SINTESI 1° lezione di CLIL /biotecnologie a cura

SINTESI 1° lezione di CLIL /biotecnologie
a cura di Marinelli Alessia, VCsa
BIOTECNOLOGIE E DNA RICOMBINANTE
Per biotecnologie si intende qualunque tecnica o pratica che modifica/utilizza organismi viventi allo
scopo di sviluppare processi o prodotti utili per l’uomo. Non si sa precisamente quando si è
cominciato ad usare il termine biotecnologie: pare che il termine sia stato coniato agli inizi del ‘900
da un ingegnere ungherese, anche se la pratica delle biotecnologie è iniziata molto tempo prima.
Gli allevatori e gli agricoltori dell’età della pietra oltre 10000 anni fa, addomesticando animali e
piante, diedero inizio alla rivoluzione biotecnologica. 8000 anni fa i nostri antenati erano in grado
di convertire l’uva in vino, il latte in yoghurt e formaggio e il frumento in pane lievitato sfruttando
microorganismi come batteri, lieviti e funghi. Anche Cinesi (7000 anni fa) ed Egizi (4000 anni fa)
utilizzarono queste metodiche. Dal 19° secolo i contadini selezionarono specie animali e vegetali
facendo ricorso ad incroci selettivi e all’impollinazione incrociata e fecero uso di microrganismi per
controllare gli insetti che devastavano le coltivazioni. Nella seconda metà del 20° secolo si
sfruttarono i microrganismi per produrre antibiotici e vitamine. Dal 1983 vengono prodotti vaccini
utilizzando batteri o cellule superiori geneticamente modificate. Grazie all'ingegneria genetica è
possibile infatti trasferire i geni delle proteine (antigeni) presenti sulla superficie degli agenti
patogeni in batteri o cellule superiori, in modo che questi le producano. Le proteine prodotte
possono così essere utilizzate come vaccini, stimolando il sistema immunitario del ricevente.
Ad esempio, il vaccino contro il virus dell'epatite B viene prodotto seguendo questa procedura.
La moderna biotecnologia, a differenza di quella antica che agiva sugli organismi selezionandoli in
base ai cambiamenti che comparivano per caso, ricorre a tecniche più precise, che modificano solo
le parti interessate del genoma.
L’uso delle biotecnologie trova applicazioni in vari ambiti: agroalimentare, industriale,
farmacologico. Si può parlare dunque di:
1.
2.
3.
4.
Biotecnologia verde: applicazione agricole;
Biotecnologia bianca: applicazioni industriali;
Biotecnologia rossa : applicazioni mediche;
Biotecnologia blu: applicazioni marine e acquatiche.
Lo schema sottostante evidenzia le discipline che contribuiscono alla biotecnologia molecolare
e la vasta gamma di prodotti commerciali che ne derivano.
Le biotecnologie si avvalgono della tecnologia del DNA ricombinante, che consiste nell’utilizzo in
vitro di tecniche molecolari per isolare e manipolare frammenti di DNA. Il DNA ricombinante è
una sequenza di DNA ottenuta dalla combinazione di materiale genetico di diversa origine, che può
essere inserito in altre cellule per essere copiato più volte (amplificato) ed espresso. Le tecnologie
del DNA ricombinante e del clonaggio molecolare si sono rivelate fondamentali per comprendere
struttura e funzione dei geni.
Clonare in biologia molecolare significa generare una copia intera di un intero organismo oppure
una copia identica di un frammento di DNA come un gene. Nel primo caso si parla di clonazione,
nel secondo di clonaggio molecolare. Nel 1973, con il primo esperimento di clonaggio di un
segmento genico inserito nel batterio Escherichia coli, Stanley Cohen e Herbert Boye dimostrarono
che è possibile produrre copie multiple di un determinato gene.
I MATERIALI NECESSARI PER IL PROCESSO DI CLONAGGIO SONO:
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



un frammento di DNA, che può essere ricavato anche da un mRNA (in questo caso viene
detto cDNA);
specifici enzimi di restrizione che servono a “tagliare” il DNA;
particolari enzimi in grado di unire le estremità di nucleotidi (DNA-ligasi);
i plasmidi, vettori in grado di inserirsi nelle cellule ospiti;
cellule batteriche modificate in modo da rendere la loro membrana permeabile al plasmide.
I PLASMIDI SONO:
 molecole circolari di DNA a doppia elica, capaci di replicazione indipendente, che
contengono alcuni geni (da uno a decine);
 presenti naturalmente nelle cellule batteriche, alle quali conferiscono caratteristiche
peculiari;
 utilizzati in natura dai batteri per favorire il trasferimento di informazioni da una cellula
all’altra;
 in grado di trasportare un frammento genetico da un organismo all’altro (vettori) come nella
trasduzione.
I VETTORI PLASMIDICI CONTENGONO:
 un’origine di replicazione (ori), sequenza necessaria per avviare la duplicazione autonoma
del plasmide all'interno della cellula ospite;
 un gene marcatore, sequenza necessaria per selezionare le cellule che hanno incorporato il
plasmide da quelle che ne sono prive; nei casi più semplici tale sequenza può essere un gene
per la resistenza ad un antibiotico come l'ampicillina;
 sito di clonazione multipla o polylinker: tale sequenza contiene siti unici di
riconoscimento per endonucleasi di restrizione, in cui inserire il DNA esogeno.
I plasmidi possono conferire caratteristiche diverse ai batteri.
Per esempio:
• plasmidi degradativi: consentono ai batteri di metabolizzare determinate sostanze, anche
tossiche, come alcuni residui del petrolio o pesticidi;
• plasmidi Col: codificano per le colicine, proteine in grado di uccidere altri batteri;
• plasmidi della virulenza: trasformano le cellule ospiti in patogene;
• plasmidi F: consentono ai batteri di scambiare tra loro materiale genetico;
• plasmidi R: conferiscono resistenza ad alcuni antibiotici.
Se trattiamo un frammento di DNA e un plasmide con lo stesso enzima di restrizione, il frammento
può integrarsi nel plasmide, dato che le loro estremità sono complementari. L’enzima DNA-ligasi
unisce e richiude le estremità di DNA ripristinando il legame fosfodiesterico tra due nucleotidi
adiacenti in una catena di DNA.
Gli enzimi di restrizione sono particolari enzimi, identificati nei batteri, che riconoscono e tagliano
le sequenze nucleotidiche in punti specifici. I batteri li utilizzano per difendersi dal DNA estraneo,
tagliandolo in più punti. Gli enzimi di restrizione possono effettuare due tipi di tagli:

netti (il taglio genera estremità piatte), come l’enzima Hpa1e Pvull

sfalsati (il taglio genera estremità sporgenti) come gli enzimi EcoR1 e Hind3, che
tagliano in maniera asimmetrica il DNA, creando “estremità appiccicose”, coesive (sticky
ends)
CLONAGGIO DI UN DNA ESOGENO
Una volta che il plasmide è stato
modificato (plasmide ricombinato), viene
inserito in un batterio. Quando
quest’ultimo viene inserito in un terreno
di coltura, inizia a replicarsi per scissione
binaria e il nuovo DNA viene amplificato
e i nuovi geni possono esprimersi
producendo proteine o enzimi che
possono essere utili per noi (vedi
produzione di farmaci come l’insulina, la
somatostatina ecc).
Negli anni ‘80 il chimico statunitense Karin Mullis inventò la reazione a catena della polimerasi
(PCR) per produrre (amplificare) milioni/miliardi di copie di una sequenza di DNA in poco tempo.
Per eseguire una PCR si deve
preparare una miscela di reazione
contenente
Taq
polimerasi,
nucleotidi liberi, primers , buffer di
reazione (soluzione salina a pH
neutro), MgCl2; essa va inserita in
una macchina (termociclatore), che
la sottopone a più cicli a differenti
temperature.
Gli step sono i seguenti:
1) i filamenti di DNA a doppia
elica
vengono
sottoposti
a
riscaldamento e si separano in
filamenti singoli (denaturazione);
2) i primers, sintetizzati artificialmente, si legano all’estremità di ciascun filamento (annealing);
3) la DNA polimerasi (Taq polimerasi) catalizza la produzione di nuovi filamenti complementari
con l’aggiunta di nucleotidi all’estremità 3’(polimerizzazione);
4)In pochi minuti, un singolo ciclo può raddoppiare la quantità di DNA presente in soluzione e lo
riporta allo stato di doppio filamento. La ripetizione del ciclo per molte volte produce una crescita
esponenziale del numero di copie della sequenza di DNA; per questo il processo prende il nome
di amplificazione della sequenza. In questo modo il DNA viene replicato solo nelle sequenze utili
alla ricerca.
APPLICAZIONI della PCR (DIAGNOSTICA – MEDICINA LEGALE – BIOTECNOLOGIE –
RICERCA)
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Identificazione di agenti patogeni nell’uomo, negli animali o negli alimenti (batteri e virus);
Identificazione di organismi geneticamente modificati (OGM);
Analisi del DNA in medicina legale (es. test di paternità, uso dei profili genetici, analisi
DNA di sangue o sperma );
Diagnosi pre-natale di malattie genetiche da DNA di cellule embrionali (es. anemia
falciforme, distrofia di Duchenne, talassemia);
Diagnosi di malattie tumorali (es. linfoma);
Clonaggio e sequenziamento (es. di frammenti di DNA rinvenuti in mammut lanosi
congelati vissuti 40000 anni fa o di DNA di geni virali isolati da cellule infettate).
ELETTROFORESI
Tecnica analitica che permette la separazione differenziata di molecole cariche elettricamente
(amminoacidi, peptidi, proteine, acidi nucleici, ecc) quando, immerse in un gel di agarosio (acidi
nucleici) o di poliacrilammide (proteine), vengono sottoposte a un campo elettrico. La tecnica
dell’elettroforesi può essere applicata al DNA tagliato da enzimi di restrizione per separarne i
frammenti o applicata alle proteine (es. elettroforesi delle sieroproteine per diagnosi malattie). Per
quanto concerne il DNA, la tecnica si basa sul fatto che, a pH neutro, il DNA è carico
negativamente per la presenza dei gruppi fosfato e se sottoposto a d.d.p, tende a migrare verso il
polo positivo.
Applicando un campo elettrico, il
DNA (carico negativamente) migra
verso il polo positivo e le molecole
si separano in base al peso
molecolare (P.M.)
Si visualizza la disposizione dei
frammenti di DNA a bande grazie
ad un colorante che diventa
fluorescente ai raggi UV (con il
transilluminatore).
Una
volta
separati i frammenti si stabilisce la
loro lunghezza e
sequenza
nucleotidica. La disposizione a
bande è utile per operare confronti
tra DNA conosciuto e DNA
incognito, valutando somiglianze e
differenze (es. individuazione geni
alterati nelle malattie genetiche,
confronto di DNA di persone
sospette con DNA ritrovato sul
luogo di un delitto).
BIBLIOGRAFIA E SITOGRAFIA
p.p.t 1° lezione in inglese del 22/1/2016
libro di testo in uso “Dal carbonio agli OGM plus” Ed. Zanichelli
http://www.gene-abc.ch/it/geni-e-medicina/
wikipedia (immagini)