Rivista Italiana di Genetica e Immunologia Pediatrica - Italian Journal of Genetic and Pediatric Immunology
Anno III numero 3 - luglio 2011 | direttore scientifico: Carmelo Salpietro - direttore responsabile: Giuseppe Micali
L'evoluzione della genetica e dell'U.O.C. di Genetica ed Immunologia Pediatrica dell'Università
di Messina
The evolution of genetics and U.O.C. Pediatric Genetics and Immunology, University of
Messina
Silvana Briuglia, Piera Vicchio, Caterina Cuppari, Valeria Ferraù, Carmelo Salpietro
UOC Genetica ed Immunologia Pediatrica, Dipartimento Scianze Pediatriche Mediche e Chirurgiche, AOU Policlinico Universitario Messina
La scienza “dell’eredità e della variazione”. E’ questa la prima definizione di
genetica, utilizzata per la prima volta nel 1906 da William Bateson, nel corso di una
conferenza sull’ibridazione tenutasi alla Royal Horticultural Society di Londra.
Nei primi del Novecento gli studi di genetica hanno permesso di stabilire che la
trasmissione di caratteri familiari è controllata da unità chiamate geni e che le
diverse forme di un carattere sono dovute a forme alternative dei geni che chiamate
alleli. Nello stesso periodo sono stati introdotti i concetti di omozigoti ed eterozigoti
rispetto ad un carattere.
Questi concetti, divenuti poi dei fondamentali della eredità e della variazione, hanno
permesso quella travolgente evoluzione che la genetica, come scienza, conoscerà
dai primi del Novecento ai giorni nostri.
Nel primo decennio del Novecento il susseguirsi delle scoperte biologiche porta
all’individuazione di strutture intracellulari dette “cromosomi” che vengono
successivamente candidati ad essere i depositari di quei “fattori mendeliani”, i geni.
La definizione di gene arriva nel 1909, ad opera di Vilhelm Johannsen (Fig. 1), “la
particella che possiede le proprietà mendeliane di segregazione e di
ricombinazione”.
Figura 1 Vilhelm Johannsen
Da questo momento e fino agli anni ‘30 e ‘40, la genetica svilupperà quelle basi
fondamentali che verranno, in parte, confermate dalla citogenetica prima e dalla
genetica molecolare poi. Fino al 1952 la citogenetica, ovvero l’osservazione al
microscopio di struttura, proprietà biochimiche, organizzazione, funzionamento ed
evoluzione del materiale ereditario, si avvaleva di tecniche di coltura cellulare che
non permettevano una separazione sufficiente dei cromosomi.
Nel 1956 ha inizio la citogenetica moderna. In quell'anno, infatti, Tjio e Levan
riescono a determinare il numero dei cromosomi umani, ovverosia 46 cromosomi (22
coppie identiche più 2 cromosomi sessuali). Inizia, così, il periodo della ricerca delle
anomalie cromosomiche di numero, in cui i citogenetisti rivolsero la loro attenzione ai
pazienti che presentavano anomalie congenite. Lejeune e collaboratori scoprono, nel
1959, che i pazienti affetti dalla sindrome descritta da Down possiedono 47
cromosomi, invece di 46.
Alla fine degli anni ‘60 inizia una nuova grande rivoluzione, la cosiddetta era del
bandeggio.
Questo metodo consente di produrre bande orizzontali di differente intensità di
colorazione su tutti i cromosomi del corredo, per ottenere così una facile
identificazione e un preciso accoppiamento tra cromosomi omologhi.
La prima definizione di cariotipo (Fig.2), fatta utilizzando criteri di lunghezza del
cromosoma e di posizione del centromero, fu formulata alla Conferenza di Denver
nel 1960; ma è solo nel 1966, alla conferenza di Chicago, che i cromosomi sono
raggruppati in sette gruppi, nominati con le lettere maiuscole da A a G.
Vengono messe a punto, nel corso di quegli anni, tecniche di bandeggio sempre più
raffinate.
Figura 2 Cariotipo
Le possibilità diagnostiche per la genetica aumentano con gli anni
Nel 1968 viene mappato il primo locus cromosomico mediante studi di linkage ad
opera di Donahue, il gene del gruppo sanguigno.
Il concetto di linkage (associazione) era già noto dal 1906, quando Bateson e
Punnett scoprono che geni associati sullo stesso cromosoma non segregano
indipendentemente
ma
insieme;
un’importante
eccezione
alla
legge
dell’assortimento indipendente di Mendel.
L’analisi di linkage permette di determinare la posizione cromosomica di un locus
responsabile di una determinata malattia/carattere genetico rispetto a marcatori
polimorfici la cui localizzazione è nota. Inoltre per mezzo dell’analisi di linkage si
possono avere informazioni sull’ordine lineare e la distanza dei geni sullo stesso
cromosoma. Solitamente vengono studiati geni che, se mutati, sono responsabili di
un fenotipo patologico.
L’analisi di concatenazione nell’uomo si basa sullo studio degli alberi genealogici e
sulla ricerca delle meiosi informative (quando si può identificare se il gamete è o
meno ricombinante).
Gli anni 1953 e 1957 costituiscono la vera rivoluzione della genetica molecolare,
con James Watson e Francis Crick (Fig. 3), che presentano sulla rivista Nature,
quello che oggi è accertato come il primo modello della struttura del DNA, quello
della doppia elica.
Nel 1957 Crick propose il dogma centrale della biologia molecolare, secondo il
quale l'informazione genetica parte dagli acidi nucleici per arrivare alle proteine,
seguendo questa direzione.
Figura 3 Watson e Crick
Nel 1992 si verifica la seconda rivoluzione della citogenetica, che diventa
molecolare, con l’avvento dell’ibridazione in situ con sostanze fluorescenti (FISH)
(Fig. 4), ad opera di Lichter. Questa tecnica consiste nel mettere a contatto acidi
nucleici a singolo filamento provenienti da due fonti differenti: una sonda marcata di
acido nucleico e un DNA bersaglio non marcato. In questo modo è possibile la
localizzazione di una specifica sequenza di acido nucleico su preparati fissati di
cromosomi metafasici, di nuclei interfasici o di sezioni di tessuto con l'utilizzo di una
sonda, rappresentata dal tratto di DNA complementare al tratto cromosomico che si
vuole evidenziare.
Figura 4 FISH
La possibilità di utilizzo su larga scala di tecniche diagnostiche raffinate e precise,
ha portato ad una conoscenza sempre più approfondita, dal punto eziopatogenetico
oltre che clinico delle malattie genetiche, con la possibilità di effettuare diagnosi
sempre più corrette e correlazioni tra genotipo e fenotipo sempre più accurate. Nella
pratica clinica, la possibilità di accesso a tali tecniche diagnostiche, è diventata
effettiva negli anni ’90, epoca in cui la rivoluzione diagnostica in genetica è arrivata
sul territorio nazionale.
La U.O.C. di Genetica e Immunologia Pediatrica dell’A.O.U. “G. Martino” di Messina
ha seguito negli anni la vertiginosa evoluzione della genetica e delle sue tecniche.
Dall’inizio degli anni 2000 la diagnosi delle malattie genetiche rare, nell’area dello
Stretto, è stata possibile mediante la creazione di laboratori dove si effettuano
quotidianamente indagini di citogenetica e di genetica molecolare. Il risultato è la
possibilità di offrire una diagnosi a pazienti con patologia cromosomica e genica,
evitandone, in molti casi, i pellegrinaggi sanitari. La possibilità di effettuare il
cariotipo ha permesso di poter fare diagnosi di alterazioni numeriche dei cromosomi
(Sindrome di Down, trisomia 13 e 18, sindrome di Turner, Sindrome di Klinefelter
ecc.) (Figg 5, 6) o di delezioni cromosomiche (Sindrome di Wolf-Hirschhorn,
Sindrome du cri du chat, ecc.) (Figg 7, 8).
Figura 5 Sindrome di Down - trisomia 21
Figura 6 Sindrome di Klinefelter – 47, XXY
Figura 9 Cariotipo e FISH
Talvolta le risposte diagnostiche ai pazienti sono state affiancate da scoperte in
campo genetico e immunologico. Le analisi di linkage condotte su una grande
famiglia dell’entroterra messinese, ad esempio, hanno permesso di associare un tipo
di candidiasi muco cutanea cronica familiare (CMC) ad un deficit di molecole
intercellulari di adesione – 1 (ICAM-1) [1] e di trovarne il locus [2], a livello della
regione 11p12–q12.1 (1, 2). (Fig. 10).
Figura 10 Analisi di linkage. CMC
Contestualmente all’evoluzione della citogenetica molecolare vengono creati i
microarray, sonde di DNA attaccate ad una superficie solida (vetro, plastica, o chip di
silicio). Tali array vengono usati per analizzare il profilo d’espressione di un gene o
per identificare la presenza di un gene o di una breve sequenza all'interno di una
miscela del patrimonio genetico di un organismo. La Comparative Genomic
Hybridation array (Fig. 5) consente di valutare contemporaneamente e con alta
specificità più regioni cromosomiche, in modo da poter evidenziare sbilanciamenti
cromosomici. Con questa metodica si analizza la presenza di variazioni
submicroscopiche nel patrimonio genetico e si effettua un mappaggio simultaneo ad
alta risoluzione di queste variazioni nella sequenza genomica. Migliora, pertanto, la
rilevazione di piccole anomalie cromosomiche, avendo un livello di risoluzione oltre
quello del microscopio ottico (5-10 Mb) e permettendo l’analisi molecolare di tutto il
genoma.
Figura 7 Sindrome di Wolf- Hirschhorn. Delezione braccio corto cromosoma 4
Figura 8 Sindrome 5p
La stretta collaborazione con altri centri italiani, in particolare con l’Istituto Mendel di
Roma, anche grazie al progetto REGEM (REte GEnetica Messina), ha permesso di
poter usufruire di indagini più complete, quali la FISH, di formulare diagnosi più
precise e, in definitiva di offrire una consulenza genetica adeguata. La FISH ci ha
permesso di capire, ad esempio, il perché della presenza, nell’ambito di sindromi
genetiche note, di condizioni associate. È questo il caso della coesistenza, in una
paziente con delezione cromosomica 18q-, di un deficit di IgA legato proprio alle
dimensioni della delezione che coinvolgeva il locus 18q22.3-q23, regione dove
mappano i geni di questa classe di immunoglobuline. Un altro nostro caso in cui la
FISH è stata dirimente, è quello di un soggetto di sesso maschile ma con cariotipo
46, XX. In questo caso peculiare la FISH è riuscita, ancora una volta, a fornirci la
risposta, ovvero la presenza del gene SRY (Sex Determining Region, Yp11.3)
traslocato sul cromosoma X (Fig. 9).
Figura 11 Array-CGH
Negli ultimissimi anni è diventato possibile effettuare l’exome sequencing. Si tratta
di una strategia diagnostica che permette di ottenere la sequenza delle regioni
codificanti dell’intero genoma umano, al fine di identificare nuovi geni associati a
malattie rare o patologie comuni. Questa indagine è però ancora effettuata solo in
pochi laboratori al mondo.
La possibilità di effettuare e di usufruire delle tecniche di diagnosi più moderne ha
prodotto anche un altro effetto positivo: la riduzione dei pellegrinaggi sanitari. Come
il caso di chi, a 8 anni ha già ricevuto una decina di diagnosi nel suo peregrinare e
che, solo grazie all’ausilio e all’impiego di analisi moderne, è stato possibile giungere
alla diagnosi di sindrome di Chudley-Lowry, una malattia X-linked recessiva,
caratterizzata da: ritardo mentale, dimorfismi facciali, bassa statura, obesità e
ipogonadismo. Nonostante le possibilità di diagnosi in genetica, negli anni ’90,
diventassero sempre più precise, molti casi di ritardo mentale rimanevano senza una
spiegazione e senza la possibilità di poter offrire a questi pazienti un follow-up
adeguato o una consulenza genetica completa. In questo senso, la scoperta dei
riarrangiamenti telomerici ha dato una svolta allo studio del ritardo mentale e delle
sue cause genetiche. Le regioni subtelometiche sono regioni ricche di geni,
pseudogeni e sequenze ripetute che facilitano l’appaiamento anomalo alla meiosi. I
riarrangiamenti più comuni si localizzano in 1p, 22q, Xq e nel 50% dei casi si
verificano de novo. Anche in una nostra paziente affetta da ritardo mentale e
dismorfismi facciali, grazie all’impiego ancora una volta della FISH, si è riusciti a
dimostrare una delezione della regione subtelomerica del braccio lungo del
cromosoma 18 ed una duplicazione della regione subtelomerica del braccio corto del
cromosoma 9, da malsegregazione di traslocazione bilanciata materna (9:18)
(pter;qter).
Infine la collaborazione internazionale, espressa anche in termini di ricerca, si è
concretizzata ad esempio, nella descrizione prima clinica [3] poi molecolare [4], di
sindromi rarissime quali la sindrome di Nablus. In particolare, nel 2003, il nostro
gruppo ha descritto il secondo caso al mondo di sindrome di Nablus (Fig. 12),
caratterizzata fenotipicamente da: ipertelorismo, blefarofimosi bilaterale, sopracciglia
rade, sottili, arcuate ed altri dimorfismi (3).
Figura 12 Paziente con sindrome di Nablus
L’impiego della CGH-array in due dei tre pazienti al mondo con sindrome di Nablus,
tra cui il nostro caso, ha permesso l’individuazione di una delezione a livello del
cromosoma 8 al locus q22.3q22.1 (Fig. 10); la diagnosi è poi stata confermata con la
citogenetica molecolare (FISH) (4). Tale delezione era assente nei genitori. La
collaborazione con l’Università di Standford ha permesso di confrontare il genoma di
2 dei 3 casi di sindrome di Nablus descritti al mondo, delezione che è stata
successivamente riscontrata in un paziente americano, terzo caso individuato della
sindrome (Shieh JT et al., 2006).
Figura 13 CGH-array. Del 8q22.3q22.1
La CGH-array ha reso possibile l’individuazione di alterazioni genomiche sempre
più “piccole”, ma capaci di dare vita a fenotipi particolari, come ad esempio 3 casi di
microdelezioni a carico, rispettivamente del braccio lungo del cromosoma 1, 11 e del
braccio corto del cromosoma 6, tutte associate a specifici quadri dismorfologici. La
CGH-array e la successiva conferma con la FISH, hanno permesso di fare diagnosi
di sindrome di Smith- Magenis (Microdelezione interstiziale in 17p11.2) in un
paziente con ritardo mentale, disturbi del linguaggio, criptorchidismo, brachidattilia e
altri segni dismorfici.
E’ evidente quindi come allo stato attuale, la corsa all’evoluzione iniziata dalla
genetica come scienza, appena un secolo fa, ha già prodotto risultati importanti sia
in termini di conoscenza delle basi eziopatogenetiche di molte patologie genetiche
rare, che in termini di possibilità diagnostiche. Avere a disposizione tecniche capaci
di dare risposte precise e affidabili diventa cruciale nell’evoluzione della genetica.
Bibliografia
1) Familial Chronic Nail Candidiasis with ICAM-1 deficiency: a new form of Chronic
Mucocutaneous Candidiasis . Zuccarello D, Salpietro DC, Gangemi S, Toscano V,
Merlino MV, Briuglia S, Bisignano G, Mangino M, Mingarelli R, Dallapiccola B J
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2) A gene for familial isolated chronic nail candidiasis (CMC) maps to chromosome
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MV, Briuglia S, Bisignano G, Mingarelli R, Dallapiccola B. European Journal of
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3) Confirmation of NablusMask-like Facial Syndrome. CD Salpietro, S Briuglia, MV
Merlino, L Rigoli, B DallapiccolaAm J Med Genet, 2003
4) Nablus mask-like facial syndrome is caused by a microdeletion of 8q detected by
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Manning MA, Cherry AM, Brumblay J, Salpietro CD, Bernardini L, Dallapiccola B,
Hoyme HE. Am J Med Genet A. 2006 Jun 15;140 (12):1267-73.
Trimestrale di divulgazione scientifica dell'Associazione Pediatrica di Immunologia e Genetica
Legge 7 marzo 2001, n. 62 - Registro della Stampa Tribunale di Messina n. 3/09 - 11 maggio 2009
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