RICOSTRUZIONE 3D DI AGGREGATI PROTEICI DA PROIEZIONI CASUALI TEM: USO DI DUE MICROGRAFIE A DIVERSO ANGOLO S. Lanzavecchia*, P. L. Bellon*, G. Tognon§ e A. Ghiretti Magaldi§ *Dipartimento di Chimica Strutturale, via G. Venezian 21, 20133 Milano §Dipartimento di Biologia, via Trieste 75, 35121 Padova La struttura quaternaria di grandi molecole proteiche può essere studiata in 3D a partire da proiezioni ottenute al TEM lungo direzioni casuali. Le tecniche più moderne comportano l’osservazione di un grande numero di molecole prive di colorante, immerse in ghiaccio amorfo e mantenute a temperature molto basse. La dose di elettroni è ridotta in modo da limitare i danni dovuti alla radiazione. Nonostante il rapporto S/R delle immagini sia basso ed il contrasto appena percettibile, a partire da proiezioni siffatte è possibile ottenere ricostruzioni con risoluzione ≤ 1nm, prossime a quelle ottenibili nei più accurati studi TEM su cristalli 2D (DeRosier, Nature, 386: 26, 1997). Note le orientazioni delle proiezioni, è relativamente semplice ricostruire la struttura 3D, ad esempio mediante algoritmi di retro-proiezione. Il problema fondamentale consiste nell’assegnare alle proiezioni la corretta orientazione. La sua soluzione si basa sullo studio delle 'linee comunì fra i sinogrammi delle proiezioni (van Heel, Ultramicroscopy, 21: 111, 1987) o sul confronto con le proiezioni di un modello. La tecnica delle linee comuni risente molto del rumore e necessita l'uso di pesanti pre-elaborazioni con analisi statistica. La tecnica da noi sviluppata si basa su una doppia ripresa del campo immagine con due inclinazioni del portacampioni. Ogni molecola fornisce una coppia di proiezioni con relazione nota fra gli angoli di vista. La ricerca delle linee comuni fra sinogrammi avviene esaminando due coppie di proiezioni ed individuando quattro linee comuni per volta, che devono soddisfare alcuni requisiti geometrici. Un algoritmo quasi Booleano di ricerca permette di effettuare l'allineamento in modo rapido, anche in presenza di rumore. La metodologia consente di stabilire ab-initio la corretta chiralità della molecola. La tecnica é stata sperimentata su campioni di emoglobina extracellulare di un Anellide marino (Sabella spallanzani), una proteina con peso molecolare di 3.3 Mda. costituita da circa 200 catene globiniche. La proteina é stata osservata al TEM in ghiaccio vetrificato a -180° ed a 38K ingrandimenti. Sono state ottenute coppie di immagini a ±23° di inclinazione. Le immagine sono state digitalizzate tramite microdensitometro ed elaborate con una libraria di calcolo sviluppata dagli autori. Sono state raccolte circa 400 coppie di proiezioni di emoglobina che sono state allineate rispetto ad una o più coppie prese come riferimento. Una volta determinati gli angoli di proiezione, la molecola é stata ricostruita in 3D tramite retro-proiezione pesata. Le ricostruzioni preliminari ottenute assumendo di volta in volta differenti coppie come riferimento sono state allineate e mediate per innalzare il rapporto S/R. Il modello risultante, cui è stata imposta la simmetria D6, é stato usato per allineare 1600 immagini provenienti da prime esposizioni. Dopo alcuni cicli di affinamento é stata ottenuta una ricostruzione a circa 2.5 nm di risoluzione. I dati mostrano un perfetto accordo con le ricostruzioni ottenute da altri autori per l'emoglobina di Anellidi differenti.