Articolo originale
Vol. 97, N. 4, Aprile 2006
Pagg. 193-196
Epatopatie virali croniche
ed espressione epatocitaria di oncoproteine
Luigi Santacroce, Tommaso Losacco
Riassunto. Notevole interesse ha suscitato e suscita tuttora il tentativo di individuare e
studiare le basi biologiche e molecolari delle epatopatie croniche e la loro possibile evoluzione in senso neoplastico. In tale ambito si inserisce lo studio degli oncogeni e delle oncoproteine che possono rappresentare un valido marker prognostico per le patologie epatiche croniche ad impronta necrotico-flogistica. Gli autori presentano i risultati di uno studio relativo alla espressione dell’EGF e della proteina p62, condotto su biopsie epatiche
di 39 pazienti affetti da cirrosi epatica e da epatiti croniche di 3 differenti tipi (attiva,
persistente, e lobulare).
Parole chiave. Cirrosi, c-myc, EGF-r, epatopatie virali croniche, oncogeni, oncoproteine.
Summary. Chronic viral diseases of the liver and oncoproteins externalization in hepatocytes.
Strong interest exists about the biomolecular basis of the chronic liver diseases due to
viral infections. It seems to be very interesting because of their evolutive potential. In this
context the study of oncogenes and oncoproteins could be interesting as prognostic factors for chronic viral diseases of the liver. In this study the authors show the results
obtained about EGF and p62 expression in 39 selected patients with cirrhosis and 3
different chronic viral hepatitis (persistant, lobular, and active).
Key words. Chronic viral liver diseases, cirrhosis, c-myc, EGFr, oncogenes, oncoproteins.
Introduzione
Gli oncogeni sono sequenze nucleotidiche responsabili della codificazione di proteine deputate
al controllo della differenziazione e della divisione
cellulare.
Negli ultimi anni è stata ipotizzata una correlazione fra la espressione di tali geni e la comparsa e la persistenza di patologie epatiche
croniche. È stato osservato che alcuni oncogeni
modificati sono coinvolti nell’eziopatogenesi di
varie neoplasie maligne (c-myc nei linfomi di
Burkitt, nelle leucemie promielocitiche e nei tumori del colon e del polmone; c-erb B2 nei tumori
benigni della mammella, negli adenocarcinomi
delle ghiandole salivari, stomaco, pancreas, ovaio,
mammella). Da ciò è scaturito l’interesse nei confronti degli oncogeni nello studio dei processi proliferativi preneoplastici e neoplastici, fra i quali le
patologie croniche del fegato correlate ad HBV,
HCV, o HBV+HCV che determinano nel tempo
l’insorgenza della neoplasia.
Una alterazione delle sequenze nucleotidiche
degli oncogeni preindotta da virus (retrovirus
oncogeni) può causare un disturbo nel controllo
della proliferazione cellulare1,2.
L’espressione degli oncogeni può essere valutata
direttamente mediante tecniche di ibridizzazione in
situ ed indirettamente con specifici anticorpi monoclonali verso proteine codificate dai geni stessi. A volte, queste sequenze geniche sono responsabili della
sintesi di enzimi, fattori di crescita (EGF) o recettori per fattori di crescita che possono essere iperespressi per un fenomeno di amplificazione genica3-5.
I protooncogeni quindi sembrano svolgere un
ruolo centrale nell’insorgenza prima e nell’accrescimento poi dei processi neoplastici6.
Le patologie necrotico-flogistiche del fegato, ovvero l’Epatite Cronica Persistente (ECP), l’Epatite
Cronica Lobulare (ECL), l’Epatite Cronica Attiva
(ECA) e la Cirrosi (Cir), sono prevalentemente correlate ad infezioni virali determinate da virus epatotropi di ceppo B e C, singolarmente ed in associazione (HBV, HCV ed HBV + HCV).
Dipartimento di Odontostomatologia e Chirurgia (DOC), Cattedra di Chirurgia Generale, Università, Bari.
Pervenuto il 14 febbraio 2006.
194
Recenti Progressi in Medicina, 97, 4, 2006
rossidasi) utilizzando anticorpi monoclonali anti-p62
Poiché le flogosi croniche da virus epatotropi
umana.
a carico del fegato risultano spesso implicate nelLa metodica prevede:
la evoluzione in senso neoplastico del danno epa1) reazione tra anticorpo legato alla biotina ed antigetocitario, lo studio dell’espressione di oncoproteine da evidenziare;
ne correlate ai geni c-erb B2 e c-myc può fornire
2) un secondo anticorpo capace di legare il primo e leimportanti informazioni circa gli eventi molecogato a sua volta alla biotina, aggiunto in eccesso per
lari che precedono l’insorgenza dell’epatocarciavere uno dei siti di legame libero;
7,8
noma .
3) aggiunta del complesso ABP con uno dei siti reattivi
sulla avidina libero per legare il residuo presente
Il gene c-erb B2, anche definito ker2 (indivisull’anticorpo.
duato sul cromosoma 17), è stato individuato in tumori benigni (per esempio mammari) ed in forma
In tal modo è stato evidenziato l’antigene e a tal punamplificata in alcuni adenocarcinomi (ghiandole
to la positività per il c-erb B2 è stata rilevata nel citosalivari, stomaco, pancreas, mammella). Questo
plasma delle cellule esaminate valutando la positività o
gene è responsabile della sintesi della proteina Cmeno delle lesioni studiate.
erb B2 messa in evidenza in tali tessuti neoplastici con tecniche immunoistochimiche9.
Nel 1992 Brunt e coll. hanno dimostrato la
Risultati
presenza della proteina sintetizzata dal c-erb B2
Sia per c-myc che per c-erb B2 è stato assegnato +
in alcuni epatocarcinomi, di cui uno insorto su
per positività al 25% delle cellule studiate, ++ per valocirrosi HCV correlata, due insorti su cirrosi postri fra il 25% e il 50% e +++
necrotica (uno da HCV ed
per valori superiori al 50%.
uno da HBV), due insorti
La presenza di falsi positisu necrosi epatocellulari
vi per entrambi gli oncogeni è
Abbiamo
ritenuto
interessante
indagare
l’e(una submassiva ed una
stata esclusa con controlli nespressione di oncoproteine correlate ai gemassiva). Si è pensato
gativi, sostituendo, alla prima
ni
c-erb
B2
e
c-myc
nella
cirrosi
epatica
e
che questa proteina, dotappa, una soluzione tamponelle altre patologie necrotico-flogistiche
ne all’anticorpo primario.
tata di attività tirosinchicroniche del fegato indotte da virus che soL’EGF-R è risultato prenasica, potrebbe essere
no considerate fra i precursori morfologici
sente quando si evidenziava
un recettore per un fattodell’epatocarcinoma, con lo scopo di evireattività per lo stesso sulla
re di crescita10. Tale redenziare le proteine sintetizzate dai predetmembrana cellulare degli
cettore, quando espresso
ti protooncogeni, al fine di ottenere utili
endoteli vascolari; invece la
in larga misura, determiinformazioni circa l’attività sintetica, prolip62 si evidenziava confron13,14
nerebbe una veloce creferativa e differenziativa di tali cellule
.
tando i campioni con framscita delle cellule tumomenti di tessuto normale
rali, per un maggior sti(controllo) in cui è distribuita con un tipico pattern.
molo alla replicazione
L’esame è stato eseguito su quattro gruppi di patolocellulare, quindi una maggior aggressività della
gie flogistiche del fegato (ECP, ECL, ECA, Cir) correlate
neoplasia11,12.
da un punto di vista virologico:
Il gene c-myc, invece, è omologo di un protoon– per le ECP : 5 ad HBV, 4 ad HCV ed una HBV +
cogene leucemico (rinvenuto sul cromosoma 8) e
HCV;
codifica per la proteina p62 che sembra essere
– per le ECL : 3 ad HBV, 5 ad HCV e 4 ad HBV + HCV;
coinvolta nel controllo della differenziazione e di– per le ECA : 4 ad HBV, 5 ad HCV e 3 ad HBV + HCV;
visione cellulare. Una aumentata espressione del
– per le Cir : 1 ad HBV, 2 ad HCV e 2 HBV + HCV.
gene c-myc è stata osservata in colture cellulari
L’esame di tale materiale ha permesso di riscontrare
derivate da linfomi di Burkitt, leucemia, tumori
per il c-myc una presenza nel 100% delle forme ECP, nel
del colon e polmonari.
56% delle forme ECL, nell’87% delle forme ECA e nel
50% delle Cir correlate all’epatite da HBV.
Materiali e metodi
Abbiamo studiato l’interazione fra patologie epatiche croniche ad etiologia virale e l’espressione delle oncoproteine prodotte dai geni c-erb B2 e c-myc, selezionando 39 biopsie eseguite su pazienti con le seguenti patologie: 5 (13%) Cir, 10 (25%) ECP; 12 (31%) ECA; 12
(31%) ECL.
Tali patologie erano correlate nel 26% dei casi ad
epatite da HBV + HCV, nel 33% ad HBV e nel 41% ad
HCV.
I frammenti epatici sono stati fissati in formalina
neutra tamponata al 10%, inclusi in paraffina e tagliati in sezioni dello spessore di 5 μm. Alcune di queste sono state colorate con metodiche di routine, mentre le altre sono state trattate con per un analogo del recettore
degli EGF e per la P62 correlati agli oncogeni c-erb B2
e c-myc secondo la metodica ABP (Avidina-Biotina + Pe-
Discussione e conclusioni
Le forme HCV correlate presentano positività
per il gene c-myc nel 100% degli epatociti in corso
di ECP, ECL, ECA e Cir. Infine, nelle forme da
HBV + HCV si sono evidenziati valori pari al 100%
nelle ECP e Cir e pari all’83.3% nelle ECL ed ECA.
C-erb B2, evidenziato con metodiche immunoistochimiche, è stato individuato nelle patologie da
HBV nel 50% degli epatociti in caso di ECP, nel
37,5% delle ECL, 31,2% delle ECA e 0% delle Cir.
Nelle forme da HCV si è riscontrata positività
pari al 43,7% per ECP, 50% nelle ECL, 33,3% nelle ECA e 37,5% nelle Cir.
L. Santacroce, T. Losacco: Epatopatie virali croniche ed espressione epatocitaria di oncoproteine
Infine, le forme da HBV + HCV hanno mostrato nel 100% dei casi di ECP presenza del gene, nel
25% delle ECL, nel 58,3% delle ECA e nel 62,5%
delle Cir.
Uno studio eseguito da Voravud nel 1989 ha
messo in evidenza l’espressione dei geni c-ras, cmyc, c-erb B2 (in colangiocarcinomi ed epatocarcinomi a confronto con tessuto normale) che
potrebbe suggerire una intempestiva o inappropriata attivazione dei sistemi che controllano la
proliferazione e lo sviluppo delle cellule normali15.
Inoltre Tiniakos, studiando l’espressione del cmyc in corso di epatocarcinoma e nel tessuto epatico non neoplastico ha evidenziato, in corso di epatocarcinoma ed ugualmente in corso di Cir, l’aumentata espressività dell’oncogene stesso16.
Tale evidenza è assente in fegati colestatici fetali ed adulti normali, ossia l’oncoproteina C-myc
potrebbe indicare espressioni fenotipiche maligne
negli epatocarcinomi17.
Ancora a tal proposito, nel 1992 Brunt e coll.
hanno valutato l’immunoreattività per c-erb B2
in fegati con patologie benigne e patologie maligne, ed hanno osservato che l’espressione di questo gene è comune nelle proliferazioni epatocellulari reattive e che è maggiore in corso di lesioni necrotico-flogistiche croniche correlate ad
HBV ed HCV.
Si è ipotizzato che tale evento possa essere utile per definire la trasformazione maligna nella colangite sclerosante primitiva. Possiamo concludere
che l’oncoproteina c-myc è espressa in maniera
particolare nelle lesioni HCV correlate (come nel
nostro studio) e comunque elevata in corso di Cir
(HBV + HCV correlate; è invece ridotta l’espressione nelle forme HBV correlate). In questo caso
l’oncogene n-myc viene utilizzato come indice prognostico negativo (indipendentemente dagli stadi)
poiché quanto più è espresso tanto peggiore sarà la
prognosi.
Il gene c-erb B2, invece, è espresso maggiormente nelle lesioni correlate ad HBV + HCV, in
particolare se si tratta di Cir. Una espressività intermedia è stata riscontrata nelle forme da HCV
e diminuita nelle forme da HBV.
In ogni caso, quindi, le oncoproteine c-erb B2 e
c-myc studiate sono rappresentate abbondantemente nelle lesioni epatiche da HCV. Tali oncogeni in pratica determinerebbero la trasformazione
cellulare in senso neoplastico attraverso l’induzione di almeno due diversi meccanismi:
1) la capacità replicativa indefinita delle cellule
(immortalità cellulare);
2) l’attivazione di un oncogene cellulare da cui deriva la trasformazione.
La presenza è intermedia in quelle correlate
ad HBV + HCV; in quelle correlate con l’HBV compare una bassa reattività. Nelle Cir, invece, non è
rilevante il virus coinvolto poiché è stata notata
comunque una maggiore espressione delle
oncoproteine.
195
Sulla scorta dei risultati di questo studio sembrano utili un ulteriore approfondimento ed una conferma, utilizzando altre metodiche, quali l’analisi molecolare dei tessuti patologici e lo studio
istochimico per la ricerca del Ki67 (che sembra
essere un fattore prognostico nel carcinoma
gastrico, in linfomi, in tumori stromali gastroenterici e in epatocarcinomi di piccole dimensioni).
Sapendo, infatti, che la concentrazione di Ki67
varia durante il ciclo cellulare (aumenta in fase G1, è maggiore in G1-S, diminuisce in G2 ed
è minore in M) sarebbe utile valutare
l’espressività della stessa nelle lesioni necrotico-flogistiche che precedono la comparsa dell’epatocarcinoma nella sua storia naturale.
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Indirizzo per la corrispondenza:
Prof. Tommaso Losacco
Policlinico Universitario
DOC, Cattedra di Chirurgia Generale
Piazza Giulio Cesare, 11
70124 Bari
E-mail: [email protected]
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