1 LA BIOLOGIA MOLECOLARE APPLICATA ALLA VALUTAZIONE

LA BIOLOGIA MOLECOLARE APPLICATA ALLA
VALUTAZIONE DI STABILITÀ DEGLI ALBERI
Giovanni Nicolotti e Paolo Gonthier
Università degli Studi di Torino
Dipartimento di Valorizzazione e Protezione delle Risorse Agroforestali
Flormart
Padova 16 Febbraio 2007
1
Perenniporia fraxinea
Ganoderma resinaceum
Inonotus hispidus
2
Valutazione della
stabilità
stabilità delle
piante in piedi
Metodi di
identificazione
Identificazione
precoce dell’
dell’agente
di carie coinvolto
Tecniche molecolari
•Analisi caratteri macro e micromorfologici dei basidiomi (Bernicchia 2005)
Non sempre possibile, identificazione tardiva
•Analisi colture miceliari (Nobles 1965; Stalpers 1978)
Isolamento in purezza
Variabilità morfo-fisiologica
Distinzione taxa vicini
•Tecniche immunologiche e biochimiche (Jellison and Jasalavich 2000; Clausen 2003)
Isolamento in purezza
Estrattivi del legno inibitori ELISA
3
Valutazione della
stabilità
stabilità delle
piante in piedi
Metodi di
identificazione
Identificazione
precoce dell’
dell’agente
di carie coinvolto
Tecniche molecolari
Specificità
Sensibilità
Semplicità
Introduzione
Taxon specific priming multiplexmultiplex-PCR
applicata ad estratti di DNA da legno
• Impiego primer taxon-specifici disegnati su porzioni di rDNA per
l’identificazione di basidiomiceti
(Utomo and Niepold 2000; Moreth and Schmidt 2001; Sicoli et al. 2003; Suhara et al. 2005)
• Estrazione DNA fungino direttamente da legno (Bahnweg et al. 1998)
• Messa a punto di multiplex-PCR: impiego simultaneamente di più
primer in una stessa reazione-presenza di più microrganismi da matrici
ambientali
(Elnifro 2000; Corbiere Morot- Bizot 2004)
4
Taxa selezionati
•Armillaria spp. (Agaricales, Marasmiaceae)
•Ganoderma spp. (Polyporales, Ganodermataceae)
3 gruppi
•Hericium spp. (Russulales, Hericiaceae)
•Inonotus/Phellinus spp. (Hymenochaetales, Hymenochaetaceae)
•Laetiporus spp.(Polyporales, Polyporaceae)
6 gruppi
(Wagner and Fischer
2002)
•Perenniporia fraxinea (Polyporales, Polyporaceae)
•Pleurotus spp. (Agaricales, Pleurotaceae)
•Schizophyllum spp. (Agaricales, Schizophyllaceae)
•Stereum spp. (Russulales, Stereaceae)
•Trametes spp. (Polyporales, Polyporaceae)
Fasi della messa a punto
4. Primer disegnati per le multiplexmultiplex-PCR
Primer
name
Nucleotide sequence (5'-3')
Armi2R
AAACCCCCATAATCCAATCC
Tm1 Location
56°C
ITS II
Gano2R TATAGAGTTTGTGATAAACGCA 55°C
ITS I
Heri2R
CAGCCCTTGTCCGGCAGT
61°C nuc-LSU
Hyme2R
TGCDCCCCCTYGCGGAG
60°C –
nuc-LSU
64°C
HypoR
GCTACGCTTAGGGGATGCTA
LaetR
CCGAGCAAACGAATGCAA
PerR
ATCTGCAAAGACCGGTAAGGT
Pleu2R
AACCAGGAAGTACGCCTCAC
60°C nuc-LSU
Schi2R
CTCCAGCAGACCTCCACTTC
63°C
ITS II
Ste2R
GTCGCAACAAGACGCACTAA
58°C
ITS II
TraR
60°C
ITS II
54°C nuc-LSU
60°C
TTCATAGTCTTATGGAAACCGC 58°C
ITS II
mt-SSU
Use in taxon
specific PCR
Reverse primer
with the forward ITS3
Reverse primer
with the forward ITS1f
Reverse primer
with the forward 25sF
Reverse primer
with the forward F115
Reverse primer
with the forward ITS3
Reverse primer
with the forward 25sF
Reverse primer
with the forward ITS3
Reverse primer
with the forward 25sF
Reverse primer
with the forward ITS3
Reverse primer
with the forward ITS3
Reverse primer
with the forward MS1
25sF
TGGCGAGAGACCGATAGC
58°C nuc-LSU
Forward primer
F115
TAAGCGACCCGTCTTGAAAC
58°C nuc-LSU
Forward primer
PCR
product
size (bp)
Identified taxon
185
Armillaria spp.
226228
Ganoderma spp.
200
Hericium spp.
111
Inonotus spp.;
Phellinus spp.
219
Hypoxylon sp.
146
Laetiporus spp.
152
P. fraxinea.
158
Pleurotus spp.
191
Schizophyllum spp.
234240
Stereum spp.
220
Trametes spp.
5
Fasi della messa a punto
4. Disegno Primer da usare in multiplexmultiplex-PCR
Inonotus spp./Phellinus spp.
Primer
name
Nucleotide sequence (5'-3')
PCR
Use in taxon specific
product
PCR
size (bp)
Reverse primer with
nuc-LSU
258bp
the forward 25sF*
Tm1 GC% Location
FomR CCCAGCCCATGTATACAATAG
60
48
FuscR
58
61
nuc-LSU
IdryaR ACCGACGCATACAACAAAGG
58
50
nuc-LSU
InocuR
CCTCAGTCCCCGACGGT
60
71
nuc-LSU
InssR
GGCGCTACATTCCCTCTG
58
61
nuc-LSU
PhssR
GATGTTGACCCGTCCGAC
58
61
nuc-LSU
CACACTCCGAAGAGTGCC
Reverse primer with
the forward 25sF
Reverse primer with
the forward 25sF
Reverse primer with
the forward 25sF
Reverse primer with
the forward 25sF
Reverse primer with
the forward 25sF
Identified
taxon
Fomitiporia
225bp
Fuscoporia
254bp
Pseudoinonotus
265bp
Inocutis
214bp
Inonotus s.s.
173bp
Phellinus s.s.
Ganoderma spp.
Primer
name
Nucleotide sequence (5'-3')
GaR
CAGGCAACAAGTGCGCTC
58
61%
ITS1
GlR
TTCACGAAGCCCCGCAAG
58
61%
ITS1
GrR
AAGAGCCCGCTTCACAACG
60
58%
ITS1
Tm1 GC% Location
Use in taxon
PCR
Identified
taxa
specific PCR
product size
G. australe
Reverse primer with
218bp
G.applanatum
the forward ITS1f
Reverse primer with
G. lucidum
202 bp
the forward ITS1f
G. resinaceum
Reverse primer with
185 bp
G.pfeifferi
the forward ITS1f
Fasi della messa a punto
1. Scelta delle regioni del rDNA per disegno dei primer
2. Disegno Primer da usare in multiplexmultiplex-PCR
3. Valutazione efficienza e specificità
specificità Primer in PCR
4. Sensibilità
Sensibilità Taxon specific Primer multiplexmultiplex-PCR
Simulazione estrazione di DNA fungino da legno
6
Fasi della messa a punto
7. Sensibilità
Sensibilità Taxon specific Primer multiplexmultiplex-PCR
M1
M2
M 1P 2P 3P 4P 5P 1Q 2Q 3Q 4Q 5Q C+ M
M 1P 2P 3P 4P 5P 1Q 2Q 3Q 4Q 5Q C+ M
1P= 1 ng fungal DNA in wood DNA extract
solution of P. hybrida
2P= 0.1 ng fungal DNA in wood DNA extract
solution of P. hybrida
3P= 10 pg fungal DNA in wood DNA extract
solution from P. hybrida
4P= 1 pg fungal DNA in wood DNA extract
solution from P. hybrida
Species and related isolate used
G. resinaceum-FGR1
0.1 pg
M1
P. tuberculosus-FPT1
1pg
1pg
I. hispidus-FIH2
1pg
1pg
5P= 0.1 pg fungal DNA in wood DNA extract
solution from P. hybrida
1Q= 1 ng fungal DNA in wood DNA extract
solution from Q. kellogii
2Q= 0.1 ng fungal DNA in wood DNA extract
solution from Q. kellogii
M2
3Q= 10 pg fungal DNA in wood DNA extract
solution from Q. kellogii
4Q= 1 pg fungal DNA in wood DNA extract
solution from Q. kellogii
5Q= 0.1 pg fungal DNA in wood DNA extract
solution from Q. kellogii
DNA am ount
threshold 1
Q. agrifolia P. hybrida
PCR protocol
tested
M3
C+= 1ng fungal DNA
C-= no DNA
Hypoxylon sp. specific PCR
0.01 pg
H. flagellum-654
0.1 pg
0.01 pg
P. ostreatus-2470
0.1 pg
0.1 pg
L. sulphureus-FLS2
0.1 pg
0.1 pg
Armillaria sp.-T4D
1pg
1pg
S. hirsutum-DP49
0.1 pg
0.1 pg
T. versicolor-2473
1 pg
1 pg
S. commune-DP61
0.1 pg
0.1 pg
0.1pg
P. fraxinea-FPF5
0.1pg
U. deusta-108703
0.1pg
0.1pg
Hypoxylon sp.-P1
0.1 pg
0.1 pg
Descrizione del metodo
Prelievo
Carota o tassello di legno
Estrazione DNA
M1
7
Descrizione del metodo
M1
Nuc-rDNA
18 S
ITS1
ITS1F
ITS2
5.8 S
ITS4
Gano2R
Fungi
25 S
F115 Hyme2R
600-800bp
Ganoderma spp.
M 1
228bp
M
Inonotus/
Phellinus spp.
1
2
3
111 bp
1000
1.
Trametes versicolor
2.
Phellinus punctatus
3.
Ganoderma
resinaceum
L. DNA ladder 100 bp
IT S
500
228
200
111
Descrizione del metodo
Prelievo
Carota o tassello di legno
Estrazione DNA
•Estrazione non efficiente
Inonotus/
Ganoderma spp.
Phellinus spp.
111 bp
228 bp
700 bp
M1
-
Nessun fungo presente
M3
M2
8
Descrizione del metodo
M2
Nuc-rDNA
ITS2
5.8 S
ITS3
M
25 S
Armi2R
25sF
185bp
Armillaria spp.
Laetiporus spp.
Pleurotus spp.
M 2
Hericium spp.
1
2
3
4
LaetR
Heri2R
Pleu2R
146bp
158bp
200bp
1 0 0 0
1.
Armillaria mellea
2.
Laetiporus sulphureus
3.
Pleurotus ostreatus
5 0 0
2
1
1
1
2 0 0
0
8
5
4
0
5
8
6
4.
Hericium flagellum
L.
DNA ladder 100 bp
1 0 0
Descrizione del metodo
M3
Nuc-rDNA
ITS2
5.8 S
ITS3
PereR
25 S
M3
Ste2R
M
Schi2R
P. fraxinea
1 2 3 4
152bp
Schizophyllum spp.
Stereum spp.
1000
190bp
240bp
500
Mt-rDNA
ssu
MS1
Trametes spp.
200
TraR
220bp
1.
S. hirsutum
2.
T. versicolor
3.
S. commune
4.
P. fraxinea
234
220
190
152
100
9
Descrizione del metodo
Prelievo
Carota o tassello di legno
Mgano
Mhyme
Estrazione DNA
•Estrazione non efficiente
Inonotus/
Ganoderma spp.
Phellinus spp.
111 bp
228 bp
M1
700 bp
M3
Nessun fungo presente
Schizophyllum spp.
Stereum spp.
Trametes spp.
P. fraxinea
M2
Armillaria spp.
Hericium spp.
Laetiporus spp.
Pleurotus spp.
-
Altro fungo
Descrizione del metodo
Multi-Hyme
Nuc-rDNA
ITS2
25 S
25sF
PhssR
FuscR FomiR
InssR
Phellinus s.s.
Inonotus s.s.
Fuscoporia
I. dryadeus
Fomitiporia
Inocutis
173bp
IdryaR InocuR
(P.tubercolosus, P.igniarius, P.tremulae)
(I.andersonii, I.hispidus, I.cuticularis)
212bp
223bp
(P.gilvus, P.torulosus)
254bp
258bp
265bp
(P.robustus, P.punctatus)
(I.dryophilus, I.tamaricis)
10
Descrizione del metodo
Multi-Hyme: Genescan analysis
P.tubercolosus
I.hispidus
P.torulosus
I.dryadeus
P.punctatus
I.dryophilus
Descrizione del metodo
Multi-Gano
Nuc-rDNA
ITS1
18 S
GrR
ITS1f
5.8 S
GaR
GlR
G. resinaceum-G.
pfeifferi
G. lucidum
G. applanatumG. australe
Multi-gano
M 1 2
185bp
3 4
5
6
M
202bp
1000
218bp
1.
G. australe
2.
G. applanatum
3.
G. resinaceum
4.
G. pfeifferi
5.
G. lucidum
6.
G. lucidum
M
100 bp
500
218
202
185
100
11
Fomitiporia
Fuscoporia
Inonotus dryadeus
Inocutis
Inonotus s.s.
Phellinus s.s.
Descrizione del metodo
G. resinaceumG. pfeifferi
G. lucidum
G. applanatumG. australe
Prelievo
Carota o tassello di legno
Mgano
Mhyme
Estrazione DNA
•Estrazione non efficiente
Inonotus/
Ganoderma spp.
Phellinus spp.
111 bp
228 bp
700 bp
M3
M2
Armillaria spp.
Hericium spp.
Laetiporus spp.
Pleurotus spp.
M1
-
Nessun fungo presente
Schizophyllum spp.
Stereum spp.
Trametes spp.
P. fraxinea
Altro fungo
Validazione
•118 campioni di legno (tasselli o carote prelevate
mediante trivella di Pressler) da piante affette da
carie e con carpofori
•Risultati attesi
9da analisi visiva dei corpi fruttiferi ritrovati
•Risultati ottenuti
9da protocollo messo a punto
•Confronto tra i risultati attesi e i risultati ottenuti
mediante protocollo molecolare
12
Validazione
• Efficienza metodo nell’
nell’individuazione del fungo agente di carie
direttamente da legno
8%
4%
88%
individuazione fungo agente di carie
no funghi individuati
fungo contaminante o saprofita
Validazione
• Efficienza metodo nell’
nell’individuazione del fungo agente di carie
direttamente da legno
• Specificità
Specificità del metodo
1
107
amplifcazione aspecifica
no amplificazioni aspecifiche
13
Validazione
• Efficienza metodo nell’
nell’individuazione del fungo agente di carie
direttamente da legno
• Specificità
Specificità del metodo
• Individuazione simultanea di più
più taxa
Validazione
• Efficienza metodo nell’
nell’individuazione del fungo agente di carie
direttamente da legno
• Specificità
Specificità del metodo
• Individuazione simultanea di più
più taxa
• Specificità
Specificità: MultiMulti-Hyme (49/49
(49/49))
MultiMulti-Gano (15/15
(15/15))
14
Applicazioni e prospettive
• metodo complementare per affinare VTA
Analisi da carote di legno estratte con trivella di
Pressler
Presenza agente fungino anche ad uno stadio precoce di
colonizzazione
Previsione dell’evoluzione del processo cariogeno all’interno
della pianta
• metodo di controllo fitosanitario
Standardizzazione metodo di campionamento
Più approfondita conoscenza relazioni specie
fungina/specie ospite
• metodo per studi ricerca di base e applicata
Esempio applicativo
Armillaria
Controlli
negativi
Controllo
positivo di
Armillaria
15
Esempio applicativo
E
A
B
F
C
D
Pianta (schiantata) con presenza di Armillaria
Pianta con presenza di Ganoderma
Pianta con presenza di Perenniporia
Pianta sana
Pianta non esaminata
Pianta non esaminata – sostituzione (giovane esemplare)
INFORMAZIONI
Laboratorio di Patologia Forestale
c.a. Prof. Giovanni NICOLOTTI
Università di Torino – DI.VA.P.R.A. Patologia Vegetale
Via Leonardo da Vinci 44 – 10095 GRUGLIASCO (Torino)
[email protected]
16