Prof Andrew Millar, University of Edinburgh

Prof Andrew Millar, University of Edinburgh
‘Plant science leads the way in understanding biological timekeeping’
Gatsby Plant Science Summer School Lecture 2012,
http://www.gatsbyplants.leeds.ac.uk/tree/uploads/Lectures/Knight_M_SS11/player.html
ITALIAN TRANSLATION
Primary Italian translation by Maura Di Martino – University of Warwick
Edited and proofread by
Prof. Rosario Muleo
DAFNE
Universita’ della Tuscia (Viterbo, Italy)
Web site: http://www.dafne.unitus.it/web/interna.asp?idPag=1312
Slide 2
E' un grande piacere essere di nuovo qui. Abbiamo scoperto che l’ultima volta che sono
stato in questa scuola era il 2005, quindi le cose sono cambiate ma 6 diapositive sono
rimaste ancora lì. Questo è un filmato che mostra 24 ore della vita di un girasole del giardino
posteriore di un biologo delle piante, il Prof Roger Hangarter, nel bel mezzo degli Stati Uniti.
Ha lasciato la luce della veranda accesa per tutta la notte, così si può ancora vedere cosa sta
facendo il girasole. Si inizia con le foglie orientate ad est. A mezzogiorno con il sole alto, le
foglie sono orientate verso l'alto. È possibile vedere le ombre muoversi alla fine della
giornata e la pianta seguire il sole. Gli angoli della foglia cambiano per catturare la luce. Le
foglie si abbassano durante la notte per poi rialzarsi quando spunta il sole. Si dovrebbe
riflettere un po' su questo comportamento su cui torneremo più tardi.
Il tema di questa conferenza è la tempistica biologica, ossia le piante hanno un orologio
biologico che è prezioso per loro. La tempistica è qualcosa con cui si ha familiarità, è così,
alzi la mano chi non indossa un orologio. Oh un bel po'. Ho fatto la stessa domanda nel 2005
e quasi tutti indossavo un orologio, ma forse con i telefoni cellulari non è più necessario.
Slide 3
Comincio con la motivazione sul perché lavoriamo sulle piante e il tipo di lavoro che stiamo
facendo. Questo è un punto di vista di livello molto alto. Potreste aver sentito prima della
sfida sulla sicurezza alimentare. Qui è dove tutte le persone in ogni momento possono
accedere realmente al famigerato cibo in maniera sufficiente e ciò è sostenuto dai sistemi
alimentari. Questi sono molto complessi, affascinanti e vanno ben oltre le scienze
biologiche.
Slide 4
Il fondamento dei sistemi alimentari è nella produttività primaria: la fotosintesi. Il fatto è
che i nostri sistemi alimentari attualmente sono poco efficienti tale che 1 miliardo di
persone sono denutrite o malnutrite, che è più del numero delle persone affette da AIDS, TB
e malaria messe insieme. Questa è una sfida che parte dalla scienza delle piante, e sostengo
che per ottenere quello che abbiamo oggi, quando il pianeta avrà 9 miliardi di persone nel
2050, sarà richiesta alla scienza delle piante la comprensione della fotosintesi, della biologia
dello sviluppo delle piante, dell’orologio circadiano forse, e di nuovi modi di lavorare. Una
delle cose di cui voglio parlare è un nuovo approccio, per capire le scienze biologiche, che
utilizza i modelli, e forse avrete fatto i sistemi di modellazione L, che potremo affrontare.
Al fine di sostenere la popolazione dell'Asia, sull’ asse x, la raccolta del riso in milioni di
tonnellate, sull’asse delle y, è dovuta aumentare dal 1961 fino a circa il 2000. Gli autori di
questo articolo hanno usato una matematica semplice per fare una estrapolazione lineare
per il 2050. Per arrivare al 2050 abbiamo bisogno di un aumento dal 50% al 100% della resa,
ma come faremo ad arrivarci? La sfida è maggiore se si conosce qualche anno in più di dati.
La linea di tendenza della resa non è una linea retta, piuttosto ha una tendenza al ribasso
quindi il rendimento di riso, grano e altre colture non riesce ad aumentare più velocemente
della popolazione. La caduta di tendenza determina un lavoro ancora più grande da fare per
raggiungere i raccolti necessari entro il 2050, con meno terra, meno acqua e la restrizione
sui fertilizzanti come nitrati e fosfati.
Slide 5
2
Una cosa interessante della scienza delle piante è che si può osservare che un esperimento
che state testando in laboratorio può essere ingrandito fino a raggiungere una scala molto
grande. Per questo ho intenzione di parlare di questa pianta Arabidopsis thaliana, di cui
probabilmente avrete sentito ben parlare, e con cui siamo impegnati in una serie di diversi
progetti che hanno diverse sigle mostrate qui, che stanno studiando Arabidopsis a livello
base all'interno delle cellule, ma possiamo osservare che il percorso del nostro esperimento
continua fino a raggiungere la scala paesaggistica e la produzione di un aumento delle rese
nel raccolto.
Slide 6
Il modo in cui ho intenzione di parlare del problema di scala, è quello di passare dalla
tempistica quotidiana, fatta dai vostri orologi o dai telefoni cellulari, alla tempistica annuale,
quando nel corso dell'anno una pianta fa qualcosa, a un ritmo che può essere stagionale
piuttosto che a un ritmo quotidiano, e la scelta chiave che una pianta fa è quando fiorisce. Si
tratta di piante di Arabidopsis coltivate in inverno simulato (giorni corti) o coltivate in estate
simulata (giorni lunghi). Ciò che viene coltivato in estate fiorisce molto più rapidamente e
questa tempistica dipende dall’orologio circadiano. I vostri telefoni hanno calendari e
orologi e abbiamo intenzione di parlare di una parte della biologia che ha entrambe queste
funzioni.
Slide 7
Il problema è che è molto complicato, infatti ci vuole di più a capire come i circuiti genici
funzionano rispetto a fare solo esperimenti. Il modo in cui lavoriamo è una disciplina
chiamata biologia dei sistemi in cui si raccolgono i dati che potrebbero essere di massa,
anche se non dovrebbero. I dati sono poi oggetto di analisi o statistica e il punto importante
è che la comprensione che si ottiene da tale analisi viene acquisita in modelli matematici
formali. Quando i sistemi si complicano, come quelli che vi mostrerò è molto difficile
ragionare su di loro senza l'ausilio di modelli matematici, tuttavia è anche difficile usare i
modelli senza alcun software che renda tutto più facile. Non voglio parlare del software ma
esso è importante.
3
Dall’analisi dei modelli si generano le previsioni, le previsioni si trasformano in nuovi
progetti sperimentali. Quando facciamo questi nuovi esperimenti, otteniamo dati che
affinano il modello e questo è quello che vi mostrerò in 2 esempi, ma il punto di questo ciclo
non è quello di fare modelli, o di fare software, o di fare previsioni. Il punto è capire come
funziona la biologia e la comprensione umana è molto semplice. Non possiamo fornire un
modello e dire che non abbiamo capito niente, la sua comprensione avviene solo quando si
può parlare di esso e ragionare su di esso. Quindi, questa che stiamo realmente affrontando
e che vi mostrerò è una cosa a basso livello dimensionale, che proviene dalla modellazione,
usata dalla cognizione umana, ma non è la stessa cosa della modellazione.
Slide 8
Lavoriamo in un Istituto chiamato ‘SynthSys’ che è il Centro della sintesi e della biologia dei
sistemi di Edimburgo, e ho intenzione di parlare molto brevemente di biologia sintetica, ma
non molto.
Slide 9
Le persone del mio laboratorio sono indicate sulla colonna di sinistra, questi sono tutti i
membri del mio vecchio laboratorio, a partire dal mio primo studente di dottorato, quindi il
2005 è alla fine di quella colonna. Tutti gli sperimentali sono in bianco e tutti i teorici o
modellisti sono in blu. Si può vedere che fino al 2005 quasi tutti nel mio laboratorio erano
sperimentalisti mentre dal 2005 si ha un quadro molto più misto e recentemente un gran
numero di persone del laboratorio sono intermedie tra il nero e il blu. Abbiamo persone con
una duplice esperienza che hanno un mix di competenze diverse e questo è anche qualcosa
che mi piacerebbe sottolineare. Andare avanti con un mix di competenze diverse è una delle
cose fondamentali per la vostra futura carriera. Sarà estremamente utile. Noi lavoriamo con
un gran numero di collaboratori e oggi ho intenzione di parlare del lavoro che è stato
avviato con David Rand, un matematico a Warwick, e Matthew Turner. Stiamo facendo il
lavoro con Mark Stitt in Germania e Paloma Mas a Barcellona.
4
Slide 10
Ho parlato di motivazione prima, ora di orologi circadiani per poi andare sui calendari e
finire con una conclusione sui modelli.
Slide 11
Sapete degli orologi. Essi controllano il ciclo sonno-veglia, vi danno il Jetlag quando viaggiate
attraverso tanti fusi orari e determinano se il 20% della popolazione che lavora turni regolari
può facilmente lavorare di sera o fare turni di notte o ha reale difficoltà’ nel farlo.
Conosciamo l'orologio circadiano umano perché le persone sono disposte a registrare quello
che fanno giorno dopo giorno, come questo tizio. Questo è un registro, chiamato diario del
sonno, così ogni volta che questo particolare soggetto va a dormire segna quel momento e
quindi questo è un episodio di sonno, che viene contrassegnato da una barra bianca. Si va a
dormire qua e si sveglia là e lo stesso giorno è tracciato due volte, e poi giorni successivi
vengono tracciati al di sotto di quello prima, nella parte bassa del grafico abbiamo nove
mesi di dati. Possiamo vedere che questo ragazzo ha una vita molto normale per un sacco di
tempo. Per cinque giorni si alza alla stessa ora e poi due giorni si alza tardi. Questo
rappresenta un pezzo di biologia o un pezzo di sociologia. E nel fine settimana che non si
può vedere il tempismo biologico negli esseri umani a meno che non li porti fuori dalla
società, facendoli uscire dalla loro sveglie, telefonini, caffè del mattino e così via.
Slide 12
Per fare questo si porta l'organismo umano o qualsiasi altro organismo, in quello che noi
chiamiamo un ambiente costante, ma per l'uomo questo è difficile. Infatti, siamo sensibili a
un sacco di input diversi di temporizzazione, quindi abbiamo bisogno di portare le persone
in qualche parte piuttosto insolita, e questo è uno di questi luoghi. Questa è l’indagine fatta
nella base antartica britannica Hally dove durante l’ inverno antartico tutta la base è nelle
tenebre per diversi mesi e nell’ estate antartica è in luce costante. Un ambiente costante si
potrebbe pensare, ma in realtà il diario che ho appena mostrato è derivato da un lavoratore
5
su quella base dove il suo ambiente era molto strutturato. Questo perché nell'indagine
antartica un ex sergente dell'esercito maggiore ha il compito di suonare una grande
campana, in un particolare momento, ogni mattina svegliando l'intera base. Quindi non è un
buon posto per studiare i ritmi circadiani o gli orologi biologici. Per fortuna c'era un gruppo
di controllo di un'organizzazione dove tipicamente non impiegano ex-sergenti dell’esercito.
Questo è Greenpeace.
Slide 13
Questi sono i diari del sonno di quattro volontari di Greenpeace su una nave di ricerca al
largo della costa antartica, non lontano dalla base, e si possono vedere qui nove mesi di
dati. Cominciano nello stesso momento: nella primavera antartica, quando c'è un ciclo di
luce-buio, e si può vedere che le registrazioni sonno-veglia sono molto regolari e sono tutte
sincronizzate tra di loro. Questo perché ogni persona è sincronizzata al ciclo di luce-buio.
Venite in estate antartica e potete vedere che le registrazioni si trovano lungo l’asse di
destra ciò significa che ognuno si è alzato ad un'ora o due più tardi ogni giorno, e che sta
andando a letto un'ora o due più tardi. L'orologio del corpo umano in queste condizioni
scorre lento e non mantiene un tempo di 24 ore. Questa è un'osservazione molto comune
nella maggior parte delle persone. Esiste una variazione, ma questa è la media. Quando
torna il ciclo luce-buio tutti si sincronizzano, così l'orologio biologico umano non ha un
periodo di 24 ore. Il tempo tra ore di veglia e ore di sonno è sincronizzato dal ciclo luce-buio
esterno che è ancora vero. Questa quantità di luce potrebbe essere sufficiente, ma la luce
del sole è meglio: se avete bisogno di superare il jetlag dovete vedere il sole, tuttavia in
Scozia questo non è sempre facile. Coloro che hanno la vista acuta potranno anche vedere
che a metà estate si è verificato un evento felice e le prime due registrazioni sono
sincronizzate tra di loro quindi questo significa che queste due persone si sono alzate dal
letto insieme e sono andate a letto insieme. C'è un’intera storia a riguardo, uno di loro era il
capitano.
Slide 14
Le semplici ipotesi che si ottengono da questi dati sono di carattere generale e si applicano
6
agli orologi biologici e ai sistemi biologici. Il sistema orologio include un oscillatore che
genera un periodo o un ritmo vicino alle 24 ore, ma non esattamente 24 ore. Esso ha un
sistema di input che permette cicli di luce e buio per persuadere l'oscillatore per
sincronizzarlo con la luce dell'ambiente esterno, ci deve essere qualche sistema di output
che controlla tutti i ritmi evidenti: i nostri livelli di ormone, la tolleranza all'alcol, la
tolleranza al dolore, le ore di sonno-veglia e così via. Questo è vero nei cianobatteri, in
funghi filamentosi, nella Drosophila e nel criceto.
C'è un'altra cosa su cui non mi dilungherò. Questo è un oscillatore molto insolito. È un
insolito pezzo di biochimica, perché è bilanciato con la temperatura, così l'orologio
mantiene la stessa velocità a temperature calde e a temperature fredde mentre la maggior
parte delle reazioni biochimiche accelerano all'aumentare della temperatura. Che,
naturalmente, potete vedere che si sa adattare. La rotazione del pianeta non rallenta solo
perché capita che un giorno fa freddo e così l'orologio permette agli organismi di anticipare
il loro ambiente perché è sincronizzato con quello che sta accadendo al di fuori ed è molto
robusto. Come si fa a fare un orologio e cosa succede all'interno di questo oscillatore? Io sto
mostrando qui alcuni passi con una barra lì che significa un feedback negativo in modo che C
attiva la D, D attiva E, E attiva F ma F spegne C.
Slide 15
Perché pensiamo che funziona? Questo è un concetto molto semplice. Sto per mostrarvi
due concetti in questo discorso, e questo è il primo. E' presente in tantissimi sistemi
biologici diversi, con un sacco di diversi oscillatori. In questo caso si tratta di un sistema
genetico, così abbiamo bisogno di 2 ingredienti: le risposte negative e il ritardo. Cosa
determina un’oscillazione? Abbiamo un gene qui. Esso produrrà un RNA e questo RNA
codificherà per un repressore, o qualcosa di questo tipo per fermare la trascrizione. L'RNA
aumenta nel tempo e come l’RNA raggiunge un livello alto comincia a produrre le proteine.
Quando la proteina raggiunge un livello alto si spegne (la produzione) di RNA. L’ RNA spegne
la trascrizione ed infine l’RNA diminuisce. È importante sottolineare che la proteina
repressore deve essere degradata. Quando non c'è il repressore si può produrre più RNA e il
ciclo ricomincia. Si può vedere davvero chiaramente come questo motivo molto semplice
7
potrebbe produrre oscillazioni e in effetti lo fa. È necessario il ritardo in modo tale che la
proteina spenga immediatamente l’RNA, quando il sistema di sintesi della proteina è in
corso. Ci deve essere abbastanza tempo per accumulare un elevato livello di proteine che
determina lo spegnimento della proteina.
Slide 16
Il ritardo può essere creato in qualsiasi modo vi piace. Può essere costituito da un passaggio.
Può essere costituito da molti passaggi. In questo caso siamo di fronte a tutta una serie di
attivazioni in modo che A attiva B, C, D, E, F, G e H ed eventualmente H torna indietro. Come
facciamo a sapere che ha funzionato? E' stato costruito ed è stato testato in biologia
sintetica un meccanismo esattamente di questo tipo che ha generato una oscillazione in un
organismo che non aveva oscillatore.
Slide 17
Questo è un pezzo classico di un capitolo tratto da un lavoro di Michael Elowitz e Stan
Leibler. Hanno fatto un circuito costituito da tre repressori quindi in questo caso i passaggi
intermedi sono entrambi negativi, ma si tratta della stessa cosa. Qui abbiamo un repressore.
Questo è un repressore lac che spegne il repressore tet, il repressore tet spegne il
repressore lambda (C1) e il repressore lambda spegne il repressore lac. Sono tutti codificati
da un plasmide, si mette il plasmide in E. coli con un reporter GFP, e se si segue la punta
della freccia: questa particolare cellula viene ad essere spenta ed accesa, spenta ed accesa,
spenta ed accesa, spenta ed accesa. È possibile tracciare la sua oscillazione. Questo è un
caso forte che prova ciò che pensiamo: che le risposte negative insieme ad un ritardo
producono oscillazioni, perché possiamo vederle e disegnarle.
Slide 18
Ok prima sintesi. Gli orologi circadiani guidano ritmi autosufficienti. Non hanno bisogno del
ciclo luce-buio. Continuano a funzionare in Antartide. I ritmi possono anticipare i
cambiamenti quotidiani, l’orologio solare non lo fa. Vi ricordate la pianta di girasole?
8
Ricordate cosa ha fatto al finire della notte? Tutte le foglie erano appese nel mezzo della
notte e alla fine della notte le foglie si sono orientate ad est prima che il sole spuntasse.
Questo è l'effetto di temporizzazione biologica. Se si dispone di un orologio l'organismo è in
grado di anticipare un cambiamento prevedibile. Se la pianta di girasole fosse riuscita a
rispondere
solo
come
un
orologio
solare,
allora,
non
avrebbe
potuto
fare
quell’anticipazione, quindi loro (i girasoli) hanno gli orologi (endogeni). Che cosa sono questi
meccanismi? Come si fa a costruire una risposta negativa e un ritardo dei geni e delle
proteine?
Slide 19
Questa è la domanda di cosa c’è all’interno di questo meccanismo dell'orologio. Arriveremo
a questo successivamente.
Slide 20
Ora sto passando da concetti generici a concetti specifici della biologia vegetale, parlando
quasi esclusivamente di Arabidopsis. Qui sta crescendo sul marciapiede davanti casa mia a
Cheltenham. La dimensione è di un tappo di bottiglia di Coca Cola e si può vedere qui un
tipico ritmo circadiano. Questi semi sono in crescita in luce costante e temperatura
costante, ma si può vedere che la loro crescita non è costante. Se si guarda man mano che
crescono, esse crescono e si fermano. Crescono e si fermano. Crescono e si fermano. Ogni
volta che smette di crescere i cotiledoni si aprono in modo che crescano ogni giorno la sera
e smettano di crescere ogni giorno al mattino. Questo perché sotto, all'interno di ogni
cellula l'orologio circadiano controlla l'espressione di molti geni mostrati qui in un ritratto di
un micro-array. Qui ci sono i geni espressi la sera, la notte, la mattina, per tutto il giorno e la
sera successiva. Il 30% di tutti i geni delle piante sono controllati dal suo timer e tra quei
geni ci sono quelli che controllano la fioritura.
Slide 21
Per studiare questo, stiamo cercando di rendere quei ritmi interni e invisibili un po' più
9
visibili. Quindi lo abbiamo fatto utilizzando un gene reporter della lucciola. Probabilmente
avete incontrato prima il concetto di gene reporter. Vogliamo vedere ciò che la pianta sta
facendo in un processo che altrimenti sarebbe difficile da studiare, quindi abbiamo collegato
un gene eterologo, in questo caso dalla lucciola, ad una parte del sistema regolatore della
pianta, in questo caso, il promotore del gene che regola l’orologio di Arabidopsis. Abbiamo
messo in fusione la pianta transgenica e l'immagine della pianta transgenica sotto una
fotocamera estremamente sensibile. Ora la quantità di luce del gene della lucciola riflette la
quantità di trascritto del gene della pianta e possiamo vedere i ritmi di luminescenza dalle
singole piante. Ora abbiamo un marcatore, possiamo dire ciò che sta facendo il circuito
dell’orologio senza dover macinare piante. Siamo in grado di seguire le singole piante e
questo trucco, che abbiamo assemblato quando ero uno studente di dottorato, viene ora
davvero ampiamente utilizzato. Quindi ad oggi ci sono mosche, topi e cianobatteri
ritmicamente luminescenti.
Slides 22
Ora possiamo guardare più da vicino ciò che le singole cellule stanno facendo, quindi questa
è una delle piante che ha i geni del ritmo collegati alle luciferasi di lucciola e potete vedere
in questa foglia sotto il microscopio le oscillazioni di espressione attraverso la foglia. Ogni
giorno ce un’oscillazione di espressione che inizia da qualche parte al centro. Non
chiedetemi perché questo accade in quanto non abbiamo idea, ma basti dire che si può
vedere che ogni cellula è ritmica in quelle situazioni. Ora il 30% di alcuni di quei geni sono in
realtà parte del meccanismo dell'orologio. Non sono solo le lancette dell'orologio che vi
mostrano la sincronizzazione dall’esterno, come il gene della lucciola. Il gene della lucciola
non ha niente a che fare con gli ingranaggi. Alcuni di questi geni costituiscono gli ingranaggi,
ma solo 20 e questo è uno di loro. Questo è il gene dell’orologio mattutino chiamato CCA1
(orologio circadiano associato al gene 1) ed ha un partner chiamato LHY1.
Slide 23
Basti dire che sono i geni dell’orologio della mattina e usando il gene reporter luciferasi e
molti altri metodi, tutta una serie di laboratori di tutto il mondo hanno individuato un intero
10
gruppo di geni ritmici. Non avete bisogno di conoscere i nomi, basta ricordare la risposta
negativa e il ritardo. Ho intenzione di parlare di questi tre geni che sono in verde: LHY e
CCA1 che lavorano insieme. Essi sono fattori di trascrizione. Si legano ai promotori di tutta
una serie di geni dell’orologio e li spengono. Questa è la funzione di arresto in rosso. LHY e
CCA1 spengono un gruppo di geni al mattino in modo che questi geni non possono essere
espressi fino a sera. Ho intenzione di concentrarmi su uno di quei geni serali chiamati TOC1
che supportano la tempistica di espressione di CAB1. Così TOC1, vi mostrerò che attiva
indirettamente LHY1 e CCA1, quindi seguendo le linee verdi, abbiamo la nostra risposta
negativa e qui ci sono componenti sufficienti per determinare un ritardo. Quel piccolo
circuito di risposte negative non è solo. TOC1 ha una serie di fratelli e sorelle, chiamati
regolatori di pseudo-risposta PRRs e fanno il proprio circuito di risposte negative con LHY e
CCA1 per cui vi è una risposta negativa, ma è molto più complicata. Ve lo mostrerò
esattamente in un minuto. Ci sono altre due informazioni sulla diapositiva: queste proteine
non sono conservate, non troverete nessuna di quelle nell'orologio di animale o
nell'orologio di funghi o nell'orologio di cianobatteri ma sono importanti in altre piante.
Questo PRR7 controlla il tempo di fioritura in orzo. La chinasi che regola CCA/LHY1 controlla
il tempo di fioritura in riso. L4 è stata identificata in pisello come uno dei geni serali e L3 è
un altro gene dell’orzo quindi l'intero sistema controlla il tempo di fioritura in tutte le specie
vegetali.
Slide 24
Come facciamo a saperlo? Questi circuiti sono stati collegati con un processo di logica molto
semplice, si tratta esclusivamente di genetica convenzionale. In questo caso, possiamo
iniziare con i nostri geni mattutini LHY e CCA1 che sono molto simili e possono scambiarsi
tra di loro perché sono così vicini che li consideriamo quasi identici.
Si parte da una pianta che ha una sovra-espressione di LHY e CCA1. Siamo in grado di
monitorare l'espressione di TOC1. Qui nell’asse y c’è il livello dell’RNA di TOC1. C’è un
intervallo di buio durante la notte e poi il giorno, in cui le piante si muovono in luce
costante, che viene indicata con questa barra bianca. L’espressione di TOC1 scende al
11
mattino, fino alla sera e poi prosegue in luce costante. Se abbiamo troppo LHY in una pianta
sovra-espressa, questo è un segnale di stop. Costruiamo loro un segnale di stop per tutto il
tempo con un transgene che sovra-esprime LHY, non a caso il suo gene target è spento, così
in quella linea mutante il segnale TOC1 viene diminuito ad un livello molto basso e l'orologio
della pianta si ferma. Questo ci dice che LHY è un repressore ma cosa fa TOC1 e come si
chiude questo ciclo. Se si prende un mutante TOC1 che ha una bassa espressione di questo
e poi si monitora l’espressione di LHY o CCA1, che in questo caso è associato, nelle piante
wild-type viene espresso al mattino e non la sera, la mattina del giorno successivo. Senza
TOC1 il livello di espressione scende ad un livello molto basso e accelera, quindi ha un
orologio veloce. TOC1 ha il compito di mantenere l'orologio ad una velocità di andatura
normale e particolarmente attiva CCA1, così TOC1 chiude questo ciclo di risposte negative.
Questo è già un sistema abbastanza complicato ed è stato a quel punto che il mio allievo
James Locke, che era uno studente Gatsby, ha iniziato a costruire un modello matematico
per spiegare ciò che quel semplice cartoon ci stava dicendo, in maniera sufficiente, per
spiegare i dati. Vi ho raccontato una storia basandomi su una diapositiva di PowerPoint, ma
il cervello umano è davvero incapace a dedurre quanto di qualcosa avrà un effetto in un
momento particolare, così la comprensione della quantificazione e della dinamica è difficile
senza un modello.
Slide 25
Ho intenzione di mostrarvi due diapositive con le equazioni. James ha appena riscritto il file
powerpoint attraverso equazioni differenziali. Così ho detto LHY è un repressore di TOC1 e
TOC1 attiva LHY. Nel mezzo modelliamo un pool di proteine nel citoplasma e un pool di
proteine nel nucleo. Ciascuno di questi pool ha un'equazione e questa è l'equazione che
descrive LHY. E' abbastanza semplice. Costruiamo l’ mRNA di LHY con un termine di
trascrizione e poi degradiamo l’ mRNA di LHY. Il pool nucleare di TOC1 attiva la trascrizione.
Ho detto che TOC1 attiva la trascrizione di LHY e questo è solo quello che è scritto
nell'equazione. L'unica cosa che non vi ho detto a riguardo sono tutti questi valori V e K,
questi sono i tassi: il tasso di trascrizione, il tasso di degradazione e così via. Non li
conoscevamo al momento, quindi James ha dovuto fare una ricerca. Questo mi ricorda che
12
dopo aver lasciato il mio laboratorio, James è andato a lavorare con Michael Elliott, il
ragazzo che ha fatto il repressore, sta tornando in questo paese per lavorare nel laboratorio
di Sainsbury.
Slide 26
James annotò un insieme di equazioni, una per ciascuno dei componenti.
Slide 27
Ha testato tantissime combinazioni diverse di parametri, per vedere di riuscire a trovare una
serie di vs e ks che permettono a questo piccolo circuito di funzionare e riprodurre i dati. In
breve, abbiamo provato milioni di queste e, sì, siamo in grado di riprodurre l'orologio wildtype, ma questo non è molto soddisfacente. Come vi ho detto ci aspettavamo che la risposta
negativa e il ritardo funzionassero, il repressore successivamente ha funzionato. Questo
funziona come modello, ma non abbiamo imparato ancora nulla.
Slide 28
Non abbiamo iniziato a imparare cose fino a quando non abbiamo testato il modello
confrontando alcuni nuovi dati, quindi, se questo modello è corretto e si rimuovono questi
componenti, si dovrebbero togliere una parte di quel ciclo di risposte negative e il tutto
dovrebbe fermarsi. Se non è più possibile chiudere il circuito, l'orologio deve fermarsi. Bene
questi sono i dati. Questo è un altro gene reporter della luciferasi in una pianta doppio
mutante che non ha LHY o CCA1 e che ha un orologio veloce che funziona a 18 ore, ma è
ancora chiaramente ritmico, quindi il modello o è errato o è incompleto. Questo singolo
ciclo non è sufficiente. Ci deve essere qualcos'altro che tiene il tempo senza LHY / CCA1. Ora
abbiamo imparato qualcosa. Questo è la procedura per provare a costruire un modello,
mettendo le migliori idee che si ottengono dagli esperimenti per poi testarle confrontandole
con ulteriori dati che ci hanno permesso di fare ad oggi un bel po' di progressi.
Slide 29
13
Ora stiamo andando avanti velocemente, dal 2005 con i modelli di James al 2010 e 2011. I
modelli sono ancora in corso per diventare molto più complicati, ma in un paio di
diapositive li semplificherò di nuovo. Il modello del 2010 include ancora lo stesso percorso
LHY e CCA1 inibiscono TOC1, TOC1 attiva LHY nel nostro ciclo di risposte negative. E' incluso
un set di altri geni che il lavoro sperimentale ci aveva mostrato fossero parte dell'oscillatore,
quindi è stato un grande miglioramento.
Slide 30
E ancora non si ha la spiegazione di tantissimi dati e, in particolare, c’erano due gruppi di
mutanti che controllano TOC1. ztl degrada la proteina TOC1, qui ci sono prr7prr9, i suoi
partner. Non siamo riusciti a spiegare con il modello del 2010, i dati pubblicati da questi
mutanti. Esso ha spiegato un sacco di altri dati, ma non questi e quindi c'era ancora
qualcosa che mancava al nostro modello e dopo un bel po' di ragionamento abbiamo
pensato che TOC1 non fosse un attivatore. Doveva essere un repressore e infatti era già
noto che questi geni PRR erano repressori. Abbiamo scritto un modello che ha incluso anche
questo e siamo in grado di esplorare il modello utilizzando simulazioni. Questo è quello che
vi ho mostrato degli output del modello, nella parte inferiore dello schermo. Al centro
abbiamo una simulazione wild-type che mostra che l’RNA di LHY presenta un picco all'alba,
niente al tramonto, arrivando il giorno dopo. In un mutante TOC1 si assiste ad un aumento
in LHY / CCA1 in questo mutante simulato e se TOC1 viene sovra-espresso si ha la
repressione di LHY / CCA1. Questa è stata una previsione che ha suggerito che potremmo
invertire i dati che vi ho mostrato. Prima vi avevo mostrato che il mutante TOC1 riduce i
livelli di questi geni, ma nel modello suggerito avremmo dovuto cambiare le condizioni,
avremmo dovuto fare l'esperimento in un modo diverso per vedere questo. Quando
abbiamo fatto questi esperimenti abbiamo ottenuto il risultato previsto, così in questi studi,
alla fine della notte TOC1 e CCA1 si stanno semplicemente avvicinando da quella parte della
curva. Qui c’è il mutante con una maggiore livello di CCA1, non molto più alto di LHY ma la
sovra-espressione è minore lì. Questo è un esperimento molto semplice che suggerisce che
il nostro modello potrebbe essere giusto. Non siamo riusciti a combinarlo con i dati
precedenti. Cambiamo il modello per vedere come avremmo potuto fare meglio. Il nuovo
modello contraddice una delle nostre ipotesi precedenti, ma sembra corrispondere meglio
14
ai dati.
Slide 31
Insieme ad altre diverse modifiche che ci hanno portato a questo, che è il modello
dell’orologio allo stato attuale. E' davvero troppo complicato andare fino in fondo a questo,
al momento ha 35 equazioni e include questa previsione: il TOC1 è un repressore.
Inizialmente a nostra insaputa altri due laboratori, uno in Spagna e uno negli Stati Uniti,
stavano testando la stessa ipotesi.
Slide 32
All'inizio di quest'anno, sono uscite due pubblicazioni che dimostravano attraverso diversi
esperimenti e diverse metodologie, che in effetti TOC1 non è solo un fattore di trascrizione
che si lega al DNA, ma è anche un repressore. La previsione che abbiamo fatto in cui il
nostro modello non funzionava è stata convalidata in modo indipendente da noi e da questi
altri due laboratori. Questo è il primo di due esempi con cui sto cercando di mostrarvi che
quando un sistema biologico diventa abbastanza complicato è utile avere un modello e il
modello è
utile perché permette di fare previsioni specifiche che sono testabili in
esperimenti
Slide 33
Mi sembra un po' come questo dipinto. Si inizia nel bel mezzo di uno di questi cicli e come si
iniziasse a camminare lontano da dove si è iniziato, si incontrano sempre più cicli di
regolazione genica. Se si inizia da questa parte, non si sa neanche dei cicli laggiù, quindi
questo è un problema significativo. Quello che i modelli sembrano mostrare è più la
complessità e ciò che è altrettanto importante da dire è che i modelli sono utili per rendere
le cose semplici.
Slide 34
15
Dopo aver scritto il modello, per noi è stato più facile vedere che all'interno di tutta quella
rete di geni, c'era un ciclo di tre repressori. LHY / CCA1 stavano reprimendo, come una
nuova serie di geni chiamati il ‘complesso della sera’. Il complesso della sera reprime un set
di geni chiamati PRRs che includono TOC1 e, questi, a loro volta reprimono LHY / CCA1 per
cui vi è una risposta negativa, ma non passa attraverso una componente positiva che ci
sembrava TOC1 ma piuttosto attraverso due passaggi negativi. In realtà avete visto questo
prima, che è il repressilator Elowitz e Leibler. Questa è un’ ipotesi. Si tratta di una vera e
propria semplificazione, ma è lì, e questo è un messaggio semplice, che possiamo capire e
che potete utilizzare facilmente per predisporre esperimenti.
Solo per dire ancora una volta come questo cambiamento funziona, inizialmente
pensavamo che i geni della sera come TOC1 attivassero i geni della mattina come LHY /
CCA1 ma di fatto inibiscono gli inibitori di quei geni della mattina in modo che la
connessione è ancora lì. Esso ha lo stesso segnale, ma un meccanismo diverso.
Slide 35
Secondo riassunto- L'orologio della pianta controlla molti ritmi e queste sono le lancette,
così il 30% dei geni controllano la crescita ritmica, il movimento dell’organo come ha
mostrato il video. Gli ingranaggi degli orologi circadiani sono i geni ritmici che formano cicli
di risposte negative e il circuito è complicato. Risulta che gli stessi geni sono presenti anche
negli animali, dove vi è un circuito molto simile. Esso è complicato allo stesso modo, non
molto più complicato, è quasi lo stesso. Non capiamo perché. Questa è una delle cose che
stavano cercando di capire. I modelli fanno previsioni verificabili e dettagliate che
consentono di progettare nuovi esperimenti, ma aiutano anche a rivelare concetti semplici
in modo da poter capire come funziona il sistema, nonostante tutti i dettagli molecolari.
Quali sono le piante che utilizzano gli orologi? In che modo questi danno un vantaggio alle
piante che possiamo utilizzare a nostro vantaggio?
Slide 36
Ora sto andando verso l'ultima parte della conferenza dove pensiamo all’ orologio come ad
un calendario. La relazione avviene attraverso la lunghezza del giorno, perché la lunghezza
16
del giorno cambia nel corso dell'anno. Se potete utilizzare il vostro orologio per misurare la
lunghezza del giorno significa che potete intuire il periodo dell'anno. Questo è il trucco
chiave.
Slide 37
Questo è ciò che molte colture utilizzano: le informazioni del fotoperiodo, le informazioni
sulla lunghezza del giorno determinano il tempo di fioritura. Il tempo di fioritura determina
il momento del raccolto. Naturalmente ci sono anche molti altri controlli sul tempo di
fioritura e di raccolta. La fioritura delle colture è stata intensamente domesticata e
manipolata. Possiamo capire che parte della fisiologia della coltura in Arabidopsis utilizza
questo processo. L’inverno simulato rallenta la fioritura mentre l’estate simulata velocizza la
fioritura. La nostra sfida è ora quella di capire come funziona questo processo di
misurazione. Che cosa è ciò che misura la lunghezza di un giorno e cambia il
comportamento della pianta da questo a quello?
Slide 38
Il fatto che ciò conta è indicato dalla circostanza che è presente nei modelli scientifici delle
colture di maggior successo, quindi vi sto mostrando qui un output molto semplice di un
grande modello di crescita del grano. Sull'asse delle x c’è il tempo osservato di fioritura
mentre sull'asse delle y c’è il tempo previsto e si può vedere che il modello abbina
realmente la previsione in maniera splendida attraverso diversi luoghi in Francia, diverse
varietà di frumento e in due diversi anni del raccolto. Questi modelli funzionano
egregiamente e permettono agli agricoltori di decidere quali varietà piantare.
Slide 39
Il tempo di fioritura in tali modelli è complicato come questo. La linea verde qui è il modello,
cosi quando la lunghezza del giorno è breve il fotoperiodo è breve e la velocità
dell’induzione fiorale è bassa mentre quando la lunghezza del giorno è lunga, la velocità
dell’induzione fiorale nella pianta è alta e fiorisce in fretta. E poi si connettono i due con
17
una linea retta, questo è tutto. Sotto c’è un meccanismo molecolare e ora capiamo quel
meccanismo molecolare e possiamo utilizzare ciò che conosciamo da Arabidopsis per
informare i modelli scientifici delle colture.
Questo è il secondo concetto e questo è uno stadio più complesso di risposta negativa. E’
venuto da un tizio di nome Owen Bunning negli anni '30. Egli ha avuto un sogno riguardante
un campo di fagioli e, alla fine del suo sogno gli venne questa idea. E' stata una notte di
sonno estremamente produttivo e l'idea è semplice. Dall’ orologio, dopo il tramonto in
giorno corto SD, avete un output che chiamiamo CO e questi picchi in uscita per un giorno
corto. Tutte le volte che le luci sono accese il vostro CO non è attivo mostrando un basso
livello qui. In un giorno lungo, la lunghezza del giorno è estesa, quindi ora abbiamo il
tramonto e dopo questo CO ha raggiunto il picco e la pianta deve unire due pezzi di
informazione: la tempistica che si ottiene da CO e la luce. Quando si ottiene CO e la luce
insieme questo è il segnale che la pianta può utilizzare per indurre un gene trigger per la
fioritura chiamato FT (che sta per Flowering Time). In giorno lungo, la luce coincide con il CO
e si ottiene la fioritura. In giorno corto, il CO è ancora lì, ma il picco non include nessuna
parte della giornata durante l'intervallo di luce del giorno e così l’espressione del tempo di
fioritura è bassa e non si ottiene la fioritura per un lungo periodo di tempo. Abbiamo
identificato i geni di George Copeland in laboratorio e molti altri gruppi che lavorano in tutto
il mondo hanno identificato uno dei geni chiave, quindi qui c’è il mutante in CO. Non può
fare il cambiamento. Il tempo di fioritura è sempre lento in questo modo perché ha perso la
capacità di fare quella combinazione tra luce e tempo.
Slide 40
Siamo passati attraverso lo stesso processo. Questo è il secondo esempio di come utilizzare i
dati per costruire un modello e poi affinare il modello. Il modello inizia con un orologio
interno che controlla CO in output dall’orologio. Diciamo che la luce si unirà con il nostro
output dell’orologio per attivare il gene del tempo di fioritura. Questo è il nostro primo
modello. Nella seconda parte colleghiamo questo e tutto ciò che al suo interno abbiamo del
circuito del nostro orologio, e utilizzeremo uno dei geni della sera TOC1 come gene
delegato, come output dell’orologio per la fioritura. Questo picco al momento giusto e
18
quindi nel modello sarà sostituito con questo e ciò è stato pubblicato nel 2009.
Slide 41
In pratica, nelle prossime due slide ho intenzione di mostrare come per i geni fratelli,
possiamo costruire un modello allo stesso modo in cui abbiamo costruito l'orologio. Non è
necessario ricordare ogni dettaglio di questo. Quando abbiamo accanto un cartoon, tornerò
al modo in cui è organizzato il sistema. Qui abbiamo i nostri Constans, il nostro output
dell’orologio, l’RNA (CO), e l'output dell’orologio derivato da giorni corti e da giorni lunghi.
L’espressione del gene del tempo dell’induzione fiorale è bassa nei dati di giorno corto
mentre si ha un alto contenuto di ‘dia’ nei dati a giorno lungo e in realtà possiamo simulare
ciò in modo semplice. Ci limitiamo a dire che ci vuole CO e luce per determinare il tempo di
fioritura. Quando CO è bassa non si ottiene la fioritura, se l'output dell’orologio è alto
durante il giorno si ottiene. Questo modello si adatta meglio ai dataset; i dataset si adattano
a vicenda. Non si può fare un modello migliore in quanto è molto semplice e funziona.
Slide 42
Abbiamo poi collegato questo all’orologio. È interessante notare che l'ora di punta per
l’output dell'orologio cambia dai giorni corti ai giorni lunghi e quindi abbiamo dovuto fare
un modello in cui l'orologio si muoverebbe con la lunghezza del giorno crescente. Ok, Ecco
una simulazione chiara dell’output dell’orologio che produce un picco al momento giusto,
ma nei dati è presente una discontinuità (ginocchio). Non è una curva regolare. La curva ha
una modifica dell’andamento (discontinuità o ginocchio), qui alla fine della giornata e
questo non è nel modello. Non esiste un meccanismo nel nostro orologio che fa due colpi al
giorno, uno qui e uno là. Il nostro CO sembrava più come i dati qui, le stelle, che provengono
dal mutante chiamato FKF1 (Filthy Komplicating factor), quindi il nostro modello si adatta
meglio ai dati del mutante FKF1 che ai dati del wild-type. Sappiamo che il mutante FKF1
sottovaluta la quantità di CO e fiorisce più lentamente. Abbiamo meno CO che è meno in
coincidenza con la luce. Si ottiene meno FT e ci vuole più tempo.
19
Slide 43
Ci aspettavamo di avere un problema con questo, perché ci aspettavamo che il nostro
modello avrebbe fatto lo stesso. Qui c’è il nostro modello ora collegato ai giorni corti, ok. C'è
il dato per il gene del tempo della fioritura e il modello. In realtà è più basso, un quarto del
normale in altezza, nei giorni lunghi. Ecco l'output del modello che vi ho mostrato prima.
Usiamo questo per prevedere quanto del nostro FT RNA dovremmo avere e in effetti era
meno in wild-type. Ci aspettavamo che sarebbe stato meno ed è stato meno, ma poi
abbiamo avuto un problema. Questa differenza non era abbastanza grande. La pianta
mutante ha prodotto solo molto RNA di FT così abbiamo avuto una riduzione del 40% e nella
pianta vi è stata una riduzione del 95%. Questa quantità di CO nel mutante, nel modello dice
che dovrebbe produrre tanto FT e il modello si inserisce in un gran numero di gruppi di dati
in piante wild-type. Questa pianta mutante FKF1 non può farlo. Non può andare da nessuna
parte li vicino. Ciò ha determinato la previsione che abbiamo fatto rispetto a quella grande
diminuzione, ma in realtà otteniamo una grande riduzione del tempo di fioritura nella nuova
pianta. Questo mutante FKF1 sta facendo qualcos’altro, non è solo la produzione di quel
piccolo margine. Sta facendo qualcosa a valle di CO in modo che il mutante FKF1 ha tutto
questo CO alla luce ma ha solo molto FT così FKF1 lo ha contorto.
Slide 44
Si è ottenuto un output del gene CO ma deve anche fare qualcosa a valle. Ok, così abbiamo
fatto un modello di quello. Questo è il modello in wild-type ora si può vedere che lo
abbiniamo al margine e può colpire perfettamente il wild-type a livello di FT. Lo abbiamo
fatto dicendo va bene abbiamo il gene che è stato perso nel mutante che è ritmico,
sappiamo che è espresso nello stesso periodo del gene CO e sappiamo che funziona solo alla
luce. Abbiamo bloccato queste caratteristiche nel modello e questo è ciò che abbiamo
ottenuto.
Slide 45
20
Possiamo ora abbinare il mutante? Ebbene sì, possiamo. Ecco la simulazione del mutante.
Non ha il margine e ora corrisponde ai dati del gene FT nella pianta mutante. Nel cartoon il
nostro gene FKF1 sta facendo due cose nel complesso: attiva il margine che è al livello della
produzione dell’RNA (CO) dell’orologio e fa anche qualcosa a valle in modo che senza di essa
la quantità di RNA (CO) che si ottiene non dà origine a molte proteine. Il nostro problema
non è il meccanismo noto. Dalla previsione diciamo che si possono connettere, ma non si ha
idea di come funziona.
Slide 46
Molto fortunatamente per noi uno dei ricercatori americani di cui abbiamo utilizzato i dati
nel primo modello era sufficientemente ispirato a usare il suo primo post-doc e la sua prima
borsa di studio nel suo laboratorio per andare e trovare il meccanismo e non ha solo trovato
un meccanismo, ne ha trovati due e quindi questo è l’articolo che è il risultato di ciò - il
nostro fattore Komplicating FKF stabilizza la proteina CO.
Slide 47
Nel dettaglio è risultato essere molto più complicato rispetto a ciò che il modello aveva
previsto. C'erano due meccanismi: così FKF1 regola positivamente la proteina e
negativamente regola un inibitore che colpisce sia CO RNA sia FT RNA, questa fu una
sorpresa. Ci aspettavamo di trovare un effetto, ma ce ne erano due. Non era possibile
saperlo prima. Il modello è stato utile perché ha mostrato che entrambi devono funzionare,
così abbiamo potuto fare le versioni mutanti del modello in cui abbiamo silenziato solo
questo effetto o solo quell’effetto e non è stato possibile farlo con la genetica. Non c'era
modo di separare l'effetto perché non lo conoscevamo abbastanza. Questa è la quantità di
FT per una previsione wild-type, qui è bassa, un basso livello nel mutante FKF1 e se elimini
uno di questi due meccanismi si perde la reattività, si perde FT RNA. Entrambi questi
meccanismi devono funzionare nella pianta e noi dimostriamo che è vero per molti scenari
diversi.
21
Slide 48
L’ultima sintesi è allora che le piante utilizzano tale meccanismo di coincidenza esterno per
misurare la lunghezza del giorno. Il sogno di Bunning è stato una notte utile. Il circuito è di
nuovo complicato e in questo caso non capisco perché. Per gli orologi abbiamo alcune idee.
In questo caso anche i sistemi animali non sono altrettanto ben caratterizzati. L’allevamento
stagionale è molto importante in pecore, polli e salmone d'allevamento ma i meccanismi
molecolari alla base di questo non sono così ben capiti come lo sono in questo sistema
pianta. Questo suggerisce che la modellazione può essere utile per dirigere alcuni
esperimenti anche in quest’ altri sistemi animali. Ora stiamo lavorando con un laboratorio di
topi per cercare di capire come la regolazione della tiroxina nella ghiandola pituitaria
controlla l’allevamento di questi animali. Concludo semplicemente mostrando una singola
diapositiva su come questo possa essere utilizzato. Ora abbiamo la comprensione di quel
circuito molecolare che controlla il tempo di fioritura.
Slide 49
Ho detto che questo è stato importante nei modelli delle piante colturali.
Slide 50
Yin-Hoon, uno studente del laboratorio di Karen Halliday nel progetto ROBUST è stato in
grado di comprendere il nostro piccolo orologio e il suo percorso fotoperiodico in un
contesto modellistico che comprende altre parti della scienza delle piante. Esso comprende
la fotosintesi e include la struttura della foglia in una pianta che cresce. Questo modello
quando abbiamo qualche output visivo sarà in grado di crescere una pianta non come in un
sistema L che da vita solo a foglie e rami, ma quella in cui ogni pezzo di crescita richiede
carbonio e tutto quel carbonio deve essere fissato attraverso la fotosintesi in modo che
limiti la crescita della quantità di carbonio disponibile. Lo fa in un modo che possiamo
regolare utilizzando l'orologio che fa parte dello stesso modello.
Slide 51
Penso che questo è il tipo di modello che ci permetterà di ottenere tra 20 anni, da oggi al
22
2030 utilizzando la variazione naturale e la riduzione dei rifiuti, la migliore agronomia di
tutti, sarà molto importante. Per i successivi 20 anni penso che i guadagni di rendimento
deriveranno dalla comprensione della pianta e non solo da una piccola parte della pianta
come la fotosintesi o lo sviluppo di per sé, ma piuttosto dalla comprensione della pianta con
le connessioni tra fotosintesi, sviluppo e sistemi come l'orologio biologico. L'orologio
biologico è stato utile per noi perché è un interessante pezzo di biologia e capiamo gli
orologi umani un po' meglio in parte grazie alle cose su cui stiamo ragionando. Rappresenta
anche un modello molto utile in cui possiamo sviluppare nuovi modi per comprendere la
biologia complicata e qui nuovi modi di lavorare dovrebbero essere applicabili a tutti i
diversi sistemi che sono necessari per i prossimi 40 anni, validi per aumentare le rese delle
colture.
Slide 52
Questo è il genere di cose in cui spero anche alcuni di voi possano essere coinvolti e non
vedo l'ora per questo. Grazie
Acknowledgements
This translation is a result of a collaborative project between the Global Plant Council
http://globalplantcouncil.org/ and the University of Leeds, Plant Science TREE project
http://www.tree.leeds.ac.uk .
Special thanks go to Maura Di Martino, University of Warwick, Prof. Rosario Muleo,
Universita’ della Tuscia and Michael Wilson, University of Leeds who made this translation
possible.
23
24