RICOSTRUZIONE 3D DI AGGREGATI PROTEICI DA PROIEZIONI CASUALI TEM:
USO DI DUE MICROGRAFIE A DIVERSO ANGOLO
S. Lanzavecchia*, P. L. Bellon*, G. Tognon§ e A. Ghiretti Magaldi§
*Dipartimento di Chimica Strutturale, via G. Venezian 21, 20133 Milano §Dipartimento di Biologia, via Trieste
75, 35121 Padova
La struttura quaternaria di grandi molecole proteiche può essere studiata in 3D a partire da proiezioni
ottenute al TEM lungo direzioni casuali. Le tecniche più moderne comportano l’osservazione di un grande
numero di molecole prive di colorante, immerse in ghiaccio amorfo e mantenute a temperature molto basse. La
dose di elettroni è ridotta in modo da limitare i danni dovuti alla radiazione. Nonostante il rapporto S/R delle
immagini sia basso ed il contrasto appena percettibile, a partire da proiezioni siffatte è possibile ottenere
ricostruzioni con risoluzione ≤ 1nm, prossime a quelle ottenibili nei più accurati studi TEM su cristalli 2D
(DeRosier, Nature, 386: 26, 1997).
Note le orientazioni delle proiezioni, è relativamente semplice ricostruire la struttura 3D, ad esempio
mediante algoritmi di retro-proiezione. Il problema fondamentale consiste nell’assegnare alle proiezioni la
corretta orientazione. La sua soluzione si basa sullo studio delle 'linee comunì fra i sinogrammi delle proiezioni
(van Heel, Ultramicroscopy, 21: 111, 1987) o sul confronto con le proiezioni di un modello. La tecnica delle
linee comuni risente molto del rumore e necessita l'uso di pesanti pre-elaborazioni con analisi statistica.
La tecnica da noi sviluppata si basa su una doppia ripresa del campo immagine con due inclinazioni del
portacampioni. Ogni molecola fornisce una coppia di proiezioni con relazione nota fra gli angoli di vista. La
ricerca delle linee comuni fra sinogrammi avviene esaminando due coppie di proiezioni ed individuando quattro
linee comuni per volta, che devono soddisfare alcuni requisiti geometrici. Un algoritmo quasi Booleano di
ricerca permette di effettuare l'allineamento in modo rapido, anche in presenza di rumore. La metodologia
consente di stabilire ab-initio la corretta chiralità della molecola.
La tecnica é stata sperimentata su campioni di emoglobina extracellulare di un Anellide marino (Sabella
spallanzani), una proteina con peso molecolare di 3.3 Mda. costituita da circa 200 catene globiniche. La proteina
é stata osservata al TEM in ghiaccio vetrificato a -180° ed a 38K ingrandimenti. Sono state ottenute coppie di
immagini a ±23° di inclinazione. Le immagine sono state digitalizzate tramite microdensitometro ed elaborate
con una libraria di calcolo sviluppata dagli autori. Sono state raccolte circa 400 coppie di proiezioni di
emoglobina che sono state allineate rispetto ad una o più coppie prese come riferimento. Una volta determinati
gli angoli di proiezione, la molecola é stata ricostruita in 3D tramite retro-proiezione pesata. Le ricostruzioni
preliminari ottenute assumendo di volta in volta differenti coppie come riferimento sono state allineate e mediate
per innalzare il rapporto S/R. Il modello risultante, cui è stata imposta la simmetria D6, é stato usato per
allineare 1600 immagini provenienti da prime esposizioni. Dopo alcuni cicli di affinamento é stata ottenuta una
ricostruzione a circa 2.5 nm di risoluzione. I dati mostrano un perfetto accordo con le ricostruzioni ottenute da
altri autori per l'emoglobina di Anellidi differenti.
