardiache isolate, hanno dimostrato che il sistema di Purkinje è molto
suscettibile a subire post-potenziali tardivi (DADs) e triggered activity.
Il progetto di ricerca ha anche permesso di valutare obiettivi clinici attraverso numerosi studi in vivo e in vitro. Abbiamo studiato diverse
classi di composti per valutarne i meccanismi modulatori su RyR2. Tali
classi di composti sono calcio antagonisti, bloccanti del canale RyR2,
modulatori della cascata adrenergica e agenti capaci di controllare la
frequenza cardiaca. Due sostanze sono risultate promettenti e potrebbero avere una diretta applicabilità clinica: l’Ivabradina, capace di ridurre drasticamente l’inducibilità delle aritmie dopo stress adrenergico, e il KN-93, un inibitore della Calmodulina Kinasi II (mediatore del
segnale adrenergico della proteina canale RyR2), che reprime completamente l’insorgere delle aritmie nei topi CPVT, previene l’inducibilità
delle DADs e la triggered activity in vitro.
Nel complesso pensiamo che questo progetto abbia soddisfatto gli
obietti proposti e costituisca un passo in avanti nella comprensione
della patologia ed un miglioramento delle possibilità terapeutiche.
(1) Dipartimento di Biologia, Università degli Studi di Padova
(2) Dipartimento di Scienze Medico-Diagnostiche e Terapie Speciali, Università
degli Studi di Padova
(3) Dipartimento di Scienze Cardiologiche, Toraciche e Vascolari, Università degli Studi di Padova
La cardiomiopatia aritmogena del ventricolo destro (Arrhytmogenic
Right Ventricular Cardiomyopathy-ARVC) è una malattia ereditaria
caratterizzata da necrosi dei cardiomiociti con sostituzione fibro-adiposa La malattia è di origine genetica and numerosi geni malattia
sono stati finora identificati. L’espressione clinica è variabile. Durante il primo anno del progetto abbiamo tentato di stabilire la penetranza clinica della malattia in soggetti portatori di mutazione causativa dei geni finora identificati nella nostra casistica (PKP2, DSP,
DSG2) attraverso l’analisi clinico strumentale di 137 soggetti portatori di mutazione (PKP2: n. 39, DSP: n.46, DSG2: n. 29, mutazioni
multiple-MM: 23). Tra i soggetti portatori di MM la malattia mostrava
una penetranza maggiore rispetto ai portatori di mutazione singola.
Il grado di penetranza nel gruppo MM differiva in maniera significativa se si paragonavano i vari tipi di mutazione. I nove pazienti portatori di 2 mutazioni dello stesso gene ereditato in trans mostravano
una penetranza del 100%, mentre i 12 soggetti con 2 mutazioni di
due geni differenti ereditati da entrambi i genitori mostravano una
penetranza del 40%. Inoltre gli eterozigoti composti per mutazioni
dello stesso gene mostravano un’espressione clinica più severa in
termini elettrocardiografici ed ecocardiografici.
Poiché mutazioni in geni ARVC noti sono identificate nel 50% circa
dei probandi, si ipotizza il coinvolgimento di altri geni nella determinazione della malattia. La ricerca di nuovi geni e loci è stata quindi
effettuata attraverso due approcci differenti: screening di geni candidati e genome wide search. In accordo con l’ipotesi che l’ARVC è per
lo più dovuta a difetti dei desmosomi, i geni PKP4 (plakophilin-4) e
PERP (p53 apoptosis effector related to PMP-22) sono stati considerati dei buoni candidati.
Lo screening di entrambi i geni in 80 casi indice ha permesso di
identificare alcune variazioni nucleotidiche, che non sembrano però
essere mutazioni causative. Ciò suggerisce che PKP4 e PERP non sono probabilmente coinvolti nell’ARVC.
Un’analisi di tutto il genoma è stata effettuata sul DNA di soggetti
appartenenti a tre grandi famiglie con ricorrenza di ARVC e in cui
non era stata identificata alcuna mutazione causativa. E’ stato utilizzato il set di marcatori SNP ad alta densità HumanHap 370K Duo
BeadChip (Illumina). In tutte tre le famiglie sono stati ottenuti valori positivi di LOD score per specifiche regioni cromosomiche. In particolare, l’analisi nella prima famiglia ha permesso di mappare un
nuovo locus ARVC sul cromosoma 19p13.3 (multipoint LOD score
3,85). L’identificazione di nuovi geni ARVC consentirà di studiare in
dettaglio i meccanismi patogenetici della malattia e di sviluppare in
seguito specifici trattamenti farmacologici.
ABSTRACT N. 187
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
ABSTRACT N. 186
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 3
PRIORI SILVIA GIULIANA
GGP06007
431.050
Durata (anni): 3
GGP07016
220.900
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2007
VARIABILITÀ DEL RISCHIO PER ARITMIE E MORTE IMPROVVISA NELLA SINDROME DEL QT LUNGO. IDENTIFICAZIONE E
RUOLO DEI GENI MODIFICATORI
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
SCHWARTZ PETER J.
Crotti Lia (1,2,3), Insolia Roberto (2,3), Spazzolini Carla (1), Monti
Maria Cristina (4), Iannopollo Gianmarco (1), Goosen Althea (5), Brink
Paul A. (5), George Jr Alfred L. (6), Schwartz Peter J. (1,2,3,5,7)
Anno d’inizio: 2006
CARATTERIZZAZIONE DI UN MODELLO MURINO KNOCK-IN
DI MORTE CARDIACA IMPROVVISA SU BASE GENETICA: IMPLICAZIONI PER LA GESTIONE DI PAZIENTI AFFETTI DA TACHICARDIA VENTRICOLARE CATECOLAMINERGICA
(1) Dipartimento di Cardiologia, Fondazione IRCCS Policlinico S. Matteo, Pavia
- Viale Golgi, 19, 27100 Pavia, Italy. Tel. +39-0382-503567/503673 Fax +390382-503002 E-mail: [email protected]
(2) Sezione di Cardiologia, Dipartimento di Scienze Ematologiche, Pneumologiche, Cardiovascolari mediche e chirurgiche, Università di Pavia, Pavia, Italy
(3) Laboratorio di Cardiologia Molecolare, Fondazione IRCCS Policlinico S. Matteo, Pavia, Italy
(4) Dipartimento di Scienza della Salute, Università di Pavia; Dipartimento di
Biostatistica, Columbia University Medical Center, New York, USA
(5) Dipartimento di Medicina, Università di Stellenbosch, South Africa
(6) Dipartimento di Medicina e Farmacologia, Università di Vanderbilt, Nashville, USA
(7) Laboratorio di Genetica Cardiovascolare, Hatter Institute for Cardiovascular Research, Department of Medicine, University of Cape Town, Cape Town, South Africa
Denegri Marco (1), Liu Nian (5), De Giuli Luciana (1), Bloise Raffaella (1), Avelino-Cruz Josè Everardo (1), Arcelli Diego (2), Caprini
Elisabetta (2), Russo Giandomenico (2), Citterich Mauro Helmer
(2), Scellini Beatrice (3), Poggesi Corrado (3), Tesi Chiara (3), Belus Alexandra (3), Cerbai Elisabetta (3), Piroddi Nicoletta (3), Sartiani Laura (3), Napolitano Carlo (1,5), Priori Silvia Giuliana (1,4,5)
(1) Cardiologia Molecolare, I.R.C.C.S.-Fondazione Salvatore Maugeri Via Salvatore Maugeri n° 4, 27100, Pavia, Tel.0382-592040, Fax 0382-592094-59,
[email protected], [email protected]
(2) Laboratorio di Oncologia Molecolare, Unità Bioinformatica, Istituto Dermopatico dell’Immacolata (IDI) I.R.C.C.S.
(3) Centro Interuniversitario di Medicina Molecolare e Biofisica Applicata
(CIMMBA) e Dipartimento di Scienze Fisiologiche, Università di Firenze
(4) Dipartimento di Cardiologia, Università di Pavia
(5) Cardiovascular Genetics, Leon H. Charney Division of Cardiology, New York
University School of Medicine, New York, USA
La sindrome del QT lungo (LQTS), patologia monogenica ereditaria,
rappresenta la prima causa di morte cardiaca improvvisa al di sotto
dei 20 anni, a seguito di aritmie ventricolari maligne. Caratteristica
della LQTS è la penetranza incompleta, ossia la possibile assenza di
segni clinici di malattia in soggetti portatori del difetto genetico.
Inoltre, la stessa mutazione può manifestare una espressione variabile della malattia tra i soggetti della stessa famiglia (espressività
variabile). Tutto questo pone le basi razionali per la ricerca di geni
106
033-132 Abstract-11_ITA.qxd:telethon 021-234 Abstract
21-02-2011
15:54
Pagina 107
PROGETTI DI RICERCA TELETHON
modificatori (GM) che possano giustificare un fenotipo variabile pur
in presenza dello stesso difetto genetico. L’identificazione di GM
nelle patologie a trasmissione mendeliana, oltre a migliorare la diagnostica di tipo molecolare, permetterebbe di stratificare il rischio
aritmico in maniera più accurata. Pertanto, lo scopo del nostro lavoro consiste nell’individuare GM del rischio aritmico, utilizzando la
LQTS come modello.
Per studiare adeguatamente i GM è opportuno esaminare le founder
populations (FP), nelle quali tutti i soggetti discendono da uno stesso antenato e condividono lo stesso difetto genetico. Abbiamo inizialmente indagato una FP in Sud Africa e ora stiamo validando i risultati in una FP finlandese. Sono state identificate 22 famiglie con
un capostipite Boero che intorno al 1670 emigrò dall’Olanda in Sud
Africa, e nelle quali segrega la mutazione KCNQ1-A341V. Il gene
KCNQ1 codifica per la corrente IKs ed è responsabile della variante
LQT1, la forma più frequente di LQTS, in cui la maggioranza (90%)
degli eventi cardiaci si associa ad una aumentata attività simpatica,
solitamente associata all’esercizio fisico e alle emozioni improvvise.
Abbiamo dimostrato nella popolazione sudafricana come elevati valori di frequenza cardiaca e di sensibilità barocettiva (BRS), quale
indice della risposta autonomica, si associno ad un alto rischio di
sviluppare eventi cardiaci. Inoltre, é stata individuata una correlazione tra la BRS e due polimorfismi (SNPs) nei geni codificanti recettori adrenergici (ADRA2C-del322-325; ADRB1-R389) ed associati
a una aumentata risposta simpatica.
Recenti studi su tutto il genoma hanno dimostrato nella popolazione
generale una associazione di alcuni SNPs del NOS1AP sia con la durata dell’intervallo QT che con la morte improvvisa. Abbiamo pertanto verificato se NOS1AP potesse essere un GM della LQTS nella
popolazione sudafricana. Abbiamo quindi dimostrato: a) un’associazione tra gli alleli minori di due SNPs (rs4657139; rs16847548) e la
probabilità di avere un QTc più lungo tra i portatori della mutazione; b) una probabilità superiore rispettivamente di 1,4 o 1,8 volte
di sviluppare aritmie maligne per gli individui KCNQ1-A341V, con
almeno una copia dell’allele minore su rs16847548 o rs4657139.
Questo studio rappresenta la prima evidenza di un’associazione statisticamente significativa tra polimorfismi genetici ed il rischio di
eventi cardiaci severi.
disponibili, i pazienti LQT3 possono soffrire di eventi cardiaci severi,
nonostante la terapia.
Obiettivo del nostro progetto è quello di sviluppare una innovativa
terapia genica per i pazienti LQT3. Lo studio verrà inizialmente condotto in un ceppo di topi transgenici, eterozigoti per la mutazione
deltaKPQ nel canale al sodio SCN5A. Questo modello animale, caratterizzato da un fenotipo estremamente simile a quello dei pazienti
LQT3 deltaKPQ, rappresenta un prezioso strumento per condurre
una ricerca di tipo traslazionale. La tecnologia degli short interfering
RNA (siRNA), con l’impiego di un vettore adeno-virale (AAV), sarà
impiegata per silenziare l’espressione dell’allele mutato. Inoltre l’attività cardiaca dei topi transgenici sarà indagata mediante un monitoraggio Holter telemetrico sulle 24 ore. Questi studi saranno replicati
nella coorte di pazienti LQT3 portatori della stessa mutazione. Intendiamo quindi identificare specifici pattern che ci consentano di ottimizzare la stratificazione del rischio in questi pazienti.
Al momento, abbiamo selezionato una serie di molecole siRNA, selettivamente in grado di silenziare l’allele mutato. La validazione del
silenziamento è stata ottenuta valutando la riduzione della fluorescenza di EGFP. L’espressione della EGFP è ottenuta mediante un
RNA messaggero chimerico fra la sequenza codificante EGFP e un
segmento dell’RNA bersaglio. Per meglio caratterizzare il topo transgenico LQT3 e per identificare possibili nuovi fattori di rischio per
gli eventi cardiaci, stiamo anche studiando la relazione tra le variazioni nell’attività autonomica, la frequenza cardiaca e la ripolarizzazione ventricolare in questo modello animale.
Il prossimo passo sarà quello di trasfettare nel topo le molecole di
siRNA, attraverso l’impiego di un vettore AAV, per testare in vivo
l’effetto della terapia genica. Verrà quindi misurata la lunghezza del
QT e verrà testata l’inducibilità delle aritmie, prima e dopo la correzione genica. Stiamo inoltre seguendo una famiglia composta da diversi portatori della mutazione deltaKPQ, con una elevata incidenza
di morte cardiaca improvvisa ed arresto cardiaco. Nel caso di convincenti successi sperimentali nel modello murino, adottando le appropriate misure di sicurezza, sarà possibile verificare a livello clinico questo approccio di terapia genica per la cura dei pazienti LQT3.
ABSTRACT N. 189
ABSTRACT N. 188
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
CROTTI LIA
Totale
383.700
Telethon grant N.
Num Centri: 4
Telethon grant N.
Totale
GGP09247
Durata (anni): 3
Num Centri: 2
Anno d’inizio: 2009
PIERONI MAURIZIO
GGP10186
336.000
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2010
IDENTIFICAZIONE DEI PREDITTORI GENETICI, ELETTROANATOMICI E STRUTTURALI DI ARITMIE VENTRICOLARI MALIGNE IN PAZIENTI CON SINDROME DI BRUGADA
DAL TOPO ALL’UOMO: VERSO L’IDENTIFICAZIONE DI UNA
TERAPIA GENICA PER LA VARIANTE LQT3 DI SINDROME DEL
QT LUNGO
Oliva Antonio (2), Smaldone Costantino (1), Partemi Sara (1), Severino Anna (1), Bellocci Fulvio (1), Pascali Vincenzo (2), Crea Filippo (1), Pieroni Maurizio (1)
Insolia Roberto (2,3), Mugione Alessandra (2), Calvillo Laura (4),
Besana Alessandra (5), Zentilin Lorena (6), Porta Alberto (7), Montano Nicola (8), Giacca Mauro (6), Schwartz Peter J. (1,2,3,5,9),
Crotti Lia (1,2,3)
(1) Cardiology Department, Catholic University, Rome - Largo Agostino Gemelli
1, 00168 Roma, [email protected]
(2) Institute of Legal Medicine, Catholic University, Rome
(1) Dipartimento di Cardiologia, Fondazione IRCCS Policlinico S. Matteo, Pavia
- Viale Golgi, 19, 27100 Pavia. Tel. +39-0382-501323/501322. Fax +39-0382501322. E-mail: [email protected]
(2) Laboratorio di Cardiologia Molecolare, Fondazione IRCCS Policlinico S. Matteo, Pavia
(3) Sezione di Cardiologia, Dipartimento di Scienze Ematologiche, Pneumologiche, Cardiovascolari mediche e chirurgiche, Università di Pavia, Pavia
(4) IRCCS Istituto Auxologico Italiano, Baranzate di Bollate (MI)
(5) Unità di Elettrofisiologia Cellulare, Laboratorio di Genetica Cardiovascolare
IRCCS Istituto Auxologico Italiano, Cusano Milanino (MI)
(6) International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology, Trieste
(ICGEB)
(7) Università di Milano e Istituto Ortopedico Galeazzi, Milano
(8) Università di Milano e Ospedale Sacco, Milano
(9) Laboratorio di Genetica Cardiovascolare, Hatter Institute for Cardiovascular Research, Department of Medicine, University of Cape Town, Cape Town, South Africa
Premessa
La sindrome di Brugada è una malattia cardiaca su base genetica
caratterizzata dalla disfunzione di canali ionici che regolano il flusso
ionico trans-membrana e, quindi, l’attività elettrica delle cellule cardiache. I pazienti affetti da questa malattia possono andare incontro a morte improvvisa causata dall’insorgenza, non prevedibile, di
aritmie ventricolari maligne. Nonostante negli ultimi anni la conoscenza delle basi genetiche della malattia sia progredita, non è ancora chiaro il ruolo della mutazione genetica e delle alterazioni
strutturali del tessuto miocardico nello scatenare le aritmie maligne.
Attualmente non sono stati fatti progressi nella comprensione dei
meccanismi alla base dell’insorgenza delle aritmie e, quindi, non disponiamo di migliori mezzi di prevenzione e terapia delle aritmie.
Obiettivi dello studio
Con questo progetto intendiamo chiarire i meccanismi che portano
dalla mutazione dei canali ionici alla genesi delle aritmie, cercando
in particolare di identificare l’importanza del background genetico e
delle alterazioni strutturali del tessuto miocardico.
Obiettivi specifici
Lo studio proposto intende correlare le alterazioni elettroanatomiche, con le anomalie genetiche e strutturali, per identificare i meccanismi che scatenano le aritmie ed eventuali markers prognostici
che permettano di riconoscere i pazienti ad alto rischio candidati ad
un approccio terapeutico più aggressivo.
Descrizione del progetto
La sindrome del QT lungo (LQTS) è una delle principali cause di
morte cardiaca improvvisa in età giovanile ed è caratterizzata da un
prolungamento dell’intervallo QT all’ECG di superficie, e da un aumentato rischio di aritmie ventricolari maligne. Diverse mutazioni
sono state identificate alla base della malattia e quasi tutti i geni
implicati codificano per canali ionici cardiaci. Le tre varianti più comuni sono la LQT1 e la LQT2 (mutazioni loss-of-function nei canali
al potassio) e la LQT3 (mutazioni gain-of-function nel canale al sodio). Mentre i pazienti LQT1 LQT2 sono ben protetti con le terapie
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
I pazienti con diagnosi di Sindrome di Brugada arruolati, verranno
sottoposti ad una accurata valutazione mediante studi non invasivi
ed invasivi, comprendenti ecocardiogramma, risonanza magnetica
cardiaca e mappaggio elettroanatomico con biopsie endomiocardiche multiple del ventricolo destro. In particolare le biopsie verranno
eseguite secondo una nuova metodica messa a punto nella nostra
Università, che permette di prelevare frammenti di miocardio da zone del ventricolo che presentino anomalie elettriche al mappaggio
elettroanatomico. Sulle biopsie endomiocardiche verranno condotti i
seguenti studi: istologia ed immunoistochimica, RT-PCR per la ricerca di virus cardiotropi, RT-PCR per analizzare l’espressione del canale ionico WT e mutato nel tessuto miocardico, microscopia elettronica per rilevare alterazioni ultrastrutturali. Verranno inoltre eseguiti studi di elettrofisiologia cellulare su miociti isolati da biopsia.
In tutti i pazienti eseguiremo l’analisi genetica e lo studio in vitro
della funzione dei canali ionici.
I pazienti verranno sottoposti ad impianto di defibrillatore se indicato
secondo le attuali linee guida (della American Heart Association-American College of Cardiology e della European Society of Cardiology) e
verranno seguiti per un periodo di follow-up di almeno 2 anni. In
questo periodo valuteremo in modo non invasivo, l’evoluzione clinica
e la comparsa di aritmie per identificare eventuali fattori in grado di
discriminare tra pazienti ad aumentato rischio di morte improvvisa e
quelli che possono essere rassicurati a riguardo della prognosi. Tutto
ciò è finalizzato ad elaborare nuove strategie terapeutiche ed una migliore stratificazione del rischio in questi giovani pazienti.
Risultati preliminari
Sulla base dei nostri risultati preliminari sui primi pazienti studiati
riteniamo di poter identificare il ruolo specifico del background genetico e di alterazioni strutturali nella aritmogenesi e quindi di identificare strumenti utili per una più precisa stratificazione prognostica
ed una miglior prevenzione della morte improvvisa.
NCT00683124) ed è riconosciuto dalla Agenzia Italiana del Farmaco
(num. EudraCT 2008-001462-81).
Al 31/12/2010 sono arruolati 221 pazienti. Ognuno è stato sottoposto
a valutazione clinica basale: ECG, ecocardiogramma standard e valutazione aortica secondo il metodo di Roman, con calcolo dello z-score
[Roman MJ, Am J Cardiol 1989], esami ematochimici, test QoL (questionario SF-36). In base alle esigenze cliniche i successivi controlli sono programmati ogni 6 o 12 mesi. Prevediamo di completare l’arruolamento entro i primi 8 mesi del 2011. Finora 189 pazienti sono ritornati
al primo controllo, 150 al secondo, 75 al terzo e 25 al quarto.
Conclusioni. L’analisi ad interim è programmata al termine del secondo anno dello studio, che al momento è completo per 78 pazienti. Ad
oggi nessuno dei pazienti ha presentato dissezione aortica. Due pazienti hanno abbandonato lo studio avendo richiesto l’intervento elettivo di correzione dell’aneurisma aortico e due pazienti per sopravvenuta indicazione a terapia con ACE-inibitore. Entrambi i farmaci in
studio sono ben tollerati e non hanno causato effetti collaterali maggiori. Lo studio produrrà dati basati sull’evidenza su quale sia il miglior trattamento medico nella MFS e approfondirà i meccanismi patogenetici della malattia, farmacogenomici e trascrittomici che possono spiegare la responsività alla terapia e la variabilità fenotipica.
ABSTRACT N. 191
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 1
GGP08238
194.700
Anno d’inizio: 2009
Sacco Francesca (1), Gherardini Pier Federico (1), Tinti Michele (1),
Palma Anita (1), Corallino Salvatore (1), Ragnini-Wilson Antonella
(1,3), Paoluzi Serena (1), Neuman Beate (2), Heriche Jean-Karin
(2), Pepperkok Reiner (2), Ellenberg Jan (2), Helmer-Citterich Manuela (1), Castagnoli Luisa (1), Cesareni Gianni (1)
ARBUSTINI ELOISA
Durata (anni): 3
254.600
Durata (anni): 3
ANALISI DI RETI DI INTERAZIONE GENICA PER L’IDENTIFICAZIONE DI GENI IMPLICATI NELLE SINDROMI DI NOONAN
E LEOPARD
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Telethon grant N.
GGP09243
Telethon grant N.
ABSTRACT N. 190
Responsabile
CESARENI GIANNI
Responsabile
Anno d’inizio: 2008
(1) Department of Biology, University of Rome Tor Vergata, Rome, Italy
(2) Cell Biology and Biophysics Unit, European Molecular Biology Laboratory
(EMBL), Heidelberg, Germany
(3) High-throughput Microscopy facility; Department of Translational
and Cellular Pharmacology, Consorzio Mario Negri Sud, SM. Imbaro, Italy
EFFETTI DEL LOSARTAN VS. NEBIVOLOLO VS. L’ASSOCIAZIONE DEI DUE FARMACI SUI LIVELLI DI TGFB ATTIVO E
SUI PROFILI DI ESPRESSIONE QUANTITATIVA DEI GENI DEL
PATHWAY DEL TGFB IN 300 PAZIENTI CON SINDROME DI
MARFAN E MUTAZIONI DEL GENE FBN1
Il nostro progetto triennale mira allo sviluppo di una strategia sperimentale ed informatica per inferire geni che possano modificare l’espressione di geni malattia. Sebbene l’approccio sia generale il progetto finanziato da Telethon si focalizzerà sul “pathway” di RAS. Il
progetto ha due obbiettivi principali:
i) Produrre una lista ordinata in ordine di importanza di geni che
siano candidati modificatori del “pathway” di RAS.
ii) Sviluppare uno strumento informatico accessibile attraverso il
world wide web per la prioritizzazione di candidati geni malattia.
Durante il primo anno del progetto abbiamo mirato ad integrare il
prodotto del gene PTPN11, la fosfatasi SHP2, che è responsabile per
più del 50% delle mutazioni che causano le sindromi di Noonan e
Leopard nel contesto della rete di interazioni fisiche e funzionali del
proteoma umano. A questo scopo abbiamo utilizzato varie strategie
indipendenti.
i) Come primo approccio abbiamo sviluppato uno strumento di recupero automatico dell’informazione per estrarre dalla letteratura informazioni che riguardassero interazioni di SHP-2.
ii) Abbiamo quindi mirato a completare quest’informazione mediante
un approccio proteomico per identificare nuovi partner di interazione
e substrati di SHP2.
iii) Infine abbiamo utilizzato un approccio automatizzato di microscopia a fluorescenza per analizzare su larga scala l’effetto dell’inattivazione di ciascuna delle 300 fosfatasi umane su una varietà di fenotipi
cellulari. Discuteremo come l’integrazione di questi risultati possa
portare ad una lista di geni candidati da analizzare in pazienti.
Gambarin Fabiana I (1), Favalli Valentina (1), Serio Alessandra (1),
Disabella Eliana (1), Grasso Maurizia (1), Canclini Camilla (1), Regazzi Mario (2), Broglia Monica (2), Klersy Catherine (3), Dore Roberto (4), Arbustini Eloisa (1)
(1) Centre for Inherited Cardiovascular Diseases, IRCCS Policlinico San Matteo
Piazzale Golgi 2 27100 Pavia, Italy. email: [email protected]
(2) Farmacologia e Farmacocinetica, IRCCS Fondazione Policlinico San Matteo
(3) Servizio di Biometria ed Epidemiologia Clinica, IRCCS Fondazione Policlinico
San Matteo
(4) Radiologia, IRCCS Fondazione Policlinico San Matteo
Introduzione. La sindrome di Marfan (MFS) è una malattia genetica rara causata da mutazioni di Fibrillina 1 (3:10.000 individui). L’aneurisma della radice aortica (>80% dei casi) può complicarsi con la dissezione aortica per diametri =5 cm. Il Fattore di Crescita Trasformante
beta 1 (TGFbeta1) ha un ruolo chiave nel danno della parete aortica.
In studi animali il blocco del TGFbeta previene il danno strutturale e la
dilatazione aortica: pertanto i sartani (ARB), che inibiscono tale molecola, sono indicati nella terapia della MFS [Shin GT, Am J Kidney Dis
2000(2); Fukuda N, Am J Hypertens 2000]. In passato sono stati usati
i beta bloccanti (BB), ma esiste discordanza sulla loro efficacia nel prevenire la dissezione aortica.
Metodi. È uno studio in aperto di fase III; include 291 pazienti affetti
da MFS con dimostrata mutazione su FBN1 e dilatazione aortica. I pazienti sono randomizzati a terapia con Losartan, Nebivololo o entrambi. Obiettivo primario è la valutazione comparativa dell’efficacia dei
farmaci sulla progressione dimensionale della radice aortica. Gli obiettivi secondari comprendono la farmacocinetica dei farmaci, il dosaggio
comparativo dei livelli di TGFB totale ed attivato, l’analisi quantitativa
dell’espressione del gene mutato, le basi farmacogenetiche della risposta alla terapia. È inoltre stimata la qualità di vita (QoL) nei tre
gruppi. L’analisi statistica comprende una analisi ad interim al mese
24 e analisi conclusive al mese 48. Il Comitato Etico locale ha approvato lo studio. Esso è registrato in ClinicalTrials.gov (OMS: num.
ABSTRACT N. 192
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
108
TARTAGLIA MARCO
GGP10020
231.700
Durata (anni): 2
Anno d’inizio: 2010
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15:54
Pagina 109
PROGETTI DI RICERCA TELETHON
BASI MOLECOLARI DELLA SINDROME DI NOONAN E DELLE
MALATTIE GENETICHE AD ESSA CORRELATE
Ammirabile Grazia (1), Tessari Alessandra (1), Sutera Sardo Fabio
(1), Pignataro Viviana (1), Sedmera David (2), Campione Marina (1)
Cordeddu Viviana (1), Martinelli Simone (1), Carta Claudio (1),
Pantaleoni Francesca (1), Fodale Valentina (1), Flex Elisabetta (1),
Caputo Viviana (1), Stellacci Emilia (1), Zampino Giuseppe (2), Digilio Maria C (3), Mazzanti Laura (4), Sarkozy Anna (5), Rossi Cesare (6), De Luca Alessandro (5), Di Schiavi Elia (7), Dallapiccola Bruno (3,5), Ma’ayan Avi (8), Pennacchio Len A (9), Zenker Martin
(10), Gelb Bruce D (8), Tartaglia Marco (1)
(1) CNR- Istituto di Neuroscienze - Viale G. Colombo,3-35121 Padova
(2) Institute of Animal Physiology and Genetics, Praha, Czech Republic
Capire le vie molecolari che regolano la crescita e la funzionalità
cardiaca è cruciale per prevenire e curare le malattie cardiache. Il
gene homeobox Pitx2 gioca un ruolo importante in questi processi,
dato che è richiesto per conferire l’identità atriale destra e per regolare il rimodellamanto asimmetrico ventricolare.
Abbiamo generato un knock out miocardio specifico del gene Pitx2 incrociando topi in cui il gene Pitx2 è floxato con i topi in cui la Cre recombinasi è sotto il controllo del promotore “cardiac troponin T” (cTnT). In
tali topi il gene viene deleto fin dai primi stati della cardiomiogenesi.
Gli embrioni cTnT Cre-Pitx2 ko (cTP komyo) presentano isomerismo
atriale destro, che è accompagnato dalla presenza di due nodi seno
atriali (SAN). Il SAN ectopico di sinistra presenta un pattern molecolare identico a quello del SAN costitutivo destro, ed è funzionale,
come dimostrato da esperimenti di optical mapping. Il modello di
topi ko myo Pitx2 è quindi un buon modello per esplorare come si
genera l’ asimmetria destra del SAN.
E’ stato dimostrato che i precursori del SAN sono identificabili nel
topo ad E8.5 come una regione bilaterale caratterizzata dalla coespressione dei fattori di trascrizione Isl1 e Tbx18, tuttavia già a
E9.5 l’espressione di Isl1 è localizzata esclusivamente nel lato destro. Mediante ibridazione in situ abbiamo visto che negli embrioni
Pitx2 komyo la coespressione simmetrica di Isl e Tbx18 è mantenuta anche a sinistra nel miocardio appena differenziato. Tale risultato
indica che l’espressione di Pitx2 nei precursori cardiaci di sinistra è
necessaria per prevenire il differenziamento di un SAN funzionale
sinistro mediante la repressione dell’ espressione di Isl1.
Mutazioni nel gene Pitx2 umano sono responsabili della syndrome
di Rieger, un disordine autosomico dominante caratterizzato, tra
l’altro, da difetti cardiaci quali difetti di settazione atriale, difetti
delle valvole atrioventricolari e anomalie di conduzione. A tale riguardo, l’analisi ECG di topi adulti cTP eterozigoti ha evidenziato un
ridotto battito cardiaco, episodi di flutter atriale e problemi di conduzione ventricolare.
I nostri studi sono focalizzati alla comprensioni delle basi molecolari
mediante le quali Pitx2 conferisce l’identità atriale di sinistra e regola la funzionalità ventricolare.
(1) Istituto Superiore di Sanita’, Roma - Dipartimento di Ematologia, Oncologia
e Medicina Molecolare, Istituto Superiore di Sanita’, Viale Regina Elena, 299 00161 Roma. Tel: 0649902569, Fax: 0649902850, Email: [email protected]
(2) Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma
(3) Ospedale Bambino Gesù, Roma
(4) Università di Bologna, Bologna
(5) Istituto Mendel-IRCCS ‘‘Casa Sollievo della Sofferenza’’, Roma
(6) Policlinico S. Orsola-Malpighi, Bologna
(7) Istituto di Genetica e Biofisica ‘A. Buzzati Traverso’, CNR, Napoli
(8) Mount Sinai School of Medicine, New York, NY, USA
(9) Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA, USA
(10) Institute of Human Genetics, University Hospital, Magdeburg, Germany
La Sindrome di Noonan (SN) è tra le più comuni malattie genetiche
associate a difetti dello sviluppo e della crescita. Precedentemente,
abbiamo dimostrato che mutazioni germinali di PTPN11, KRAS e
SOS1 rappresentano la causa molecolare della malattia nel 60% dei
casi, suggerendo che la disregolazione della via di trasduzione del
segnale mediata da RAS ne rappresenti il meccanismo patogenetico.
Nel progetto GGP07115 (2007-2009) recentemente concluso e in
quello appena avviato (GGP10020, 2010-2012) ci siamo proposti i
seguenti obiettivi: identificare nuovi geni-malattia, chiarire i meccanismi patogenetici e caratterizzare le relazioni genotipo-fenotipo con rilevanza clinica. Di seguito, presentiamo i risultati più rilevanti ottenuti
nell’ambito dei suddetti progetti.
Tramite un approccio basato sull’analisi di un pannello di geni candidati codificanti per proteine con un ruolo chiave nella via di RAS, abbiamo identificato 4 nuovi geni implicati nella malattia: RAF1,
SHOC2, NRAS e CBL. RAF1 codifica per un effettore di RAS con attività serin/treonin chinasica. Le mutazioni di RAF1 sono responsabili
del 5-10% dei casi e sono fortemente associate a cardiomiopatia
ipertrofica. La maggior parte dei difetti coinvolge un sito di regolazione con funzione inibitoria e promuove l’iperattivazione della proteina
e della cascata MAPK (Pandit et al. 2007, Nat Genet 39:1007-12).
SHOC2 codifica per una proteina adattatrice che funziona come subunità regolatoria della proteina fosfatasi 1, la cui attività è richiesta per la corretta attivazione di RAF1. La mutazione 4A>G (S2G),
individuata nel 5% dei soggetti affetti, è associata a deficit cognitivi
e anomalie ectodermiche. La mutazione introduce un sito di miristilazione che ha come conseguenza la traslocazione della proteina in
membrana plasmatica e l’attivazione della cascata MAPK (Cordeddu
et al. 2009, Nat Genet, 41:1022-6).
Abbiamo inoltre dimostrato che mutazioni germinali di NRAS causano
la SN favorendo l’attivazione delle MAPK in risposta a fattori di crescita. I difetti di NRAS associati a SN non coinvolgono residui normalmente mutati nel cancro, suggerendo un diverso ruolo funzionale delle due classi di mutazioni (Cirstea et al. 2010, Nat Genet, 42:27-9).
Infine, mutazioni germinali nel gene onco-soppressore CBL, codificante una proteina adattatrice con attività ubiquitin-ligasica, causano una nuova condizione sindromica all’interno dello spettro fenotipico della SN. Le mutazioni di CBL rendono la proteina incapace di
mediare il processo di degradazione di recettori cellulari che contribuisce alla modulazione negativa del flusso del segnale lungo la via
di trasduzione (Martinelli et al. 2010, Am J Hum Genet, 87:250-7).
Accanto alle implicazioni diagnostiche e prognostiche, queste scoperte rappresentano un fondamentale passo in avanti per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici mirati al trattamento degli aspetti
postnatali della SN, quali la cardiomiopatia ipertrofica, la bassa statura e i deficit cognitivi.
ABSTRACT N. 194
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 3
Totale
Num Centri: 1
La sindrome del cuore sinistro ipoplasico (HLHS) è una malformazioni cardiaca congenita grave, caratterizzata dall’iposviluppo delle
strutture del complesso cuore sinistro-aorta con anomalie del miocardio ventricolare sinistro. Senza intervento chirurgico nei primi
giorni di vita, HLHS ha un esito fatale. Ci sono forti evidenze a sostegno dell’eziologia genetica di HLHS e molteplici loci genetici sono
stati implicati in HLHS, anche se nessun gene o pathway ad oggi
identificato sembra essere specifico per queste malformazioni cardiache. Lo scopo di questo studio è l’identificazione delle basi genetiche di HLHS per chiarire il meccanismo alla base della malattia. A
questo scopo, abbiamo analizzato 53 pazienti ben caratterizzati da
un punto di vista clinico, utilizzando un approccio integrato che
combinava il sequenziamento di cinque geni candidati (NKX2-5,
NOTCH1, HAND1, FOXC2 e FOXL1) e un’analisi genome-wide con
array CGH ad alta risoluzione. Abbiamo identificato in 30 pazienti:
due mutazioni de novo in NOTCH1, 8 varianti rare ereditate in NOTCH1, FOXC2 e FOXL1 e 33 copy number variations. Tutte le variazioni identificate sembrano essere associate alla malattia ed alcune
GGP08112
293.000
Anno d’inizio: 2007
(1) Laboratorio di Genetica Medica, Ospedali Riuniti, Largo Barozzi, 1, Bergamo, Italy
(2) Genetica Medica, Università di Pavia, Pavia, Italy
(3) Dipartimento Cardiovascolare, Ospedali Riuniti, Bergamo, Italy
CAMPIONE MARINA MONICA
Durata (anni): 3
269.900
Durata (anni): 2
Iascone Maria (1), Ciccone Roberto (2), Lorenzo Galletti (3), Daniela Marchetti (1), Duccio Federici (3), Anna Rita Lincesso (1), Laura
Pezzoli (1), Paolo Ferrazzi (3), Orsetta Zuffardi (2)
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Telethon grant N.
GGP07235
LA DISSEZIONE DEI MECCANISMI GENETICI DELLA SINDROME DEL CUORE SINISTRO IPOPLASICO SUGGERISCE UN MODELLO “MULTIPLE-HITS”
ABSTRACT N. 193
Responsabile
ZUFFARDI ORSETTA
Anno d’inizio: 2008
IL GENE HOMEOBOX PITX2, MUTATO NELLA SINDROME DI
RIEGER, È CRUCIALE PER DETERMINARE L’IDENTITÀ E LA
FUNZIONE DEL NODO SENOATRIALE
109
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15:55
Pagina 110
PROGETTI DI RICERCA TELETHON
di essi coesistono nello stesso paziente. I nostri risultati suggeriscono che HLHS è caratterizzato da un modello eterogeneo e complesso di eredità con rare mutazioni de novo altamente penetranti o alterazioni multiple a bassa penetranza che contribuiscono all’eziologia della malattia. L’analisi in silico delle anomalie individuate, inoltre, mostra una associazione funzionale tra sette geni coinvolti nello
sviluppo della valvola cardiaca indicando che HLHS è almeno in parte una malattia “valvolare”.
co (2), Baldassarre Damiano (1), Franceschini Guido (1), Gomaraschi Monica (1)
(1) Center E. Grossi Paoletti, Department of Pharmacological Sciences, Università degli Studi di Milano - Via Balzaretti 9, 20133 Milano, Tel 02-50319903,
fax 02-50319900, e-mail: [email protected]
(2) Department of Pharmacological and Biological Sciences and Applied Chemistries, University of Parma, Parma
Scopo del progetto è definire la rilevanza delle caratteristiche strutturali e funzionali delle HDL (profilo HDL) nel determinare il rischio
cardiovascolare (CV) di soggetti con difetti genetici delle HDL, disordini monogenici rari caratterizzati da livelli plasmatici di HDL-colesterolo (HDL-C) estremamente ridotti o elevati. I soggetti con basso
HDL-C dovrebbero essere esposti ad un aumentato rischio CV, mentre i soggetti con alti livelli di HDL-C dovrebbero essere protetti da
malattia cardiovascolare precoce; tuttavia, alcune mutazioni si associano a fenotipi paradossali. Nel corso del progetto il profilo HDL
verrà caratterizzato in portatori di mutazioni nei geni che codificano
per apoA-I, ABCA1, LCAT e CETP, valutando la struttura e la composizione delle HDL, e l’efficienza delle HDL nel trasporto inverso del
colesterolo e nel preservare la funzionalità endoteliale. Lo stato CV
dei portatori è valutato misurando l’ispessimento medio-intimale carotideo (IMT) e la vasodilatazione endotelio-dipendente (FMD).
I portatori di mutazioni nel gene LCAT presentano ridotti livelli plasmatici di HDL-C. Il loro profilo HDL è caratterizzato dall’assenza di
HDL2 e dalla prevalenza di prebeta-HDL. Le HDL di questi portatori
hanno una capacità di promuovere efflusso di colesterolo superiore
rispetto ad HDL controllo, grazie all’elevato contenuto di prebetaHDL. Inoltre, in cellule endoteliali le HDL dei soggetti con deficit di
LCAT hanno una normale attività anti-infiammatoria e una capacità
di attivare l’enzima eNOS superiore rispetto ad HDL controllo. Le
analisi di IMT e FMD confermano l’attività ateroprotettiva delle HDL
dei deficit di LCAT: i portatori hanno valori di IMT e FMD simili a
quelli dei soggetti controllo.
I portatori di mutazioni nel gene CETP presentano valori elevati di
HDL-C. Il loro profilo HDL è caratterizzato dall’accumulo di grandi
HDL2 ricche in apoE. Inoltre, il loro contenuto di colesterolo è superiore e quello di trigliceridi inferiore rispetto a HDL controllo. Le HDL
dei deficit di CETP sono meno efficaci delle HDL controllo nel promuovere efflusso di colesterolo, poiché l’aumento dell’efflusso
ABCG1-mediato non compensa la riduzione dell’efflusso ABCA1-mediato. In cellule endoteliali, le HDL dei deficit di CETP hanno una
normale attività anti-infiammatoria, dovuta alla superiore efficacia
delle loro HDL2 rispetto alle HDL2 di controllo. Le HDL dei deficit di
CETP hanno però una ridotta capacità di attivare eNOS, dovuta al
loro ridotto contenuto di sfingosina-1-fosfato.
Quindi, i portatori di mutazioni di LCAT non presentano un aumentato rischio CV nonostante la marcata riduzione di HDL-C,
poiché le loro HDL, prevalentemente piccole e discoidali, hanno
capacità ateroprotettive normali o addirittura superiori a normali
HDL. Al contrario, i portatori di mutazioni nel gene CETP hanno
valori di HDL-C elevati, ma gli esperimenti condotti finora indicano
che alcune delle attività ateroprotettive delle loro HDL potrebbero
essere compromesse.
ABSTRACT N. 195
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
VANONI MARIA ANTONIETTA
Responsabile
GGP10090
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
206.800
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2010
STUDI STRUTTURA-FUNZIONE SULLA 24-DEIDROCOLESTEROLO RIDUTTASI, L’ENZIMA DIFETTOSO NELLA DESMOSTEROLOSI, UNA GRAVE MALATTIA EREDITARIA A CARICO DEL
METABOLISMO DEGLI STEROLI
Zucchini Daniela, Vanoni Maria Antonietta
Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie - Via Celoria 26, 20131 Milano
La desmosterolosi e’ una rara malattia ereditaria che causa gravi difetti dello sviluppo. Essa e’ stata associata a mutazioni di un gene
che e’ stato proposto codificare la 24-deidrocolesterolo riduttasi
(DHCR24), l’enzima che catalizza la conversione di desmosterolo in
colesterolo nell’ultimo passo della biosintesi del colesterolo. E’ stato
anche dimostrato che la DHCR24 è identica ad un’altra proteina,
Seladin-1 (da “Selective Alzheimer Disease Indicator protein-1”),
un nuovo fattore antiapoptotico.
In base ad analisi di sequenza e esperimenti di localizzazione in varie
cellule è stato proposto che DHCR24 sia una flavoproteina associata
alla membrana del reticolo endoplasmico. Essa è stata trovata anche
associata alle embrane dell’apparato di Golgi e nel nucleo. Tuttavia,
la proteina non è mai stata isolata e caratterizzata in vitro. Pertanto
la sua identità, le attività catalitiche ad essa associate e il nesso tra
l’attività enzimatica e la funzioen anti-apoptotica restano da definire.
Inoltre, non sono stati ancora chiariti l’esistenza di isoforme, la localizzaione fine della proteina e quali stimoli ne possano determinare la
ridistribuzione in diversi compartimenti cellulari.
Per questi motivi abbiamo, recentemente, iniziato un progetto che
mira a produrre, purificare e caratterizzare biochimicamente la DHCR24 per usare i dati enzimologici per chiarire il ruolo di DHCR24/Seladin1 nella cellula. Ingegnerizzando il cDNA codificante la
DHCR24 umana e clonandolo in diversi vettori abbiamo già prodotto
una serie di plasmidi per la produzione della forma intera (in E. coli e S.
cerevisiae) e di forme troncate, mancanti di porzioni N-terminali (in E.
coli), queste ultime per l’identificazione dei limiti del dominio catalitico
solubile predetto da analisi di sequenza. In S.cerevisiae sono state ottenute quantità di proteina troppo basse per la sa successiva purificazione. In E. coli, solo forme mancanti dei primo 30-60 residui sono state prodotte in quantità massiccia. Forme più lunghe sono risultate tossiche e forme più brevi non sono state prodotte. Tuttavia, le proteine
sono principalmente associate ai corpi di inclusione. La purificazione
della quota solubile di diverse forme proteiche prodotte come fusione
N- o C-terminale con vari “tag” ha permesso di ottenere proteine omogeneee che, pero’ mostrano una forte tendenza ad aggregare e sono
prive di cofattore flavinico suggerendo che siano malripiegate.
Pertanto stiamo mettendo a punto nuovi protocolli di produzione di DHCR24 e di purificazione della proteina dalla frazione solubile o da corpi
di inclusione (dopo risolubilizzazione e seguita da esperimenti di rinaturazione). Parallelamente stiamo mettendo a punto i metodi di dosaggio
dell’attività desmosterolo riduttasica con metodi gascromatografici.
ABSTRACT N. 197
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 1
GOMARASCHI MONICA
86.500
Anno d’inizio: 2010
(1) Dipartimento di Biotecnologie, Università degli Studi di Siena - Via Fiorentina,
1, 53100, Siena. Tel.: 0577-234958; fax: 0577-234903; e-mail: [email protected]
(2) Sezione di Reumatologia, Dipartimento di Medicina Clinica e Scienze Immunologiche, Università degli Studi di Siena, Siena
(3) Centro Interdipartimentale per lo Studio Biochimico delle Patologie
Osteoarticolari, Università degli Studi di Siena, Siena
GGP08052
Durata (anni): 2
233.200
Durata (anni): 3
Spreafico Adriano (2,3), Braconi Daniela (1), Bernardini Giulia (1), Millucci Lia (1), Amato Loredana (1), Laschi Marcella (1), Ghezzi Lorenzo
(1), Chellini Federico (2), Tinti Laura (2), Santucci Annalisa (1,3)
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Telethon grant N.
GGP10058
ALLESTIMENTO DI MODELLI SPERIMENTALI DI ALCAPTONURIA E VALUTAZIONE PRECLINICA DI AGENTI TERAPEUTICI
PER IL TRATTAMENTO DELL’ARTROPATIA OCRONOTICA
ABSTRACT N. 196
Responsabile
SANTUCCI ANNALISA
Anno d’inizio: 2008
STRUTTURA ED ATTIVITÀ ATEROPROTETTIVE DELLE HDL IN
DIFETTI GENETICI DELLE HDL
Alcaptonuria (AKU) è una malattia rara dovuta a mutazioni del gene
HGD che provocano inattività dell’omogentisato 1,2-diossigenasi,
enzima del metabolismo della tirosina. AKU comporta accumulo di
Calabresi Laura (1), Conca Paola (1), Ossoli Alice (1), Bernini Fran-
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
ac. omogentisico (HGA) e ocronosi, cioè la deposizione di pigmenti
nel tessuto connettivo, che comporta gravi patologie delle articolazioni ed invalidità. Fino ad oggi la mancanza di modelli sperimentali
adatti ha limitato lo sviluppo di una terapia efficace per AKU.
Nei nostri laboratori, modelli di AKU di alta qualità sono stati sviluppati e caratterizzati dal punto di vista biochimico per identificare
biomarcatori di malattia. Inoltre, è stato valutato il trattamento con
anti-ossidanti, con ottimi risultati preliminari.
Inizialmente abbiamo usato linee di osteosarcoma come modelli cellulari in vitro. Cellule MG63, SaOS-2 e TE-85 sono state trattate con concentrazioni di HGA da 0.1 a 1 mM e sottoposte a microscopia ottica e a
trasmissione e a colorazione di Schmorl per il pigmento. Sono state valutate anche la crescita cellulare e sintesi di collagene. La deposizione
del pigmento nelle cellule e nella matrice associata è risultata essere
dose-dipendente nel range di HGA da 33 a 0.33 mM. La pigmentazione
in vitro era più veloce che in vivo, dipendente dalla presenza di cellule
e osservabile anche a concentrazioni non tossiche di HGA. Inibizione
cellulare e della sintesi di collagene è stata osservata fino a HGA 0.33
mM, e grave citotossicità con HGA 1 mM. L’analisi proteomica e redoxproteomica degli effetti di HGA e ac. ascorbico (ASC) sul proteoma condrocitario ha rivelato come HGA e ASC alterino i livelli di proteine del
folding, dell’organizzazione cellulare e della risposta allo stress e difesa
cellulare. I livelli aumentati di carbonili proteici nelle cellule trattate con
HGA o ASC ci hanno permesso di corroborare l’ipotesi di danno ossidativo mediato da HGA sulle proteine. Abbiamo quindi usato condrociti
articolari umani primari trattati con HGA 0.33 mM per saggiare gli effetti di ASC e NAC (soli o co-somministrati) come antiossidanti. Abbiamo valutato: apoptosi, vitalità, proliferazione e metabolismo. NAC ha
diminuito l’apoptosi HGA-indotta e parzialmente ripristinato la crescita
ed il rilascio di proteoglicani. Miglioramenti significativi sono stati ottenuti con la co-somministrazione dei 2 antiossidanti. Da ultimo, abbiamo
allestito un modello in vitro di siero umano trattato con HGA 0.33 mM e
testato la capacità degli antiossidanti ASC, NAC, ac. fitico (PHY), taurina (TAU), ac. ferulico (FER) e ac. lipoico (LIP) di prevenire o ritardare
la produzione di pigmento melanino-simile e ridurre l’ossidazione di
proteine. Il livello di fluorescenza del pigmento indotto da HGA è stato
usato per valutare l’efficacia dei composti. PHY, TAU, LIP e FER hanno
mostrato gli effetti più significativi di riduzione del pigmento e dell’ossidazione proteica, aprendo così la strada a nuove terapie antiossidanti
per il trattamento dell’ocronosi alcaptonurica.
Ubiad1 utilizzando modelli cellulari e animali per capire quali sono i
difetti molecolari alla base di questa patologia umana ed, quindi, sviluppare delle strategie terapeutiche adeguate, per effettuare della
terapia genica e/o cellulare su pazienti affetti da SCCD.
ABSTRACT N. 199
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 1
Dip di Biochimica e Biotecnologie Mediche, Università Federico II - via S. Pansini 5 - 80131 Napoli - tel 081-7463200 fax 081 7463205 - [email protected]
Frizzled4 (Fz4) è il gene responsabile della vitreoretinopatia essudativa familiare (FEVR), un grave difetto dello sviluppo caratterizzato da un’aberrante vascolarizzazione periferica della retina. La forma autosomica dominante della FEVR è causata da un frameshift
che modifica quasi l’intera coda citosolica del recettore Fz4 (Fz4-FEVR), il quale non raggiunge più la superficie cellulare e intrappola
anche la proteina wild-type all’interno della cellula. Fz4-FEVR ha
perso il motivo valinico C-terminale che gioca un ruolo importante
nel trasporto di molte proteine transmembrana. Ciò non spiega perché Fz4-FEVR non proceda lungo il pathway secretorio dato che la
rimozione di tali motivi in genere rallenta ma non blocca il trasporto. Noi riteniamo che Fz4 abbia un motivo nascosto di ritenzione/riciclo che viene smascherato dalla mutazione autosomica dominante. Quindi, il trasporto di Fz4 sarebbe modulato dal gioco di motivi “positivi” e “negativi”. Al fine di rivelare il meccanismo molecolare alla base della mancata espressione di Fz4-FEVR sulla membrana plasmatica, e di generare modelli cellulari e animali di FEVR per
esplorare strategie terapeutiche, abbiamo:
i) analizzato la localizzazione intracellulare di Fz4-FEVR mediante
microscopia confocale in cellule Huh7. Tale analisi ha rivelato una
quasi completa localizzazione nel Reticolo Endoplasmatico (RE),
suggerendo che un forte meccanismo di ritenzione prevenga l’uscita
dal RE di Fz4-FEVR;
ii) ampiamente mutagenizzato i 36 residui della coda citosolica di
Fz4-FEVR. La mutagenesi indica che la regione compresa tra i residui 23-28 gioca un ruolo importante nella ritenzione: troncando la
coda o sostituendo quei residui con alanina si assiste ad un significativo recupero dell’espressione in superficie. Inoltre, la coda citosolica di Fz4-FEVR determina ritenzione nel RE della proteina reporter chimerica VSVG-Fz4-FEVR. Questi risultati suggeriscono la presenza in Fz4-FEVR di un motivo di ritenzione nel RE. Inoltre, anche
la sostituzione in alanina dei residui T425K426 nel terzo loop intracellulare di Fz4-FEVR consente il parziale recupero in superficie,
suggerendo che anche questa regione possa essere coinvolta nella
ritenzione del recettore mutante;
iii) eseguito esperimenti di co-immunoprecipitazione seguiti da SDSgel e spettrometria di massa per identificare interattori proteici della
coda di Fz4-FEVR. La validazione dei putativi interattori è in corso;
iv) in collaborazione con BioGem (Ariano Irpino), abbiamo isolato
una linea cellulare murina di ES dopo ricombinazione omologa in cui
un allele Fz4 contiene la regione codificante la coda di Fz4-FEVR
umana. Questa linea cellulare è attualmente impiegata per generare una linea murina FEVR e per studiare l’espressione di Fz4 e Fz4FEVR durante il differenziamento delle cellule ES.
GGP10195
338.800
Anno d’inizio: 2009
D’Agostino Massimo, Lemma Valentina, Carmelo Ramona, Caporaso
Gabriella, Mallardo Massimo, Bonatti Stefano
SANTORO MASSIMO
Durata (anni): 3
151.300
Durata (anni): 2
COMPRENDERE IL MECCANISMO MOLECOLARE DI UNA FORMA DOMINANTE DELLA VITREORETINOPATIA ESSUDATIVA
FAMILIARE E GENERARE OPPORTUNI MODELLI SPERIMENTALI PER ESPLORARE STRATEGIE TERAPEUTICHE
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Telethon grant N.
GGP09029
Telethon grant N.
ABSTRACT N. 198
Responsabile
BONATTI STEFANO
Responsabile
Anno d’inizio: 2010
CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE E CELLULARE DI
UBIAD1, UN NUOVO PRODOTTO GENICO COINVOLTO NELLA
DISTROFIA DEL CRISTALLINO DI SCHNYDER
Vera Mugoni (1), Valeria Catanzaro (1), Elisa Deluca (1), Giuseppe
Digilio (1,2), Massimo Santoro (1,2)
(1) Molecular Biotechnology Center, University of Torino - Via Nizza 52, 10126 Torino
(2) DISAV, University of Piemonte Orientale
La Distrofia del Cristallino di Schnyder (Schnyder crystalline corneal
dystrophy; SCCD) è una malattia genetica autosomica dominante
caratterizzata da una progressiva cecità dovuta al progressivo accumulo di lipidi (colesterolo e fosfolipidi) nella cornea di questi pazienti. In una percentuale di questi individui sono stati individuati severi
problemi cardiovascolari la cui patogenesi è sconosciuta. La SCCD è
stata recentemente associata a mutazioni del gene UBIAD1. Ubiad1
è una proteina transmembrana con un putativo dominio preniltransferasico la cui funzione è totalmente sconosciuta. Un piccolo pesce
tropicale presente in molti acquari, detto pesce zebra o zebrafish, e
da qualche anno considerato un utile sistema modello per lo studio
di biologia di sviluppo dei vertebrati, viene attualmente utilizzato per
lo studio dei meccanismi evolutivamente conservati alla base di molte patologie umane. Il pesce zebra e particolarmente adatto per lo
studio del normale sviluppo dei vasisanguigni e di eventuali difetti
nel sistema cardiocircolatorio. Durante un recente screening genetico per individuare nuovi geni coinvolti nello sviluppo del sistema cardiovascolare abbiamo trovato due diversi mutanti del gene UBIAD1
di zebrafish. Questi linee mutanti che presentano mutazioni recessive di UBIAD1 presentano un fenotipo cardiovascolare molto evidente
la cui causa è ancora ignota e che ricordano molto quelle presenti
nei pazienti umani della malattia di Schnyder. In questo progetto ci
prefiggiamo di studiare i meccanismi di funzionamento della proteina
ABSTRACT N. 200
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 6
CARELLI VALERIO
GGP06233
645.800
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2006
DEGENERAZIONE DELLE CELLULE GANGLIONARI DELLA RETINA NELLE NEUROPATIE OTTICHE MITOCONDRIALI: IDENTIFICAZIONE DEI MECCANISMI PATOGENETICI
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
ABSTRACT N. 201
Giulia d’Amati (2), Anna Ghelli (3), Raffaele Lodi (4), Andrea Martinuzzi (5), Palmiro Cantatore (6), Valerio Carelli (1)
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
(1) Dipartimento di Scienze Neurologiche, Università di Bologna, Bologna - Via
Ugo Foscolo 7, 40123 Bologna
(2) Dipartimento di Medicina Sperimentale, Università “La Sapienza”, Roma
(3) Dipartimento di Biologia, Università di Bologna, Bologna
(4) Dipartimento di Medicina Clinica e Biotecnologia Applicata, Università di Bologna, Bologna
(5) IRCCS “E. Medea”, Conegliano (TV)
(6) Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare “Ernesto Quagliariello”,
Università di Bari, Bari
SIMONELLI FRANCESCA
Responsabile
GGP10199
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
221.800
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2010
STUDIO DI SICUREZZA ED EFFICACIA IN SOGGETTI CON
AMAUROSI CONGENITA DI LEBER (ACL) TRAMITE VETTORE
ADENO-ASSOCIATO PER TRASFERIRE IL GENE RPE65 UMANO NELL’EPITELIO PIGMENTATO DELLA RETINA (EPR):
TRATTAMENTO E FOLLOW-UP DI 3 PAZIENTI ITALIANI
Questo progetto ha indagato i meccanismi patogenetici che portano
alla neurodegenerazione le cellule gangliari della retina nella neuropatia ottica ereditaria di Leber (LHON; mutazioni del mtDNA in geni
per le subunità del complesso I e nell’atrofia ottica dominante
(DOA; mutazioni nel gene nucleare che codifica la proteina mitocondriale OPA1).
Entrambe le malattie presentano una penetranza incompleta e nella
LHON è evidente una prevalenza maschile. I risultati sono presentati come segue:
LHON:
1. Abbiamo dimostrato in cibridi LHON che gli estrogeni migliorano
significativamente la vitalità cellulare inducendo mitocondriogenesi,
riducendo lo stress ossidativo e aumentando il consumo di ossigeno, suggerendo quindi una spiegazione per la prevalenza di sesso
nella LHON e nuove idee per la terapia.
2. Abbiamo condotto un’analisi di linkage sul cromosoma X in un’ampia famiglia LHON brasiliana identificando un nuovo locus di suscettibilità per la LHON Xq25-27.2, con un two-point linkage score non-parametrico di 10.12 (P=0.003) per il marker DXS984 (Xq27.1).
3. Abbiamo dimostrato che l’associazione della LHON (in 3613 soggetti) con l’aplogruppo mitocondriale J è dovuta al ruolo modificatore di due subcladi (J1c e J2b) che incrementano la penetranza delle
mutazioni 11778/ND4 e 14484/ND6.
4. Abbiamo dimostrato che l’aplogruppo mitocondriale J aumenta la
sensitività di cellule LHON alla neurotossina 2,5-esandione, fornendo la prima evidenza che un background mitocondriale può interagire con un fattore ambientale.
5. Abbiamo mostrato che le mutazioni LHON possono indurre una
parziale instabilità nell’assemblaggio del complesso I nei cibridi e
che questo effetto è modulato dall’aplogruppo mitocondriale.
6. Abbiamo dimostrato che le mutazioni LHON producono uno shift
nella soglia del voltaggio necessario per aprire il poro di permeabilità transitoria nei cibridi.
7. Abbiamo dimostrato che il numero di copie del mtDNA differisce
tra i pazienti affetti da LHON e i carrier di mutazione non affetti, essendo significativamente maggiore nelle cellule ematiche e nelle
biopsie muscolari di quest’ultimi. Inoltre, i fibroblasti dei carrier non
affetti attivano ulteriormente la biogenesi mitocondriale, aumentando le copie di mtDNA, se cresciuti in medium con galattosio. La valutazione del numero di copie di mtDNA in cellule escisse via laser
da sezioni di nervo ottico e retina ha dimostrato che il sistema papillomaculare, che è il più vulnerabile, presenta la quantità più bassa di mtDNA.
DOA:
1. Lo studio di fibroblasti con mutazioni OPA1 che inducono aploinsufficienza ha dimostrato un difetto di fusione e una riduzione dell’OXPHOS, mediata principalmente dal complesso I. Abbiamo anche
dimostrato che OPA1 interagisce fisicamente con componenti dell’OXPHOS e con AIF, suggerendo una stretta interazione tra il difetto di fusione e quello nell’OXPHOS.
2. Abbiamo definito un sottogruppo di pazienti DOA portatori di mutazioni OPA1 missenso nel sito GTPasico che sviluppano una malattia multisistemica con miopatia mitocondriale e delezioni multiple
del mtDNA (DOA plus), rivelando una funzione inaspettata della
proteina pro-fusione OPA1 nel mantenimento del mtDNA.
3. Abbiamo dimostrato che anche le mutazioni OPA1 classiche, che
inducono la DOA non sindromica, possono associarsi a livelli variabili di delezioni multiple del mtDNA e espressione clinica più ampia.
4. Abbiamo dimostrato in vivo che il difetto bioenergetico osservato
in vitro nei fibroblasti si riflette in un ridotta capacità bioenergetica
muscolare misurata con la spettroscopia in RM.
5. Abbiamo dimostrato che il silenziamento delle isoforme OPA1 che
includono l’esone 4b induce deplezione di mtDNA e una marcata alterazione della distribuzione dei nucleoidi nel network mitocondriale, confermando il ruolo di OPA1 nel mantenimento del mtDNA.
Conclusioni: questi risultati hanno prodotto un significativo progresso nella comprensione di queste patologie che speriamo di tradurre
presto in terapie per i pazienti.
Testa Francesco (1), Rossi Settimio (1), Maguire Albert (3,5), Banfi
Sandro (2), Surace Enrico Maria (2), Acerra Carmela (1), Wright Fraser (4,5), Wellman McDonnell Jennifer (5), High Katherine (4,5),
Bennett Jean (3,5), Auricchio Alberto (2,6), Simonelli Francesca (1,2)
(1) Dipartimento di Oftalmologia, Seconda Università degli Studi di Napoli,
Italy - Dipartimento di Oftalmologia, Via S. Pansini, 5 - 80131 Napoli; tel & fax
0817704501; email: [email protected]
(2) Telethon Institute of Genetics and Medicine, Napoli, Italy
(3) Scheie Eye Institute, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA
(4) School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA
(5) Center for Cellular and Molecular Therapeutics, Children’s Hospital, Philadelphia, PA, USA
(6) Dipartimento di Pediatria, Università di Napoli “Federico II”, Napoli, Italy
La terapia genica è potenzialmente efficace nel trattamento delle
degenerazioni retiniche ereditarie attualmente incurabili.
I risultati preliminari del nostro studio, che ha sperimentato l’applicazione della terapia genica in pazienti con LCA-RPE65 (studio di fase 1), hanno dimostrato un miglioramento della funzione visiva attraverso parametri di misurazione sia soggettivi che oggettivi nei
primi tre pazienti trattati.
Successivamente, l’inclusione di pazienti pediatrici nel trial, ha consentito di valutare un effetto età-dipendente nel recupero della funzione visiva. La capacità visiva è stata valutata in 12 soggetti di età
compresa tra 8 e 44 anni affetti da LCA-RPE65 dopo una singola
iniezione subretinica unilaterale di AAV2-hRPE65v2.
Il follow-up, attualmente giunto a tre anni per i primi pazienti trattati, ha dimostrato che la somministrazione del vettore adeno-associato è stata ben tollerata e che tutti i soggetti hanno riportato uno
stabile miglioramento della funzione visiva con un recupero maggiore osservato nei bambini che hanno guadagnato una capacità
autonoma di deambulazione.
La sicurezza, l’entità e la stabilità nel tempo del recupero visivo osservato in tutti i pazienti trattati dimostra l’efficacia della terapia
genica adeno-associata per il trattamento delle distrofie retiniche
ereditarie, suggerendo che l’intervento precoce possa conferire un
maggiore guadagno della funzione visiva.
ABSTRACT N. 202
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
GALLI RESTA LUCIA
GGP06031
200.850
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2006
INTERAZIONI NEUROVASCOLARI NELLO SVILUPPO DELLA
RETINA: INDAGINE SULL’EZIOLOGIA CELLULARE DELLA MALATTIA DI NORRIE, E VERIFICA DI POSSIBILI APPROCCI TERAPEUTICI SPERIMENTALI IN MODELLI ANIMALI
Leone Paola (1,3), Schäfer Nikolaus (2), Luhmann Ulrich (2),
Berger Wolfgang (2), Galli-Resta Lucia (1)
(1) Istituto di Neuroscienze CNR - Via G. Moruzzi 1 -56124 Pisa, Italia
(2) Institute of Medical Molecular Genetics University of Zurich, CH
(3) Fondazione Bietti IRCCS - 00198 Roma, Italia
La malattia di Norrie è una rara patologia genetica X-linked, caratterizzata da cecità congenita e, in parte dei pazienti, da sordità e
possibile ritardo mentale.
Il modello murino, caratterizzato dalla perdita funzionale dello stesso
gene, noto come NDP, ha consentito di individuare nella proteina codificata dal gene NDP un elemento cruciale nel programma di sviluppo dei vasi sanguigni della retina, della coclea e di parte del cervello.
Senza tale proteina i vasi si sviluppano in modo anomalo e ridotto.
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033-132 Abstract-11_ITA.qxd:telethon 021-234 Abstract
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15:55
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
Questo dà supporto all’ipotesi che i danni neuronali risconstrati nella malattia di Norrie siano dovuti ad un’insufficienza vascolare cronica. La verfica di questa ipotesi è importante perchè consentirebbe
di progettare terapie di supporto metabolico che possano prevenire
o ritardare i danni neuronali associati alla malattia. Questa verifica
sulla retina del modello murino della malattia di Norrie (topo Norrie)
è obiettivo del progetto in corso.
La retina del topo Norrie manca di due dei tre plessi sanguigni che
normalmente caratterizzano la retina. Studiando i danni precoci
della malattia di Norrie non abbiamo riscontrato alcuna perdita sistematica di neuroni. Abbiamo trovato invece danni selettivi ad alcuni comparti subcellulari. Questi danni includono una drastica riduzione di proteine associate alle vescicole sinaptiche nelle cellule bipolari dei bastoncelli e una ridotta espressione dei canali sodio che
supportano potenziali d’azione ad alta frequenza negli assoni delle
cellule ganglionari.
Questi danni neuronali hanno tre aspetti peculiari che li legano al
danno vascolare: a) il danno neuronale si verifica nelle regioni della
retina che hanno perso il loro normale supporto vascolare e sono
più lontane dagli unici vasi presenti nella retina del topo Norrie; b)
all’interno di queste regioni di scarso supporto metabolico, il danno
colpisce selettivamente i comparti cellulari che servono le funzioni
con maggiori costi energetici; c) il danno neuronale non è di per se
tale da rendere le cellule colpite non funzionanti, ma ne riduce il
potenziale di spesa energetica.
Questi risultati quindi indicano che i deficit neuronali della malattia
di Norie sono strettamente legati anatomicamente e funzionalmente
a quelli vascolari e danno supporto a disegni di intervento terapeutico basati su strategie di supporto metabolico.
Inoltre, essendo una delle prime analisi sistematiche della tipologia
del danno neuronale associato ad un’insufficienza vascolare cronica,
questi risultati hanno interesse anche per altre patologie neurodegenerative in cui si ipotizza un contributo dovuto a deficit vascolari.
ne proteica, come la complementazione di proteine fluorescenti o
ad attività luciferasica, usando le arrestine come partners di OA1.
Inoltre, per identificate gli effettori a valle di OA1 nel trasporto degli
organelli, abbiamo utilizzato approcci di co-immunoprecipitazione
combinati ad identificazione proteica tramite spettormetria di massa, e abbiamo costruito proteine chimeriche costituite dal recettore
fuso con proteine G-alpha-i o con beta-arrestine. I nostri risultati
suggeriscono che sia G-alpha-i sia beta-arrestine sono implicate nel
mediare la funzione di OA1 e che il motore molecolare chinesina I
possa rappresentare l’effettore finale del recettore. Ulteriori studi
sono in corso per definire gli specifici meccanismi coinvolti.
ABSTRACT N. 204
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 1
Department of Biomedical Sciences, University of Modena and Reggio Emilia,
Modena, Italy
Meccanismi molecolari che causano la morte cellulare nella retinite
pigmentosa (RP) sono ancora poco compresi e questo impedisce lo
sviluppo di una cura per questa malattia che porta alla cecità. Variazioni nell’omeostasi del calcio sono state associate con la degenerazione retinica nel topo rd1, modello per RP. La ritenzione nel
reticolo endoplasmatico (ER) della proteina mutante causa danni alla retina di topi transgenici che esprimono rodopsina mutante
(RhotgP23H). Abbiamo dimostrato che AIF e caspasi-12 sono attivate dalle calpaine in questi due modelli di RP (Sanges et al, Proc
Natl Acad Sci USA. 2006 103:17366-17371). Esperimenti simili sono stati condotti su cellule staminali di retina differenziate in vitro in
bastoncelli e derivate da topi wild type o mutanti che entrano in
apoptosi spontanea (Giordano et al., Mol Vis. 2007 13:1842-1850).
Al fine di correlare l’attivazione di AIF dal mitocondrio, caspasi-12
dall’ER e la morte cellulare, abbiamo abbassato l’espressione o di
AIF o di caspasi-12 nel modello in vitro derivato da cellule staminali. Questi studi hanno rivelato che AIF gioca un ruolo chiave nella
morte dei bastoncelli (Sanges et al, Proc Natl Acad Sci USA. 2006
103:17366-17371,).
Abbiamo inoltre caratterizzato la funzione delle calpaine durante la
degenerazione retinica. Iniezioni intravitreo di calpstatina, un inibitore delle calpaine, in topi mutanti all’età P10 hanno portato ad una
riduzione dell’apoptosi e dell’ attivazione delle calpaine, di AIF e di
caspasi-12 sia in vivo che nei bastoncelli differenziati in vitro (Paquet-Durand et al, J Neurochem. 115:930-940, 2010).
Le vie apoptotiche attivate dalle cellule sono molteplici e rendono la
scelta dell’apoptosi come possibile bersaglio terapeutico alquanto
complessa. Ciò nonostante la comprensione dei meccanismi molecolari che attivano i diversi fattori apoptotici durante la degenerazione retinica e l’identificazione di attivatori comuni sono il primo
passo verso questo scopo. Questo studio identifica l’attivazione delle calpaine come un processo comune in tre modelli di RP.
GGP08156
384.500
Anno d’inizio: 2006
Comitato Antonella, Aruta Claudia, Morandi Paolo, Benassi Silvia,
De Feo Gaetano, Marigo Valeria
SCHIAFFINO MARIA VITTORIA
Durata (anni): 3
199.867
Durata (anni): 3
I MECCANISMI APOPTOTICI NELLA DEGENERAZIONE RETINICA POSSONO ESSERE UTILIZZATI COME BERSAGLI TERAPEUTICI PER LIMITARE LA MORTE DEI FOTORECETTORI
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Telethon grant N.
GGP06096
Telethon grant N.
ABSTRACT N. 203
Responsabile
MARIGO VALERIA
Responsabile
Anno d’inizio: 2008
ALLA RICERCA DELLE BASI MOLECOLARI DELL’ALBINISMO
OCULARE DI TIPO 1: UN’ECCEZIONALE OPPORTUNITÀ PER
FAR LUCE SULLA TRASDUZIONE DEL SEGNALE NEL SISTEMA
DELLE ENDOMEMBRANE
Palmigiano Angela (1), D’Ambrosio Rosa Lucia (1), Daniele Tiziana
(1), Palmisano Ilaria (1), D’Ischia Marco (2), Napolitano Alessandra
(2), Bachi Angela (3), Schiaffino Maria Vittoria (1)
(1) Center for Genomics, Bioinformatics and Biostatistics, San Raffaele Scientific Institute, Milano - Via Olgettina 58, 20132 Milano; tel. 02-26434729; FAX
02-26434723; email: [email protected]
(2) Dipartimento di Chimica Organica e Biochimica, Università degli Studi di
Napoli Federico II, Napoli
(3) Division of Genetics and Cell Biology, San Raffaele Scientific Institute, Milano
L’albinismo oculare di tipo 1 è una malattia genetica trasmessa come carattere recessivo legato al sesso, che si manifesta negli individui maschi principalmente con un grave difetto della vista e con la
presenza di melanosomi giganti, detti macromelanosomi, nei melanociti cutanei e nell’epitelio pigmentato della retina (RPE). Il gene
responsabile dell’albinismo oculare codifica per una proteina, chiamata OA1, espressa nelle cellule pigmentate e con caratteristiche
strutturali e funzionali tipiche dei recettori associati a proteine G
(GPCR), inclusa la capacità di interagire con proteine G trimeriche e
arrestine. Tuttavia, a differenza dei classici recettori GPCR, OA1 non
è localizzato sulla membrana plasmatica, ma su quella di organelli
intracellulari, in particolare melanosomi e lisosomi, grazie a specifici
segnali di smistamento. Da questa sede intracellulare, OA1 sembra
controllare non solo la corretta biogenesi dei melanosomi, come
suggerito dal ridotto numero e dall’alterata taglia degli organelli,
ma anche la loro motilità. Infatti, in assenza di OA1, i melanosomi
sono rari nell’area perinucleare e si accumulano verso la periferia
cellulare, dimostrando un difetto di motilità microtubulo-dipendente. Queste caratteristiche indicano che OA1 è un recettore intracellulare e suggeriscono che possa essere attivato da un ligando intraluminale, possibilmente la L-DOPA o altri composti correlati alla melanina, per regolare maturazione e movimento dei melanosomi in
modo organello-autonomo. Per dimostrare l’attivazione di OA1 a
liello intracellulare, abbiamo utilizzato approcci di complementazio-
ABSTRACT N. 205
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
BARSACCHI GIUSEPPINA
GGP07275
218.000
Durata (anni): 2
Anno d’inizio: 2007
COME TRASFORMARE CELLULE STAMINALI EMBRIONALI IN
CELLULE RETINICHE: RUOLO DI GENI SPECIFICI DELL’OCCHIO
Casarosa Simona (1,2), Lan Lei (1), Vitobello Antonio (1), Bertacchi
Michele (1), Messina Andrea (2), Demontis Gian Carlo (3), Cremisi
Federico (1), Vignali Robert (1), Andreazzoli Massimiliano (1), Barsacchi Giuseppina (1)
(1) Dipartimento di Biologia, Universita’ di Pisa - S.S. 12 Abetone e Brennero,
113
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
ABSTRACT N. 207
4 56127 Pisa
(2) Centre for Integrative Biology (CIBIO), Universita’ di Trento, Trento
(3) Dipartimento di Psichiatria, Neurobiologia, Farmacologia e Biotecnologie,
Universita’ di Pisa, Pisa
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 1
Istituto di Biofisica, CNR, Genova - Istituto di Biofisica, CNR, Via De Marini 6,
16149 Genova, tel 010 6475561, e-mail: [email protected]
Il nostro progetto si concentra su due malattie genetiche causate da
mutazioni in geni che codificano proteine CLC che trasportano Cl-.
Difetti del CLC-5 renale causano la mattia di dent, caratterizzata da
proteinuria e calcoli renali. Mutazioni nel ClC-Kb e nella subunità beta dei canali CLC-K, barttina, causano sindrome di Bartter, che nel
caso di mutazioni della barttina sono associate anche a sordità.
Il CLC-5 è un antiporto Cl/H con una stechiometria di 2:1 (Zifarelli &
Pusch, EMBO Rep 2009 10:1111-6). E’ espresso negli endosomi di
cellule del tubulo prossimale dei nefroni ed è importante per l’endocitosi. Il suo ruolo specifico è però ancora non chiaro. I canali CLC-K
sono espressi nel tratto ascendente dell’ansa di Henle e sono cruciali
per il riassorbimento di NaCl e per la produzione di endolinfa.
Attraverso esperimenti di patch clamp in configurazione inside-out
su CLC-5 espresso in oociti di Xenopus abbiamo scoperto che il trasportatore è stimolato da nucleotidi adenosinici intracellulari. ATP,
ADP, e AMP hanno un effetto simile con un EC50 intorno a 1 mM e
una stimolazione massima di circa un fattore due. Due importanti
mutazioni (Y617A e D727A) aboliscono la modulazione dei nucleotidi in accordo con i risultati strutturali di Meyer et al (Nat Struct Mol
Biol 2007 14:60-7). Questi risultati sono potenzialmente importanti
per comprendere il meccanismo patologico che conduce alla malattia di Dent.
Abbiamo usato esperimenti di two-electrode voltage-clamp sul canale CLC-Ka co-espresso con barttina in oociti di Xenopus, in combinazione con estesa mutagenesi, per identificare i siti di legame
per protoni e calcio extracellulari. Abbiamo identificato una coppia
di residui acidi (E261 e D278 nel loop che connette le eliche I e J),
che sono vicini tra di loro anche se localizzati su subunità diverse,
come probabili candidati a formare un sito di legame per il calcio tra
le subunità. Le singole mutazioni E261Q e D278N diminuiscono fortemente e la doppia mutazione E261Q/D278N abolisce completamente la modulazione del Ca. Diverse mutazioni di un residuo istidina (H497) omologa ad un’istidina responsabile per il blocco dei
H(+) nel ClC-2 hanno dato luogo a canali non funzionanti. Il triplo
mutante E261Q/D278N/H497M elimina completamente il blocco indotto H(+). Abbiamo quindi identificato una regione della proteina
coinvolta nel legame di questi ligandi fisiologicamente importanti e
che probabilmente è soggetta a cambiamenti conformazionali legati
al complesso gating dei canali CLC-K (Gradogna et al, J Gen Physiol
2010 136:311-23).
GGP10149
141.400
Anno d’inizio: 2010
UNA NUOVA STRATEGIA TERAPEUTICA MIRATA AL DANNO
OSSIDATIVO DEI FOTORECETTORI NELLE EREDO-DEGENERAZIONI RETINICHE INDOTTE DA MUTAZIONI DEL GENE ABCR. STUDIO CLINICO E SPERIMENTALE
Falsini Benedetto (1), Bisti Silvia (2), Piccardi Marco (1), Maccarone
Rita (2), Marangoni Dario (1), Minnella Angelo (1), Savastano Cristina
(1), Fadda Antonello (3), Di Renzo Antonio (3), D’Esposito Fabiana (4)
(1)
(2)
(3)
(4)
Anno d’inizio: 2008
Zifarelli Giovanni, Gradogna Antonella, Zanardi Ilaria, De Stefano
Silvia, Murgia Anna Rosa, Jeworutzki Elena, Pusch Michael
FALSINI BENEDETTO
Durata (anni): 2
195.000
Durata (anni): 3
MECCANISMI DI TRASPORTO DELLE PROTEINE CLC COINVOLTE IN MALATTIE GENETICHE UMANE E LORO REGOLAZIONE DA PARTE DI LIGANDI INTRACELLULARI ED EXTRACELLULARI
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Telethon grant N.
GGP08064
Telethon grant N.
ABSTRACT N. 206
Responsabile
PUSCH MICHAEL
Responsabile
La retinite pigmentosa (RP) e’ una malattia neurodegenerativa ereditaria che rappresenta una delle principali cause di cecita’ nel mondo. La RP colpisce direttamente i fotorecettori ma porta successivamente anche alla perdita di cellule bipolari ed orizzontali. Le forme
non sindromiche di RP colpiscono una persona ogni 4000 e sono caratterizzate da un’alta etereogeneita’ genetica. Un approccio promettente per la cura della RP e’ la terapia di sostituzione cellulare
basata sull’uso di cellule staminali (embrionali o derivate da fibroblasti) indotte a differenziare nei tipi cellulari che degenerano nella
malattia.
In questo progetto abbiamo usato le cellule embrionali della calotta
animale (ACES) della rana Xenopus laevis come utile sistema modello per saggiare funzioni geniche ed abbiamo scoperto che la proteina secreta Noggin, un inibitore di BMP, e’ in grado di attivare
marcatori di differenziamento retinico in vitro. In seguito a trapianto in embrioni di rana, le cellule ACES che esprimono alte dosi, ma
non basse dosi, di Noggin formano occhi completi anche quando
trapiantate in regioni ectopiche. Gli occhi che vengono a formarsi in
seguito al trapianto sono funzionanti come dimostrato dall’analisi
elettrofisiologica e dall’attivazione di c-fos in risposta alla luce. Inoltre, abbiamo osservato che la coespressione di Noggin e del fattore
di trascrizione Otx5 porta ad un aumento dell’espressione di opsina,
IRBP e NRL.
Questo suggerisce che Otx5 e’ un efficace strumento per indurre fotorecettori in cellule trattate con Noggin. In uno studio parellelo,
abbiamo dimostrato che l’inattivazione di quattro piccoli RNA regolatori (miRNAs) indirizza i progenitori retinici verso un destino di
cellule bipolari. Le molecole individuate in questo progetto, insieme
ad altre attualmente in corso di analisi, verranno utilizzate in protocolli per la generazione di cellule retiniche contribuendo cosi’ allo
sviluppo di strategie innovative di sostituzione cellulare mirate alla
cura della RP.
Universita’ Cattolica del S. Cuore - Largo F. Vito 1, 00168 Rome, Italy
Universita’ dell’Aquila, L’Aquila
Istituto Superiore di Sanita’, Rome
Universita’ Federico II, Naples
ABSTRACT N. 208
L’area di interesse nella quale questo progetto è sviluppato è quella
delle degenerazioni retiniche dovute a mutazioni del gene ABCR, responsabili della distrofia maculare giovanile di Stargardt (STD/FF).
La STD/FF è una delle maggiori cause di ipovisione grave in eta’
giovanile, e consiste in una disfunzione e perdita dei fotorecettori
coni e bastoncelli, in conseguenza di un danno fotoossidativo. Una
terapia mirata a contrastare questo meccanismo di danno fotossidativo potrebbe mitigare gli effetti della malattia o quantomeno arrestarne l’evoluzione.
In questo progetto si propone di investigare una nuova terapia basata sulla somministrazione di un derivato de crocus sativus (Zafferano) che si è dimostrato particolarmente efficace nella protezione
del danno fotossidativo nel modello animale. In aggiunta, dati preliminari nella degenerazione maculare legata all’età, altra patologia
legata al danno fotossidativo, mostrano un’efficacia del composto
nel migliorare significativamente la funzionalità retinica, in assenza
di effetti collaterali.
Il progetto si sviluppa in due laboratori, uno, quello dell’Università
Cattolica, in cui verranno esaminati e trattati i pazienti, ed un altro,
quello dell’Università dell’Aquila, in cui verranno testati e trattati topi transgenici con knock-out genetico del gene ABCR.
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
GASPARINI PAOLO
GGP09037
257.000
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2009
GENETICA DELLA PERDITA UDITIVA
Giorgia Girotto, Nicola Pirastu, Savina Dipresa, Paolo Gasparini
Dipartimento clinico di scienze della riproduzione e dello sviluppo e di medicina
pubblica - Ospedale infantile Burlo Garofolo, Università di Trieste, Via dell’Istria
65/1, 34100, Trieste
Il progetto si focalizza principalmente sull’identificazione delle cause
genetiche della sordità per migliorare le strategie di diagnosi e la
terapia dei pazienti e dei loro familiari. Per raggiungere questo
obiettivo, abbiamo pianificato una strategia che combina una attività di ricerca di base e applicata che include a) l’identificazione di
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
nuovi geni mediante sequenziamento ad alto processamento di
coorti e mediante approccio genome wide e di linkage in famiglie e
popolazioni isolate b) l’ottenimento di dati molecolari epidemiologici, di nuovi algoritmi e linee guida diagnostiche e la validazione di
un metodo non invasivo per l’analisi di portatori di mutazioni a carico del gene GJB2.
Durante il primo anno del progetto, sono state sviluppate le seguenti attività:
a) GWAS focalizzati su tratti quantitativi ottenuti mediante metanalisi di dati provenienti da sei popolazioni isolate di origine Europea
per un numero totale di 3417 individui. Otto loci significativi (p<107) sono stati identificati con una serie di geni espressi nell’orecchio.
Altri SNPs potenzialmente candidati sono stati identificati (p<10-6).
Alcuni di questi nuovi loci mappano su loci sordità già noti la cui
funzione deve ancora essere definita. I dati sono stati inoltre utilizzati per costruire una significativa pathway “in silico” basata sullo
studio della funzione uditiva e caratterizzata da un network di 49
geni, 34 dei quali espressi nell’orecchio;
b) metanalisi di dati ottenuti da studio di associazione GWAS su
tratti qualitativi in popolazioni isolate con particolare riferimento alla presbiacusia. Dati preliminari hanno portato all’identificazione di
loci nei seguenti cromosomi: 2,13,19,17,16,20 coinvolgendo in alcuni casi geni correlati allo sviluppo e alla funzione uditiva, ma anche geni la cui funzione è ancora sconosciuta. Una fase di replica di
questi risultati è stata pianificata utilizzando una casistica di soggetti provenienti da differenti paesi Europei;
c) sequenziamento dell’esoma di 4 casi selezionati da pazienti provenienti da un’estesa famiglia della popolazione isolata di Carlantino. L’analisi è stata eseguita per permettere di identificare i geni
causativi e i dati filtrati stanno per essere analizzati;
d) sequenziamento target specifico di una grande famiglia di soggetti che presentano una forma dominante di sordità che mappa nel
braccio lungo del cromosoma 15 in un locus non ancora identificato.
I dati filtrati sono ora sotto analisi;
e) sequenziamento dell’esoma di una famiglia affetta da una forma
recessiva di sordità. Questa famiglia di consanguinei proveniente
dal Qatar è risultata negativa per mutazioni nei geni GJB2, GJB6 e
per la mutazione mitocondriale A1555G. I risultati ottenuti sono ora
in fase di valutazione;
f) fase di validazione di un metodo rapido e non invasivo di screening per i portatori di mutazioni sul gene GJB2. Per quanto riguarda
la fase di validazione della metodica di screening, diversi centri Italiani di riferimento sono stati coinvolti per analizzare I portatori di
mutazioni nel gene GJB2 mediante ecografia cutanea. Centinaia di
portatori con i rispettivi controlli sono stati reclutati nello studio. I
dati preliminari sembrano confermare l’affidabilità del protocollo
diagnostico.
di cellule non sensoriali, dove sono largamente colocalizzate e possono formare canali di giunzioni cellulari eteromerici. Di seguito,
descriviamo la generazione e la caratterizzazione di un modello
murino per una perdita dell’udito bilaterale per le medie/alte frequenza, basato sulla sostituzione di un residuo di treonina, altamente conservato, con uno di metionina in posizione 5, vicino all’N
terminale della Cx30 (Cx30T5M).
La mutazione è stata inserita nel genoma murino tramite ricombinazione omologa in cellule staminali embrionali di topo. In questi
topi transgenici l’espressione della mutante Cx30T5M è sotto il
controllo del promotore endogeno della Cx30, ed è stata analizzata
tramite l’attivazione del gene reporter lacZ. A seguito di registrazioni delle risposte uditive del tronco encefalico (ABR), si osserva
che i topi Cx30T5M/T5M presentano un debole ma significativo aumento della soglia uditiva di circa 15dB a tutte le frequenze testate. Immunofluorescenze ottenute con anticorpi contro la Cx26 o la
Cx30 suggeriscono una localizzazione normale di queste proteine
nell’orecchio interno dei topi adulti. Tuttavia, analisi di Western
blot rivelano una significativa riduzione dei livelli di espressione
delle Cx26 e Cx30. L’accoppiamento elettrico, testato attraverso
registrazioni di patch-clamp, risulta nomale nella coclea in via di
sviluppo. Tuttavia, il trasferimento di un tracciante fluorescente, la
calceina, tra le cellule non sensoriali della coclea è ridotto, così come lo sono i segnali di calcio dovuti ai rilasci spontanei di ATP dagli
emicanali di connessine. I nostri risultati collegano la perdita uditiva ad un ridotto accoppiamento biochimico dovuto ad una mutazione puntiforme della Cx30 nei topi.
ABSTRACT N. 210
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
MAMMANO FABIO
Totale
331.500
Num Centri: 1
Anno d’inizio: 2009
(1) Università di Padova, Dipartimento di Scienze Mediche e Chirurgiche Via
Giustiniani, 2; 35128 Padova. Tel: 328 3337780; Fax: 049 8278906
(2) Università di Milano-Bicocca, Dipartimento di Medicina Clinica e Prevenzione
(3) Yale University Medical School, Section of Digestive Diseases, Liver Center,
New Haven, CT, USA
(4) Harvard University, Liver Research Center, Boston, MA, USA
INTRODUZIONE La fibrosi epatica congenita (CHF) e la malattia di
Caroli (CD) sono patologie ereditarie dell’epitelio biliare causate da
mutazioni del gene PKHD1 che codifica per la fibrocistina, una proteina espressa su ciglia e centromeri dei colangiociti, la cui funzione
è ignota. Sia CHF che CD sono caratterizzate da disgenesia biliare
con fibrosi progressiva ed ipertensione portale. Nella CHF/CD i meccanismi responsabili della fibrosi portale non sono chiari. Di recente
è stato trovato che l’integrina aVb6, una glicoproteina di membrana
espressa dai colangiociti, svolge un ruolo rilevante nella fibrosi biliare mediando l’attivazione di TGF-b1.
SCOPO Studiare se l’espressione di aVb6 integrina è sovra-regolata
nei colangiociti mutati per Pkhd1 e se ciò correla con la crescita delle cisti e con la fibrosi peribiliare.
METODI Sono stati utilizzati topi Pkhd1del4/del4 mutati per il gene
Pkhd1 a diverse età maturative (1-12 mesi, n = 3/6 topi per ogni
età). In sezioni di tessuto epatico sono stati valutati: a) strutture biliari come percentuale di cellule K19-positive; b) fibrosi portale con Sirius Red, c) espressione di avb6 integrina in immunoistochimica (IHC)
e RT-PCR; d) infiltrato infiammatorio portale con IHC per a-SMA
(marker di miofibroblasti), CD45 (leucociti), NINP-R14 (polimorfonucleati), F4/80 (macrofagi); e) andamento nel tempo dei marcatori di
fibrosi (a-SMA, collagene di tipo I, TGFb1, TGFb2) con RT-PCR. Le funzioni secretorie di colangiociti primari polarizzati isolati da topi WT e
Pkhd1del4/del4 di 3 mesi, sono stati valutati con Luminex (n= 3).
RISULTATI In IHC abbiamo osservato: 1) un aumento lineare dell’area cistica e della fibrosi portale con la maturazione dei topi
Pkhd1del4/del4, 2) un aumento età-dipendente dell’espressione di
integrina aVb6 su cisti biliari che correla con area cistica e fibrosi
portale, 3) un progressivo aumento di cellule CD45+ve nell’infiltrato
infiammatorio portale che correla fortemente con l’espressione di
integrina aVb6 sulle cisti biliari. L’aumento dell’espressione di a-
GGP09137
Durata (anni): 3
218.200
Durata (anni): 3
Locatelli Luigi (2), Spirlì Carlo (3), Cadamuro Massimiliano (1), Lecchi Silvia (2), Popov Yuri (4), Schuppan Detlef (4), Fabris Luca (1)
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Telethon grant N.
GGP09189
TRANSIZIONE EPITELIO-MESENCHIMALE E MECCANISMI DI
CROSS TALK NELLO SVILUPPO DELLA FIBROSI EPATICA NEI
DIFETTI CONGENITI DI FIBROCISTINA (FIBROSI EPATICA
CONGENITA)
ABSTRACT N. 209
Responsabile
FABRIS LUCA
Anno d’inizio: 2009
LA MUTAZIONE T5M DELLA CONNESSINA 30, ASSOCIATA
NELL’UOMO A SORDITÀ, NEL TOPO CAUSA UNA LIEVE PERDITA UDITIVA E RIDUCE L’ACCOPPIAMENTO BIOCHIMICO
ATTRAVERSO LE CELLULE NON SENSORIALI DELLA COCLEA
Schutz Melanie (1), Scimemi Pietro (2,3), Majumder Paromita (4),
De Siati Romolo Daniele (2,3), Crispino Giulia (4), Rodriguez Laura
(4), Bortolozzi Mario (4,5,6), Santarelli Rosamaria (2,3), Seydel
Anke (4), Sonntag Stephan (1), Ingham Neil (7), Steel Karen P.
(7), Willecke Klaus (1), Mammano Fabio (4,5,6)
(1) Institut fuer Genetik, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universitaet Bonn,
Bonn
(2) Dipartimento di Specialità Medico Chirurgiche, Università di Padova, Padova
(3) Servizio di Audiologia, Ospedale Ca’ Foncello, Treviso
(4) Istituto Veneto di Medicina Molecolare, Fondazione per la Ricerca Biomedica Avanzata, Padova, e-mail: [email protected]
(5) Dipartimento di Fisica ‘G. Galilei’, Università di Padova, Padova
(6) Istituto CNR di Neuroscienze, Padova,
(7) Wellcome Trust Sanger Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Cambridge, UK
Le mutazioni nei geni GJB2 e GJB6, che codificano per la connessina 26 (Cx26) e la connessina 30 (Cx30), rappresentano la causa
più diffusa di sordità non sindromica perlinguale nell’uomo.
Nell’orecchio interno la Cx26 e Cx30 sono espresse in differenti tipi
115
033-132 Abstract-11_ITA.qxd:telethon 021-234 Abstract
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
SMA valutata con RT-PCR è invece evidente solo dopo i 9 mesi. I
colangiociti Pkhd1del4/del4 hanno un’elevata attività secretoria,
particolarmente manifesta sul versante basolaterale, dove sono rilasciate quantità significative di G-CSF (8x) e IL13 (17x).
CONCLUSIONI L’espressione di aVb6 integrina sui colangiociti aumenta gradualmente con la maturazione dei topi Pkhd1del4/del4 e
correla con l’area cistica e la fibrosi portale. L’infiltrato cellulare portale è caratterizzato da un incremento progressivo di cellule
CD45+ve che correla strettamente con l’espressione biliare di avb6
integrina. L’elevata secrezione di G-CSF e IL13, potenti induttori di
cellule midollari, da parte dei colangiociti mutati può favorire il reclutamento peribiliare di cellule CD45+ve.
PROSPETTIVE FUTURE Studiare: 1) se l’espressione di aVb6 regola
la secrezione di G-CSF e IL13 nei colangiociti mutati, 2) se le cellule
CD45+ve possiedono attività fibrogeniche.
Rome - c/o Azienda Policlinico Umberto I, Viale Regina Elena 324, 00161 Roma. Tel. 06-49918225; Fax 06-4464698; e-mail: [email protected]
(2) Dept. of Clinical and Molecular Medicine, Sapienza University, Rome
(3) Dept. of Biology, University “Tor Vergata”, Rome
(4) Regional Cystic Fibrosis Center, Dept. of Pediatrics, Sapienza University, Rome
L’iperviscosità seminale è una frequente causa di sub fertilità con patogenesi incerta. Abbiamo proposto un ruolo del gene CFTR (Cystic
Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) nell’iperviscosità
idiopatica del liquido seminale (ISHV), che originerebbe come forma
lieve di Fibrosi Cistica (CF). Poiché la proteina cftr è espressa nell’epitelio epididimario, è probabile che le mutazioni del CFTR influenzino i
livelli di idratazione dei vasi deferenti e del liquido seminale.
Lo scopo di questo studio è identificare le mutazioni del CFTR come
base molecolare per la ISHV. A questo scopo viene effettuata l’analisi
strutturale e funzionale del gene CFTR in pazienti sub fertili con ISHV,
confrontati con un’altra popolazione infertile per Assenza Congenita
Bilaterale dei Vasi Deferenti (CBAVD), nonché con pazienti con forme
classiche di CF e con 2 popolazioni di controllo: soggetti maschili con
caratteristiche seminali normali (controlli normospermici, NC) e soggetti della popolazione generale (controlli generali, GC).
Sono stati analizzati 1833 liquidi seminali di partner di coppie infertili; è stata stimata una prevalenza del 26,2% dell’iperviscosità seminale (480 individui) con una proporzione di forme idiopatiche del
48,1%, che individua una prevalenza complessiva della ISHV tra i
partner maschili di coppie infertili del 12,6%. L’analisi mutazionale
del gene CFTR è stata eseguita, in 60 pazienti con ISHV, 74 con
CBAVD e 484 con CF, nonché in 59 NC e 102 GC, tramite una metodologia multi step che arriva fino al sequenziamento esteso di
tutti gli esoni, zone introniche adiacenti e promotore prossimale.
E’ stata evidenziata una prevalenza decrescente di mutazioni del CFTR
nell’ordine CF > CBAVD > ISHV, con una frequenza significativamente
maggiore di mutazioni in ciascuna di queste popolazioni rispetto alle
popolazioni NC e GC (chi2 p<0.001). Pattern mutazionali molto diversi
sono stati evidenziati nelle 3 popolazioni patologiche. Nei soggetti con
ISHV sono state riscontrate 55 diverse variazioni di sequenza (SVs)
del CFTR; tra queste, 14 sono mutazioni classiche o di splicing con
una frequenza significativamente maggiore nei pazienti con ISHV che
nei GC o NC (chi2 p<0.001). Un aplotipo specifico è stato riscontrato
nei soggetti con ISHV con una frequenza significativamente maggiore
rispetto ai GC o NC (chi2 p<0.05). Per alcune delle SVs trovate, sono
stati effettuati studi funzionali del pre-mRNA splicing mediante RT-PCR
su campioni ex vivo di brushing nasale. Per 5 SVs con significato funzionale incerto, il pre-mRNA splicing è stato studiato mediante costruzione dei rispettivi vettori di espressione pTB e transfezione in cellule
eucariotiche. Sebbene la rilevanza funzionale di una parte delle SVs
trovate sia ancora da accertare, la specificità genetica complessiva
dei soggetti con ISHV, confrontata con i soggetti CBAVD, CF, GC e
NC, suggerisce che la base molecolare della ISHV possa essere un
pannello specifico di mutazioni del CFTR.
ABSTRACT N. 211
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
MOSCHETTA ANTONIO
Responsabile
GGP08259
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
205.700
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2008
ATTIVAZIONE INTESTINALE DEL RECETTORE NUCLEARE PER
GLI ACIDI BILIARI FXR NEL TRATTAMENTO DELLA COLESTASI INTRAEPATICA PROGRESSIVA FAMILIARE
Modica Salvatore (1), Petruzzelli Michele (1,2), Bellafante Elena (1),
Murzilli Stefania (1), Salvatore Lorena (1), Celli Nicola (1), Moustafa Tarek (3), Halilbasic Emina (3,4), Trauner Michael (3,4), Moschetta Antonio (1,2)
(1) Laboratory of Lipid Metabolism and Cancer, Department of Translational
Pharmacology, Consorzio Mario Negri Sud, Santa Maria Imbaro (CH)
(2) Clinica Medica ‘‘A. Murri’’, Department of Internal and Public Medicine, University of Bari, Policlinico, Bari
(3) Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Internal Medicine, Medical University of Graz, Graz, Austria
(4) Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Internal Medicine III, University of Vienna, Vienna
La colestasi é una malattia epatica caratterizzata da alterazioni del
flusso biliare con conseguente riduzione dei livelli di acidi biliari nell’intestino e ritenzione di acidi biliari nel fegato. FXR è il regolatore
trascrizionale dell’omeostasi degli acidi biliari nel sistema enteroepatico. Attivazione di FXR nel sistema enteroepatico da parte degli
acidi biliari risulta in una riduzione dei livelli di acidi bilari circolanti
come conseguenza della repressione dell’enzima CYP7A1, responsabile per la conversione del colesterolo in acidi biliari, attraverso un
meccanismo di feedback che coinvolge il recettore nucleare SHP nel
fegato e l’ormone di crescita fibloblastico 19 nell’intestino. In questo studio abbiamo voluto investigate il ruolo dell’attivazione selettiva di FXR nell’intestino nella protezione da colestasi attraverso la riduzione dei livelli epatici di acidi biliari. A tale scopo abbiamo generato un modello murino trasgenico esprimente una forma costitutivamente attiva di FXR solo nell’intestino. Stimolando quindi il nostro modello trasgenico con diverse condizioni di colestasi abbiamo
dimostrato un effetto protettivo dell’attivazione selettiva di FXR nell’intestino contro questa malattia sia a livello intraepatico che extraepatico. I nostri studi supportano dunque una rivoluzionaria idea
nel campo della colestasi: trattare l’intestino per curare il fegato.
ABSTRACT N. 213
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 4
Totale
Num Centri: 4
La fibrosi cistica (FC) è causata da un ridotto trasporto di cloruro nelle cellule epiteliali di vari organi. Lo scopo generale del nostro progetto è di sviluppare nuove strategie farmacologiche per correggere il difetto di base nella FC. Per questo scopo, stiamo considerando due diversi bersagli molecolari: CFTR, la proteina direttamente colpita dalle
mutazioni nei pazienti FC, e i canali del cloruro attivati da calcio
(CaCC), che rappresentano un bersaglio terapeutico alternativo per
aggirare il difetto di base. Il nostro progetto si propone in particolare
di: 1) identificare nuove proteine e di sviluppare farmaci utili per la
correzione funzionale di F508del, la mutazione più frequente nei pazienti FC; 2) di sviluppare attivatori farmacologici dei canali CaCC.
La mutazione F508del provoca un difetto di maturazione della proteina CFTR. Infatti, la proteina CFTR mutata è riconosciuta dai sistemi cellulari di controllo e indirizzata precocemente verso la degradazione. Per correggere il difetto di maturazione, stiamo effet-
GGP06199
109.000
Anno d’inizio: 2010
Laboratorio di Genetica Molecolare - Istituto Giannina Gaslini, 16147 Genova
STROM ROBERTO
Durata (anni): 3
391.000
Durata (anni): 3
Pedemonte Nicoletta, Sondo Elvira, Ferrera Loretta, Caci Emanuela,
Tomati Valeria, Scudieri Paolo, Zegarra-Moran Olga, Galietta Luis J.V.
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Telethon grant N.
GGP10026
IDENTIFICAZIONE DI NUOVE STRATEGIE PER LA CORREZIONE DEL DIFETTO DI BASE NELLA FIBROSI CISTICA
ABSTRACT N. 212
Responsabile
GALIETTA LUIS J. V.
Anno d’inizio: 2006
LA RIDOTTA FERTILITÀ MASCHILE DA IPERVISCOSITÀ IDIOPATICA DEL LIQUIDO SEMINALE È CAUSATA DA MUTAZIONI
E/O VARIANTI GENICHE DEL CFTR?
Lucarelli Marco (1), Rossi Tiziana (2), Pierandrei Silvia (1), Ferraguti Giampiero (1), Elia Jlenia (2), Ciminelli Bianca Maria (3), Quattrucci Serena (4), Mazzilli Fernando (2), Strom Roberto (1)
(1) Dept. of Cellular Biotechnologies and Haematology, Sapienza University of
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
tuando lo screening di una collezione di molecole di RNA silenzianti
(siRNA) dirette contro proteine cellulari dei sistemi di controllo di
qualità. Utilizzando un saggio funzionale, abbiamo identificato alcune proteine il cui spegnimento determina un recupero parziale del
mutante F508del-CFTR. Dopo questo screening iniziale effettueremo una ricerca a più ampio raggio utilizzando una libreria di siRNA
su scala genomica. I nostri risultati potranno identificare nuove proteine la cui modulazione farmacologica potrà essere sfruttata per
recuperare la funzione della proteina CFTR mutata.
In parallelo, stiamo studiando la proteina TMEM16A (Caputo et al.
Science 2008 322: 590-594), che abbiamo identificato quale componente essenziale dei canali CaCC. Il nostro scopo specifico è di
comprendere il funzionamento e la regolazione di TMEM16A e di
sviluppare strategie farmacologiche per stimolare il trasporto di cloruro nelle vie aeree dei pazienti. Abbiamo scoperto l’esistenza di diverse isoforme della proteina TMEM16A caratterizzate da proprietà
funzionali differenti (Caputo et al. Science 2008 322: 590-594; Ferrera et al., J Biol Chem 2009 284: 33360-33368). In particolare, l’isoforma prevalentemente espressa nelle vie aeree, TMEM16A(abc),
ha sensibilità al calcio ridotta e mostra inattivazione alle concentrazioni di calcio più elevate. Il comportamento peculiare dell’isoforma
TMEM16A(abc) sembra dipendere da un segmento di 22 aminoacidi
localizzato in prossimità del primo dominio transmembrana. Lo studio di questa regione potrà aiutarci nello sviluppo di strategie per
aumentare e prolungare l’attività dei canali CaCC nei pazienti FC.
coinvolti nella trasduzione del segnale che quelli devoluti all’internalizzazione di ligandi) sono alterati da mutazioni che abrogano l’attività catalitica di OCRL1. Di particolare rilevanza è l’alterazione del
trafffico intracellulare della megalina, il recettore che svolge un ruolo chiave nell’internalizzazione e nel riassorbimento di proteine a
basso peso molecolare da pare delle cellule renali del tubulo prossimale.
Infine, abbiamo sfruttato il difetto di endocitosi indotto dalla deplezione di OCRL per mettere a punto un saggio cellulare da utilizzare
in screening high-content di librerie di piccole molecole e di siRNA
volti all’identificazione di “correttori” o di possibili target per lo sviluppo di farmaci per la sindrome di Lowe.
ABSTRACT N. 215
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 1
(1) TIGEM, Via Pietro Castellino, Napoli - [email protected]
(2) Consorzio Mario Negri Sud, S. Maria Imbaro (CH)
(3) IBP, CNR Via Pietro Castellino, Napoli
GGP06166
229.350
Anno d’inizio: 2009
Vicinanza Mariella (1), Di Campli Antonella (2,3), Parashuraman
Raman (1), Corda Daniela (3), Luini Alberto (1,2), De Matteis Maria
Antonietta (1,2)
DE MATTEIS MARIA ANTONIETTA
Durata (anni): 3
200.000
Durata (anni): 1
INIZIATIVA TELETHON PER LA SCOPERTA DI BERSAGLI FARMACOLOGICI PER LE MALATTIE GENETICHE
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Telethon grant N.
GSP08002
Telethon grant N.
ABSTRACT N. 214
Responsabile
DE MATTEIS MARIA ANTONIETTA
Responsabile
Anno d’inizio: 2007
TIDID (Iniziativa Telethon per la scoperta di bersagli farmacologici)
si propone di sfruttare le conoscenze di base di base finora acquisite sul meccanismo molecolare di alcune malattie genetiche per generare un processo di sviluppo di farmaci per il trattamento di malattie genetiche.
L’impegno di TIDID finora è stato quello di mettere a punto un modello su piccola-media scala che, se di successo, potrà essere ampliato in futuro. Si sono prese in considerazione due malattie genetiche: la sindrome di Lowe (causata da mutazioni del gene OCRL e
caratterizzata da cataratta congenita, ipotonia centrale e massiva
proteinuria) e la fibrosi cistica (causata da mutazioni del canale del
cloro, CFTR).
Per la sindrome di Lowe si sono sviluppati dei saggi cellulari sensibili e rilevanti per la malattia da usare in screening high-throughput
and high-content basati su microscopia automatizzata di librerie di
siRNA (alla ricerca di bersagli farmacologici) o di piccole molecole
(alla ricerca di composti attivi, cioè in grado di correggere il fenotipo cellulare indotto dalla deplezione di OCRL). Infine, si è effettuato
un primo screening di una libreria di 1280 sostanze farmacologicamente attive (Lopac, Sigma) e si sono individuati dei “correttori”
del difetto cellulare indotto dalla deplezione di OCRL che sono attualmente in fase di ulteriore studio per la comprensione del loro
meccanismo d’azione.
Per la fibrosi cistica si è proceduto all’analisi bioinformatica e sperimentale di classi di molecole che si sono dimostrate attive nel correggere la ritenzione nel reticolo endoplasmatico del prodotto del
gene mutato CFTRΔ508, responsabile della maggior parte dei casi
di fibrosi cistica. Abbiamo così delineato dei pathways molecolari sui
quali queste molecole agiscono e testato l’effetto della manipolazione di questi pathways sulla correzione del difetto del mutante
CFTRΔ508, con lo scopo di identificare target farmacologici per il
trattamento della fibrosi cistica.
STUDIO DEI MECCANISMI MOLECOLARI E CELLULARI DELLA
SINDROME DI LOWE MIRATO ALL’IDENTIFICAZIONE E VALIDAZIONE DI BERSAGLI FARMACOLOGICI
Vicinanza Mariella (1,2), Di Campli Antonella (2), Polishchuk Elena
(2), Santoro Michele (1,2), Di Tullio Giuseppe (2), Levcthenko Elena
(3), Polishchuk Roman (1,2), Marzolo MariaPaz (4), De Matteis Maria Antonietta (1,2)
(1) TIGEM - [email protected]
(2) Consorzio Mario Negri Sud, S. Maria Imbaro (CH)
(3) Department of Pediatrics, University Hospitals Leuven, Leuven, Belgium
(4) Departamento de Biología Celular y Molecular, Pontificia Universidad Católica de Chile, Santiago, Chile
La proteina OCRL1 è una 5-fosfatasi che agisce sul fosfatidilinositolo-4,5-bifosfato. Mutazioni nel gene OCRL1 causano la sindrome di
Lowe, caratterizzata da cataratta congenita, ipotonia centrale e proteinuria massiva. Non esistono terapie specifiche per la sindrome di
Lowe.
Grazie a studi recenti conosciamo la localizzazione di OCRL-1, la
sua struttura molecilare e la sua capacità di interagire con un ampia
gamma di proteine coinvolte in vari stadi del traffico intracellulare
di membrane. Ciò che rimane ancora da comprendere a fondo è pero il ruolo cellulare di OCRL1 e il meccanismo con cui sue mutazioni
determinino un quadro patologico così grave come quello della sindrome di Lowe [1. Ungewickell et al, PNAS, 101, 13501-13506,
2004; Choudhury et al, MBC, 16, 3467-3479, 2005; Hyvola et al,
The EMBO Journal, 25,3750-61, 2006; Erdmann et al, Dev Cell, 13,
377-90, 2007]. Questi sono gli scopi principali del nostro studio che
si prefigge proprio di definire il ruolo di OCRL-1 nelle vie di traffico
intracellulare, con l’ obiettivo finale di identificare possibili bersagli
molecolari per lo sviluppo di farmaci.
Per definire il ruolo di OCRL1 (e della sua attività catalitica) nel traffico di membrana e nella patogenesi della sindrome di Lowe abbiamo valutato le conseguenze della deplezione di OCRL1 sulle vie di
traffico intracellulare che sono rilevanti per il riassorbimento delle
proteine da parte delle cellule del tubulo prossimale renale. Inoltre
abbiamo analizzato funzionalmente e strutturalmente il compartimento endosomiale nelle cellule prossimale prelevate da pazienti
con sindrome di Lowe.
I nostri risultati indicano che OCRL1 svolge un ruolo importante nello smistamento, al livello degli endosomi, di ligandi esogeni e di recettori. Infatti l’attività 5-fosfatasica di OCRL1 è necessaria per il
corretto funzionamento di vie che partendo dagli endosomi sono dirette verso diverse destinazioni, come la membrana plasmatica, il
Trans-Golgi-Network e il compartimento degradativo. Come conseguenza, il traffico e il riciclo di recettori di membrana (tanto quelli
ABSTRACT N. 216
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
DONADELLI ROBERTA
GGP07193
292.000
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2007
ANOMALIE GENETICHE DELLE MOLECOLE CHE REGOLANO IL
COMPLEMENTO NELLA SINDROME EMOLITICO UREMICA
Caprioli Jessica, Bresin Elena, Noris Marina, Donadelli Roberta, Sorosina Annalisa, Alberti Marta, Valoti Elisabetta, Daina Erica, Maranta Ramona, Gamba Sara, Piras Rossella, Rurali Erica, Remuzzi Giuseppe
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
tabolismo causato da mutazioni nel gene AGXT che codifica per
l’alanina:gliossilato aminotransferasi perossisomale epatica (AGT).
Lo scopo del progetto di ricerca Telethon GGP10092 è il miglioramento della gestione dei pazienti affetti da PH1 sia mediante la
definizione di chiare correlazioni genotipo/fenotipo che mediante
lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici. Ciò sarà ottenuto dalla
combinazione di approcci biochimici e di biologia cellulare, eseguiti dall’unità della Prof.ssa Voltattorni, con dati genetici e clinici,
raccolti ed analizzati dall’Unità del Prof. Amoroso. Nei primi mesi
di svolgimento del progetto, sono stati presi in considerazione i
seguenti temi:
A) L’Unità della Prof.ssa Voltattorni ha iniziato la caratterizzazione
biochimica di due varianti dell’AGT associate a PH1 in pazienti italiani, le varianti Ser47Arg e Ser81Val. Inoltre, sono in corso di svolgimento studi bioinformatici per l’identificazione di piccole molecole
capaci di agire da “chaperones” farmacologici per l’AGT così come
esperimenti di biologia cellulare per la purificazione dell’AGT da cellule eucariotiche.
B) L’Unità del Prof. Amoroso ha aggiornato i dati clinici e genetici
della coorte di pazienti Italiani con Iperossaluria primaria di tipo I,
che attualmente comprende 62 pazienti. E’ stata ottenuta in questo modo un’analisi epidemiologica descrittiva che, come previsto
nel progetto Telethon, è stata quindi discussa dal punto di vista
delle correlazioni genotipo-fenotipo, del miglioramento dei tempi
di diagnosi, e della definizione di criteri per le scelte terapeutiche.
I principali punti di interesse sono stati lo sviluppo di tecniche dialitiche intensive ad hoc atte a controbilanciare l’eccessiva produzione di ossalato, le indicazioni per il trapianto preventivo di fegato, e la possibilità opzione del doppio trapianto renale. In collaborazione con Colleghi dell’Università di Colonia in Germania e’ stato
avviato uno studio genetico di secondo livello mediante MLPA su
un gruppo di pazienti apparentemente omozigoti per la mutazione
comune Gly170Arg associata a responsività alla piridossina in maniera dipendente dalla dose genica, inteso a valutare l’eventuale
presenza di delezioni nel gene AGXT. Queste tematiche sono state
anche condivise con altri membri del Consorzio europeo OxalEurope in occasione di una riunione del Consorzio che si è tenuta a Torino-Orbassano il 1° Dicembre 2010, per discutere le esperienze e
discutere le regole e il formato del database Europeo in via di costruzione.
Centro di Ricerche Cliniche per le Malattie Rare “Aldo e Cele Daccò”,
Istituto Mario Negri Ranica, Bergamo
La sindrome emolitico uremica (HUS) è caratterizzata da anemia
emolitica microangiopatica e da disfunzioni renali. Molti casi pediatrici di HUS sono causati da batteri che producono Shiga -tossine.
L’altra forma, HUS atipica (aHUS), rende conto del 10% dei casi e
ha una prognosi peggiore. Nell’aHUS sono state descritte anomalie
nei geni che codificano per proteine del complemento.
In un primo studio abbiamo cercato anomalie nei geni del complemento in 273 pazienti consecutivi con aHUS e studiato il loro
ruolo nel predire il fenotipo clinico e la risposta al trattamento.
Abbiamo confrontato la frequenza delle mutazioni, la localizzazione e l’esito clinico in 82 casi di aHUS familiare e 191 casi di aHUS
sporadica.
In più del 70% dei casi sporadici e familiari sono state trovate o
mutazioni nei geni candidati, o polimorfismi nel fattore H (CFH) associati alla malattia o anticorpi anti-CFH. Sia le mutazioni che i polimorfismi per il Fattore H sono stati individuati anche nella maggioranza dei pazienti con aHUS secondaria, suggerendo una predisposizione genetica. I casi familiari hanno un’alta prevalenza di mutazioni nell’ SCR20 del CFH e una malattia più severa rispetto ai casi
sporadici. I pazienti con mutazioni al CFH o alla trombomodulina
(THBD) hanno un’insorgenza più precoce della malattia e la più alta
mortalità. Mutazioni nel gene che codifica per la proteina cofattore
di membrana (MCP) sono associate alla prognosi migliore. La terapia con plasma induce la remissione nel 55-80% degli episodi in pazienti con mutazioni al CFH, C3 o THBD o con autoanticorpi, mentre
i pazienti con mutazioni al CFI (fattore I) rispondono poco. aHUS ricorre frequentemente dopo trapianto di rene, eccetto nei pazienti
con mutazioni a MCP.
I risultati sottolineano la necessità dello screening genetico per tutti
i fattori di suscettibilità come parte della gestione clinica di aHUS e
per la identificazione di pazienti che potrebbero beneficiare del trapianto di rene.
In un secondo studio abbiamo investigato la prevalenza delle mutazioni combinate nei geni del complemento nell’aHUS. Attraverso il
gruppo di studio europeo sull’aHUS, abbiamo raccolto dati clinici e
genetici da 26 pazienti con mutazioni combinate selezioni tra più di
800 pazienti screenati per i geni del complemento. Mutazioni combinate sono state trovate in circa il 3% dei casi. Le mutazioni in
CFH raramente erano associate a mutazioni in altri geni, mentre
circa il 25% dei pazienti con mutazioni in MCP o CFI aveva anche
una seconda mutazione in un altro gene del complemento. Abbiamo
osservato che la presenza di un’altra mutazione non modificava la
prognosi nei pazienti con mutazioni in CFH o CFI, rispetto a pazienti
con una singola mutazione in questi geni. Al contrario, pazienti con
mutazioni in MCP combinate a mutazioni in altri geni avevano una
più elevata incidenza di insufficienza renale terminale rispetto a pazienti con sole mutazioni in MCP. La maggior parte dei pazienti con
mutazioni combinate ha risposto alla terapia con plasma. Pazienti
con mutazioni in CFH o CFI combinate a mutazioni in MCP hanno
avuto un migliore outcome del trapianto rispetto a pazienti con sole
mutazioni in CFH o CFI. Questi risultati sottolineano la complessità
della genetica dell’aHUS ed il suo impatto complesso sull’outcome
clinico.
ABSTRACT N. 218
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
VOLTATTORNI CARLA
Totale
213.200
Num Centri: 2
Anno d’inizio: 2007
ZIALE PER LA FORMAZIONE DELLE CIGLIA E ALLA BASE DELLA MALATTIA DEL RENE POLICISTICO (PKD, POLYCYSTIC
KIDNEY DISEASE)
Vannuccini Elisa (1), Paccagnini Eugenio (1), Rossi Benedetta (1),
Etebari Maryam (1), Cantele Francesca (2), Lanzavecchia Salvatore
(2), Lupetti Pietro (1)
GGP10092
Durata (anni): 3
208.300
Durata (anni): 3
COMPLESSI PROTEICI RESPONSABILI DEL TRASPORTO INTRAFLAGELLARE (IFT): SISTEMA MOLECOLARE ESSEN-
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Telethon grant N.
GGP07269
ANALISI ULTRASTRUTTURALE AD ALTA RISOLUZIONE DEI
ABSTRACT N. 217
Responsabile
LUPETTI PIETRO
(1) Dipartimento di Biologia Evolutiva Università di Siena - Pietro Lupetti - Via
Aldo Moro 2, 53100, Siena, Italy
(2) Dip. di Chimica Strutturale Università di Milano, Milano
Anno d’inizio: 2010
Il rene policistico (PKD) è una delle malattie ereditarie più comuni
nell’uomo. È stato dimostrato che le ciglia primarie svolgono un
ruolo rilevante nella funzionalità renale e che difetti nel loro assemblaggio possono portare alla PKD (Pazour et al, 2000). L’assemblaggio ed il mantenimento di ciglia e flagelli eucariotici sono regolati dal Trasporto Intraflagellare (IFT): un rapido movimento di particelle multi proteiche lungo i microtubuli flagellari (Rosenbaum and
Witman, 2002). Un malfunzionamento in tali complessi può causare, oltre alla PKD, diverse malattie come, per esempio, il situs inversus, l’obesità e il diabete. Mentre sono note molte informazioni
sulla biochimica e la biologia molecolare di IFT (Cole, 2003), pochi
studi ultrastrutturali sono stati svolti prima del nostro coinvolgimento. Le ricerche del nostro laboratorio, cofinanziate da Telethon,
hanno permesso di ottenere, tramite tomografia elettronica di Chlamydomonas reinhardtii, il primo modello 3D ad alta risoluzione di
treni IFT in situ (Pigino et al., 2009). Analizzando flagelli provenienti da cellule vegetative, abbiamo identificato due distinte tipologie
di treni che differiscono per la loro lunghezza complessiva e per la
SVILUPPO DI NUOVE STRATEGIE PER IL TRATTAMENTO DELL’IPEROSSALURIA PRIMARIA DI TIPO I
Mandrile Giorgia (1), Zanone Chiara (1), Giachino Daniela (1), Bongiovanni Daniela (2), Berutti Silvia (3), Marangella Martino (3), Peruzzi Licia (4), De Marchi Mario (1), Amoroso Antonio (2), Cellini
Barbara (5), Montioli Riccardo (5), Oppici Elisa (5), Gotte Giovanni
(5), Carla Voltattorni (5)
(1) Department of Clinical and Biological Sciences, University of Torino
(2) Department of Genetics, Biology and Biochemistry, University of Torino
(3) Nephrology Unit, Ospedale Mauriziano, Torino
(4) Pediatric Nephrology Unit, Children Hospital OIRM Sant’Anna, Torino
(5) Department of Life Sciences and Reproduction, Section of Biological Chemistry, University of Verona, Verona
L’Iperossaluria Primaria di tipo I (PH1) è un raro disordine del me-
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Pagina 119
PROGETTI DI RICERCA TELETHON
periodicità strutturale delle particelle: treni lunghi e sottili, treni
corti e compatti. Durante i nostri studi abbiamo ottenuto il modello
3D dei treni lunghi di IFT solo dopo aver sviluppato nuove e più efficienti strategie di 3D modelling, in collaborazione con il gruppo di
ricerca del Prof. Salvatore Lanzavecchia dell’Università di Milano
(Lanzavecchia et al. 2009). Sempre con il gruppo di Milano, stiamo
ottimizzando le strategie metodologiche per la ricostruzione 3D dei
treni corti di IFT. Attualmente stiamo anche studiando se alle due
tipologie di treni IFT siano associate differenze funzionali. Ovvero se
i treni lunghi siano responsabili del movimento anterogrado e i treni
corti di quello retrogrado. Un’ ipotesi alternativa è che la diversità
ultrastrutturale tra treni IFT lunghi e corti possa essere imputata alla presenza di cargo indipendentemente dalla direzione del loro movimento, con i treni lunghi associati ai cargo ed i corti privi di essi.
Nel tentativo di dirimere questa problematica stiamo studiando l’ultrastruttura, la frequenza e la morfometria di treni IFT in flagelli di
Chlamydomonas wt durante la rigenerazione flagellare, dopo deflagellazione con shock di pH. In una tale condizione fisiologica IFT
anterogrado è dominante rispetto al trasporto retrogrado. Stiamo
inoltre analizzando flagelli provenienti da gameti di Chlamydomonas
wt, dove i treni IFT risultano prevalentemente privi dei cargo, per
paragonarli con quelli full lenght di cellule vegetative. Presenteremo
alla Convention Telethon 2011 i dati ottenuti da questi studi.
next-generation sequencing in 2 famiglie e’ risultata in una copertura media di 119X (>95% a >8X). Abbiamo identificato >14.000 polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) per campione. Dopo controlli
di qualità e di filtro, ~ 600 SNPs per ogni individuo erano nuovi. Sono state trovate 34 nuove varianti: 3 codoni di stop prematuro, 11
mutazioni del sito di splice e 20 varianti missense. Abbiamo validato 18 di queste varianti mediante sequenziamento Sanger e 6 cadevano all’interno di picchi di linkage. Tre (2 in una famiglia e 1 nell’altra) segregano con il fenotipo. Lo screening di questi geni in
>200 pazienti per la ricerca di mutazioni indipendenti ha portato all’identificazione di 17 nuovi SNPs, tra cui una mutazione di stop
prematuro.
Conclusioni. Usando una combinazione di analisi di linkage, ricerca
di CNV e sequenziamento di nuova generazione, siamo stati in grado di identificare nuovi disordini genomici e potenziali geni causali
per RHD/CAKUT. Studi di replicazione ed esperimenti funzionali sono in corso.
ABSTRACT N. 220
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
ABSTRACT N. 219
Totale
Num Centri: 4
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 2
GGP08050
355.700
GGP09126
574.700
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2009
DELUCIDARE LE BASI GENETICHE DELLA MENOPAUSA PRECOCE E ALCUNI DEI MECCANISMI MOLECOLARI DELLA PATOLOGIA
GHIGGERI GIAN MARCO
Durata (anni): 3
TONIOLO DANIELA
Anno d’inizio: 2008
Persani Luca (4), Rossetti Raffaella (4), Marozzi Anna (2), Bione Silvia (3), Corre Tanguy (1), Carrabino Salvatore (1), Toniolo Daniela
(1,3)
DETERMINANTI GENETICHE DELL’IPODISPLASIA RENALE
NON SINDROMICA (RHD) E FENOTIPI ASSOCIATI
(1)
Via
(2)
(3)
(4)
Bodria Monica (1), Sanna-Cherchi Simone (2), Carrea Alba (1),
Burgess Katelyn (2), Kiryluk Krzysztof (2), Sterken Roel (2), Caridi
Gianluca (1), Scolari Francesco (3), Allegri Landino (4), Gesualdo
Loreto (5), Lifton Richard (6), Tasic Velibor (7), Gharavi Ali G (2),
Gianmarco Ghiggeri (1)
Divisione di Genetica e Biologia Cellulare, Istituto Scientifico San Raffaele, Olgettina 58, 20132 Milano
Università di Milano, Dip Biologia e Genetica per le Scienze Mediche, Milano
IGM-CNR, Via Abbaitegrasso 207, Pavia
Universita di Milano, IRCCS Istituto Auxologico Italiano, Milano
L’insufficienza ovarica precoce, o POF, è una patologia eterogenea
con una rilevante componente genetica. Il progetto si propone da
una parte di identificare nuovi geni responsabili del fenotipo POF e
dall’altra di studiare la funzione di due geni, DIAPH2 e BMP15, e
dell’allele premutato del gene FMR1, già associati a POF.
Il coordinatore e il partner 2 si sono occupati della riorganizzazione
della collezione di DNA e della banca dati di pazienti POF per adeguarla ai nuovi progetti di GWAS e resequenziamento. La coorte Val
Borbera è entrata fare parte di un consorzio internazionale (the ReproGen Consortium) che si propone di studiare la genetica dell’età
riproduttiva della donna. Un GWAs in cui sono state identificati geni
per l’età del menarca è già stato pubblicato (Nature Genetics 2010
Dec; 42(12):1077-85) e un manoscritto per il GWAS dell’età di menopausa è in preparazione. Il gruppo è direttamente responsabile di
un terzo GWAS, in corso, per EM e POF. Il coordinatore ha continuato lo studio del gene DIAPH2. Mediante resequenziamento si
cercano le varianti causative associate all’aplotipo di rischio già
identificato. Gli studi funzionali in cellule di granulosa umane (hGC)
e in ovaio di topo, stanno dimostrando un ruolo rilevante di DIAPH2
nell’organizzazione del citoscheletro di hGC.
Il partner 1 ha dimostrato che una mutazione missense nella regione corrispondente al peptide mature del gene BMP15 causa
una riduzione della proteina bioattiva simile a quanto dimostrato
nella pecora. Il gruppo ha iniziato un analisi del trascrittoma di
hGC trattate e non con BMP15. Dati preliminari indicano nelle cellule trattate un regolazione negativa di RNA codificanti per proteine coinvolte nella folliculogenesi e un’attivazione di geni per la
proliferazione di hGC. Infine è incorso un analisi del DNA mitocondriale che sta mostrando come un difetto di tale DNA potrebbe essere responsabile di POF.
Il partner 4 ha dimostrato che una sonda a RNA composta da 76 ripetizioni CGG mostra una maggiore affinità di legame per alcune
proteine (rCGG-repeat-binding (RBPs)) di hGC rispetto ad una sonda ad RNA composta da 28 ripetizioni. Le proteine sono state isolate mediante analisi MALDITOF e ESI-Q-TOF. L’interazione dell’mRNA endogeno è stato testato in vivo mediante immunoprecipitazione dell’RNA; solo mRNA premutato è in grado di co-immunoprecipitare insieme alle proteine HSP27 e CRYAB, suggerendo che in vivo
l’mRNA premutato differisce da quello wild type nella capacità di
creare complessi RNA-proteine. Il ruolo della HSP27 e CRYAB nella
patogenesi della FX-POF è stato indagato in un modello cellulare di
derivazione ovarica. In cellule della granulosa ovarica che esprime-
(1) Division of Pediatric Nephrology, G. Gaslini Institute, Genoa, Italy - Division
of Nephrology, Dialysis and Tranplantation and Laboratory on Pathophysiology
of Uremia, Istituto G. Gaslini, Largo G. Gaslini 5, Genoa, Italy. Phone: (+39)
010 380742. Fax: (+39) 010 395214. E-mail: [email protected]
(2) Department of Medicine, Columbia University, New York, NY, USA
(3) Division of Nephrology, Hospital of Montichiari, Italy
(4) Division of Nephrology, University of Parma, Italy
(5) Department of Biomedical Sciences, University of Foggia, Italy
(6) Department of Genetics, Yale University, New Haven, CT, USA
(7) Division of Pediatric Nephrology, Skopje, Macedonia
Introduzione. La RHD non sindromica rappresenta una delle forme
piu’ severe di malformazioni renali. Nonostante una componente
genetica sia nota, le basi genetiche rimangono elusive. Il nostro
progetto ha lo scopo di identificare nuovi geni con ampio effetto in
una vasta coorte di pazienti utilizzando un approccio genetico integrato che si basa su nuove tecnologie altamente sofisticate. Materiali e Metodi. Abbiamo reclutato una vasta casistica di pazienti e
famiglie affetti da Anomalie Congenite dei Reni e Vie Urinarie
(CAKUT) attraverso un network mondiale di medici. La nostra strategia per l’identificazione genica nel CAKUT include l’integrazione di
analisi di linkage, ricerca di rare copy number variations (CNV) e
whole exome capture seguito da next-generation massive parallel
sequencing. L’analisi di linkage e’ stata condotta con gli Affymetrix
10K 2.0 arrays. La CNVs discovery e’ stata eseguita con gli Illumina
610-Quad arrays. Il whole exome capture e’ stato fatto su chips
Nimblegen e la next-generation sequencing eseguita su un Illumina
Genome Analyzer.
Risultati. La nostra casistica include 2,365 pazienti e >50 pedigree.
Mediante analisi di linkage in famiglie abbiamo identificato 5 loci
suggestivi/significativi sui cromosomi 1q, 3p, 10q, 11q and 18q.
Abbiamo proceduto alla ricerca di CNV nei probandi di tali famiglie,
in sporadici (196 in totale) e in >13,000 controlli genotipizzati per
>600,000 SNPs. Abbiamo identificato 2.754 CNVs unici, 61 dei quali interrompono geni e sono assenti nei controlli e database pubblici.
16 pazienti erano portatori di CNV di ruolo patogenetico noto, 25
pazienti erano portatori di rare CNV geniche, che rappresentano
nuovi disordini genomici. Abbiamo validato queste CNV mediante
PCR quantitativa in tutti i pazienti e familiari disponibili e 7 di queste varianti sono risultate de novo. Questi dati indicano che rare
CNV costituiscono una causa importante di CAKUT. La whole exome
119
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
PROCCIO IN VIVO CON UN MODELLO MURINO DI DISPLASIA
DIASTROFICA
vano un mRNA di FMR1 premutato è stato osservata una risposta di
tipo shock termico suggerendo che l’mRNA premutato di per sé
stesso sia tossico a livello ovarico.
de Leonardis Fabio (1), Facchini Marcella (1), Gualeni Benedetta (1), Forlino
Antonella (1), Tenni Ruggero (1), Cetta Giuseppe (1), Pecora Fabio (1), Geoffroy Valerie (2), de Vernejoul Marie-Christine (2), Superti-Furga Andrea (3),
Rossi Antonio (1)
ABSTRACT N. 221
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
KRAUSZ CSILLA GABRIELLA
Responsabile
Totale
Num Centri: 1
(1) Dipartimento di Biochimica, Università di Pavia - Via Taramelli 3/b, I-27100
Pavia. Phone: (0382)987229; Fax: (0382)423108; E-mail: [email protected]
(2) INSERM U606, Hôpital Lariboisière, Paris
(3) Centre Hospitalier Universitaire Vaudois, University of Lausanne, Switzerland
GGP08204
Telethon grant N.
84.500
Durata (anni): 2
Anno d’inizio: 2008
VARIAZIONI DEL NUMERO DI COPIE (CNVS) DEL CROMOSOMA Y
Mutazioni nel trasportatore del solfato della displasia diastrofica
(DTDST) causano una famiglia di condrodisplasie che include forme
letali con generalizzata ipoplasia dello scheletro (acondrogenesi 1B
e atelosteogenesi 2), una forma non letale, la displasia diastrofica
(DTD), ed una forma relativamente lieve di displasia multipla epifisaria. Il gene codifica per un trasportatore intracellulare del solfato
necessario alla solfatazione delle macromolecole, in particolare dei
proteoglicani. Utilizzando il topo dtd, un modello animale di DTD,
intendiamo definire il ruolo della solfatazione delle macromolecole
nella patogenesi delle osteocondrodisplasie legate al DTDST e sviluppare nuove strategie terapeutiche.
Per studiare la ridotta crescita scheletrica nella DTD, abbiamo considerato la solfatazione dei proteoglicani nelle zone della piastra di
crescita del topo dtd ed i risultati sono stati correlati alla istomorfometria della piastra di crescita ed a studi di proliferazione. Abbiamo
rilevato un aumento della sottosolfatazione dei proteoglicani nella
zona resting, proliferante e ipertrofica del topo dtd rispetto al wt. Il
tasso di proliferazione cellulare, misurato mediante marcatura con
bromodeossiuridina, era significativamente ridotto nei topi mutati.
L’immunoistochimica della piastra di crescita dei topi dtd ha dimostrato che il difetto di solfatazione altera la distribuzione di Indian
hedgehog, un morfogeno necessario per la proliferazione e differenziamento dei condrociti, contribuendo cosi alla ridotta crescita delle
ossa lunghe.
Le radiografie unitamente a studi di densitometria e istomorfometria ossea hanno dimostrato un fenotipo osseo. I livelli serici del telopeptide C-terminale del collagene di tipo I erano superiori alla
norma nel topo dtd suggerendo così che la ridotta massa ossea è la
conseguenza di un aumentato riassorbimento osseo dovuto ad una
alterata matrice ossea. Nel loro insieme questi risultati indicano che
il difetto di solfatazione non colpisce solo la cartilagine, ma anche
l’osso.
Il solfato citoplasmatico per la solfatazione delle macromolecole può
provenire dallo spazio extracellulare o dal catabolismo dei tioli e degli aminoacidi contenenti zolfo. Per verificare se i derivati della cisteina contribuiscono alla solfatazione delle macromolecole abbiamo
misurato la solfatazione dei proteoglicani dopo somministrazione di
N-acetilcisteina a topi dtd e wt. E’ stato rilevato un incremento nella
solfatazione dei proteoglicani nel gruppo di animali dtd trattati con
il farmaco rispetto al gruppo placebo. Tuttavia gli studi di farmacocinetica hanno dimostrato che la N-acetilcisteina viene rimossa molto rapidamente dal torrente circolatorio. In conclusione l’apporto
della cisteina alla solfatazione dei proteoglicani della cartilagine in
vivo è minima in condizioni fisiologiche; tuttavia il contributo dei
composti tiolici alla solfatazione diventa significativa aumentando la
loro concentrazione plasmatica.
Giachini Claudia, Laface Ilaria, Nuti Francesca, Daguin Fabrice,
Guarducci Elena, Degl’Innocenti Selene, Krausz Csilla
SOD Andrology and Sexual Medicine, Department of Clinical Physiopathology,
University of Florence - Viale Pieraccini 6, 50139 Firenze. Tel +39 055
4271485; Fax +39 055 4271371; e-mail: [email protected]
Nei paesi occidentali circa il 7% degli uomini presenta problemi di infertilità e l’eziopatogenesi della disfunzione testicolare non è nota nel
50% dei casi (“infertilità idiopatica”). I casi “idiopatici” hanno presumibilmente un’origine genetica, visto che i geni coinvolti nella spermatogenesi umana sono più di mille e, ad oggi, ne sono stati studiati solo
alcune decine. Il cromosoma Y è particolarmente ricco di sequenze
duplicate con un grado di identità >99.9% che possono rappresentare
il substrato per la generazione di CNVs mediante ricombinazione omologa non allelica (NAHR). Il nostro obiettivo era di definire il significato
clinico di due CNVs Y-linked.
1) Riarrangiamenti parziali della regione AZFc (delezioni e duplicazioni): abbiamo effettuato il più ampio studio caso/controllo pubblicato
ad oggi sui caucasici; 1062 e 504 soggetti sono stati analizzati per le
delezioni e duplicazioni parziali, rispettivamente, utilizzando un metodo combinato basato sull’analisi di STSs (+/-) seguita dallo studio
quali- e quantitativo dei geni CDY1-DAZ. La frequenza della delezione
gr/gr nei pazienti è risultata significativamente più alta rispetto ai controlli (3.1% vs 0.4%, rispettivamente; p<0.001), con un OR=7.6
(95% CI 1.8-32.7), mentre le delezioni b2/b3 erano rare in entrambi i
gruppi (0.9% nei pazienti, 0.2% nei controlli). Riguardo alle duplicazioni parziali, la loro frequenza non è risultata significativamente diversa tra casi (2.9%) e controlli (3.8%).
2) Variazione del numero di copie del gene TSPY1: abbiamo determinato mediante Q-PCR il numero di copie geniche TSPY1 in 212 pazienti infertili idiopatici e in 168 controlli normozoospermici (originari del
centro Italia) e definito gli aplogruppi del cromosoma Y (Y hgs) in tutti
i soggetti; la loro distribuzione risultava simile nei due gruppi. I nostri
risultati mostrano che il numero di copie geniche TSPY1 varia marcatamente tra Y hgs, indicando che la stratificazione della popolazione
può rappresentare un potenziale bias per gli studi di associazione caso/controllo. Inoltre abbiamo riportato: i) una correlazione positiva significativa tra numero di copie TSPY1 e numero di spermatozoi
(Rho=0.276; p<0.001), ii) che la media del numero di copie TSPY1
differisce significativamente tra casi e controlli (28.5±7.9 vs
32.6±9.8; p<0.001); iii) che soggetti con un numero di copie <33
presentano un rischio 1.3 volte maggiore di presentare parametri seminali alterati (95% CI 1.1-1.6; p<0.001).
Conclusioni: Questo studio dimostra che: 1) la delezione gr/gr è il fattore di rischio genetico più rilevante per un’alterata spermatogenesi.
Sulla base di questo risultato, il suo screening è stato introdotto nel
work-up diagnostico del maschio infertile. 2) Il numero di copie geniche TSPY1 influenza significativamente l’efficienza della spermatogenesi; un basso numero di copie TSPY1 rappresenta un nuovo fattore di
rischio per l’infertilità maschile, con potenziali conseguenze cliniche, e
dovrebbe essere tenuto in considerazione nell’ambito di un approccio
multigenico per l’infertilità idiopatica. Studi futuri saranno mirati a determinare le conseguenze funzionali, a livello molecolare, di queste
anomalie genetiche.
ABSTRACT N. 223
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 1
ROSSI ANTONIO
GGP06076
140.700
Durata (anni): 3
262.500
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2009
Riminucci Mara (1,3), Saggio Isabella (2,3), Remoli Cristina (1,2),
Cersosimo Stefania (1,3), Di Consiglio Alberto (1,3), Costa Rossella
(1,3), Bianco Paolo (1,3)
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Telethon grant N.
GGP09227
DISPLASIA FIBROSA POLIOSTOTICA - MODELLI DI MALATTIA E MODELLI DI TERAPIA
ABSTRACT N. 222
Responsabile
BIANCO PAOLO
(1) Università la Sapienza, Dipartimento di Medicina Molecolare - Viale Regina
Elena 324, 00161 Roma, email: [email protected], [email protected]
(2) Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles Darwin, Università la Sapienza, Roma
(3) Parco Biomedico San Raffaele, Roma
Anno d’inizio: 2006
IL RUOLO DELLA SOLFATAZIONE DEI PROTEOGLICANI NELLO SVILUPPO ED OMEOSTASI DELLO SCHELETRO: UN AP-
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
Allo scopo di generare dei modelli animali della Displasia Fibrosa/S. di MucCune-Abright umana (OMIM 174800), abbiamo generate 3 diversi modelli trasngenici. In due di essi (LV-EF1a-GsalphaR201C e LV-PGK-GS-alphaR201C), il gene malattia e’
espresso sotto il controllo di promotori costitutivi (e dunque in
tutti i tipi cellulari dell’ambiente osseo) mentre nell terzo modello
(COL1A1-Gs-alphaR201C) e’ selettivamente espresso in osteoblasti maturi. La caratterizzazione comparativa del fenotipo di almeno 2 linee per ciascun modello, estesa all’intera durata della vita
degli animali, ha ora rivelato la precisa sequenza di eventi che
istituiscono le lesioni DF in vivo. Mentre gli animali con espressione costitutiva del gene malattia sviluppano una replica esatta delle lesioni DF umane, gli animali con espressione ristretta agli
osteoblasti maturi sviluppano un peculiare fenotipo di alta massa
ossea, ma una replica solo imperfetta e parziale delle lesioni DF
umane.
Aspetti chiave come la fibrosi del midollo, l’osteomalacia e l’osteolisi mancano caratteristicamente in topi COL1A1-Gs-alphaR201C,
ma sono invece fedelmente riprodotti in topi con espressione costitutiva del gene malattia, il che implica cellule diverse da osteoblasti maturi nella genesi della lesione. L’analisi dell’espressione
del transgene a diversi stadi differenziativi del lineage osteoblastico ha rivelato la sua espressione costitutiva in progenitori scheletrici ottenuti da topi LV-EF1a-Gs-alphaR201C e LV-PGK-GSalphaR201C, ma non da topi COL1A1-GS-alphaR201C, nei quali
l’espressione compare invece solo dopo induzione del differenziamento osteoblastico. L’espressione del transgene attiva l’upregolazione di RANK-L e la downregolazione di Osteoprotegerina in
modo indipendente dallo stadio differenziativo, il che predice la
promozione di esagerata osteoclastogenesi in vivo nei diversi modelli. Solo negli animali con espressione costitutiva del transgene,
tuttavia, questi eventi si traducono nella promozione di osteoclastogenesi da parte di progenitori osteoblastici anziche’ da parte di
osteoblasti maturi. Invece, negli animali con espressione osteoblasto-specifica del transgene la promozione dell’osteoclastogenesi rimane accoppiata alla sintesi e deposizione di collagene. Di
conseguenza, lesioni osteolitiche si verificano selettivamente in
topi con espressione costitutiva del transgene, e sono queste lesioni a innescare lo sviluppo di lesioni DF. Attraverso una complessa sequenza di inaccoppiato riassorbimento osseo, microfratture, ed espansione di progenitori osteoblastici in tessuto “fibrotico”, lesioni DF istologicamente indistinguibili da quelle umane si
sviluppano in un arco di tempo non inferiore a 12 mesi. Lo sviluppo di lesioni DF nei nostri modelli segue un pattern temporale e
spaziale definito e altamente riproducibile nei diversi individui, cosi’ che comparsa ed evoluzione di lesioni DF possono essere affidabilmente predette.
L’analisi delle ragioni sottostanti la prevedibilita’ del fenotipo rivela determinanti aggiuntivi e inattesi della genesi delle lesioni DF, e
altrettanti potenziali punti di attacco terapeutico. Ad oggi, due di
queste ragioni sono identificate in una peculiare pattern temporospaziale di downregolazione di specifiche fosfodiesterasi nello
scheletro, e nella associazione del pattern di sviluppo delle lesioni
DF con il pattern di conversione adiposa del midollo osseo.
che producano una forma solubile di RANKL (sRANKL) da rilasciare nella circolazione. Innanzitutto abbiamo verificato che gli
osteoblasti murini (mOBs) rapprensentano la principale fonte di
sRANKL e che il trattamento con l’enzima MMP14 determina un incremento concentrazione-dipendente di sRANKL nel terreno di coltura (controllo 454±29pg/ml; MMP14: 50ng/ml, 710±309pg/ml;
500ng/ml, 950±273pg/ml*; 1000ng/ml, 1261±324pg/ml*;
*p<0.05 vs controllo). Abbiamo inoltre dimostrato che mOBS coltivati su supporti tridimensionali di idrossiapatite (3D-HA) su cui
era stata immobilizzata l’MMP14, presentano un incremento del rilascio di sRANKL di 1.7 volte maggiore rispetto a cellule coltivate
su supporti non manipolati (p<0.01).
Per fini terapeutici, abbiamo effettuato esperimenti preliminari di
impianto in vivo delle camere di diffusione, ottenendo un buon
attecchimento in animali wild type di 21 giorni. Attualmente
stiamo perfezionando la procedura, al fine di applicarla al modello murino di osteopetrosi RANKL-dipendente. L’osteopetrosi
autosomica dominante è una forma meno grave ma spesso caratterizzata da fratture multiple e pessima qualità di vita. E’ dovuta a mutazioni in eterozigosi del gene CLC7, codificante l’antiporto cloro/protoni di tipo 7, una proteina dimerica indisensabile
per il riassorbimento osseo.
Poiché anche per tale forma non esiste alcuna cura, stiamo verificato l’ipotesi che il silenziamento specifico dell’allele mutato
mediante “small interfering” RNA (siRNA) possa ripristinare un
fenotipo normale. Abbiamo dimostrato l’efficacia in vitro di tale
strategia per le mutazioni R767W, A788D e R286W e abbiamo
perfezionato il disegno di siRNA per la mutazione più frequente,
G215R. Inoltre abbiamo completato la generazione del topo
transgenico G215R-clc7, di cui a breve termineremo l’analisi fenotipica. Stiamo mettendo a punto la procedura in vivo utilizzando siRNA marcati con Cy3 (Cy3-siRNA) diretti contro l’mRNA
normale del clc7. A tal fine, abbiamo iniettato 2mg/Kg di Cy3clc7-siRNA nella vena caudale di topi wild type CD1. Dopo 24-48
ore gli animali sono stati sacrificati ed i livelli di espressione del
clc7 sono stati analizzati in rene, fegato, polmone, milza, cuore
e tibia, nei quali abbiamo osservato una riduzione tempo-dipendente del trascritto. Tali dati dimostrano che entrambi gli approcci sperimentali sono promettenti per future terapie dell’ostepetrosi.
ABSTRACT N. 225
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 1
TETI ANNA MARIA
200.100
Anno d’inizio: 2010
(1) CNR-ITB, Segrate, Italy - via Manzoni 113, 20089 Rozzano (MI), tel 02
82245164; fax 02 82245191; email [email protected]
(2) Istituto Clinico Humanitas IRCCS, Rozzano, Italy
(3) University of Brescia, Department of Pathology I, Brescia, Italy
(4) University of Pittsburgh, Department of Pathology, Pittsburgh, USA
(5) Amgen Inc, Thousand Oaks, USA
GGP09018
Durata (anni): 3
138.000
Durata (anni): 2
Lo Iacono Nadia (1,2), Marrella Veronica (1,2), Cassani Barbara
(2), Ficara Francesca (2), Guerrini Matteo (1,2), Poliani Pierluigi
(3), Fontana Elena (3), Blair Harry (4), Kostenuik Paul (5), Vezzoni
Paolo (1,2), Villa Anna (1,2), Sobacchi Cristina (1,2)
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Telethon grant N.
GGP10116
APPROCCIO FARMACOLOGICO PER LA CURA DELL’OSTEOPETROSI AUTOSOMICA RECESSIVA RANKL-DIPENDENTE
ABSTRACT N. 224
Responsabile
SOBACCHI CRISTINA
Anno d’inizio: 2009
NUOVI APPROCCI TERAPEUTICI PER L’OSTEOPETROSI
L’osteopetrosi autosomica recessiva (ARO) è una rara malattia genetica dell’osso caratterizzata da aumento della densità ossea a
causa di un difetto nel riassorbimento osseo.
I sintomi compaiono nella prima infanzia, i principali sono pancitopenia a causa della mancanza di cavità midollare, ematopoiesi extramidollare che porta a epatosplenomegalia, fratture e difetti del
sistema nervoso centrale a causa della compressione dei nervi cranici con cecità e sordità secondaria.
La malattia è letale se non trattata e finora l’unica terapia possibile
è il trapianto di cellule staminali emopoietiche (HSCT), che ha maggiori probabilità di successo quando è disponibile un donatore HLA
compatibile.
Diversi geni sono stati coinvolti nella patogenesi della malattia (Villa
et al, Calcif Tissue Int 84:1, 2009).
In particolare, abbiamo recentemente identificato un sottogruppo
di pazienti ARO recanti mutazioni del gene RANKL (Sobacchi et al,
Nat Genet 39:960, 2007), codificante per una citochina che svolge
un ruolo essenziale nel processo di osteoclastogenesi, infatti i pa-
Del Fattore Andrea (1,2), Cappariello Alfredo (1,2), Capannolo Marta (1), Peruzzi Barbara (1), Rucci Nadia (1), Teti Anna (1)
(1) Department of Experimental Medicine, University of L’Aquila, L’Aquila - via
Vetoio-Coppito 2, 67100, L’Aquila, Italy. Tel. 0862-433511; e-mail: [email protected]
(2) Children Hospital, Bambino Gesù, Rome, Italy
L’osteopetrosi è una patologia genetica rara, caratterizzata da
sclerosi dello scheletro, dovuta a ridotta o totale assenza di funzione degli osteoclasti. Esistono diverse forme di osteopetrosi tra
le quali quella autosomica recessiva è letale. Poiché la variante
dovuta a mutazioni nel gene TNFSF11, codificante la citochina
osteoclatogenica RANKL prodotta da cellule stromali, non può essere trattata con trapianto di cellule staminali emopoietiche, abbiamo ipotizzato un nuovo approccio sperimentale, utilizzando dispositivi biocompatibili (camere di diffusione) contenenti cellule
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
ABSTRACT N. 227
zienti con ARO RANKL-dipendente non hanno osteoclasti nelle loro
ossa.
E’ interessante notare che HSCT classico non ha alcuna possibilità
di curare questa particolare forma di ARO, dal momento che HSCs
non producono RANKL che è invece espresso principalmente dagli
osteoblasti, cellule di origine mesenchimale/stromale. RANKL agisce
sia come ligando legato alla membrana sia come citochina solubile,
come dimostrato in vitro e in vivo.
Quindi abbiamo suggerito che i pazienti ARO RANKL-dipendenti
possano trarre beneficio dalla somministrazione farmacologica di
RANKL esogeno. Per verificare questa ipotesi, abbiamo definito
un protocollo in cui topi rankl-/-, che ricapitolano la malattia della loro controparte umana, ricevono iniezioni sottocutanee o di
RANKL ricombinante, murino solubile o di PBS, come controllo,
ogni 48 ore. Due diverse dosi di citochina ricombinante sono state testate.
Al sacrificio, sono state effettuate l’analisi istomorfometrica dell’osso, dosaggi sierologici e l’analisi istologica di tutti gli organi potenzialmente interessati dal trattamento e sono stati confrontati i risultati ottenuti nei diversi sottogruppi.
In particolare, nei topi che hanno ricevuto la più bassa dose di
RANKL l’osteopetrosi sembrava essere trattata in maniera non
adeguata con solo lievi miglioramenti della malattia, mentre nei topi che hanno ricevuto la dose più alta la struttura ossea è apparsa
sostanzialmente normale con un residuo molto limitato di cartilagine osteopetrotica, e la qualità della vita è stata notevolmente migliorata. Tuttavia, in entrambi i casi l’eruzione dei denti non è stata ripristinata.
I nostri risultati supportano in modo evidente l’ipotesi che la somministrazione di RANKL negli animali che non producono questa citochina possa correggere quasi completamente il loro fenotipo
osteopetrotico, anche se ulteriori ricerche sono necessarie per valutare gli aspetti tossicologici di questo trattamento.
Nel complesso, crediamo fermamente che i dati incoraggianti ottenuti finora possano giustificare uno sforzo ulteriore verso la definizione di una nuova terapia per i pazienti ARO RANKL-dipendenti.
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 1
(1) IDI IRCCS Biochemistry Laboratory, Department of Experimental Medicine
and Biochemical Sciences, University of Rome “Tor Vergata”, Via Montpellier 1,
00133 Rome, Italy
(2) Medical Research Council, Toxicology Unit, Hodgkin Building, Leicester University, Lancaster Road, P.O. Box 138, Leicester LE1 9HN, UK
Le displasie ectodermiche (ED), malattie autosomico-dominanti
caratterizzate da anomalie cranio-facciali, sono causate da mutazioni del gene p63. Al momento non sono presenti cure per i pazienti affetti da queste malattie. Mutazioni nel dominio di legame
al DNA di p63 sono state identificate in pazienti affetti da EEC,
mentre il dominio di interazione proteina-proteina (SAM) risulta
mutato nella sindrome di Hay Wells (AEC). p63, un membro della
famiglia genica di p53, codifica sei diverse proteine. Le isoforme
trascrizionalmente attive (TA) possono attivare molti dei geni bersaglio di p53, inducendo apoptosi e arresto della proliferazione
cellulare. Al contrario le isoforme mancanti dell’estremità aminoterminale (DeltaN), si comportano come dominanti negativi. p63 è
espresso nello strato basale dell’epidermide e nella cresta ectodermica apicale, un epitelio essenziale per la morfogenesi dell’arto. Il fenotipo dei topi che presentano una delezione del gene p63,
hanno dimostrato che p63 è un importante regolatore trascrizionale dell’embriogenesi. I meccanismi molecolari attraverso cui
p63 controlla il differenziamento e il programma di morte dei cheratinociti sono ancora scarsamente caratterizzati.
Lo scopo di questo progetto è quindi studiare i meccanismi molecolari di regolazione di p63 ed il ruolo delle forme TA e DeltaN
nel differenziamento epidermico e nella patogenesi delle malattie
ED.
In questo studio abbiamo caratterizzato l’attività trascrizionale e la
stabilità proteica dei mutanti DeltaNp63, riscontrate nei pazienti affetti da EEC, AEC e SHFM.
Le proteine con mutazioni nel dominio di legame al DNA e nel dominio SAM si accumulano nella pelle dei pazienti affetti da EEC e AEC
sindrome, e mostrano un estesa emivita in vitro. Inoltre, i mutanti
legano l’E3 ubiquitina ligasi Itch in maniera simile al wt e mostrano
un’attività trascrizionale ridotta su molti promotori di geni epidermide-specifici.
Al contrario, le mutazioni C-terminali riscontrate nei pazienti di
SHFM mostrano un emivita simile al wild type e sono trascrizionalmente attive. L’espressione ectopica della forma wild type di DeltaNp63 reverte l’aumento di emivita delle proteine mutanti
(EEC/AEC), suggerendo un nuovo meccanismo di regolazione di
DeltaNp63, possibilmente implicato in queste patologie.
Studi sulla stabilità e sulla degradazione di p63 hanno evidenziato
che la E3 ubiquitina ligasi WWP1 è in grado di legare in modo specifico DeltaNp63 ma non è in grado di determinare la degradazione
proteosoma-dipendente. L’ubiquitilazione WWP1-dipendente di DeltaNp63 avviene a livello della lisina 63. Abbiamo anche dimostrato
che WWP1 è in grado di aumentare l’attività trascrizionale di DeltaNp63 e che l’eliminazione dell’espressione di WWP1 nei cheratinociti primari induce arresto del ciclo cellulare, dimostrando che
WWP1 partecipa a regolare l’attività trascrizionale di DeltaNp63,
contribuendo cosi’ alla regolazione della proliferazione e della sopravvivenza di cellule epiteliali.
GGP07075
215.900
Anno d’inizio: 2009
Melino Gerry (1,2), Peschiaroli Angelo (1), Anna Maria Lena (1), Valeria Serra
(1), Francesca Bernassola (1), Eleonora Candi (1), Alessandro Terrinoni (1)
WILSON CATHAL
Durata (anni): 3
223.000
Durata (anni): 3
RUOLO DI P63 NELL’EPIDERMIDE NORMALE E NELLE DISPLASIE ECTODERMICHE
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Telethon grant N.
GGP09133
Telethon grant N.
ABSTRACT N. 226
Responsabile
MELINO GENNARO
Responsabile
Anno d’inizio: 2007
STUDIO DEL RUOLO DELLA SEDLINA NELLA PATOGENESI
DELLA SPONDILOEPIFISODISPLASIA TARDA (SEDT)
Venditti Rossella (1,2), Mahfouz Hichem (2), Gaibisso Renato (2),
Di Tullio Giuseppe (2), De Matteis Maria Antonietta (1,2), Wilson
Cathal (1,2)
(1) TIGEM, Via Pietro Castellino, 111, 80131, Napoli
(2) Consorzio Mario Negri Sud, Santa Maria Imbaro (Chieti)
La spondiloepifisodisplasia tarda (SEDT) è una malattia genetica
rara legata al cromosoma X e caratterizzata da statura estremamente bassa, collo e tronco corti, e torace a botte derivando dalle mutazioni nel gene sedlin (SEDL) (Gedeon et al., Am J Hum
Genet. 68, 1386-1397, 2001).
E’ noto che SEDL, e il suo ortologo in lievito Trs20p, è parte di un
complesso multiproteico chiamato TRAPP che è coinvolto nel trasporto delle proteine all’interno e verso la membrana plasmatici
delle cellule ma l’esatta funzione di SEDL/Trs20p rimane da chiarire. In questo progetto stiamo utilizzando in maniera congiunta
sia sistemi modello di lievito che di mammifero per studiare la
funzione di SEDL/Trs20p nel traffico intracellulare e le possibili
cause della patogenesi di SEDT.
Analisi mutazionale del gene Trs20 di lievito suggeriscono che essa ha un ruolo multifunzionale nella cellula, perché le mutazioni
portano a difetti di trasporto dagli endosomi al Golgi, un blocco in
meiosi che può essere collegato a difetti nell’autofagia, e un possibile ruolo nel trasporto tra il reticolo endoplasmatico (ER) e il
Golgi. Riduzione del’espressione del gene SEDL in cellule di mammiferi usando siRNA ha portato a resultati simili, risultando in un
difetto nel riciclaggio del recettore del mannose-6-phosphate e,
soprattutto, un blocco specifico nel uscita di procollagene II dal
ER in condrociti. Quest’ultimo risultato potrebbe essere di particolare importanza per un condrodisplasia come SEDT ma una
piena comprensione dei vari ruoli di SEDL/Trs20p sarà importante per affrontare possibili strategie terapeutiche.
ABSTRACT N. 228
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
MISSERO CATERINA
GGP09230
276.200
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2009
STUDIO DEI MECCANISMI COINVOLTI NEI DIFETTI CUTANEI
CARATTERIZZANTI LA SINDROME DI HAY-WELLS E SVILUPPO DI STRATEGIE TERAPEUTICHE
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
Ferone Giustina (1), Thomason Helen (2), Antonini Dario (1), Dixon
Jill (2), Missero Caterina (1)
trial. In particolare, la deficienza di laminina-5 è stata corretta in vitro e in vivo in un modello murino. Gli studi di genotossicità hanno
riguardato la determinazione dei siti preferenziali di integrazione dei
vettori virali utilizzati e il loro rischio di mutagenesi inserzionale. Il
nuovo vettore permetterà di riprendere lo studio clinico sulla JEB e
valutarne il suo potenziale terapeutico.
(1) CEINGE Biotecnologie Avanzate, Napoli, Italy - via Gaetano Salvatore 486,
80145 Napoli, e-mail: [email protected]
(2) University of Manchester, Manchester, UK
La sindrome AEC (o sindrome di Hay-Wells) è una rara patologia
autosomica dominante caratterizzata da palatoschisi, displasia ectodermica, e difetti gravi della cute. La patologia è causata da mutazioni missenso nel gene p63, un membro della famiglia di p53.
Anche se il modello murino knock-out per p63 ha contribuito significativamente a comprendere la funzione di p63 negli epiteli stratificati, poco è ancora noto riguardo la patogenesi della sindrome AEC.
Per comprendere i difetti molecolari alla base della sindrome AEC,
abbiamo generato un modello murino “knock-in” (p63+/L514F) che
porta una mutazione puntiforme riscontrata nei pazienti nel dominio
proteico SAM (sterile-alfa-motivo) dell’ isoforma p63 alfa.
Il topo p63+/L514F muore alla nascita con grave palatoschisi del
palato secondario, displasia ectodermica e difetti dell’epidermide,
ma non anomalie degli arti, ricapitolando così fedelmente i difetti
osservati nella sindrome AEC. Negli embrioni mutanti i palati embrionali si elevano correttamente, anche se non sono in grado di
congiungersi a formare il palato secondario a causa della loro ipoplasia.
Allo stesso modo, l’epidermide ed i follicoli piliferi di p63+/L514F
sono ipoplastici nonostante che proliferazione cellulare, differenziamento, e tasso di apoptosi siano normali. Alla nascita, l’epidermide
presenta un numero ridotto di cellule staminali associata con una
modesta riduzione della proliferazione durante lo sviluppo embrionale che determina il fenotipo ipoplastico.
A livello molecolare, la mutazione causativa della sindrome AEC ha
un effetto selettivo su alcuni segnali cruciali che determinano l’espansione di cellule progenitrici durante lo sviluppo embrionale.
ABSTRACT N. 230
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Totale
Num Centri: 6
Totale
Num Centri: 1
(1) Centro di Medicina Rigenerativa, Università di Modena e Reggio Emilia - Via
Gottardi 100, 41125 Modena, Tel: 059-2058076; e-mail: [email protected]
(2) Policlinico Universtitario di Modena, Modena
(3) HSR-Telethon Institute for Gene Therapy, Milano
(4) CEINGE Biotecnologie Avanzate, Napoli
(5) Istituto Tecnologie Biomediche, Consiglio Nazionale delle Ricerche, Milano
L’epidermolisi bollosa (EB) è una famiglia di malattie genetiche gravi dovute a difetti di adesione dell’epidermide. Le EB sono caratterizzate, nelle forme non letali, da distacco bolloso della cute, piaghe
sfiguranti, infezioni ricorrenti, compromissione delle capacità visive
e un aumento del rischio di tumori della pelle. Non esistono cure
per le EB e le terapie esistenti si limitano al controllo dell’infezione,
alla protezione della cute da traumi e al mantenimento di una accettabile qualità della vita. Questo progetto è mirato allo sviluppo di
una terapia definitiva per diverse forme di EB, basata sul trapianto
di cute coltivata in laboratorio a partire da cellule staminali geneticamente modificate attraverso l’utilizzo di una nuova generazione di
vettori retrovirali. Il progetto è basato sulla collaborazione di sei ricercatori italiani di fama internazionale con esperienza pluriennale
in terapia genica e cellulare, biologia molecolare e biologia delle cellule staminali. In un arco di tempo di tre anni, i ricercatori inizieranno una sperimentazione clinica sulla terapia genica dell’EB giunzionale e apriranno la strada alla terapia delle forme distrofiche. Il progetto mira inoltre all’avanzamento delle conoscenze attuali sulla
biologia delle cellule staminali della pelle e allo sviluppo di tecnologie di trasferimento genico sicure ed efficaci, in grado di sostituire i
vettori retrovirali nelle sperimentazioni cliniche future.
GGP08095
171.700
Anno d’inizio: 2010
De Luca Michele (1), Tupler Rossella Ginevra (2), Naldini Luigi (3),
Missero Caterina (4), De Bellis Gianluca (5), Mavilio Fulvio (1)
RECCHIA ALESSANDRA
Durata (anni): 2
503.700
Durata (anni): 1
TERAPIA GENICA DEI DIFETTI DI ADESIONE DELL’EPIDERMIDE
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Telethon grant N.
GPP10012
Telethon grant N.
ABSTRACT N. 229
Responsabile
MAVILIO FULVIO
Responsabile
Anno d’inizio: 2008
SVILUPPO PRE-CLINICO DI VETTORI LENTIVIRALI PER LA
TERAPIA GENICA DELL’EPIDERMOLISI BOLLOSA GIUNZIONALE
Cocchiarella Fabienne (1), Cavazza Alessia (1), Maruggi Giulietta
(1), Miccio Annarita (1), De Luca Michele (1), Pellegrini Graziella
(1), Del Rio Marcela (2), Larcher Fernando (2), Mavilio Fulvio (1),
Recchia Alessandra (1)
ABSTRACT N. 231
(1) Dipartimento di Scienze Biomediche, Università di Modena e Reggio Emilia,
- via Campi 287, Modena, Italia
(2) Epithelial Biomedicine Division, CIEMAT-CIBERER U714 Madrid, Spain
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
L’epidermolisi bollosa giunzionale (JEB) è una malattia genetica dovuta a difetto di adesione a causa di mutazioni nei geni codificanti
per la laminina-5 (catene alfa2, beta3 e gamma2), un componente
cruciale della giunzione dermo-epidermica. In un trial clinico pilota
di fase I condotto nel 2005 su un paziente affetto da una forma non
letale di JEB, il nostro gruppo ha dimostrato che il trapianto di pelle
coltivata in vitro a partire dalle cellule staminali del paziente geneticamente modificate è ben tollerato e porta a correzione funzionale
a lungo termine del difetto di adesione della pelle. Cellule staminali
epidermiche sono state trasdotte con un vettore retrovirale derivato
da MLV codificante il cDNA per la catena beta3 della laminina-5 sotto il controllo del promotore virale (LTR). Questo tipo di vettore genetico è stato associato a rischio genotossico a causa della sua integrazione random nel genoma umano. L’attivazione inserzionale di
proto-oncogeni è stata associata all’insorgenza di disturbi linfoproliferativi in cinque pazienti coinvolti in un trial di terapia genica per
una malattia non correlata (immunodeficienza X-SCID) in Francia e
UK. Questi episodi hanno portato le autorità regolatorie in Europa e
negli USA a considerare rischioso e non più accettabile l’utilizzo di
vettori retrovirali basati su MLV per trasdurre cellule staminali. Lo
scopo di questo progetto è quindi lo sviluppo di un sistema di trasferimento genico per cellule staminali epidermiche basato su un
nuovo tipo di vettore (i vettori lentivirali self-inattivanti) e su elementi di regolazione specifici per l’epidermide per dirigere l’espressione del gene terapeutico. L’efficacia e la sicurezza dei nuovi vettori è stata testata in parallelo con quelle del vettore usato nel primo
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
CANDI ELEONORA
GGP06048
255.560
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2006
LE TRANSGLUTAMINASI E IL LORO RUOLO NELLA PATOGENESI DELL’ITTIOSI LAMELLARE E DELLA SINDROME DA
ESFOLIAZIONE CUTANEA
Terrinoni Alessandro, Serra Valeria, Lena Anna Maria, Candi Eleonora
IDI-IRCCS & Dipartimento di Medicina Sperimentale e Scienze Biochimiche,
Università di Tor Vergata - Via Montpellier, 1 00133, Roma. Tel. 06-72596487; email: [email protected]
Le transglutaminasi (TG) sono una famiglia di nove enzimi calcio-dipendenti (tipo 1-7, banda 4.2 e fattore XIII) che catalizzano la formazione di un legame covalente (cross-linking) tra un residuo di
glutammina e un residuo di lisina, formando un legame isopeptidico
epsilon-(gamma-glutamil)-lisina tra due proteine substrato. Le proteine modificate dalle TG sono resistenti alla degradazione proteolitica. Tali modificazioni post-traduzionali hanno un ruolo importante
in vari processi biologici, come nell’ossificazione e nell’interazione
della matrice extracellulare (TG2), nella coagulazione (fattore XIII),
nel liquido seminale (TG4) e nel differenziamento epidermico (TG1,
TG3, TG5). Quattro membri di questa famiglia genica (TG1-3 e 5)
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
sono espressi negli epiteli pluristratificati ed hanno un ruolo importante nell’assemblamento dell’involucro corneo. Mutazioni nel gene
che codifica per la TG1, causano la malattia recessiva congenita Ittiosi Lamellare (IL), caratterizzata da ipercheratosi e cute a scaglie.
L’IL è una malattia geneticamente eterogenea. L’inattivazione della
TG5, causa un’altra malattia genetica, la sindrome da esfoliazione
cutanea (PPS). La PPS è una malattia genetica autosomica recessiva caratterizzata da un’esfoliazione degli strati più esterni dell’epidermide. I risultati che abbiamo ottenuto in questo ultimo periodo
riguardano:
(i) Identificazioni di nuove mutazioni nel gene che codifica per la
TG1. Abbiamo analizzato 20 famiglie affette da IL, tra queste 12
presentano mutazioni nel gene che codifica per la TG1, otto delle
quali sono mutazioni nuove, mai descritte prima. Tre tra queste sono presenti sostituzioni di singoli aminoacidi (G505S, R47G,
R315H), due mutazioni causano codoni di stop prematuro (R54X,
W281X) altre sono inserzioni e/o delezioni di nucleotidi che causano
errori di splicing o formazione di splicing alternativi.
(ii) Identificazioni di nuove mutazioni nel gene che codifica per la
TG5. In collaborazione con il gruppo di McLean (Dundee), abbiamo
identificato tre nuove mutazioni in tre pazienti affetti da PSS, Si
tratta della sostituzione di singoli aminoacidi R35Q, D391N and
K445N. Abbiamo anche verificato attraverso dei saggi biochimici di
cross-linking che quest tre nuovi mutanti sono in grado di ridurre
l’attività dell’enzima in modo significativo, rispettivamente del 90%,
95% e 70%.
(iii) Generazione di topi TGM3 knock-out. Una cassetta contenente il
gene della betagalattosidasi e della resistenza alla neomicina è stata
inserita nel primo introne del gene che codifica per la TG3 murina attraverso ricombinazione omologa in cellule murine embrionali staminali. La corretta ricombinazione è stata verificata nelle cellule staminali embrionali sia per PCR che per southern blot. Sono stati ottenuti
dei topi chimerici i quali sono stati accoppiati con topi C57Bl/6N per
ottenere la generazione F1 eterozigote. Al momento stiamo amplificando la colonia di topi transgenici eterozigoti.
una alterata interazione con TRAF6 e una ridotta attivazione di
NF-kappaB da parte di IL-1beta, ma non del TNFalfa. TRAF6 è una
E3-ligasi e partecipa al controllo di vie di segnalazione nell’immunità, nell’osteoclastogenesi, nello sviluppo della pelle e nelle funzioni cerebrali. Abbiamo definito i domini di interazione NEMO/TRAF6, sia su NEMO (amino terminale) sia su TRAF6 (coiled
coil) e abbiamo osservato che tale interazione è un bersaglio per
molecole con finalità terapeutiche.
Per acquisire conoscenze sui meccanismi molecolari alla base dei
difetti del SNC in IP (epilessia, convulsioni, paresi spastica, motore e ritardo mentale, microcefalia), abbiamo cercato nuovi interattori di NEMO nel SNC. Oltre NESCA, il cui ruolo con NEMO nella
via di NF-kappaB è stato già riportato, ci siamo concentrati su un
nuovo interattore COMMD7, identificato mediante 2-hyb, appartenente alla famiglia di 10 proteine COMMD, che inibiscono l’attivazione di NF-kappaB da TNFalfa. Abbiamo osservato che l’iperespressione di COMMD7 induce una debole inibizione, mentre il
dimero COMMD7/1 esercita un forte effetto sinergico inibitorio
sull’attivazione di NF-kappaB in seguito al trattamento con TNFalfa e/o TRAF2 e all’iper-espressione IKKbeta. Pertanto, riteniamo
che NEMO, oltre a partecipare alla attivazione di IKK, potrebbe
anche contribuire con l’associazione alle COMMDs allo spegnimento dell’attività di NF-kappaB, scoprendo nuovi ruoli di NEMO inaspettati e non identificati in precedenza. Una descrizione dettagliata dei dati qui brevemente illustrati sarà presentata nel poster.
ABSTRACT N. 233
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 3
GGP07086
172.600
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2007
DIFETTI DI IMPRINTING GENOMICO COME CAUSA DI DISORDINI CONGENITI DELLA CRESCITA
ABSTRACT N. 232
Responsabile
RICCIO ANDREA
URSINI MATILDE VALERIA
Riccio Andrea, Cerrato Flavia, Sparago Angela, Verde Gaetano, De
Crescenzo Agostina, Citro Valentina, Cubellis Maria Vittoria
351.800
Istituto di Genetica e Biofisica “A. Buzzati Traverso”, CNR, Napoli
GGP08125
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2008
L’obiettivo di questo progetto è di definire il ruolo dei geni imprinted nella patogenesi dei disordini congeniti della crescita, come la
Sindrome di Beckwith-Wiedemann (BWS) e la Sindrome di SilverRussell (SRS). Nel corso di questo progetto, abbiamo analizzato
più di 300 individui con diagnosi clinica di BWS (o quadri correlati)
e 90 individui con SRS. I risultati ottenuti hanno permesso di identificare un difetto molecolare in 136 casi di BWS e 33 casi SRS. I
BWS sono stati classificati in sette sottogruppi e gli SRS in quattro
sottogruppi diversi. Tra i casi BWS con difetti di imprinting del locus IGF2-H19, abbiamo dimostrato che questi possono derivare da
mutazioni ereditate della ICR e presentare un elevato rischio di ricorrenza o originare in maniera indipendente dalla sequenza in cis
e non essere trasmessi alla progenie. Abbiamo poi dimostrato che
in circa il 20% dei casi BWS con difetto di metilazione nel locus
KCNQ1OT1, anche altre ICR normalmente caratterizzate da metilazione materna, come PLAGL1 e GNAS/NESPAS, risultano ipometilate e tale alterazione molecolare correla con una presentazione clinica più complessa. L’uso della MS-MLPA e dell’array-CGH hanno
permesso di definire meglio il complesso ruolo delle delezioni/duplicazioni di 11p15.5 nella BWS e SRS. Tra i casi di maggiore
interesse, abbiamo recentemente dimostrato un caso di BWS causato da una delezione criptica che includeva il dominio centromerico del cluster di geni imprinted di 11p15, un caso familiare con fenotipi BWS e SRS associati a duplicazione di 11p di origine parentale opposta ed un caso familiare di BWS associato a duplicazione
parziale ed imprinting aberrante di KCNQ1OT1. Più recentemente,
attraverso l’analisi di linee cellulari di pazienti, abbiamo dimostrato
nei casi di BWS e SRS con difetti di imprinting di IGF2-H19 che alterazioni opposte della metilazione del DNA della ICR correlano con
cambiamenti delle modifiche istoniche, legame di CTCF-coesina ed
interazioni a distanza, il che indica chiaramente l’importanza della
struttura cromatinica nel controllo dell’espressione dei geni imprinted e nei relativi difetti che si riscontrano nelle patologie. Un ulteriore studio effettuato su una linea di cellule staminali embrionali
ha dimostrato l’importanza di alcuni fattori coinvolti nel cross-talk
tra metilazione del DNA e modificazioni cromatiniche delle ICR, come ZFP57 e KAP1/TIF1beta, nel mantenimento dell’asimmetria
epigenetica tra gli alleli materno e paterno dei loci imprinted, e ciò
suggerisce un ruolo per tali proteine nella patogenesi dei disordini
associati all’imprinting.
MECCANISMI MOLECOLARI DELL’ATTIVAZIONE DI NEMO E
CORRELAZIONE CON LA PATOGENESI DELL’INCONTINENTIA
PIGMENTI
Fusco Francesca (1), Pescatore Alessandra (1), Napolitano Gennaro
(1,2), Miano Maria Giuseppina (1), Vito Pasquale (3), Leonardi Antonio (2), Ursini Matilde Valeria (1)
(1) Institute of Genetics and Biophysics “A. Buzzati-Traverso” - Via P. Castellino 111, 80131, Naples, Italy
(2) Department of Molecular and Cellular Biology and Pathology, Federico II
University of Naples, Italy
(3) Biogem Institute of Genetic Research “Gaetano Salvatore”, Ariano Irpino
(AV) Italy
Obiettivo generale del progetto è migliorare la comprensione degli
aspetti patogenetici dell’Incontinentia Pigmenti (IP; MIM308300),
una malattia X-linked dominante letale nei maschi. Il gene NEMO,
le cui mutazioni causano IP, codifica per la subunità regolatrice
del complesso IKK responsabile per l’attivazione di NF-kappaB,
coinvolto nell’infiammazione, sopravvivenza cellulare e apprendimento.
I nostri risultati dimostrano che l’IP è un disturbo genomico dovuto a del/dup di NEMO e del suo pseudogene. Diversi meccanismi
(NAHR, conversione genica, NHEJ) possono generare riarrangiamenti che si estendono in regione al di fuori del locus IP e nei geni limitrofi (es. G6PD). Per spiegare questa tendenza, abbiamo
analizzato 7 breakpoint di delezioni isolati nel locus IP e abbiamo
trovato numerose micro/macromologie e sequenze ripetute, che
destabilizzano la struttura genomica e favoriscono riarrangiamenti
(Alu-Alu-mediata, FoSTeS e/o MMBIR). Le mutazioni di NEMO associate ad IP sono utili per studiare in dettaglio i passaggi alterati
durante l’attivazione di NF-kappaB dovuta a citochine infiammatorie associate alla malattia. Differenti modifiche posttraduzionali
(fosforilazione, sumoilazione o poliubiquitinazione) e specifici residui di NEMO, coinvolti nel legame a molecole chiave (es. catene di
ubiquitina), sono necessari per la corretta attivazione di NF-kappaB. Il mutante E57K, responsabile di una forma lieve di IP, ha
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
ABSTRACT N. 234
NATURALI: BASI CELLULARI E MOLECOLARI PER UN UN INTERVENTO IMMUNOTERAPEUTICO INNOVATIVO NEL DIABETE DI TIPO 1
Progetti di Ricerca Telethon - Other Genetic Diseases
MARTINI ALBERTO
Responsabile
Totale
Num Centri: 3
Procaccini Claudio (1,2), De Rosa Veronica (1,2), Galgani Mario
(1,2), Carbone Fortunata (1,2), La Rocca Claudia (1,2), Matarese
Giuseppe (1,2)
GGP07236
Telethon grant N.
183.400
Durata (anni): 2
Anno d’inizio: 2007
(1) Laboratorio di Immunologia, Istituto di Endocrinologia e Oncologia Sperimentale, Consiglio Nazionale delle Ricerche (IEOS-CNR), Napoli 80131, Italy
(2) Dipartimento di Biologia e Patologia Cellulare e Molecolare, Università di
Napoli “Federico II”, Napoli 80131, Italy
LA SINDROME TRAPS (TUMOR NECROSIS FACTOR RECEPTROS ASSOCIATED SYNDROME): NUOVI ASPETTI PATOGENETICI E RISPOSTA AL TRATTAMENTO ANTI-IL-1 IN ETÀ PEDIATRICA
Esiste una discrepanza apparente tra lo stato di anergia in vitro
delle cellule T regolatorie (Treg) naturali CD4+CD25highFoxP3+ e
la loro capacità proliferativa in vivo. Il meccanismo che sottintende a tale paradosso è ancora sconosciuto. Noi evidenziamo nel
nostro studio, che lo stato di anergia in vitro delle cellule Treg
umane isolate dalla periferia dipende dall’elevata attività del
pathway intracellulare attivato dalla leptina e dal mammalian target of rapamycin (mTOR): difatti una inibizione transiente del
pathway di mTOR col farmaco rapamicina, prima la stimolazione
del recettore delle cellule T, è in grado di trasformare le cellule
Treg da energiche in altamente proliferative, in assenza di aggiunta di alte dosi di interleuchina-2.
Tale fenomeno è dinamico e bifasico in quanto caratterizzato da
una precoce inibizione di mTOR e da un successivo innalzamento
della stessa attività di mTOR. In questo contesto, topi deficitari
del recettore della leptina mostrano una proliferazione aumentata in vitro delle cellule Treg associata a una ridotta attività di
mTOR nelle fasi precoci di attivazione. Inoltre, abbiamo anche
osservato in uno strain di topo non obese diabetic (NOD), in cui
mancava il recettore della leptina, una alterata capacità di attivazione di mTOR attraverso la leptina. Tale contesto di alterato
signalling leptinico, induceva una resistenza di tale topo allo sviluppo del diabete di tipo 1 e alla distruzione delle insule betapancreatiche.
Tali eventi si associavano ad una aumentata proliferazione delle
Treg nel pancreas ed in vivo. Questi risultati suggeriscono che lo
stato energetico intracellulare controllato da leptina/mTOR, può
controllare la responsività delle cellule T reg, attraverso uno “switch” dinamico della sua attività; tali effetti rivelano nuovi orizzonti
per la manipolazione della tolleranza immunologica e dell’autoimmunità attraverso lo stato metabolico intracellulare (Procaccini et
al., Immunity. 2010 Dec 14;33(6):929-41; Galgani et al., J Immunol. 2010 Dec 15;185(12):7474-9; Matarese et al., Nat Rev Neurol.
2010 Aug;6(8):455-61).
Isabella Ceccherini (2), Gattorno Marco (1), Tassi Sara (3), Chiesa
Sabrina (1), Bechetti Tiziana (2), Carta Sonia (3), Lasigliè Denise
(1), Borghini Silvia (2), Delfino Laura (3), Caroli Francesco (2), Ferlito Francesca (1), Rubartelli Anna (3), Martini Alberto (1)
(1) UO Pediatria 2, Istituto G. Gaslini - Largo G. Gaslini 5, 16147, Genova
(2) Laboratorio Genetica Molecolare, Istituto G. Gaslini, Genova
(3) Laboratorio Biologia Sperimentale, Istituto Tumori Genova
La sindrome TRAPS (MIM 142680) è legata alla mutazione del gene
per il recettore tipo I per il tumor necrosis factor (TNFR1) ed è caratterizzata da episodi ricorrenti di infiammazione sistemica e possibile sviluppo di amiloidosi renale.
Scopi specifici del progetto: i) individuare i meccanismi intracellulari
associati al difetto di apoptosi TNF-indotta, ii) determinare l’efficacia e sicurezza del trattamento con il recettore antagonista dell’IL1; iii) analizzare il pattern di secrezione di IL-1? dei monociti circolanti; iv) studio di altri geni candidati in pazienti con manifestazioni
simil-TRAPS.
Risultati del 2° anno di studio:
i) Abbiamo transfettato 4 costrutti TNFR1, 3 dei quali con mutazioni
in cisteina (C43R, C55Y C29Y). La quarta era una delezione di 27
aa in esone 6, osservata in un paziente TRAPS. A queste sono stati
aggiunti il TNFR1 wild-type, il polimorfismo R92Q e la forma mutata
con la sostituzione aminoacidica Y207A, nota per essere associata
ad un difetto di internalizzazione. Come già osservato il TNFR1 era
normalmente espresso sulla superficie delle cellule GFP-positive
transfettate con la proteina wild-type e la mutazione R92Q.
Al contrario le mutazioni con residui di cisteina erano associate ad
un difetto di espressione del TNFR1 sulla membrana. La del 27aa
e la mutazione Y207A esibivano invece una normale espressione
in superficie. Dopo stimolo con il TNF, le cellule 293T tranfettate
con il wild-type e la mutazione R92Q evidenziavano una riduzione
dell’espressione del recettore, come già osservato nei monociti
dei pazienti. Al contrario le cellule 293T con la delezione 27 aa
presentavano lo stesso difetto di internalizzazione osservato con
la variante Y207A. Gli esperimenti di transfezione hanno confermato l’alterazione di traffiking delle mutazioni che coinvolgono
residui di cisteina. D’altra parte alterazioni del gene TNFR1 diverse dalle mutazioni in cisteina (associate clinicamente a fenotipo
grave) hanno mostrato una espressione normale del recettore
mutato ed un difetto di internalizzazione, già per altri evidenziatosi nelle cellule dei pazienti.
ii e iii) Queste parti del progetto sono state completate nel primo
anno dello studio.
iv) Poiché, in una notevole proporzione di pazienti con un fenotipo simil-TRAPS non è stata rinvenuta alcuna mutazione del gene
TNFRSF1A, abbiamo analizzato sei di questi, caratterizzati anche
da difetto di shedding e/o di apoptosi, concentrandosi su quei
meccanismi capaci di rallentare la risposta infiammatoria indotta
da TNF, come ad esempio i) lo shedding del recettore, ii) l’internalizzazione del recettore con conseguente induzione di apoptosi
e iii) diminuita regolazione trascrizionale di NF-kB. Il sequenziamento del DNA ha permesso di escludere il coinvolgimento dei
geni ERAP1, NUCB2, RBMX, TNFAIP3, CARP-2 e ZFP36 nella patogenesi di questi pazienti simil-TRAPS. Studi di espressione in cellule dagli stessi pazienti permetteranno di identificare ulteriori
candidati da valutare.
ABSTRACT N. 236
Progetti di Ricerca Telethon - Common/Complex Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 1
Obiettivo generale: Sviluppare un nuovo approccio terapeutico per
la protezione delle cellule beta pancreatiche nel corso di un attacco autoimmune e per la prevenzione del diabete di tipo 1, basato
su composti vegetali non peptidici. Premessa/razionale: Abbiamo
in precedenza dimostrato che l’estratto di Hypericum perforatum
(St. John’s wort, SJW) e il suo componente iperforina (HPF) proteggono cellule beta in coltura dai danni indotti da citochine,
agendo come potenti inibitori dell’attivazione dei fattori di trascri-
GJT08004
100.000
Anno d’inizio: 2009
(1) Dipartimento di Patologia Sperimentale B.M.I.E., Università di Pisa
Via Roma 55 -Scuola Medica- 56126 Pisa, Tel. 0502218571, Fax 0502218557,
E-mail: [email protected]
(2) Istituto di Fisiologia Clinica, CNR, Pisa
(3) Dipartimento di Scienze Morfologico-Biomediche, Università di Verona, Verona
(4) Dipartimento di Endocrinologia e Metabolismo, Università di Pisa, Pisa
(5) Dipartimento di Medicina Interna, Università di Pisa, Pisa
MATARESE GIUSEPPE
Durata (anni): 3
50.000
Durata (anni): 3
Novelli Michela (1), Beffy Pascale (2), Menegazzi Marta (3), Martino
Luisa (1), Masini Matilde (1), De Tata Vincenzo (1), Lupi Roberto
(4), Pratesi Federico (5), Migliorini Paola (5), Marchetti Piero (4),
Masiello Pellegrino (1)
Progetti di Ricerca Telethon - Common/Complex Diseases
Telethon grant N.
GJT08016
EFFETTI PROTETTIVI DI COMPOSTI FITOCHIMICI NEI CONFRONTI DEI DANNI INDOTTI DA CITOCHINE NELLE CELLULE
BETA PANCREATICHE ED ESPLORAZIONE DEI MECCANISMI
COINVOLTI
ABSTRACT N. 235
Responsabile
MASIELLO PELLEGRINO
Anno d’inizio: 2009
LEPTINA, STATO METABOLICO E CELLULE T REGOLATORIE
125
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
zione STAT-1 e NF-kB. Dato che la via di STAT-1 è coinvolta nella
differenziazione linfocitaria Th1, questi composti potrebbero anche
esercitare effetti immunomodulatori. Durante la prima parte del
progetto, tre specifici scopi sono stati perseguiti in parallelo: A)
stabilire gli effetti protettivi di SJW e HPF in isole pancreatiche di
ratto e umane; B) esplorare in dettaglio l’andamento temporale
dell’inibizione di STAT-1; C) saggiare la capacità di HPF di inibire
la risposta Th1 delle cellule mononucleate del sangue periferico
(PBMC). Metodi: Isole isolate di ratto e umane, esposte a citochine con o senza l’estratto di SJW (50-200 microg/ml) o HPF (1-5
microM), sono state usate per studi funzionali, ultrastrutturali, di
espressione genica e morte cellulare. L’attivazione di STAT-1 e
NF-kB è stata valutata mediante EMSA. Le citochine rilasciate da
PBMC umane sono state dosate mediante ELISA.
Risultati: Obiettivo A. Nelle isole di ratto e umane, SJW e l’HPF
hanno corretto la disfunzione causata dalle citochine e inibito l’attivazione di STAT-1 e NF-kB, nonché l’espressione di geni pro-infiammatori quali iNOS, COX-2, CXCL9, CXCL10. Inoltre, l’aumento
di apoptosi e necrosi riscontrato nelle isole esposte per 48 h alle
citochine è stato completamente prevenuto da SJW e parzialmente da HPF, come confermato da studi ultrastrutturali.
Obiettivo B. SJW e HPF, se presenti durante una preincubazione di
30-60 min della linea beta cellulare INS-1E, hanno conservato in
gran parte il loro effetto inibitorio su STAT-1 anche quando rimossi dal mezzo di coltura prima dell’esposizione alle citochine, oppure quando aggiunti 15-30 min dopo le citochine. Ciò suggerisce
che le sostanze vegetali inducono uno stato di resistenza alle citochine, che può essere innescato sia prima che dopo l’esposizione
alle citochine.
Obiettivo C. Nelle PBMC stimolate con fitoemagglutinina (PHA) o
lipopolisaccaride per 24 o 48 h, HPF (0.5-2 microM) ha ridotto
notevolmente il rilascio sia di IFN-gamma che di IL-17, senza influenzare la produzione di IL-10 o di IL-4. Questi dati, sebbene
preliminari, avvalorano l’ipotesi che componenti del SJW possano
modulare l’attività immune, bloccando non sola la risposta Th1
ma anche quella Th17, entrambe implicate nella patogenesi del
diabete di tipo 1.
Conclusioni: I nostri risultati indicano che il SJW e l’HPF migliorano la funzione e la sopravvivenza delle isole di ratto e umane ed
esercitano effetti immunomodulatori in vitro.
delle NKT2 regolatorie. Il nostro scopo è quello di correggere tale
difetto di “regolazione” mediante terapia genica e cellulare in topi
NOD e valutare se questo possa essere un valido approccio terapeutico per la cura di pazienti diabetici. Le mDC dei topi NOD sono
state trasdotte con un vettore retrovirale bicistronico (MIGR1) in cui
è stato clonato il gene Slamf1 mostrando un’efficienza di trasduzione di circa il 20%. L’analisi fenotipica al FACS ha inoltre dimostrato
che la trasduzione delle mDC non influisce sulla loro funzione/maturazione. Useremo queste mDC transdotte in vitro ed in vivo
per valutare se la correzione di questo difetto nei topi NOD può ripristinare il differenziamento delle NKT regolatorie e la loro capacità
di contro-regolare lo sviluppo dell’autoimmunità e del T1D.
ABSTRACT N. 238
Progetti di Ricerca Telethon - Common/Complex Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 1
La neo-vascolarizzazione associata alla retinopatia diabetica ed alla
degenerazione maculare associata all’età (AMD) ha una grande rilevanza clinica in quanto rappresenta la causa principale per la perdita della vista nel mondo occidentale.
I membri della famiglia del fattore di crescita vascolare endoteliale
(VEGF) giocano un ruolo centrale in queste condizioni patologiche,
ed i risultati recentemente ottenuti in pazienti AMD con un anticorpo monoclonale anti-VEGF-A, o con il relativo frammento Fab, hanno definitivamente validato VEGF-A come bersaglio per la terapia
dell’AMD.
Qui sono riportati gli avanzamenti della nostra ricerca sui due approcci proposti nel progetto Telethon volti a inibire l’angiogenesi
VEGF-A-dipendente.
1. Terapia genica con una variante del fattore di crescita placentale
(PlGF).
Due membri della famiglia VEGF, VEGF-A e PlGF, entrambi cruciali
per l’angiogenesi patologica, sono capaci di formare eterodimeri se
co-espressi nella stesa cellula. Noi abbiamo generato la variante
PlGF-DE, che ha perso la capacità di legare ed attivate il recettore
VEGFR-1, ma che è ancora in grado di eterodimerizzare con VEGFA. Abbiamo dimostrato che la over-espressione di tale variante nelle cellule tumorali rappresenta una nuova strategia per inibire l’angiogenesi VEGF-A-dipendente. Infatti, la over-espressione di PlGFDE ottenuta mediante iniezione intratumorale di Adenovirus-PlGFDE, ha determinato una forte riduzione sia della crescita tumorale
(circa il 75%) che della neo-angiogenesi VEGF-A dipendente (circa
il 70%).
Poiché i virus Adeno Associati (AAV) rappresentano il miglior vettore virale per applicazioni di terapia genica dell’occhio, AAV esprimenti PlGF-DE, e come controllo PlGF wt o GFP, del sierotipo 2 e 5,
sono stati generati ed i loro effetti nel modello sperimentale di neovascolarizzazione della coroide (CNV) saranno presentati.
2. Identificazione di nuove piccole molecole capaci di neutralizzare
l’interazione dei membri della famiglia del VEGF con i relativi recettori.
Visto il ruolo emergente del VEGFR-1 nell’angiogenesi patologica,
abbiamo eseguito screenings per identificare piccole molecole capaci di inibire l’interazione PlGF/VEGFR-1. Abbiamo così identificato un
tripeptide teteramerico da una libreria combinatoriale, composta di
amminoacidi non-naturali, che lega specificamente VEGFR-1 (IC50
circa 10microM), inibendo la sua attivazione da parte di tutti i
membri della famiglia del VEGF che lo riconoscono. In vivo, questo
composto è capace di inibire la crescita tumorale e, come atteso, di
stimolare la neo-vascolarizzazione della cornea. Inoltre, attraverso
GJT08017
124.300
Anno d’inizio: 2008
(1) Institute of Genetics and Biophysics, CNR, Napoli, Italy - Via Pietro Castellino 111, 80131 Napoli, Italy. Ph: 081-6132354; Fax: 081-6132595; email:
[email protected]
(2) Dept of Pharmaceutical Sciences, University of Salerno, Salerno, Italy
(3) Molecular Medicine Laboratory, ICGEB, Trieste, Italy
(4) Institute of Biostructures and Bioimaging, CNR, Napoli, Italy
(5) Ophthalmology & Visual Sciences, University of Kentucky, Lexington, KY,
USA
FALCONE MARIKA MARIA CATERINA
Durata (anni): 3
195.400
Durata (anni): 3
Valeria Tarallo (1), Laura Tudisco (1), Ivana Apicella (1), Laura Lepore (2), Lorena Zentilin (3), Nunziatina De Tommasi (2), Mauro
Giacca (3), Menotti Ruvo (4), Jayakrishna Ambati (5), Sandro De
Falco (1)
Progetti di Ricerca Telethon - Common/Complex Diseases
Telethon grant N.
GGP08062
NUOVI INIBITORI DELL’ANGIOGENESI VEGF-DIPENDENTE
ASSOCIATA A MALATTIE NEOVASCOLARI DELL’OCCHIO
ABSTRACT N. 237
Responsabile
DE FALCO SANDRO
Anno d’inizio: 2009
VALUTAZIONE DEL POTENZIALE TERAPEUTICO DELLE CELLULE REGOLATORIE INKT NEL DIABETE AUTOIMMUNE DI
TIPO 1
Di Pietro Caterina (1), Caielli Simone (1), Caputo Alessandra (1),
Minici Claudia (2), Degano Massimo (2), Nichols Kim (3), Falcone
Marika (1)
(1) Experimental Diabetes Unit-DRI Division of Immunology,
Transplantation and Infectious Diseases San Raffaele Scientific Institute
Via Olgettina 60 20132 Milan, Italy Phone: +390226432317
Fax: +390226432914 email: [email protected]
(2) Biocrystallography Unit, San Raffaele Scientific Institute Milan, Italy
(3) Pediatric Oncology, Children s Hospital of Philadelphia, Philadelphia, USA
Le cellule NKT sono un sottoinsieme unico di cellule T che giocano
un duplice ruolo ed esercitano funzioni proinfiammatorie o regolatorie (tollerogeniche). Queste proprietà rendono le cellule iNKT capaci
di regolare le risposte immunitarie in varie malattie incluse le infezioni, il cancro, i trapianti e l’autoimmunità. Il meccanismo responsabile della decisione delle iNKT di differenziare verso uno specifico
profilo citochinico (NKT1/NKT2) non è ancora chiaro ma sembra essere determinato dall’integrazione di diversi segnali ricevuti in periferia. Le celule dendritiche mieloidi (mDC) giocano un ruolo centrale
nell’attivazione delle cellule iNKT e l’interazione con molecole costimolatorie espresse dalle mDC regola il differente profilo citochinico
e la loro funzione. L’interazione SLAM-SLAM tra le DC mieloidi
(mDC) e le cellule T durante l’attivazione del TCR fornisce un segnale costimolatorio chiave per la produzione di IL4 e per la funzione pro-tollerogenica delle cellule NKT. Abbiamo recentemente dimostrato che la suscettibilità genetica al diabete autoimmune nei
topi NOD è collegata ad un difetto del gene Slamf1 che diminuisce
l’espressione di SLAM sulle mDC e compromette il differenziamento
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PROGETTI DI RICERCA TELETHON
lo screening di estratti di piante, abbiano identificato un composto
appartenente alla famiglia dei flavonoidi, l’Amentoflavone, capace di
interagire con i VEGFs prevenendo la loro interazione con i recettori
del VEGF (IC50 circa 8microM per PlGF e VEGF-A). In vivo questa
molecola è capace di inibire la neo-angiogenesi associata alla crescita tumorale.
La capacità di questi due composti di inibire la neo-vascolarizzazione nel modello sperimentale di CNV sarà discussa.
sano Pietro (1), Beguinot Francesco (1)
(1) DBPCM & IEOS-C.N.R., Napoli - Via Sergio Pansini, 5 - Napoli 80131, Italia
(2) IFOM (FIRC Institute of Molecular Oncology), Milano
Prep1 (proteina che regola Pbx) è un fattore di trascrizione ad
omeodominio appartenente alla sottofamiglia MEINOX delle proteine TALE ed è espresso in vari tessuti. I topi ipomorfi per Prep1
(Prep1i/i) hanno un fenotipo complesso con almeno due caratteristiche metaboliche rilevanti. Una è l’aumentata sensibilità insulinica
nel muscolo scheletrico accompagnata dalla protezione al diabete
indotto con streptozotocina.
La seconda è l’ipoplasia pancreatica caratterizzata da assoluta
ipoinsulinemia. La funzione di Prep1 sulla regolazione del metabolismo del glucosio mediata dall’insulina è ancora sconosciuta. Studi sui fegati prelevati dai topi ipomorfi per Prep1 mostrano un aumento del contenuto di glicogeno epatico ed una riduzione della
produzione e del rilascio del glucosio e dei livelli di trigliceridi,
suggerendo un’aumentata sensibilità all’insulina. La fosforilazione
in tirosina sia del recettore dell’insulina (IR) che dei suoi substrati
IRS1/2 aumenta in maniera significativa nei fegati dei topi
Prep1i/i e si accompagna ad una specifica riduzione delle tirosino
fosfatasi SYP ed SHP1.
La sovraespressione di Prep1 nelle cellule epatiche HepG2 aumenta l’espressione di SYP ed SHP1 ed inibisce la fosforilazione di
IR ed IRS1/2 e l’accumulo di glicogeno indotto dall’insulina. Parallelamente, la sovraespressione del cofattore di Prep1, Pbx1, ma
non di p160MBP, mima l’effetto di Prep1 sulla fosforilazione in tirosina di IR ed IRS1/2, sull’accumulo di glicogeno e sull’ espressione di SYP ed SHP1. In cellule sovraesprimenti Prep1, l’antisenso di SHP1, ma non di SYP, ripristina la fosforilazione di IR e l’accumulo di glicogeno mediato dall’insulina. Sia Prep1 che Pbx1 legano il promotore di SHP1 presso una regione situata tra i nucleotidi -2113 e -1778. Questo tratto di DNA mostra un’aumentata attività regolatoria ed induce incremento dell’attività luciferasica rispettivamente di 7, 6 e 30 volte in risposta a Prep1, Pbx1 o
entrambi.
Quindi, SHP1, fosfatasi nota inibire il segnale insulinico, è una
molecola bersaglio di Prep1. Nel fegato, l’attivazione trascrizionale
del gene di SHP1 riduce la trasduzione del segnale insulinico e
l’accumulo di glucosio.
ABSTRACT N. 239
Progetti di Ricerca Telethon - Common/Complex Diseases
FEDERICI MASSIMO
Responsabile
GGP08065
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
263.000
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2008
UTILIZZO DI TIMP3 PER BLOCCARE LE COMPLICANZE METABOLICHE E VASCOLARI DELL’OBESITÀ
Menghini Rossella, Casagrande Viviana, Marino Arianna, Lauro Renato, Federici Massimo
Dipartimento di Medicina Interna - Università di Roma Tor Vergata, Roma
L’obesità si associa ad un basso grado di infiammazione che predispone a diabete ed aterosclerosi. L’inibitore tissutale di metallo
proteinasi 3 (TIMP3) che ha azioni anti-infiammatorie è ridotto in
presenza di diabete e aterosclerosi. Poichè obesità ed aterosclerosi
si associano ad infiltrazione macrofagica in vari tessuti, è stato generato un modello di animale transgenico in cui l’espressione di
TIMP3 è veicolata dai macrofagi (sotto promotore di CD68) per valutarne gli effetti sull’omeostasi metabolica. I topi transgenici (Tg)
sono stati identificati mediante RT-PCR e Southern blot e confermata la sovraespressione di TIMP3 è stata mediante qPCR, Western blot e Zimografia inversa in diversi tessuti. Tg e WT sono
stati sottoposti ad un trattamento di dieta obesogenica (HFD) per
20 settimane. Al termine gli animali Tg, rispetto ai controlli WT
mostravano un significativo aumento della tolleranza al glucosio e
insulino sensibilità, misurate mediante analisi IPGTT e IPITT
(p<0.01, n=8 per gruppo). I Tg rispetto ai WT mostravano riduzione di insulina, leptina e aumento di adiponectina (p<0.01, n=8 per
gruppo). Analisi istologiche su tessuto adiposo bianco, fegato, rene
e aorta hanno evidenziato un maggiore accumulo di lipidi, di marcatori dell’infiammazione e di fibrosi nei WT rispetto ai Tg. Il profilo
di espressione genica nel tessuto adiposo mette in evidenza nei Tg
ridotta infiammazione (riduzione di F4/80, MCP1, SOCS3), ridotto
stress ossidativo (riduzione di, NADPHox, aumento di SOD1) e un
miglior profilo adipogenico (aumento di CEBP, PPARgamma, BetaKlotho, riduzione di PREF-1, beta-catenina, axin2). L’analisi proteica
mediante Western Blot mostra una ridotta fosforilazione di proteine infiammatorie, come JNK, e un aumento della fosforilazione di
AKT nei fegati degli animali Tg. Successivamente animali Tg sono
stati incrociati con animali LDLR knockout (LDLR-Tg), che rappresentano un modello di aterosclerosi e sottoposti ad un regime di
dieta western per 12 settimane. Analisi istologiche sull’aorta hanno
evidenziato una riduzione pari al 60% nella formazione di placca
(p<0.001), di F4/80, CD3 e nitrotirosina (p<0.01 per tutti, n=5
per gruppo), un aumento nel contenuto di collagene e assenza di
core necrotici negli LDLR-Tg rispetto agli LDLR knockout (n=5 per
gruppo). Analisi del profilo di espressione genica nel fegato e nell’aorta indicano un ridotto stress ossidativo e una minor attivazione
di segnali infiammatori negli LDLR-Tg rispetto agli LDLR knockout.
I nostri dati suggeriscono che TIMP3 eserciti un’azione di controllo
protettivo nei confronti di stati infiammatori indotti da lipotossicità
e disordini metabolici e un potenziale target terapeutico per la cura
di diabete e aterosclerosi.
ABSTRACT N. 241
Progetti di Ricerca Telethon - Common/Complex Diseases
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 1
La transglutaminasi 2 (TG2) è un enzima multifunzionale che ha
un’attività transamidasica Ca2+ dipendente ed una funzione di G
proteina che sono mutuamente esclusive.
In studi precedenti abbiamo dimostrato che topi knock out per TG2
sviluppano con l’età un difetto nel metabolismo del glucosio associato con una ridotta secrezione insulinica di prima fase. Inoltre abbiamo dimostrato che alcuni soggetti affetti da diabete familiare di
tipo 2 sono portatori di mutazioni nel gene umano che codifica per
la TG2. Lo scopo di questo lavoro è quello di comprendere più chiaramente qual è il ruolo della reazione di transamidazione della TG2
nel corso della secrezione insulinica di prima fase, visto che le mutazioni naturali da noi identificate hanno dimostrato causare una ri-
GGP09012
245.400
Anno d’inizio: 2009
(1) Bambino Gesù Pediatric Hospital IRCCS, Laboratory of Monogenic Diabetes
- Piazza Sant’Onofrio 1, 00100, Roma
(2) Department of Internal Medicine, University of Tor Vergata, Rome, Italy
(3) Department of Human Morphology, University of Insubria and Department
of Pathology, Ospedale di Circolo, Varese, Italy
(4) Dulbecco Telethon Institute, Mario Negri Institute for Pharmacological Research, Milan, Italy
(5) DIBIT, San Raffaele Scientific Institute, Milan, Italy
(6) Department of Cell Physiology and Metabolism, Geneva University Medical
Centre, Geneva 4, Switzerland
BEGUINOT FRANCESCO
Durata (anni): 3
41.800
Durata (anni): 1
Russo Lucia (1), Marsella Claudia (2), Placidi Claudia (3), Nardo
Giovanni (4), Massignan Tania (4), Alessio Massimo (5), La Rosa
Stefano (3), Bonetto Valentina (4), Maechler Pierre (6), Barbetti Fabrizio (1,2), Massa Ornella (1)
Progetti di Ricerca Telethon - Common/Complex Diseases
Telethon grant N.
GGP09147
UN NUOVO SCREENING GENETICO DEL GENE DELLA TG2 IN
UNA COORTE DI SOGGETTI AFFETTI DA DIABETE 2 ED UNO
STUDIO FUNZIONALE ASSOCIATO
ABSTRACT N. 240
Responsabile
MASSA ORNELLA
Anno d’inizio: 2009
LA FUNZIONE DEL GENE PREP1 NEL DIABETE TIPO 2
Cabaro Serena (1), Oriente Francesco (1), Iovino Salvatore (1),
Miele Claudia (1), Cassese Angela (1), Blasi Francesco (2), Formi-
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21-02-2011
15:55
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SERVIZI TELETHON ALLA RICERCA
duzione in vitro di questa specifica attività enzimatica.
Per effettuare questo studio abbiamo utilizzato le INS1E, un insulinoma di ratto, ed abbiamo dapprima marcato le cellule con la biotinamido pentilamina (BPNH2), un’ammina biotinilata che funziona
da donatore accettore artificiale di gruppi –NH2. Abbiamo quindi
marcato le cellule con questa ammina in condizioni basali e stimolando le cellule con 15,5 mM glucosio per 2, 5, 8 e 15 minuti. Abbiamo ottenuto così una marcatura dei substrati naturali della TG2
che separati per elettroforesi bidimensionale sono stati identificati
per spettrometria di massa. Tra i diversi substrati abbiamo trovato
l’actina ed alcune tropomiosine, molecole che sono coinvolte nel
movimento del granulo d’insulina.
Usando l’altro substrato sintetico, un peptide biotinilato, abbiamo
confermato che l’actina è tra i substrati della reazione di transamidazione. Ulteriore conferma dell’interazione diretta tra TG2 e actina
è venuta dagli esperimenti di immunoprecipitazione.
Inoltre abbiamo dimostrato che la reazione di transamidazione segue lo stesso andamento della FIPS e delle variazioni della concentrazione del Ca2+ intracellulare, aumentando quando la FIPS e il
Ca2+ raggiungono il massimo, e ritornando a livello basale quando
la FIPS si conclude e il Ca2+ ritorna alla concentrazione quasi iniziale.
Per dimostrare la specificità della reazione di transamidazione esperimenti di siRNA su TG2 sono in corso, mentre la dipendenza dal
calcio è studiata in esperimenti funzionali in assenza di calcio.
I dati fin qui raccolti permettono di ipotizzare che la TG2 durante la
FIPS funge da enzima modificatore dell’actina facilitando il rimodellamento citoscheletrico necessario per la migrazione del granulo secretorio.
Infine abbiamo trovato che nel corso della FIPS si generano delle
isoforme della TG2 di peso molecolare minore, studi sono in corso
per caratterizzare queste isoforme e chiarirne il ruolo in corso di secrezione insulinica.
ranno ammesse dopo un periodo di un anno necessario per l’implementazione di tutte le procedure.
Il TGBN collabora strettamente con UNIAMO (Federazione italiana di
circa 100 associazioni di pazienti con malattie rare) con l’obiettivo
di fornire un servizio alle famiglie. Un’innovativa attività del TGBN è
l’accordo stipulato a dicembre 2009 tra l’Associazione Internazionale RING14 e il Partner 1, finalizzato alla raccolta e alla centralizzazione di campioni molto rari per specifici progetti di ricerca.
Il TGBN acquisisce e conserva materiale biologico vario (linee cellulari e tessuti da materiale fetale/adulto, DNA/RNA, sangue e plasma) per oltre 700 differenti malattie genetiche.
Lo scopo del TGBN è quello di armonizzare tutte le procedure di
“biobanking” (raccolta, processamento, conservazione, distribuzione dei campioni a scopo di diagnosi e/o ricerca, e registrazione dei
dati correlati) assicurando, allo stesso tempo, qualità, protezione
della privacy e confidenzialità.
L’organo decisionale è il Network Board (Coordinatore e Direttori
delle Biobanche). Il TGBN inoltre si avvale di un organo consultivo,
l’Advisory Board (esperti in ambito etico e legale e da un rappresentante delle associazioni familiari), di un Coordinatore Emerito, di
un Telethon Program Manager e di un Telethon Advisor.
Per raggiungere al meglio gli obbiettivi preposti, il TGBN ha adottato un sistema informatico condiviso che gestisce tutte le attività delle Biobanche e aggrega i dati per il sito web
(www.biobanknetwork.org) dove è disponibile il catalogo on-line. Il
sistema informatico inoltre gestisce e monitora on-line, attraverso
il Pannello delle Richieste, il flusso dei campioni “in” e “out” che è
quindi condiviso da tutti i Partner. Per richiedere i campioni, i ricercatori devono registrarsi sul sito e solo successivamente possono
compilare il modulo di richiesta on-line. Una volta smistata nella
sede centrale, la richiesta viene inviata alla Biobanca interessata,
che a sua volta invia l’apposito modulo al richiedente. Il TGBN si
impegna a salvaguardare l’ultima aliquota del campione nella Biobanca a vantaggio del paziente per consentire eventuali analisi retrospettive.
Attività e politiche del TGBN sono definite nella Carta Costituente,
costantemente aggiornata, che include linee guida riguardanti gli
aspetti organizzativi ed etici e definisce i benefici e i doveri di ciascun componente.
SERVIZI TELETHON ALLA RICERCA
ABSTRACT N. 242
Servizi Telethon
Responsabile
FILOCAMO MIRELLA
Totale
1.704.960
Telethon grant N.
Num Centri: 10
ABSTRACT N. 243
Servizi Telethon
GTB07001
Durata (anni): 5
Responsabile
Telethon grant N.
Anno d’inizio: 2007
Totale
Num Centri: 1
NETWORK DI BIOBANCHE GENETICHE DI TELETHON (TGBN)
ALTRUDA FIORELLA
GTF05010
330.000
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2006
CENTRO PER LO STUDIO DI GENOMICA FUNZIONALE IN VIVO
Baldo Chiara (2), Stefano Goldwurm (3), Alessandra Renieri (4),
Corrado Angelini (5), Maurizio Moggio (6), Marina Mora (7), Giuseppe Merla (8), Luisa Politano (9), Barbara Garavaglia (10), Mirella Filocamo (1)
Altruda Fiorella, Hirsch Emilio, Poli Valeria, Turco Emilia
Molecular Biotechnology Center, Dept. of Genetics, Biology and Biochemistry,
University of Torino - via Nizza 52, 10126 Torino
(1) S.S.D. Lab. Diagnosi Pre-Postnatale Malattie Metaboliche - IRCCS G. Gaslini,
Genova - PRIMARY BIOBANK - Largo G. Gaslini 5, 16147 Genova-tel.
0105636792/609 - fax 010383983 - email: [email protected]
(2) S.C. Lab. di Genetica - E.O. Ospedali Galliera, Genova - PRIMARY BIOBANK
(3) Centro Parkinson e Disturbi del Movimento - Istituti Clinici di Perfezionamento, Milano - PRIMARY BIOBANK
(4) U.O.C. Genetica Medica, Dip. di Biologia Molecolare - Università di Siena,
Siena - PRIMARY BIOBANK
(5) Dip. Neuroscienze - Università di Padova, Padova - PRIMARY BIOBANK
(6) U.O.S. Diagnostica Malattie Neuromuscolari - Centro Dino Ferrari, Fondazione IRCCS Cà Grande Osp. Maggiore Policlinico, Milano - PRIMARY BIOBANK
(7) U.O. Malattie Neuromuscolari e Neuroimmunologia - Istituto Neurologico C.
Besta Fondazione IRCCS, Milano - PRIMARY BIOBANK
(8) Servizio Genetica Medica - IRCCS Casa Sollievo della Sofferenza, San Giovanni Rotondo (FG) - SECONDARY BIOBANK
(9) Dip. di Medicina Sperimentale - Seconda Università di Napoli, Napoli NEWLY PRIMARY APPROVED BIOBANK
(10) S.O.S. Diagnostica dei Disturbi del Movimento e Disordini del Metabolismo
Energetico – U.O. Neurogenetica Molecolare, Istituto Neurologico C. Besta Fondazione IRCCS, Milano - NEWLY SECONDARY APPROVED BIOBANK
Il progetto Genoma Umano, terminato alla fine del 2000, ci ha fornito la sequenza completa del DNA che contiene tutte le informazioni che contribuiscono alla costituzione di un organismo vivente
complesso. Affinché queste conoscenze possano avere un reale impatto sullo sviluppo della medicina sarà fondamentale ottenere conoscenze approfondite sulla funzione dei singoli geni. Attualmente
solo un decimo dei geni sono conosciuti nella loro funzione. I rimanenti sono identificati sulla base della sequenza di DNA, ma la loro
funzione è totalmente sconosciuta. Di fatto l’era “post genomica”
iniziata in questo millennio deve affrontare la sfida di decifrare la
funzione dei singoli geni ed il loro ruolo nella fisiopatologia.
L’approccio sperimentale più efficace è quello di introdurre alterazioni specifiche nei singoli geni per trarre quindi informazioni
precise sulla loro funzione. Il topo costituisce il modello tecnologicamente più versatile. L’introduzione di alterazioni specifiche
nei singoli geni richiede una tecnologia che è estremamente
complessa e che coinvolge competenze di genetica molecolare,
biologia cellulare, fisiopatologia, microchirurgia nonché una
complessa struttura per l’allevamento degli animali. Nel nostro
laboratorio a partire dal 1992 abbiamo sviluppato questo complesso di competenze ed abbiamo generato alcune centinaia di
ceppi di topo con alterazioni in geni specifici, molti dei quali sono stato studiati in collaborazione con laboratori esterni sia universitari che di imprese farmaceutiche private. Con questa proposta intendiamo condividere questa competenza con i ricercatori Telethon che hanno come missione lo studio delle malattie
causate da alterazioni genetiche.
Il Network di Biobanche Genetiche di Telethon (TGBN) è la prima risorsa nazionale di campioni biologici provenienti da pazienti affetti
da malattie genetiche mirato a supportare la ricerca biomedica e a
offrire un servizio ai pazienti e alle loro famiglie. Il TGBN, costituito
inizialmente da 7 Biobanche Primarie (ampie collezioni di campioni),
ha accolto nel 2010 una Biobanca Secondaria (piccole collezioni da
integrare a Biobanche Primarie); nel 2011 2 nuove Biobanche sa-
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SERVIZI TELETHON ALLA RICERCA
Il servizio permetterà ai ricercatori, che hanno isolato un gene di interesse, di generare un topo con un’alterazione genetica specifica
che costituirà un modello di importanza cruciale per stabilire la portata di quel gene nell’ instaurarsi della malattia genetica corrispondente.
nuove terapie.
Obiettivi: Ottenere misure neurofisiologiche in modelli animali di malattie genetiche e correlarle con variazioni cliniche e istopatologiche.
Metodi: Abbiamo sviluppato e standardizzato test neurofisiologici in
vivo e minimamente invasivi per la valutazione della conduzione del
sistema nervoso periferico (studi di conduzione nervosa) e centrale
(potenziali evocati visivi, uditivi, somatosensoriali e motori) in modelli animali -soprattutto murini- di malattie neurologiche caratterizzate da anomalie della conduzione nervosa.
Per modelli animali di epilessia o ritardo mentale abbiamo implementato registrazioni EEG con video EEG, attuale riferimento per il
monitoraggio dell’epilessia, e potenziali cognitivi. I ricercatori Telethon stanno tuttora utilizzando questa Facility, dalla seconda
metà del 2010.
Risultati: L’applicazione degli studi di conduzione nervosa, potenziali evocati ed EEG in modelli animali di malattie neurologiche verrà
presentata, insieme ai correlati clinico-istopatologici.
Conclusioni: Diverse misure elettrofisiologiche minimamente invasive possono essere utilizzate quali parametri aggiuntivi paraclinici, col vantaggio di essere più ‘oggettivi’ rispetto alla valutazione
clinica, e più ‘funzionali’ rispetto all’istopatologia.
ABSTRACT N. 244
Servizi Telethon
BIANCHI MARCO E.
Responsabile
GTF07004
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
375.000
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2008
CENTRO PER LA MUTAGENESI CONDIZIONALE
Bianchi Marco, Ronfani Lorenza, Benzoni Ivana, Rinaldi Rosanna,
Pintonello Luisa, Benini Lorenzo
Dibit, San Raffaele Scientific Institute - Via Olgettina 58, 20133 Milano. Tel
0226434765; fax 0226435352; E-mail: [email protected]
ABSTRACT N. 246
Topi transgenici e knock-out sono diffusamente usati nella ricerca in
quanto rappresentano un valido strumento per aiutare i Ricercatori
nella comprensione del ruolo svolto dalle proteine e soprattutto perché essi costituiscono modelli su cui potere studiare malattie genetiche umane.
Il gruppo CFCM (Core Facility for Conditional Mutagenesis) è una
unità di supporto nata nel 1999 con lo scopo di incrementare l’utilizzo di modelli murini nella ricerca. CFCM produce topi transgenici e
knock-out per la Comunità Scientifica di Telethon che usufruisce di
costi molto vantaggiosi.
CFCM genera topi transgenici tramite iniezione del DNA nel pronucleo e con vettori lentivirali. Effettua l’elettroporazione di cellule
Embrionali Staminali (ES) con costrutti per gene targeting, identifica i cloni ricombinanti tramite Southern blotting e inietta i cloni ricombinanti in blastocisti per generare topi knock-out. CFCM trasferisce embrioni da topi malati a topi sani, rendendo gli animali importati dal Ricercatore compatibili con gli standards dello stabulario
che li ospiterà. Inoltre, CFCM offre il congelamento degli Embrioni di
linee murine. Questo è un servizio fondamentale poichè i Ricercatori
spendono parte del loro tempo (nonchè soldi) per mantenere linee
murine che non servono ai loro studi correnti. Inoltre queste linee
murine occupano spazio prezioso nello stabulario.
Il CFCM offre ora il servizio di isolamento di cellule ES da blastocisti
appartenenti a linee di topi mutate per dare ai Ricercatori la possibilità di differenziare queste ES mutate in tutti i tipi cellulari.
CFCM ha sempre supportato i Ricercatori che hanno cominciato a
lavorare con i topi indirizzandoli sulla scelta del modello murino appropriato per gli scopi della propria ricerca. Il personale si è prestato a spiegare regole e abitudini da adottare in Stabulario, ha insegnato a manipolare e genotipizzare i topi ed ha anche fornito brevi
corsi di “breeding” mirati per ottenere nel minor tempo possibile il
topo col genotipo giusto da analizzare.
Altre informazioni sono presenti sul sito:
www.sanraffaele.org/CFCMn.html.
I modelli murini generati da CFCM sono più di 300.
Servizi Telethon
Responsabile
LEOCANI LETIZIA
Totale
35.000
Telethon grant N.
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 1
300.000
Durata (anni): 3
Anno d’inizio: 2007
SERVIZIO DI GENOTIPIZZAZIONE DI SNPS BURLO-CBM
Gasparini Paolo (1), D’Adamo Pio (1), D’Eustacchio Angela (1),
Esposito Laura (2)
(1) Medical Genetics - IRCCS-Burlo Garofolo and University of Trieste - Via dell’Istria 65, Trieste, Italy
(2) CBM scrl - Basovizza, Trieste, Italy
Il servizio di genotipizzazione BURL-CBM è stato creato alla fine del
2006 con l’obiettivo di realizzare un “service” nazionale aperto anche a collaborazioni internazionali per l’identificazione delle basi genetiche delle malattie (sia quelle Mendeliane che quelle multifattoriali). E’ stato riconosciuto da Telethon come “service” per i ricercatori Telethon stessi.
Nonstante la giovane età, il Servizio BURLO-CBM è diventanto punto di riferimento per molti ricercatori sia in Italia che all’estero. Parlando specificamente di Telethon sono stati forniti servizi di genotipizzazione a 11 diversi centri di ricerca con la produzione di diverse
decine di milioni di dati. La qualità dei genotipi prodotti è stata
sempre molto alta e si è riflettuta in un giudizio più che positivo da
parte degli utilizzatori.
A parte le attività di “service” alla comunità scientifica inclusa
quella dei ricercatori Telethon, i ricercatori direttamente coinvolti
nel gestire il Servizio BURLO-CBM hanno prodotto dati su progetti
di ricerca volti allo studio delle basi genetiche delle malattie mendeliane, multifattoriali e dei tratti quantitative. Tutte queste attività hanno portato il personale del Servizio ad acquisire professionalità ed esperienza nel gestire i vari aspetti di attività connesse
con l’analisi dei dati genetici (dalla produzione del dato all’analisi
statistica, dalla parte riguardante le norme sulle privacy a quella
sugli aspetti etici).
GTF09022
Durata (anni): 1
GTF06003
Telethon grant N.
ABSTRACT N. 245
Servizi Telethon
GASPARINI PAOLO
Responsabile
ABSTRACT N. 247
Anno d’inizio: 2010
Servizi Telethon
Responsabile
NEUROFISIOLOGIA SPERIMENTALE NEI MODELLI ANIMALI
Telethon grant N.
Totale
Leocani Letizia, Del Carro Ubaldo, Minicucci Fabio, Amadio Stefano,
Ungaro Daniela, Cambiaghi Marco, Cursi Marco, Teneud Luis, Velikova Svetla, Comi Giancarlo
Num Centri: 1
NIGRO VINCENZO
GTF06006
117.600
Durata (anni): 2
Anno d’inizio: 2007
SERVIZIO PER L’IDENTIFICAZIONE E LA VALIDAZIONE DELLE MUTAZIONI GENICHE
Neurological Dep.t - INSPE; Scientific Institute H. San Raffaele, Milan - Scientific Institute H. San Raffaele, Via Olgettina 60, 20132 Milan
Piluso Giulio (1), Dionisi Manuela (1), Del Vecchio Blanco Francesca
(1), Torella Annalaura (1), Aurino Stefania (2), Savarese Marco (1),
Bertini Enrico (3), Terracciano Alessandra (3), Criscuolo Chiara (4),
Santorelli Filippo Maria (5), Nigro Vincenzo (1,2)
Razionale: La valutazione in vivo consente la caratterizzazione funzionale non invasiva, longitudinale e oggettiva dei modelli animali,
consentendo di: i) validare il modello animale confrontando i parametri neurofisiologici a misure simili nei pazienti; ii) fornire informazioni patogenetiche; iii) valutare funzionalmente gli effetti di
(1) Dipartimento di Patologia Generale, Seconda Università degli Studi
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SERVIZI TELETHON ALLA RICERCA
La nostra piattaforma bioinformatica contiene la maggior parte delle
più diffuse applicazioni per l’analisi di dati NGS, come ad esempio
strumenti software e “front-end” per la gestione e la manipolazione
di specifici set di dati genomici. Il sistema software che forniamo è in
grado di effettuare analisi nei principali campi di applicazione delle
piattaforme NGS: risequenziamento genomico, sequenziamento dei
genomi “de-novo”, identificazione delle varianti strutturali del genoma, identificazione delle interazioni proteina - DNA ed RNA mediante
Chip-Seq e RIP-seq, “profiling” del trascrittoma, identificazione e caratterizzazione di miRNA e altri RNA non codificanti, Metagenomica,
Epigenetica e analisi di SNPs. Programmi a linea di comando, strumenti web, servizi web e database sono stati sviluppati per l’immagazzinamento, la manipolazione (es. conversione di formati), il rapido assemblaggio e l’analisi dei dati generati dalle piattaforme Roche 454 Life Sciences™, Illumina® e piattaforme ABI SOLiD™.
Le caratteristiche principali della facility sono: accesso semplice e
conveniente a un supercomputer dotato di migliaia di “core” di calcolo, con velocità di esecuzione e capacità notevolmente aumentate
per gli algoritmi sia di “assembling” sia di “mapping”, interfaccia
utente intuitiva e flessibile per condurre analisi relative alla maggior
parte dei progetti NGS.
Il portale web è disponibile all’indirizzo http://www.caspur.it/ngs.
di Napoli - Via L. De Crecchio, 7 - 80138 Napoli, Italy e-mail: [email protected]
(2) Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM), Napoli, Italy
(3) Dipartimento di Neuroscienze, Unità di Medicina Molecolare, Ospedale Pediatrico “Bambino Gesù”, Roma, Italy
(4) Dipartimento di Scienze Neurologiche, Università degli Studi “Federico II”,
Napoli, Italy
(5) IRCCS Fondazione Stella Maris, Pisa, Italy
La ibridazione genomica comparativa su array (aCGH) è oggi la
tecnologia più largamente utilizzata per la rilevazione di varianti
polimorfiche o patogeniche del numero di copie di segmenti di
DNA (CNVs) nel genoma umano. Nel campo delle malattie neuromuscolari, un numero crescente di diversi meccanismi di mutazione, come delezioni o duplicazioni, è stato rilevato in molte centinaia di geni.
Abbiamo realizzato il Motor Chip, un aCGH con piena copertura
esonica di geni coinvolti in malattie neuromuscolari. Nella versione attuale (NMDv02.15-Hg18), il Motor Chip contiene 425 geni
nucleari, di cui 245 sono associati a fenotipi neuromuscolari mentre i restanti 180 sono stati selezionati per il loro ruolo biologico in
funzioni neuromuscolari. Abbiamo utilizzato la tecnologia Agilent,
basata su oligonucleotidi e abbiamo scelto il formato meno costoso 8x60K.
I nostri esperimenti di validazione hanno dimostrato la sensibilità e
la specificità del design del Motor Chip, con il 100% di concordanza
dei campioni di DNA analizzati in doppio cieco.
Sono stati correttamente assegnati con il Motor Chip 26 campioni in
cui erano stati individuati in precedenza delezioni o duplicazioni legate a patologie neuromuscolari.
Rispetto al Motor Chip, gli array CGH commerciali hanno mostrato
un tasso di identificazione delle mutazioni del 40,7% per il 60K, del
48,1% per il 180K, 62,9% per il 244K e del 74% per il 400K. Pertanto, il nostro chip è in grado di rilevare efficacemente mutazioni
intrageniche, anche a livello di un singolo esone, che altrimenti non
sarebbero rilevabili da aCGH tradizionali.
Noi crediamo che la combinazione della copertura esonica e della
piattaforma ottimizzata possono fare del Motor Chip uno strumento
prezioso per la diagnosi molecolare e di indagine genetica nelle malattie neuromuscolari.
ABSTRACT N. 249
Servizi Telethon
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Totale
Num Centri: 1
Anno d’inizio: 2007
Horenstein Alberto Leonardo
Laboratory of Immunogenetics-Department of Genetics, Biology and Biochemistry - Via Santena 19 10126 Turin, Italy
Gli anticorpi monoclonali (AcMo) sono prodotti di laboratorio con
applicazioni in ricerca, diagnosi e terapia di numerose malattie
umane. Infatti, le loro caratteristiche permettono un’identificazione
selettiva dei bersagli cellulari. AcMo di qualità standard, in una scala di 5-10 mg, sono spesso richiesti da molti laboratori. Sovente il
loro costo è proibitivo; è emersa quindi l’esigenza di produzioni indipendenti che soddisfino i requisiti per ottenere AcMo in questa
scala. La risposta alla richiesta di AcMo di alta qualità (grado funzionale), tuttavia, non è generalmente soddisfatta dall’industria biotecnologica. Altri problemi sono la capacità di produzione di AcMo
per malattie rare che possono originarsi dalla nuova conoscenza del
genoma umano. Il progetto e stato basato sul disegno della piattaforma più efficace per l’espansione e la purificazione fino al grado
di AcMo funzionale, in scala da milligrammi-a-grammi per lotto.
Obiettivi di questo approccio è l’identificazione il più precoce possibile dei candidati ottimali per la ricerca di base ed applicata. Per
questa ragione è stata sviluppata nell’ITSF una tecnologia per l’espansione in vitro e la successiva purificazione degli AcMo idonei
per studi di ricerca, espandibili su scala più ampia fino a costituire
un Servizio, già esteso ad Istituti nazionali ed internazionali. Nonostante le nostre aspettative il Servizio non ha avuto il riscontro
aspettato per ragioni che dobbiamo approfondire.
GTF09024
105.000
50.000
Durata (anni): 2
IMMUNOGENETICA-TELETHON “CORE FACILITY” PER LA PURIFICAZIONE DI ANTICORPI MONOCLONALI DI GRADO CLINICO
PESOLE GRAZIANO
Durata (anni): 3
GTF06004
Telethon grant N.
ABSTRACT N. 248
Servizi Telethon
HORENSTEIN ALBERTO LEONARDO
Responsabile
Anno d’inizio: 2010
SERVIZI BIOINFORMATICI PER L’ANALISI DI DATI GENERATI DALLE PIATTAFORME DI SEQUENZIAMENTO DI NUOVA
GENERAZIONE
Castrignanò Tiziana (1), D’Antonio Mattia (1,4), D’Onorio De Meo
Paolo (1), Sanna Nico (1), Mignone Flavio (2), Horner David (3),
Pavesi Giulio (3), Picardi Ernesto (4), Pesole Graziano (4,5)
(1) Consorzio per le Applicazioni di Supercalcolo per Università e Ricerca, Roma - prof. Graziano Pesole - Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare
“E. Quagliariello”, Università di Bari, via Orabona, 4, 70125 Bari, Tel.
0805443588, Fax 0805443317, e-mail: [email protected]
(2) Dip di Chimica Strutturale e Stereochimica, Università di Milano, Milano
(3) Dip di Scienze Biomolecolarie Biotecnologie, University of Milano, Milano
(4) Dip di Biochimica e Biologia Molecolare “E. Quagliariello”, Università di Bari, Bari
(5) Istituto di Biomembrane e Bioenergetica, CNR, Bari
ABSTRACT N. 250
Le piattaforme di sequenziamento di DNA di nuova generazione
hanno generato un’enorme mole di dati per la ricerca biomedica,
offrendo un’opportunità senza precedenti di ottenere analisi di tipo
“high-throughput“ rapide ed economiche incluse quelle di interi genomi, trascrittomi e interattomi. Gestire l’enorme mole di dati generati dalle piattaforme NGS richiede competenze non banali, enorme potenza di calcolo e capacità di “storage” che non sono generalmente disponibili nella maggior parte dei laboratori di ricerca.
La “core facility” bioinformatica centralizzata del CASPUR fornisce
risorse condivise per il calcolo e le necessità infrastrutturali “IT”.
Eccezionali risorse hardware sono state dedicate a questo servizio
in termini sia di potenza di calcolo che di capacità di “storage”.
La estesa varietà di software disponibili che sono in continuo aggiornamento, e le competenze bioinformatiche acquisite da molti
anni forniscono a tutti gli utenti un servizio di analisi dei dati di sequenza efficiente, accurato e riproducibile.
Servizi Telethon
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
CRESCENZI MARCO
GTF08002
166.600
Durata (anni): 2
Anno d’inizio: 2009
SERVIZIO DI PROTEOMICA TELETHON
Camerini Serena (1), Fratini Federica (1), Callipo Luciano (1), Senatore Cinzia (2), Facchiano Francesco (2), Crescenzi Marco (1)
(1) Department of Cell Biology and Neurosciences, Istituto Superiore di Sanita’, Roma - Viale Regina Elena, 299 - 00161 Roma
(2) Department of Hematology, Oncology, and Molecular Medicine, Istituto Superiore di Sanita’, Roma
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SERVIZI TELETHON ALLA RICERCA
Negli ultimi dieci anni la spettrometria di massa (MS) delle proteine
e’ divenuta uno strumento insostituibile nella biochimica delle proteine. Nonostante l’importanza in costante crescita di questa metodologia, esiste un significativo divario fra la domanda di tecnologia
e la disponibilita’ di personale qualificato e di adeguati strumenti. La
biochimica delle proteine ha assunto importanza centrale nelle indagini sulle malattie genetiche. E’ percio’ essenziale garantire accesso a tecnologie aggiornate a tutti i ricercatori Telethon che ne
necessitino.
Nel 2009 Telethon ha inaugurato un servizio di proteomica che ha
fornirto ai suoi ricercatori un ampio ventaglio di servizi di MS delle
proteine. Tali servizi includono, in modo non esclusivo, identificazione di proteine, analisi di modificazioni post-traduzionali, approfondita caratterizzazione di miscele complesse, misurazioni quantitative
assolute e comparazioni quantitative relative. In aggiunta a cio’, ulteriori e specifici servizi sono stati forniti su richiesta e indicazione
degli utenti. Infine, se richiesto, il Servizio fornisce consulenza circa
la preparazione e il trattamento dei campioni e partecipa alla progettazione degli esperimenti.
Il Servizio di Proteomica Telethon deriva da una struttura di MS,
creata all’Istituto Superiore di Sanita’ (ISS) sin dal 2002, che ha
fornito servizi su base collaborativa a ricercatori interni ed esterni
all’ISS. Nel corso degli anni la Struttura ha applicato la MS a una
grande varieta’ di indagini. Questi comprendono l’identificazione di
proteine semi-purificate, lo studio di modificazioni post-traduzionali,
(fosforilazione, nitrazione, ubiquitinazione, poliglicilazione, glicosilazione), l’identificazione sistematica delle componenti di miscele proteiche complesse, studi di interazione fra proteine, l’isolamento e la
caratterizzazione di componenti proteiche dei raft di membrana, l’analisi di addotti proteici, l’estrazione di pattern diagnostici sieroproteomici ed altro.
Il Servizio attualmente si avvale di uno spettrometro di massa MALDI-ToF (Voyager-DE STR, Applera) e di una trappola ionica lineare
(LTQ XL, Thermo) dotata di electron-transfer dissociation (ETD). Altri strumenti comprendono un apparato per HPLC bidimensionale
(PF2D, Beckman), uno strumento per FPLC (Pharmacia), un liofilizzatore, ecc. Il Servizio e’ prestato da tre chimici esperti e da una
biotecnologa.
Nei suoi due anni di vita il Servizio ha collaborato con 12 gruppi di
ricerca finanziati da Telethon ed ha effettuato ben piu’ di 200 analisi. Sfortunatamente il Servizio di Proteomica Telethon, come tutte
le facility Telethon, cessera’ presto di esistere. Cio’ nonostante continueremo a servire la comunita’ scientifica nel modo piu’ flessibile
ed efficiente che ci sara’ possibile.
mento di Medicina Sperimentale, Università di Genova.
Questo abstract sintetizza l’attività svolta presso il TeFEM dal Febbraio 2008 al Dicembre 2010.
Abbiamo ricevuto 150 campioni da differenti gruppi di collaboratori.
Circa il 80% di questi sono stati analizzati per la sola morfologia, ed
includevano cellule in cultura, biopsie di campioni derivanti da topi
knockout o transgenici per specifici geni, e tre biopsie da paziente
per indirizzare la diagnosi. Per molti di questi campioni si è reso necessario il taglio di sezioni su piani differenti. Inoltre, su una parte
di questi è stata eseguita un’analisi morfometrica mediante metodi
‘point intersection’ e ‘point hit’ per la quantizzazione di fenotipi indotti su specifici organelli. Il 20% dei campioni era rappresentato
da cellule trasfettate con diversi costrutti, sulle quali è stata realizzata immuno-marcatura, sia mediante immuno-oro su cro-sezioni,
che utilizzando tecniche di pre-embedding per un analisi cinetica.
Su una parte dei campioni è stata effettuata un’analisi morfometrica per la quantizzazione della distribuzione di oro.
Abbiamo inoltre applicato un nuovo metodo di analisi ad alta resa in
microscopia correlativa.
ABSTRACT N. 252
Servizi Telethon
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Responsabile
Telethon grant N.
Totale
Num Centri: 1
Anno d’inizio: 2009
Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM) - Via Pietro Castellino,
111 80131 - Napoli, Italy
Lo studio delle malattie genetiche è composto da molti passaggi, dall’identificazione del gene responsabile dello sviluppo della malattia,
alla messa a punto di approcci terapeutici per il trattamento della
malattia. Un passaggio chiave, il chiarimento dei meccanismi della
patogenesi, richiede una precisa caratterizzazione dei meccanismi
molecolari coinvolti nella fisiologia di tali prodotti genici aberranti
(sintesi, turnover, interazioni con componenti delle macchine molecolari e precisa localizzazione cellulare). In questo passaggio, la microscopia elettronica (ME) gioca un ruolo fondamentale nella comprensione dello sviluppo della malattia, fornendo un rilevamento ad alta
risoluzione di prodotti genici anomali e analisi di cambi ultrastrutturali
indotti dallo loro espressione. Comunque, diversamente dagli approcci genetici e molecolari, gli studi di ME sono rimasti un’utopia per
molti laboratori a causa degli alti costi e della mancanza della strumentazione ed esperienza necessari. Lo scopo è quindi di fornire aiuto ai progetti Telethon che richiedono approcci di ME per l’analisi delle
malattie genetiche. Lunga esperienza, conoscenze tecniche, strumentazione e personale qualificato sono disponibili per tale aiuto al Telethon Electron Microscopy Core Facility (TeEMCoF). Il TeEMCoF fornisce assistenza tecnica ed esperienza, insieme a valutazioni qualitative
e quantitative per ME, per studi supportati dai fondi Telethon. Esso
comprende i gli esperti scienziati, tecnici, laboratori ed equipaggiamento necessari per eseguire efficacemente studi di ME richiesti dagli
scienziati Telethon.
Il TeEMCoF offre i seguenti sevizi:
- Microscopia correlativa ottica-elettronica - Per la visualizzazione di
strutture di interesse all’interno di cellule vive o fissate in microscopia
ottica e successivamente l’analisi della stessa identica struttura per
mezzo di microscopia elettronica (Polishchuk et al., J. Cell Biol. 2000
148, 45-58).
- Tomografia elettronica - Per precise analisi tridimensionali per la ricostruzione di strutture sub-cellulari complesse nelle cellule e nei tessuti affetti da disordini genetici (Koster et al., J. Struct. Biol. 1997
120, 276-308; Baumeister et al., Trends Cell Biol. 1999 9, 81-85).
- Immunolocalizzazione di prodotti genici coinvolti nella patogenesi
delle malattie - Per una mappa ad alta risoluzione dei prodotti genici
normali e anomali all’interno di strutture sub-cellulari.
- Analisi morfometriche - Per una precisa valutazione dei parametric
morfologici in campioni ottenuti usando gli altri servizi offerti dal
TeEMCoF.
- Uso della strumentazione del TeEMCoF - In sostanza, con l’aiuto di
Telethon ed in collaborazione con i ricercatori supportati da Telethon,
intendiamo migliorare la nostra conoscenza della genomica funzionale
a partire dal livello cellulare fino all’intero organismo, al fine di creare
nuovi strumenti per la scoperta e la cura delle malattie genetiche.
GTF07002
254.760
183.000
Durata (anni): 3
Polishchuk Roman, Egorova Anastasia, Egorov Mikhail, Polishchuk
Elena
TACCHETTI CARLO
Durata (anni): 3
GTF08001
SERVIZIO TELETHON DI MICROSCOPIA ELETTRONICA TEEMCOF
ABSTRACT N. 251
Servizi Telethon
POLISHCHUK ROMAN
Anno d’inizio: 2008
SERVIZIO TELETHON PER LA MICROSCOPIA ELETTRONICA:
ANALISI ULTRASTRUTTURALE E IMMUNO-LOCALIZZAZIONE
SU MODELLI DI MALATTIE GENETICHE
Cortese Katia, Gagliani Mariacristina, Venturi Consuelo, Tacchetti
Carlo
MiCroSCoBiO Research Center - Dip. Medicina Sperimentale Università di Genova - Via deToni 14, 16132, Genova
Negli ultimi anni sono stati identificati diversi geni responsabili di
malattie genetiche; la caratterizzazione della funzione e del ruolo
patogeno dei loro prodotti costituisce un importante obiettivo. L’uso
della microscopia elettronica per localizzare questi prodotti a livello
sub-cellulare e ottenere dati ultrastrutturali su fenotipi indotti, è
certamente necessario per la loro caratterizzazione.
La microscopia elettronica richiede personale specializzato e strumentazione costosa, e tutto questo incide pesantemente sui fondi.
Inoltre, l’interpretazione dei dati richiede morfologi esperti, che
comprendano le questioni biologiche di base e i limiti tecnici di ciascun metodo applicato.
Per questi motivi soltanto un numero limitato di laboratori ad oggi è
in grado di assicurare analisi ultrastrutturale e immuno-localizzazione di alto livello qualitativo, e perfino gli istituti di ricerca grandi e
ben equipaggiati, in Italia e all’estero, spesso non hanno accesso ad
efficienti ed affidabili laboratori di elettromicroscopia interni. Per
questo abbiamo chiesto ed ottenuto da Telethon di istituire un servizio Telethon per l’analisi ultrastrutturale e immuno-elettromicroscopia (TeFEM), presso il centro di Ricerca MicroScoBio, Diparti-
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Indice per Patologia
ACONDROGENESI, TIPO 1B
ATROFIA OTTICA DI LEBER
ALBINISMO OCULARE, TIPO I
AUTISMO
CARELLI VALERIO, Abstract n.200
ROSSI ANTONIO, Abstract n.222
CICCONE ROBERTO, Abstract n.141
SCHIAFFINO MARIA VITTORIA, Abstract n.203
AZOOSPERMIA NON OSTRUTTIVA, LEGATA ALL’Y
ALCAPTONURIA
KRAUSZ CSILLA GABRIELLA, Abstract n.221
SANTUCCI ANNALISA, Abstract n.197
BARTTER, SINDROME DI, TIPO 3
ALZHEIMER, MALATTIA DI
CONTE CAMERINO DIANA, Abstract n.86
DI FEDE GIUSEPPE, Abstract n.131
PUSCH MICHAEL, Abstract n.207
AMAUROSI CONGENITA DI LEBER, TIPO 2
BARTTER, SINDROME DI, TIPO 4
SIMONELLI FRANCESCA, Abstract n.201
CONTE CAMERINO DIANA, Abstract n.86
ANCHILOBLEFARON-ANOMALIE ECTODERMICHE-SCHISI
PUSCH MICHAEL, Abstract n.207
LABIO-PALATINA
BECKWITH-WIEDEMANN, SINDROME DI
DI BERNARDO DIEGO, Abstract n.2
RICCIO ANDREA, Abstract n.233
MELINO GENNARO, Abstract n.227
MISSERO CATERINA, Abstract n.228
BLACKFAN - DIAMOND, ANEMIA DI
DIANZANI IRMA, Abstract n.166
ANEMIA DISERITROPOIETICA CONGENITA
IOLASCON ACHILLE, Abstract n.165
BRUGADA, SINDROME DI, TIPO 1
PIERONI MAURIZIO, Abstract n.189
ANGIOEDEMA EREDITARIO
CICARDI MARCO, Abstract n.171
BRUGADA, SINDROME DI, TIPO 2
PIERONI MAURIZIO, Abstract n.189
ATASSIA CEREBELLARE
BRUSCO ALFREDO, Abstract n.118
BRUGADA, SINDROME DI, TIPO 3
PIERONI MAURIZIO, Abstract n.189
ATASSIA SPINOCEREBELLARE AUTOSOMICA RECESSIVA TIPO 1
LIBERI GIORDANO, Abstract n.113
CARDIOMIOPATIA DILATATIVA, TIPO 1A
NIGRO VINCENZO, Abstract n.16
ATASSIA SPINOCEREBELLARE, TIPO 28
CASARI GIORGIO, Abstract n.119
CARDIOMIOPATIA IPERTROFICA FAMILIARE
TARONI FRANCO, Abstract n.120
POGGESI CORRADO, Abstract n.183
ATASSIA TELEANGIECTASIA
CARDIOMIOPATIA VENTRICOLARE DESTRA ARITMOGENA
BARILA’ DANIELA, Abstract n.114
BAUCE BARBARA, Abstract n.185
D’ADDA DI FAGAGNA FABRIZIO, Abstract n.116
RAMPAZZO ALESSANDRA, Abstract n.184
DELIA DOMENICO, Abstract n.117
CARDIOPATIA CONGENITA
FOIANI MARCO, Abstract n.115
BALDINI ANTONIO, Abstract n.3
ATASSIA TELEANGIECTASIA-LIKE
CAROLI, MALATTIA DI
DELIA DOMENICO, Abstract n.117
FABRIS LUCA, Abstract n.210
ATELOSTEOGENESI, TIPO II
CHARCOT-MARIE-TOOTH, MALATTIA DI
ROSSI ANTONIO, Abstract n.222
FERRARIN MAURIZIO, Abstract n.93
PREVITALI STEFANO, Abstract n.89
ATROFIA DENTATO-RUBRO-PALLIDO-LUISIANA
VITA GIUSEPPE, Abstract n.92
FANTO MANOLIS, Abstract n.43
WRABETZ LAWRENCE, Abstract n.88
ATROFIA MUSCOLARE SPINALE
CHARCOT-MARIE-TOOTH, MALATTIA DI, TIPO 1A
BATTAGLIA GIORGIO STEFANO, Abstract n.98
SCHENONE ANGELO, Abstract n.94
CORTI STEFANIA, Abstract n.100
CHARCOT-MARIE-TOOTH, MALATTIA DI, TIPO 2B
SETTE CLAUDIO, Abstract n.99
BUCCI CECILIA, Abstract n.90
ATROFIA MUSCOLARE SPINALE CON DISTRESS
CHARCOT-MARIE-TOOTH, MALATTIA DI, TIPO 4B1
RESPIRATORIO, TIPO 1
BOLINO ALESSANDRA, Abstract n.40
COMI GIACOMO PIETRO, Abstract n.101
CHARCOT MARIE TOOTH, MALATTIA DI, TIPO 4F
ATROFIA MUSCOLARE SPINALE E BULBARE
(NEUROPATIA IPERTROFICA DI DEJERINE SOTTAS)
PENNUTO MARIA, Abstract n.103
FELTRI MARIA LAURA, Abstract n.87
POLETTI ANGELO, Abstract n.102
COENZIMA Q10, DEFICIT DI
SALVIATI LEONARDO, Abstract n.111
ATROFIA OTTICA
CARELLI VALERIO, Abstract n.200
COLESTASI PROGRESSIVA FAMILIARE INTRAEPATICA, TIPO 2
SCORRANO LUCA, Abstract n.52
MOSCHETTA ANTONIO, Abstract n.211
136
136-140 Indice per Patologia-11-ITA.qxd:telethon 355-362IndicePatologII
21-02-2011
15:58
Pagina 137
COLESTASI PROGRESSIVA FAMILIARE INTRAEPATICA, TIPO 3
DISTROFIA MUSCOLARE DEI CINGOLI
CONVULSIONI BENIGNE FAMILIARI INFANTILI
DISTROFIA MUSCOLARE DEI CINGOLI, AUTOSOMICA
MOSCHETTA ANTONIO, Abstract n.211
COMI GIACOMO PIETRO, Abstract n.76
TAGLIALATELA MAURIZIO, Abstract n.122
RECESSIVA, TIPO 2H
MERONI GERMANA, Abstract n.17
CRIGLER-NAJJAR, SINDROME DI
BRUNETTI PIERRI NICOLA, Abstract n.15
DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE
MURO ANDRES FERNANDO, Abstract n.160
BOZZONI IRENE, Abstract n.63
CLEMENTI EMILIO, Abstract n.62
DEFICIT DEL FATTORE H DEL COMPLEMENTO
COSSU GIULIO, Abstract n.66, 67
NORIS MARINA, Abstract n.178
DE BENEDETTI FABRIZIO, Abstract n.61
DEFICIT DI LCAT
DI ROCCO GIULIANA, Abstract n.69
GOMARASCHI MONICA, Abstract n.196
FERLINI ALESSANDRA, Abstract n.64
MATTEI ELISABETTA, Abstract n.65
DEGENERAZIONE MACULARE SENILE, TIPO 1
MERCURI EUGENIO, Abstract n.71
DE FALCO SANDRO, Abstract n.238
MESSINA SONIA, Abstract n.72
DEMENZA FRONTOTEMPORALE
ORLANDO VALERIO, Abstract n.37
DENTI MICHELA ALESSANDRA, Abstract n.132
SANDRI MARCO, Abstract n.35
TORRENTE YVAN, Abstract n.68
DENT, MALATTIA DI, TIPO 1
DE MATTEIS MARIA ANTONIETTA, Abstract n.214
DISTROFIA MUSCOLARE FACIO-SCAPOLO-OMERALE
DEPLEZIONE DEL DNA MITOCONDRIALE, SINDROME DA,
GINELLI ENRICO, Abstract n.74
PUSCH MICHAEL, Abstract n.207
GABELLINI DAVIDE, Abstract n.38
TUPLER ROSSELLA GINEVRA, Abstract n.75
FORMA MIOPATICA
BIANCHI VERA, Abstract n.108
DISTURBO BIPOLARE
MOSTACCIUOLO MARIA LUISA, Abstract n.142
DESMOSTEROLOSI
VANONI MARIA ANTONIETTA, Abstract n.195
ECTRODATTILIA - DISPLASIA ECTODERMICA - LABIO
DIABETE GIOVANILE CON ESORDIO NELLA MATURITÀ, TIPO II
PALATOSCHISI, TIPO 3
MASSA ORNELLA, Abstract n.241
MELINO GENNARO, Abstract n.227
DIABETE, TIPO 1
EMICRANIA EMIPLEGICA FAMILIARE
FALCONE MARIKA MARIA CATERINA, Abstract n.237
NISTRI ANDREA, Abstract n.129
MASIELLO PELLEGRINO, Abstract n.236
PIETROBON DANIELA, Abstract n.128
MATARESE GIUSEPPE, Abstract n.235
EMOCROMATOSI FAMILIARE
DIABETE, TIPO 2
CAMASCHELLA CLARA, Abstract n.161
BEGUINOT FRANCESCO, Abstract n.240
PIETRANGELO ANTONELLO, Abstract n.162
DE FALCO SANDRO, Abstract n.238
FEDERICI MASSIMO, Abstract n.239
EMOFILIA A
BALDINI ANTONIO, Abstract n.3
EMOFILIA B
FOLLENZI ANTONIA, Abstract n.170
DIGEORGE, SINDROME DI
ILLINGWORTH ELIZABETH, Abstract n.45
PINOTTI MIRKO, Abstract n.167
SERINI GUIDO, Abstract n.153
EMOLITICA E UREMICA, SINDROME
DISPLASIA DIASTROFICA
ROSSI ANTONIO, Abstract n.222
DONADELLI ROBERTA, Abstract n.216
ENCEFALOPATIA DA PRIONI
DISPLASIA SPONDILO-EPIMETAFISARIA TARDIVA
WILSON CATHAL, Abstract n.226
CHIESA ROBERTO, Abstract n.44
ENCEFALOPATIA EPILETTICA INFANTILE, 2
DISTROFIA DEL CRISTALLINO DI SCHNYDER
SANTORO MASSIMO, Abstract n.198
LANDSBERGER NICOLETTA, Abstract n.126
EPIDERMOLISI BOLLOSA
DISTROFIA MIOTONICA, TIPO 1
BELLOCCI FULVIO, Abstract n.77
CALAUTTI VINCENZO, Abstract n.55
MAVILIO FULVIO, Abstract n.230
DISTROFIA MUSCOLARE
MAGLIANO LORENZA, Abstract n.73
NIGRO VINCENZO, Abstract n.16
PICCOLO STEFANO, Abstract n.70
PURI PIER LORENZO, Abstract n.36
RECCHIA ALESSANDRA, Abstract n.229
EPILESSIA
BENFENATI FABIO, Abstract n.124
CARMIGNOTO GIORGIO, Abstract n.123
DISTROFIA MUSCOLARE CONGENITA
FELTRI MARIA LAURA, Abstract n.87
PREVITALI STEFANO, Abstract n.89
EPILESSIA IDIOPATICA GENERALIZZATA
CANCEDDA LAURA, Abstract n.125
EPILESSIA LEGATA AL CROMOSOMA X, CON DISTURBI
DISTROFIA MUSCOLARE, CONGENITA, DI ULLRICH
BERNARDI PAOLO, Abstract n.78
MERLINI LUCIANO, Abstract n.79
VARIABILI E DEL COMPORTAMENTO
BENFENATI FABIO, Abstract n.124
137
136-140 Indice per Patologia-11-ITA.qxd:telethon 355-362IndicePatologII
21-02-2011
15:58
EPILESSIA MIOCLONICA INFANTILE GRAVE
ITTIOSI LAMELLARE
ESFOLIAZIONE CUTANEA, SINDROME DA
JOUBERT, SINDROME DI, TIPO 1
Pagina 138
CANDI ELEONORA, Abstract n.231
BACCI ALBERTO, Abstract n.127
BERTINI ENRICO SILVIO, Abstract n.121
CANDI ELEONORA, Abstract n.231
KALLMAN, SINDROME DI
FATTORE VII, DEFICIT DI
MERLO GIORGIO, Abstract n.42
PINOTTI MIRKO, Abstract n.167
KRABBE, MALATTIA DI
FEBBRE PERIODICA FAMILIARE
BIFFI ALESSANDRA, Abstract n.32
MARTINI ALBERTO, Abstract n.234
GRITTI ANGELA, Abstract n.31
FECHTNER, SINDROME DI
LECITINA-COLESTEROLO-ACIL-TRASFERASI, DEFICIT DI
SAVOIA ANNA, Abstract n.172
CALABRESI LAURA, Abstract n.163
FENILCHETONURIA
GOMARASCHI MONICA, Abstract n.196
PASCUCCI TIZIANA, Abstract n.164
LEUCODISTROFIA AUTOSOMICA DOMINANTE
FIBROSI CISTICA
GASPARINI LAURA, Abstract n.139
GALIETTA LUIS J. V., Abstract n.213
LEUCODISTROFIA METACROMATICA
LUINI ALBERTO, Abstract n.9
BIFFI ALESSANDRA, Abstract n.32
STROM ROBERTO, Abstract n.212
GRITTI ANGELA, Abstract n.31
GLICOGENOSI, TIPO 2
NALDINI LUIGI, Abstract n.34
ANDRIA GENEROSO, Abstract n.83
RONCAROLO MARIA GRAZIA, Abstract n.33
PARENTI GIANCARLO, Abstract n.8
LINFOPROLIFERATIVA LEGATA ALL’X, SINDROME
GLOMERULONEFRITE MEMBRANOPROLIFERATIVA LEGATA AL
GRAZIANI ANDREA, Abstract n.179
CROMOSOMA X
LOWE, SINDROME OCULO-CEREBRO-RENALE DI
NORIS MARINA, Abstract n.178
DE MATTEIS MARIA ANTONIETTA, Abstract n.214
GRANULOMATOSI CRONICA
MALATTIA CISTICA DELLA MIDOLLARE RENALE, TIPO 2
DRI PIETRO, Abstract n.177
RAMPOLDI LUCA, Abstract n.53
GRISCELLI, SINDROME DI, TIPO 1
MALATTIA DELLA SOSTANZA BIANCA, AUTOSOMICA
RAGNINI-WILSON ANTONELLA, Abstract n.147
RECESSIVA
HUNTINGTON, MALATTIA DI
MINETTI CARLO, Abstract n.140
DEL SAL GIANNINO, Abstract n.133
MALATTIE DELL’OCCHIO, STUDI DI BASE
HURLER, SINDROME DI
BANFI SANDRO, Abstract n.6
SERAFINI MARTA, Abstract n.50
MALATTIE GENETICHE, STUDI DI BASE
IMMUNODEFICIENZA COMBINATA GRAVE
BALLABIO ANDREA, Abstract n.10
AIUTI ALESSANDRO, Abstract n.18, 19
BIANCHI MARCO E., Abstract n.244
IMMUNOLOGIA, STUDI DI BASE
CAMERINO GIOVANNA, Abstract n.158
FLEISCHHAUER KATHARINA, Abstract n.159
FANELLI FRANCESCA, Abstract n.49
GREGORI SILVIA, Abstract n.30
GASPARINI PAOLO, Abstract n.246
RONCAROLO MARIA GRAZIA, Abstract n.29
NALDINI LUIGI, Abstract n.28
TACCHETTI CARLO, Abstract n.251
INCONTINENTIA PIGMENTI
URSINI MATILDE VALERIA, Abstract n.232
MALATTIE GENETICHE IN GENERALE
ALTRUDA FIORELLA, Abstract n.243
INSONNIA FATALE FAMILIARE
CRESCENZI MARCO, Abstract n.250
FORLONI GIANLUIGI, Abstract n.130
FILOCAMO MIRELLA, Abstract n.242
INSUFFICIENZA OVARICA PRECOCE, TIPO 1
HORENSTEIN ALBERTO LEONARDO, Abstract n.249
TONIOLO DANIELA, Abstract n.220
LEOCANI LETIZIA, Abstract n.245
NIGRO VINCENZO, Abstract n.247
INSUFFICIENZA OVARICA PRECOCE, TIPO 2
PESOLE GRAZIANO, Abstract n.248
TONIOLO DANIELA, Abstract n.220
POLISHCHUK ROMAN, Abstract n.252
IPEROSSALURIA PRIMARIA, TIPO 1
MALATTIE MITOCONDRIALI
VOLTATTORNI CARLA, Abstract n.217
FRONTALI LAURA, Abstract n.107
IPERTERMIA MALIGNA
PINTON PAOLO, Abstract n.109
PROTASI FELICIANO, Abstract n.85
SICILIANO GABRIELE, Abstract n.104
ZORZATO FRANCESCO, Abstract n.84
VERGANI LODOVICA, Abstract n.110
ZEVIANI MASSIMO, Abstract n.105, 106
IPEX
BACCHETTA ROSA, Abstract n.23, 24
MALATTIE NEUROLOGICHE, STUDI DI BASE
GULINO ALBERTO, Abstract n.151
IPODISPLASIA RENALE NON SINDROMICA, TIPO 1
STUDER MICHELE, Abstract n.4, 5
GHIGGERI GIAN MARCO, Abstract n.219
138
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21-02-2011
15:58
Pagina 139
MALATTIE NEUROMUSCOLARI, STUDI DI BASE
NOONAN-SIMILE, SINDROME DI, CON CAPELLI CADUCI IN
CARUSO MAURIZIA, Abstract n.59
TARTAGLIA MARCO, Abstract n.192
FASE ANAGEN
BRUNI PAOLA, Abstract n.57
ELVASSORE NICOLA, Abstract n.60
NORRIE, MALATTIA DI
MINCHIOTTI GABRIELLA, Abstract n.58
GALLI RESTA LUCIA, Abstract n.202
MALFORMAZIONE CAVERNOSA CEREBRALE
OBESITÀ
RETTA SAVERIO FRANCESCO, Abstract n.154
FEDERICI MASSIMO, Abstract n.239
SERINI GUIDO, Abstract n.153
MAFFEI MARGHERITA, Abstract n.56
MARFAN, SINDROME DI
OMENN, SINDROME DI
ARBUSTINI ELOISA, Abstract n.190
VILLA ANNA, Abstract n.22
MASA, SINDROME
ORO-FACIO-DIGITALE, SINDROME
MELDOLESI JACOPO, Abstract n.152
FRANCO BRUNELLA, Abstract n.1
MAY-HEGGLIN, ANOMALIA DI
OSTEOPETROSI, AUTOSOMICA DOMINANTE TIPO 2
SAVOIA ANNA, Abstract n.172
TETI ANNA MARIA, Abstract n.224
MCCUNE-ALBRIGHT, SINDROME DI
OSTEOPETROSI, AUTOSOMICA RECESSIVA, TIPO 1
BIANCO PAOLO, Abstract n.223
TETI ANNA MARIA, Abstract n.224
MCLEOD, SINDROME DI
OSTEOPETROSI, AUTOSOMICA RECESSIVA TIPO 2
DE FRANCESCHI LUCIA, Abstract n.135
SOBACCHI CRISTINA, Abstract n.225
MIOPATIA CONGENITA “CENTRAL CORE”
OSTRUZIONE DEL TRATTO DELL’EFFLUSSO DEL VENTRICOLO
PROTASI FELICIANO, Abstract n.85
SINISTRO
ZORZATO FRANCESCO, Abstract n.84
ZUFFARDI ORSETTA, Abstract n.194
MIOPATIA DI BETHLEM
PARAPLEGIA SPASTICA EREDITARIA, AUTOSOMICA
CECCONI FRANCESCO, Abstract n.80
DOMINANTE
ORLACCHIO ANTONIO, Abstract n.112
MIOPATIA NEMALINICA
BANG MARIE-LOUISE, Abstract n.39
PARAPLEGIA SPASTICA, FAMILIARE
CASARI GIORGIO, Abstract n.119
MIOPATIE CONGENITE
BRUNO CLAUDIO, Abstract n.81
PARKINSON, MALATTIA DI
GUSTINCICH STEFANO, Abstract n.136
MIOPATIE MITOCONDRIALI
VALENTE ENZA MARIA, Abstract n.137
GRASSI BRUNO, Abstract n.82
PARKINSON, MALATTIA DI, FAMILIARE, TIPO 2
MIOTONIA CONGENITA AUTOSOMICA DOMINANTE
GUSTINCICH STEFANO, Abstract n.136
CONTE CAMERINO DIANA, Abstract n.86
PARKINSON, MALATTIA DI, FAMILIARE, TIPO 3
MIOTONIA CONGENITA AUTOSOMICA RECESSIVA
CHIEREGATTI EVELINA, Abstract n.138
CONTE CAMERINO DIANA, Abstract n.86
PARKINSON, MALATTIA DI, FAMILIARE, TIPO 8
MUCKLE-WELLS, SINDROME DI
GUSTINCICH STEFANO, Abstract n.136
GATTORNO MARCO, Abstract n.176
QT LUNGO, SINDROME DA
MUCOPOLISACCARIDOSI TIPO II
SCHWARTZ PETER J, Abstract n.187
COSMA MARIA PIA, Abstract n.14
QT LUNGO, SINDROME DA, TIPO 3
MUCOPOLISACCARIDOSI TIPO VI
CROTTI LIA, Abstract n.188
AURICCHIO ALBERTO, Abstract n.13
RENE POLICISTICO, MALATTIA DEL
NEFROPATIA IPERURICEMICA GIOVANILE FAMILIARE
BOLETTA ALESSANDRA, Abstract n.54
RAMPOLDI LUCA, Abstract n.53
LUPETTI PIETRO, Abstract n.218
NEURODEGENERAZIONE CON ACCUMULO CEREBRALE DI
RETINITE PIGMENTOSA
FERRO, TIPO 3
AURICCHIO ALBERTO, Abstract n.7
AROSIO PAOLO, Abstract n.134
BARSACCHI GIUSEPPINA, Abstract n.205
NEUROPATIA DEMIELINIZZANTE CONGENITA
MARIGO VALERIA, Abstract n.204
TAVEGGIA CARLA, Abstract n.91
RETT, SINDROME DI
NIJMEGEN, SINDROME DA ROTTURE DI
LANDSBERGER NICOLETTA, Abstract n.126
DELIA DOMENICO, Abstract n.117
PIZZORUSSO TOMMASO, Abstract n.150
GATTI MAURIZIO, Abstract n.180
RENIERI ALESSANDRA, Abstract n.149
CESARENI GIANNI, Abstract n.191
RIEGER, SINDROME DI
TONGIORGI ENRICO, Abstract n.148
NOONAN, SINDROME DI
CAMPIONE MARINA MONICA, Abstract n.193
TARTAGLIA MARCO, Abstract n.192
139
136-140 Indice per Patologia-11-ITA.qxd:telethon 355-362IndicePatologII
21-02-2011
15:58
RITARDO MENTALE LEGATO AL CROMOSOMA X
SORDITÀ EREDITARIA
D’ADAMO PATRIZIA, Abstract n.47
MAMMANO FABIO, Abstract n.209
BROCCOLI VANIA, Abstract n.145
Pagina 140
GASPARINI PAOLO, Abstract n.208
DE CURTIS IVAN, Abstract n.146
STARGARDT, MALATTIA DI, TIPO 1
PASSAFARO MARIA PIA, Abstract n.46
FALSINI BENEDETTO, Abstract n.206
SCHISI DELLE MANI E DEI PIEDI, TIPO 3
SULFATASI, DEFICIT MULTIPLO DI
MELINO GENNARO, Abstract n.227
BALLABIO ANDREA, Abstract n.11
SCHISI DELLE MANI E DEI PIEDI, TIPO 4
COSMA MARIA PIA, Abstract n.12
SCHIZOFRENIA, FORME GENETICHE
TACHICARDIA VENTRICOLARE POLIMORFA CATECOLERGICA
DI BERNARDO DIEGO, Abstract n.2
DI BERNARDO DIEGO, Abstract n.2
MOSTACCIUOLO MARIA LUISA, Abstract n.142
PRIORI SILVIA GIULIANA, Abstract n.186
SCLEROSI LATERALE AMIOTROFICA
TALASSEMIA BETA
BONETTO VALENTINA, Abstract n.41
FERRARI GIULIANA, Abstract n.25
CARRI’ MARIA TERESA, Abstract n.97
FLEISCHHAUER KATHARINA, Abstract n.159
DE BIASI SILVIA, Abstract n.95
GAMBARI ROBERTO, Abstract n.169
TORTAROLO MASSIMO, Abstract n.96
MAGGIO AURELIO, Abstract n.168
SCLEROSI LATERALE AMIOTROFICA, GIOVANILE, TIPO 4
TANGIER, MALATTIA DI
SEBASTIAN, SINDROME DI
TERAPIA GENICA, STUDI DI BASE
GOMARASCHI MONICA, Abstract n.196
LIBERI GIORDANO, Abstract n.113
GALLI ALVARO, Abstract n.157
SAVOIA ANNA, Abstract n.172
GIACCA MAURO, Abstract n.156
SHWACHMAN-DIAMOND, SINDROME DI
NALDINI LUIGI, Abstract n.26, 27
BIFFO STEFANO, Abstract n.182
RONCAROLO MARIA GRAZIA, Abstract n.29
SILVER-RUSSEL, SINDROME DI
TROMBOASTENIA DI GLANZMANN E NAEGELI
RICCIO ANDREA, Abstract n.233
GRESELE PAOLO, Abstract n.173
SINDROME AUTOIMMUNE POLIENDOCRINA, TIPO 1
TROMBOCITOPENIA 2
MUSCO GIOVANNA, Abstract n.51
BALDUINI CARLO LUIGI, Abstract n.174
SINDROME AUTOINFIAMMATORIA FAMILIARE DA FREDDO
TUBO NEURALE, ANOMALIE DI CHIUSURA DEL
GATTORNO MARCO, Abstract n.176
CAPRA VALERIA, Abstract n.155
SINDROME CARDIOFACIOCUTANEA
VITREORETINOPATIA ESSUDATIVA, TIPO 1
TARTAGLIA MARCO, Abstract n.192
BONATTI STEFANO, Abstract n.199
SINDROME CINCA
WILLIAMS, SINDROME DI
GATTORNO MARCO, Abstract n.176
CORONA DAVIDE, Abstract n.48
SINDROME LEOPARD 1
WISKOTT-ALDRICH, SINDROME DI
TARTAGLIA MARCO, Abstract n.192
BENVENUTI FEDERICA, Abstract n.175
NALDINI LUIGI, Abstract n.34
SINDROME VELO-CARDIO-FACCIALE
RONCAROLO MARIA GRAZIA, Abstract n.21
SERINI GUIDO, Abstract n.153
VILLA ANNA, Abstract n.20
SINDROME WHIM
X FRAGILE, SINDROME DA
VIOLA ANTONELLA, Abstract n.181
CATANIA MARIA VINCENZA, Abstract n.143
NERI GIOVANNI, Abstract n.144
140
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