UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI TRIESTE Dipartimento di Scienze della Vita XXII Ciclo Scuola di Dottorato in Neuroscienze e Scienze Cognitive Indirizzo in Neurobiologia Settore Scientifico‐Disciplinare BIO‐09 REGOLAZIONE MONOAMINERGICA DELLA NEUROGENESI IPPOCAMPALE ADULTA E DELL’APPRENDIMENTO SPAZIALE DOTTORANDO Marino Coradazzi DIRETTORE DELLA SCUOLA DI DOTTORATO Chiar.mo prof. Piero Paolo Battaglini RELATORE Chiar.mo prof. Giampiero Leanza Università degli Studi di Trieste ANNO ACCADEMICO 2008/2009 INDICE Indice INDICE ................................................................................................................. 1 ABBREVIAZIONI ................................................................................................... 4 1. INTRODUZIONE ............................................................................................. 6 1.1. IL SISTEMA NORADRENERGICO – IL LOCUS CŒRULEUS ......................................................... 7 1.1.1. Genesi, Sviluppo e Maturazione Postnatale .................................................... 7 1.1.2. Anatomia ......................................................................................................... 8 1.1.3. La Trasmissione Noradrenergica ................................................................... 10 1.1.4. Le Funzioni del Sistema Noradrenergico ........................................................ 11 Le proiezioni noradrenergiche discendenti ................................................... 12 L’innervazione ascendente ............................................................................ 13 Noradrenalina e neuroinfiammazione .......................................................... 14 1.1.5. Il Sistema Noradrenergico nell’apprendimento e Memoria .......................... 14 La plasticità sinaptica ..................................................................................... 14 Apprendimento e Memoria ........................................................................... 15 1.1.6. Patologie Legate al Sistema Noradrenergico ................................................ 17 1.1.7. Lesioni al Sistema Noradrenergico ................................................................ 18 1.1.8. Interazione con Altri Sistemi Neurotrasmettitoriali ....................................... 20 1.2. IL SISTEMA COLINERGICO DEL PROSENCEFALO BASALE ....................................................... 20 1.2.1. Anatomia ....................................................................................................... 20 1.2.2. Lo Sviluppo del Sistema Colinergico Basale ................................................... 22 1.2.3. Le Funzioni del Sistema Colinergico del Prosencefalo Basale ........................ 23 1.2.4. Acetilcolina e Noradrenalina ......................................................................... 26 1.3. LA MALATTIA DI ALZHEIMER ......................................................................................... 28 1.3.1. Generalità ...................................................................................................... 29 1.3.2. Fisiopatologia ................................................................................................. 31 L’Ipotesi Colinergica. ...................................................................................... 31 L’Ipotesi Amiloide .......................................................................................... 31 1.3.3. La Terapia ...................................................................................................... 32 1.3.4. Alzheimer e Sistema Noradrenergico ............................................................ 34 1.3.5. Modelli Animali .............................................................................................. 36 |1| INDICE Gli animali anziani .......................................................................................... 36 Modelli Basati sull’ipotesi Colinergica: Modelli Farmacologici e Lesivi ......... 37 Modelli transgenici ........................................................................................ 38 1.4. NEUROGENESI ADULTA ................................................................................................ 39 1.4.1. Le Cellule Staminali Neurali ........................................................................... 40 1.4.2. Proliferazione e Migrazione ........................................................................... 42 1.4.3. Funzioni della Neurogenesi Ippocampale ...................................................... 43 1.4.4. Regolazione della Neurogenesi Ippocampale ................................................ 45 1.4.5. Sistemi Colinergico e Noradrenergico e Neurogenesi Ippocampale .............. 46 1.4.6. Neurogenesi e Malattia di Alzheimer ............................................................ 47 2. SCOPI DELLA TESI ........................................................................................ 49 3. MATERIALI & METODI ................................................................................. 51 3.1. ANIMALI E CONDIZIONI DI ALLEVAMENTO ........................................................................ 51 3.2. DESIGN SPERIMENTALE ................................................................................................ 51 3.2.1. Esperimento 1: Caratterizzazione della Lesione Neonatale con αDBHsap .... 52 3.2.2. Esperimento 2: Trapianto di Progenitori Neurali in Midollo Spinale ............. 52 3.2.3. Esperimento 3: Effetti Comportamentali della Rimozione del Sistema Noradrenergico .............................................................................................. 53 Lesioni Neonatali ........................................................................................... 53 Lesioni Adulte ................................................................................................ 54 3.2.4. Esperimento 4: Effetti di Lesioni Combinate Colinergica e Noradrenergica .. 54 Effetti Comportamentali ................................................................................ 54 Effetti sulla Neurogenesi ............................................................................... 55 3.3. PROCEDURE IN VIVO .................................................................................................... 55 3.3.1. Procedure di Microchirurgia .......................................................................... 55 Lesioni Neonatali ........................................................................................... 55 Lesioni in Animale Adulto .............................................................................. 56 Trapianto di Progenitori Neurali derivanti da LC embrionali ........................ 57 3.3.2. Test Comportamentali ................................................................................... 58 Test Motori .................................................................................................... 58 Morris Water Maze ........................................................................................ 59 Spatial Probe Trial .......................................................................................... 60 Radial Arm Water Maze ................................................................................. 61 3.3.3. Sacrifici ........................................................................................................... 63 3.4. PROCEDURE EX VIVO ................................................................................................... 63 3.4.1. Processamento del Tessuto ........................................................................... 63 3.4.2. Procedure Istologiche .................................................................................... 63 Colorazione Istochimica per le fibre AChE positive ....................................... 63 Immunoistochimica ....................................................................................... 64 3.4.3. Analisi microscopiche ..................................................................................... 65 Densitometria delle fibre DBH immunoreattive e AChE positive .................. 66 Conta delle cellule neoformate ..................................................................... 66 3.4.4. Analisi Statistiche ........................................................................................... 66 |2| INDICE 4. RISULTATI ................................................................................................... 67 4.1. ESPERIMENTO 1 CARATTERIZZAZIONE DELLA LESIONE NEONATALE CON ΑDBHSAP .................. 67 4.1.1. Dose/Risposta ................................................................................................ 67 4.1.2. Effetti a Lungo Termine ................................................................................. 70 4.1.3. Specificità della Lesione ................................................................................. 71 4.2. ESPERIMENTO 2 TRAPIANTO DI PROGENITORI NEURALI IN MIDOLLO SPINALE ......................... 72 4.3. ESPERIMENTO 3 EFFETTI COMPORTAMENTALI DELLA RIMOZIONE DEL SISTEMA NORADRENERGICO ................... 76 4.3.1. Lesioni neonatali ............................................................................................ 76 Morris Water Maze ........................................................................................ 77 Spatial Probe Trial .......................................................................................... 79 Radial Arm Water Maze ................................................................................. 79 4.3.2. Lesioni Adulte ................................................................................................. 81 Effetti Anatomici ............................................................................................ 81 Morris Water Maze e Spatial Probe Trial ...................................................... 81 Radial Arm Water Maze ................................................................................. 83 4.4. ESPERIMENTO 4 EFFETTI DI LESIONI COMBINATE COLINERGICA E NORADRENERGICA ............... 85 4.4.1. Effetti Anatomici ............................................................................................ 85 4.4.2. Effetti Comportamentali ................................................................................ 88 Morris Water Maze ........................................................................................ 88 Spatial Probe Trial .......................................................................................... 90 Radial Arm Water Maze ................................................................................. 92 4.4.3. Effetti sulla Neurogenesi. ............................................................................... 94 5. DISCUSSIONE .............................................................................................. 96 5.1. 5.2. 5.3. 5.4. 5.5. CARATTERIZZAZIONE DELLA LESIONE NEONATALE CON ΑDBHSAP ESPERIMENTO 1 .................. 97 TRAPIANTO DI PROGENITORI NEURALI IN MIDOLLO SPINALE ESPERIMENTO 2 ......................... 99 EFFETTI COMPORTAMENTALI DELLA RIMOZIONE DEL SISTEMA NORADRENERGICO ESPERIMENTO 3 ....................................................................................................... 100 EFFETTI DI LESIONI COMBINATE COLINERGICA E NORADRENERGICA ESPERIMENTO 4 ............. 102 Effetti Comportamentali .............................................................................. 102 Effetti sulla Neurogenesi ............................................................................. 104 CONCLUSIONI .......................................................................................................... 106 6. BIBLIOGRAFIA ........................................................................................... 108 |3| ABBREVIAZIONI Abbreviazioni 192sap IgG 192­Saporin 5HT 5 Idrossi‐Triptamina – Serotonina 6OHDA 6‐Idrossi Dopamina AChE Acetilcolinesterasi AD Malattia di Alzheimer αDBHsap Anti­Dopamine Beta Hydroxylase­Saporin AMPA Acido α‐amino‐3‐idrossi‐4‐isoxasole‐propionico AP Coordinata Antero‐Posteriore APP Proteina Precursore dell’Amiliode Aβ Peptide β Amiloide BLA Nucleo Basolaterale dell’Amigdala BrdU Bromo‐Deossiuridina CA1 Cornu Ammonis 1 CA3 Cornu Ammonis 3 ChAT Colina‐Acetiltransferasi DBB Banda Diagonale di Broca DBH Dopamina β Idrossilasi DG Giro Dentato dell’Ippocampo DSP‐4 N‐(2cloroetil)‐N‐etil‐2‐bromobenzilamina E Giorno di vita embrionale GFAP Glial Fibrillary Acidic Protein – Proteina Acidica Fibrillare della Glia hDBB Branca Orizzontale della Banda Diagonale di Broca i.c.v. Intracerebroventricolare |4| ABBREVIAZIONI L Coordinata Laterale LC Locus Cœruleus LTD Long Term Depression – Depressione a Lungo Termine LTP Long Term Potentation – Potenziamento a Lungo Termine MS Setto Mediale NBM Nucleo Basale Magnocellulare NGF Nerve Growth Factor – Fattore di Crescita Nervoso NSC Cellule Staminali Neurali P Giorno di vita post‐natale p75NTR Recettore a Bassa Affinità per l’NGF PS1 Presenilina 1 RT Room Temperature ­ Temperatura Ambiente SC Spinal Cord – Midollo Spinale SGZ Zona Sub‐Granulare SNC Sistema Nervoso Centrale SubC Sub Cœruleus SVZ Zona Sub‐Ventricolare TH Tirosina Idrossilasi V coordinata Verticale vDBB Branca Verticale della Banda Diagonale di Broca |5| INTRODUZIONE 1. Introduzione Descritto dai primi neuroanatomici come Nucleo Pigmentato del Ponte, il Locus Cœruleus costituisce la principale fonte di innervazione noradrenergica dell’intero Si‐
stema Nervoso Centrale, dal Midollo Spinale alla Neocorteccia. La Noradrenalina, il neurotrasmettitore rilasciato dai suoi neuroni, sembra svolgere un ruolo cruciale in molti processi neuronali. Tra i quali rivestono particolare rilevanza i processi cogniti‐
vi di apprendimento e memoria. A sottolineare il ruolo importante di questo sistema neurotrasmettitoriale nei fenomeni cognitivi sono le recenti osservazioni di un suo possibile coinvolgimento nella Malattia di Alzheimer, una patologia il cui principale sintomo è il progressivo deterioramento delle funzioni di memoria spaziale e di lavo‐
ro. Alla regolazione delle attività cognitive il Locus Cœruleus sembra contribuire non lavorando da solo ma interagendo strettamente con altri sistemi neurotrasmettitoria‐
li, in particolare il Sistema Colinergico del Prosencefalo di Base anch’esso profonda‐
mente implicato nei deficit cognitivi propri della Malattia di Alzheimer. Lo studio del ruolo funzionale di questi due sistemi, negli ultimi anni ha ricevuto impulso grazie all’introduzione di specifiche immunotossine che hanno permesso di ottenere deplezioni mirate, altamente specifiche d efficienti dei due sistemi neurotra‐
smettitoriali. Negli esperimenti che compongono la presente tesi, la IgG 192­Saporin e la Anti­Dopamine­Beta­Hydroxylase­Saporin, che lesionano rispettivamente i neuroni colinergici del Prosencefalo di base e i neuroni noradrenergici del Locus Cœruleus, so‐
no state ampiamente utilizzate allo scopo di studiare gli effetti anatomici e funzionali della loro rimozione. |6| INTRODUZIONE 1.1. Il Sistema Noradrenergico – Il Locus Cœruleus 1.1.1. Genesi, Sviluppo e Maturazione Postnatale I neuroni noradrenergici hanno un’origine embriologica piuttosto precoce. Nel rat‐
to, si è osservato che essi si originano fra il 10° (E10) ed il 13° giorno dal concepimen‐
to (E13) [Lauder e Bloom, 1974; Thomas et al., 1995]. Solamente in fase post‐
mitotica, da E14, tali cellule iniziano ad esprimere gli enzimi biosintetici per i neuro‐
trasmettitori, in particolare la Tirosina Idrossilasi (TH), e la Noradrenalina stessa [Lauder e Bloom, 1974]. Da questa fase in poi l’espressione dei vari marker tissutali procede più o meno linearmente fino all’età adulta [Coyle, 1977]. Le fibre noradre‐
nergiche ascendenti raggiungono la corteccia fra E16 e E18 [Lauder e Bloom, 1974; Coyle e Molliver, 1977] e già una settimana prima della nascita raggiungono tutte le aree cerebrali che innerveranno nell’adulto emettendo numerose varicosità [Loizou, 1972]. L’innervazione noradrenergica delle regioni target sarà completata però sola‐
mente alla 3 settimana di vita postnatale [Markus e Petit, 1987; Berger‐Sweeney e Hohmann, 1997]. In questo periodo le concentrazioni di Noradrenalina raggiungono i valori adulti nel Bulbo e nel Cervelletto [Rho e Storey, 2001] mentre nelle aree supe‐
riori tali livelli saranno raggiunti solamente fra P30 e P40 [Loizou e Salt, 1970; Konkol et al., 1978; Morris et al., 1980]. Analogamente, i primati non umani presentano neu‐
roni che producono Noradrenalina già fra la 5a e la 6a settimana di gestazione ed un’innervazione noradrenergica della Corteccia all’8a, con tempi paragonabili a quelli umani, ma la densità dell’innervazione noradrenergica terminale a 6 mesi di vita è so‐
lamente la metà di quella che si raggiunge verso i 2 anni [Murrin et al., 2007]. Anche l’attività di scarica dei neuroni noradrenergici cresce in maniera simile all’innervazione terminale, aumentando progressivamente dalla nascita fino a P20 [Nakamura et al., 1987]. Inoltre l’attività dei recettori noradrenergici α2 raggiunge un picco proprio in questo periodo [Happe et al., 1999] come quella dei recettori β che subisce un incremento drammatico nelle prime due settimane di vita [Harden et al., 1977]. Da notare infine che da P10 a P30 si osserva una robusto aumento nella densi‐
|7| INTRODUZIONE tà delle sinapsi noradrenergiche, seguito poi da un lieve calo fra P30 e P60 per rag‐
giungere la densità adulta [Markus e Petit, 1987]. Esistono molte evidenze di una diversa funzionalità noradrenergica nel SNC in via di sviluppo rispetto a quello adulto. È stato osservato infatti come nel neonato si ab‐
bia una diversa regolazione noradrenergica dell’espressione dei recettori α2, dell’ e‐
spressione di geni precoci e della stimolazione di Chinasi Regolate da Segnali Extracellulari (ERK) nell’Ippocampo [Murrin et al., 2007]. Inoltre, anche la stimola‐
zione dei recettori α2 determina effetti molto diversi, se non opposti, in periodi diver‐
si dello sviluppo [Reinstein e Isaacson, 1977]. Di particolare interesse sono anche le diverse evidenze circa il ruolo fondamentale svolto dal Sistema noradrenergico nella formazione del SNC ed in particolare della Corteccia [Lauder e Bloom, 1974; Murrin et al., 2007; Sanders et al., 2008]. Ciò è di particolare rilevanza ai fini della maturazione di funzioni proprie di regioni corticali come quelle associate ad eventi di apprendimento e memoria. 1.1.2. Anatomia Le strutture nelle quali sono presenti neuroni noradrenergici all’interno del Siste‐
ma nervoso Centrale (SNC) sono essenzialmente due: il Tegmento Laterale ed il Locus Coeruleus (LC). Topograficamente i gruppi di neuroni noradrenergici del SNC vengo‐
no suddivisi secondo la classificazione proposta negli anni ’60 del ̕900 da Dahlström e Fuxe [1964], che individua 6 gruppi di cellule noradrenergiche denominati A1, A2, A4‐A7. Il Tegmento Laterale viene diviso in due parti: una, midollare, giace in parte nella formazione reticolare laterale e ventrale del bulbo caudale (A1) e in parte nel tratto solitario e nel nucleo motorio dorsale del nervo vago (A2). La seconda parte è collocata nel ponte e comprende le zone A5 e A7; il gruppo A7 costituisce la parte più rostrale del sistema noradrenergico ed è posizionato medialmente e all’interno del nucleo del lemnisco laterale; il gruppo A5, invece, giace più ventralmente e contribui‐
sce a formare parte della cosiddetta area del Sub­Cœruleus (SubC). Le cellule nora‐
drenergiche del Tegmento Laterale proiettano principalmente verso il midollo spinale, oltre ad essere la principale fonte di innervazione noradrenergica del bulbo; |8| INTRODUZIONE tuttavia queste cellule forniscono anche parte dell’innervazione noradrenergica dell’ipotalamo. Nella presente tesi l’attenzione verrà focalizzata sull’altra struttura che costituisce il sistema noradrenergico del SNC, il LC. Esso è composto da un gruppo compatto di cellule posizionato nella sostanza grigia laterale dell’istmo del ponte (gruppo A6); al‐
cune cellule si estendono poi lungo il tegmento dorso‐laterale fino ad arrivare, con le sue ultime propaggini, al tetto del 4°ventricolo (A4). La parte più ventrale della popo‐
lazione cellulare A6 va inoltre a costituire, assieme al gruppo A5, l’area del SubC. [Moore e Card, 1984]. Pur essendo composto da un numero relativamente basso di cellule (da 45'000 a 60'000 nell’uomo [German et al., 1988; Baker et al., 1989] e circa 1'500 per nucleo nel ratto[Berridge e Waterhouse, 2003]) il LC innerva la maggior parte delle strutture del SNC [Jones et al., 1977] (Fig.1.1). Le fibre discendenti provenienti dal LC vanno ad in‐
nervare nella quasi totalità il Midollo Spinale (SC); fornendo l’innervazione noradre‐
nergica alle corna dorsali, a quelle ventrali e ai neuroni spinali della colonna cellulare intermediolaterale [Nygren e Olson, 1977; Westlund et al., 1982; Westlund et al., 1983]. Fibre provenienti dal LC vanno inoltre ad innervare diverse aree del Bulbo, fra cui i nuclei parasimpatici di Edinger‐Westphal, il nucleo Salivatorio ed il nucleo Vaga‐
le Parasimpatico, i nuclei Premotori Simpatici (Bulbo Rostroventrolaterale e Rafe Caudale), il Rafe Dorsale, il Tegmento Laterodorsale e Peduncolopontino, ed i nuclei motori (facciale, ippoglosso, trigemino, e oculomotore) e sensoriali (trigemino e co‐
cleare) [Samuels e Szabadi, 2008a]. Inoltre il LC innerva anche il cervelletto ed in par‐
ticolare la corteccia cerebellare [Saigal et al., 1980]. Anche l’encefalo presenta una diffusa innervazione noradrenergica proveniente quasi esclusivamente dal LC. Nume‐
rose fibre noradrenergiche sono presenti nel Talamo, specialmente quello dorsale, e nell’Ipotalamo, nel Prosencefalo di Base (in particolare la regione del Setto Mediale‐
Banda Diagonale di Broca), nell’Amigdala ed in altre zone del diencefalo [Samuels e Szabadi, 2008a]. Ma le aree encefaliche dove le fibre noradrenergiche provenienti dal LC sono più dense sono la neocorteccia (in particolare la corteccia frontale e cingolata [Levitt e Moore, 1979]) e l’Ippocampo, in particolare il giro dentato (DG) [Swanson e Hartman, 1975]. |9| INTRODUZIONE Fig. 1.1 Innervazione Noradrenergica del Sistema Nervoso Centrale Rappresentazione schematica sul piano sagittale dell’innervazione noradrenergi‐
ca del SNC. Si noti come il Locus Cœruleus (LC), pur essendo costituito da un nu‐
mero relativamente basso di neuroni proietti le sue fibre praticamente su tutti il Sistema Nervoso Centrale. [Modificato da Sara, 2009] Pur presenti in piccolo numero, quindi, i neuroni noradrenergici sono in grado di innervare la quasi totalità del SNC, confermando così le osservazioni riguardanti l’alto numero di collateralizzazioni nelle proiezioni assonali di queste cellule [Loughlin et al., 1982]. Un tale arrangiamento determina la capacità di questo sistema neurotra‐
smettitoriale di poter regolare simultaneamente molteplici zone del SNC anche di‐
stanti tra loro [Berridge e Waterhouse, 2003]. È interessante notare che il LC riceve ugualmente input da numerose strutture del SNC: Neocorteccia, Amigdala, Ipotalamo, Tegmento Laterale, Nuclei del Rafe, Bulbo, Cervelletto e SC. [Samuels e Szabadi, 2008a]. 1.1.3. La Trasmissione Noradrenergica Come sottolineato in precedenza, l’innervazione noradrenergica è molto diffusa all’interno del SNC, tuttavia l’effetto di tale innervazione determina esiti diversi in zo‐
ne differenti. Ciò perché esistono diversi recettori in grado di legare la Noradrenalina. Questi recettori sono tutti accoppiati a proteina G e possono essere suddivisi in 3 |10| INTRODUZIONE classi: gli α1 mediano effetti eccitatori postsinaptici, mentre i recettori α2 inibiscono [Jones, 2004]. Anche i recettori β sembrano poter essere classificati come eccitatori [Berridge e Waterhouse, 2003]. Il fatto di essere recettori accoppiati a proteina G de‐
termina un’attivazione relativamente lenta rispetto ai recettori ionotropici. Questo si‐
stema di trasmissione è perciò più adatto ad una regolazione tonica nell’eccitabilità cellulare, rallentando o facilitando la trasmissione del segnale, piuttosto che alla tra‐
smissione diretta o fasica di potenziali d’azione [Kasparov e Teschemacher, 2009]. Peculiare è anche la modalità di trasmissione tipica di questi neuroni. Infatti, solo un quinto della Noradrenalina prodotta dalle cellule del LC viene rilasciata da sinapsi vere e proprie [Seguela et al., 1990], mentre la maggior parte del trasmettitore sem‐
bra essere prodotta e rilasciata in corrispondenza delle varicosità, presenti sia sugli assoni che su dendriti dei neuroni noradrenergici [Kasparov e Teschemacher, 2009]. Su queste varicosità potrebbe quindi instaurarsi un rilascio extrasinaptico di Nora‐
drenalina che potrebbe così diffondere ad una certa distanza dal sito di rilascio agen‐
do su recettori adrenergici posti sia su neuroni che su cellule di origine gliale, con una modalità denominata trasmissione di volume [Marien et al., 2004; Sara, 2009]. Questo tipo di trasmissione, tipica di neuroni neuromodulatori, permette un’influenza più diffusa nello spazio e nel tempo sull’eccitabilità e sulla plasticità sinaptica [Sara, 2009] ed è compatibile con l’evidenza che alcuni effetti della trasmissione noradre‐
nergica coinvolgano intermediari di origine gliale [Stone e Ariano, 1989; Kasparov e Teschemacher, 2009]. Infine è da notare come i neuroni noradrenergici spesso rilascino, oltre alla Nora‐
drenalina, anche altre sostanze tra le quali ATP, neuropeptide Y, galanina, Brain­
Derived Neurotrophic Factor (BDNF), encefalina ed altre neurotrofine [Weinshenker, 2008] [Marien et al., 2004]. 1.1.4. Le Funzioni del Sistema Noradrenergico Come sopra riportato, i medesimi neuroni del LC innervano diverse zone del SNC. All’alto grado di collateralizzazione assonica, pertanto, si associano anche le moltepli‐
|11| INTRODUZIONE ci funzioni nelle quali questo sistema sembra essere implicato. Di seguito verranno discusse alcune fra quelle più rilevanti. Le proiezioni noradrenergiche discendenti Le proiezioni noradrenergiche discendenti, che si originano dai neuroni posti più ventralmente nel LC e da quelli dell’area del SubC [Holstege e Kuypers, 1987], sono state associate alla modulazione di alcuni aspetti dell’attività spinale quali l’attività motoria riflessa e/o organizzata in pattern [Anden et al., 1966], la trasmissione degli stimoli nocicettivi [Jones e Gebhart, 1986] e l’aumento dell’eccitabilità motoneuronale [Hultborn e Kiehn, 1992]. L’innervazione delle corna dorsali, nelle quali risiedono i corpi cellulari dei neuroni deputati al trasporto delle informazioni sensoriali relative al dolore, alla temperatura, al tatto, alla pressione e alla propriocezione, determine‐
rebbe una regolazione di tipo inibitorio della trasmissione degli impulsi nervosi. Ed effettivamente in questa regione si è osservata la ricca presenza di recettori adrener‐
gici di tipo α2 (inibitori) [Pascual et al., 1992; Smith et al., 1995; Lang et al., 2003]. L’innervazione di quest’area da parte del LC sarebbe particolarmente importante per regolare la nocicezione, poiché modulando negativamente la trasmissione degli im‐
pulsi nervosi originati da stimoli dolorifici determina importanti fenomeni di analge‐
sia [Simson, 2001]. Ciò è confermato anche da studi che impiegavano agonisti selettivi dei recettori α2 [Eisenach et al., 1996]. Per quanto riguarda l’innervazione noradrenergica delle corna ventrali del SC, è stato dimostrato che sulla superficie cellulare dei motoneuroni sono presenti recetto‐
ri noradrenergici di tipo eccitatorio [Day et al., 1997; Domyancic e Morilak, 1997; Smith et al., 1999]. Qui L’innervazione noradrenergica faciliterebbe la risposta dei motoneuroni agli input eccitatori [White et al., 1991]. Infatti, l’applicazione microion‐
toforetica di Noradrenalina nello spazio extracellulare del SC di ratto determina un aumento dell’attività di scarica dei motoneuroni [White e Neuman, 1980]. Il LC coor‐
dinerebbe la velocità e l’efficacia degli stimoli superiori e, agendo simultaneamente sugli input sensoriali e gli output motori, gestirebbe sia la ricezione che la risposta agli stimoli ambientali importanti per la sopravvivenza dell’organismo [Berridge e Wa‐
terhouse, 2003]. |12| INTRODUZIONE Inoltre è stato ampiamente dimostrato che l’innervazione noradrenergica spinale ha un ruolo fondamentale nella regolazione dell’attività dei generatori di pattern pre‐
senti localmente. In particolare la stimolazione dei recettori noradrenergici sarebbe in grado di attivare i circuiti neuronali che regolano l’attività locomotoria nel gatto [Marcoux e Rossignol, 2000]. Nella Colonna Cellulare Mediolaterale si trovano gruppi neuronali che fanno parte del Sistema Nervoso Autonomo Ortosimpatico mentre, nei segmenti sacrali, sono pre‐
senti gruppi propri della componente Parasimpatica. Le proiezioni dal LC alla Colon‐
na Cellulare Mediolaterale sembrano eccitare direttamente i neuroni pregangliari simpatici [Lewis e Coote, 1990; Pieribone et al., 1994], mentre sembrano avere un duplice ruolo nei segmenti sacrali. Qui la densità di fibre noradrenergiche è minore e da un lato sembra attivare gli interneuroni inibitori che determinano un calo nell’attività del sistema Parasimpatico [Yoshimura et al., 1990], dall’altro sembra ini‐
bire direttamente i neuroni parasimpatici [Unnerstall et al., 1984; Smith et al., 1995; Yaici et al., 2002]. L’innervazione ascendente Molto più complesso è il ruolo dell’innervazione noradrenergica ascendente. Le prime teorie formulate negli anni ’70 del secolo scorso davano a questo sistema neu‐
rotrasmettitoriale un ruolo fondamentale nel controllo della vigilanza e dei cicli son‐
no‐veglia [Hobson et al., 1975]. Venne poi ipotizzato un suo coinvolgimento nell’attivazione comportamentale [Aston‐Jones e Bloom, 1981] oltre che nella regola‐
zione delle funzioni cardiovascolari e respiratorie [Amaral e Sinnamon, 1977]. Nono‐
stante l’evidente ruolo di questo sistema nel mantenimento della vigilanza, negli anni al LC venne assegnato un ruolo in diverse altre funzioni, tra cui il processing delle in‐
formazioni sensoriali [Hurley et al., 2004; Heath et al., 2006] e l’attenzione [Robbins, 1984; Robbins, 1997]. Inoltre, sempre più chiaro appare il ruolo chiave che il Sistema Noradrenergico potrebbe svolgere nella regolazione dei fenomeni di apprendimento e memoria [Amaral e Foss, 1975; Everitt et al., 1983]. Una tale ipotesi è da porre sostanzialmente in relazione alla presenza di una ricca innervazione noradrenergica dell’Ippocampo [Swanson e Hartman, 1975], una strut‐
|13| INTRODUZIONE tura notoriamente implicata nei fenomeni di apprendimento e memoria [Becker et al., 1980; Compton, 1991], ma anche ai disturbi cognitivi osservati dopo la deafferenta‐
zione noradrenergica dell’ippocampo [Marien et al., 2004]. Noradrenalina e neuroinfiammazione L’innervazione noradrenergica sembra giocare un ruolo importante nei fenomeni infiammatori nel SNC [Carnevale et al., 2007]. È stato infatti osservato come la Nora‐
drenalina sia in grado di bloccare l’espressione del Complesso Maggiore di Istocom‐
patibilità II [Frohman et al., 1988], del Fattore di Necrosi Tumorale α (TNFα) [Hu et al., 1991b] e dell’Interleuchina 1β (IL‐1β) [Willis e Nisen, 1995], nonché di inibire l’espressione dell’ Isoforma Inducibile dell’Ossido Nitrico Sintasi (iNOS) [Feinstein, 1998; Galea e Feinstein, 1999]. La Noradrenalina sarebbe inoltre in grado di inibire l’attivazione degli Astrociti e della microglia indotta a sèguito di fenomeni infiamma‐
tori [Feinstein et al., 2002; Heneka et al., 2003] e di stimolare la fagocitosi da parte dei Macrofagi [Kalinin et al., 2007]. 1.1.5. Il Sistema Noradrenergico nell’apprendimento e Memoria La plasticità sinaptica La plasticità sinaptica è la capacità del sistema nervoso di modificare l'efficienza di funzionamento delle sinapsi, di instaurarne di nuove e di eliminarne alcune. Questa proprietà permette al sistema nervoso di modificare la sua funzionalità e la sua strut‐
tura in modo più o meno duraturo in modo dipendente dagli eventi e sta alla base del fenomeno dell’apprendimento e della memoria. Eventi di plasticità sinaptica includo‐
no l'aumento o la riduzione dell'efficienza di trasmissione di una sinapsi come accade durante il potenziamento a lungo termine (Long Term Potentiaton ­ LTP ) o la depres‐
sione a lungo termine (Long Term Depression ‐ LTD) [Per una trattazione più estesa vediKandel et al., 2000] Già negli anni ’80 del ̕900 è stato osservato che la Noradrenalina ha un ruolo per‐
missivo nella formazione della LTP in tutte le aree dell’Ippocampo [Harley, 1987]. Più |14| INTRODUZIONE recentemente alcuni studi hanno gettato nuova luce sul significato dell’azione della Noradrenalina nel funzionamento dell’Ippocampo. Si è osservato infatti che i neuroni del LC aumentano la loro attività di scarica quando l’animale incontra un nuovo og‐
getto in un ambiente conosciuto [Vankov et al., 1995; Sara, 1998] Nella stessa situa‐
zione, inoltre, la risposta del DG alla stimolazione della via perforante è significativamente maggiore; ciò tuttavia non accade se gli animali vengono trattati con Propranololo, un antagonista dei recettori β [Kitchigina et al., 1997]. Ancora, si è osservato che esponendo l’animale ad un test simile dopo aver indotto una lieve sti‐
molazione tetanica in questa pathway, si ottiene un LTP completo [Uzakov et al., 2005]. Allo stesso modo si ha un rafforzamento dell’LTP quando agli animali, a cui viene somministrata una stimolazione tetanica della via perforante, vengono sommi‐
nistrati contestualmente stimoli positivi o negativi [Seidenbecher et al., 1997]; effetto inibito anche in questo caso dal Propranololo [Straube et al., 2003]. Studi di condizio‐
namento su primati hanno dimostrato infatti che anche la ricompensa [Sara e Segal, 1991; Bouret e Sara, 2004] o la punizione [Chen e Sara, 2007] determinano un au‐
mento di attività dei neuroni del LC. Anche la LTD sembra essere facilitata da modifi‐
cazioni in un ambiente conosciuto e anch’essa sembra essere modulabile dall’innervazione noradrenergica [Kemp e Manahan‐Vaughan, 2008]. Tutti questi dati poi sono confermati da studi che riportano come la LTP [Gelinas et al., 2008] e la for‐
mazione della memoria [Brightwell et al., 2007] a lungo termine vengano facilitate dalla cascata di segnale prodotta dall’aumento del cAMP, una delle conseguenze dell’attivazione dei recettori β. Da queste osservazioni si evince quindi che la nora‐
drenalina potrebbe giocare un ruolo molto importante nel consolidamento di quei fe‐
nomeni sinaptici, quali LTP e LTD, che sono alla base della memoria [Sara, 2009]. Apprendimento e Memoria Acquisizioni recenti suggeriscono che la Noradrenealina regoli le funzioni di ap‐
prendimento e memoria agendo in particolare sui processi di consolidamento e recu‐
pero (retrieval) dell’informazione memorizzata [Sara, 2009]. Studi farmacologici hanno evidenziato come, nel ratto, la stimolazione di recettori noradrenergici sia fondamentale per il mantenimento dell’apprendimento in una spe‐
|15| INTRODUZIONE cifica finestra temporale. Infatti somministrando intracerebralmente antagonisti dei recettori noradrenergici 2 ore dopo una sessione di apprendimento gli animali pre‐
sentano amnesia quando testati nuovamente. Quest’amnesia non si osserva se il me‐
desimo composto è somministrato all’animale subito dopo la sessione di apprendimento (5 min o 1 ora) o molto tempo dopo (5 ore)[Sara et al., 1999]. Ed ef‐
fettivamente in animali sottoposti ad un protocollo sperimentale simile, circa 2 ore dopo la sessione di apprendimento si può osservare un picco dei livelli di Noradrena‐
lina in alcune aree cerebrali suggerendo un coinvolgimento specifico di questo neuro‐
trasmettitore nel consolidamento della memoria acquisita [Tronel et al., 2004].Il ruolo della Noradrenalina nel consolidamento della memoria potrebbe poi essere le‐
gato anche ad alcune fasi del sonno, in particolare al sonno ad onde lente (Slow Wave Sleep – SWS), durante il quale, a seguito di una intensa attività di apprendimento, si può osservare un aumento dell’attività del LC normalmente quiescente durante il sonno [Eschenko e Sara, 2008]. È stato inoltre dimostrato che l’attivazione della ca‐
scata di segnale derivante dalla Proteina Chinasi cAMP‐dipendente (PKA), uno dei meccanismi di trasduzione del segnale derivante dall’attivazione dei recettori nora‐
drenergici, è fondamentale nel consolidamento della memoria e nell’instaurarsi di un LTP che duri nel tempo [Huang et al., 2006]. Infine è da sottolineare come alcuni studi abbiamo rivelato il ruolo fondamentale dell’innervazione noradrenergica del Nucleo Basolaterale dell’Amigdala (BLA) nei fenomeni di consolidamento della memoria; i‐
niettando infatti antagonisti di recettori noradrenergici nel BLA si annullano gli effetti noradrenergici su questo fenomeno; al contrario iniettando Noradrenalina nel BLA dopo l’apprendimento si osserva un aumento dose e tempo‐dipendente della capacità di memoria [McGaugh e Roozendaal, 2009]. Il recupero della memoria (memory retrieval) è quel processo di integrazione degli stimoli ambientali rilevanti con i circuiti della memoria attivato dagli stimoli ambien‐
tali stessi [Tulving e Thompson, 1973]. Diversi studi hanno evidenziato un coinvolgi‐
mento noradrenergico in questo fenomeno. Innanzitutto si è osservato che aumentando farmacologicamente l’attività del Sistema Noradrenergico con agonisti α2 [Sara e Devauges, 1989] o stimolando elettricamente il LC [Sara e Devauges, 1988] si può ottenere una facilitazione del recupero in ratti che avevano dimenticato la se‐
|16| INTRODUZIONE quenza dei movimenti all’interno di un labirinto. Tale facilitazione è stata vista essere dipendente dalla stimolazione di recettori β [Devauges e Sara, 1991]. Lo stesso effetto può essere ottenuto esponendo gli animali al contesto sperimentale, quando questo è legato a studi di rinforzo; e questa facilitazione è probabile sia data dall’attivazione dei circuiti di eccitazione dei quali il LC fa parte [Sara, 1985; Sara, 2000; Sara e Hars, 2006]. Ulteriori studi hanno evidenziato come animali transgenici mancanti della Dopa‐
mina β‐Idrossilasi (DBH), un enzima fondamentale nella biosintesi della Noradrenali‐
na, siano in grado di apprendere in un test di contextual fear conditioning ma presentino un deficit nel recupero della memoria quando testati a 48 ore dalla sessio‐
ne di apprendimento. Tale deficit viene meno se all’animale vengono somministrati agonisti dei recettori β subito prima del test. Gli stessi deficit nel recupero della me‐
moria sono stati osservati iniettando agli animali un antagonista dei recettori β, il Propranololo, subito prima di testare gli animali a 24 ore dalla sessione di apprendi‐
mento. Ciò non è tuttavia valido quando gli animali vengono testati 1 ora o 1 settima‐
na dopo la sessione di apprendimento suggerendo che la Noradrenalina sia necessaria solamente nel recupero delle memorie durante uno specifico periodo di consolidamento, mentre, una volta che la memoria sia consolidata, il recupero di essa diventa indipendente dalla stimolazione noradrenergica [Murchison et al., 2004]. Infine studi effettuati utilizzando la Risonanza Magnetica Funzionale (fMRI) sull’uomo hanno dimostrato come nel recupero della memoria, in particolare nel ri‐
conoscimento di volti neutri, vi sia un’attivazione del LC se e solo se nella fase di ap‐
prendimento vi sia stato un coinvolgimento emotivo, misurato tramite la dilatazione della pupilla. In tal caso potrebbero rinforzarsi le connessioni fra LC e Amigdala, ciò che si suppone sia fondamentale nell’attivazione dei circuiti neurali prosencefalo‐
fronto‐ippocampali, necessari nei fenomeni di recupero [Sterpenich et al., 2006]. 1.1.6. Patologie Legate al Sistema Noradrenergico Date le numerose funzioni in cui è implicato non sorprende che il Sistema nora‐
drenergico del LC/SubC sia coinvolto in diverse patologie. Alterazioni nell’attività dei |17| INTRODUZIONE neuroni noradrenergici del LC sembrano essere implicate in vari disturbi del compor‐
tamento tra cui diverse forme di ansia [Samuels e Szabadi, 2008b], nelle malattie da stress [Dunn e Swiergiel, 2008], in particolare nel Disordine da Stress Post‐
Traumatico [Krystal e Neumeister, 2009], e nella depressione [Zubenko et al., 1990; Thor et al., 2007]. La Noradrenalina sembra inoltre avere un ruolo nella suscettibilità agli attacchi epilettici [Bengzon et al., 1993; Weinshenker e Szot, 2002]. Inoltre esi‐
stono evidenze circa un coinvolgimento noradrenergico in alcune patologie neurode‐
generative. Per esempio, per quanto riguarda il morbo di Parkinson, diversi studi anatomici, elettrofisiologici, neurochimici e comportamentali indicano che la Nora‐
drenalina è importante nel funzionamento della via Nigro‐striatale; vi è infatti una marcata riduzione dei neuroni noradrenergici nel LC di pazienti affetti da tale patolo‐
gia [Zarow et al., 2003; Marien et al., 2004]. Numerosi dati sperimentali fanno anche supporre un coinvolgimento primario del Sistema Noradrenergico nella patologia di Alzheimer (AD) [vedi 1.3.4]. 1.1.7. Lesioni al Sistema Noradrenergico Nello studio della fisiologia del Sistema noradrenergico grande importanza hanno avuto, oltre a quelli elettrofisiologi, anche gli approcci basati sulla lesione sperimenta‐
le dei neuroni noradrenergici, che hanno permesso di accertare il coinvolgimento di tale sistema nella regolazione, tra gli altri, dei fenomeni di apprendimento e memoria [Nieuwenhuis et al., 2005]. Diversi studi hanno pertanto evidenziato come l’innervazione noradrenergica sia coinvolta nei processi di consolidamento della me‐
moria e come la sua rimozione renda i processi mnemonici meno stabili e più suscet‐
tibili alle interferenze [Compton et al., 1995; D'Hooge e De Deyn, 2001]. Al contrario, approcci basati sul farmacologico della trasmissione nei roditori hanno dato scarsi ri‐
sultati quando impiegati nello studio della regolazione noradrenergica dei fenomeni cognitivi [Marien et al., 2004]. La quasi totalità degli esperimenti di lesione è stata effettuata con procedure elet‐
trolitiche [Compton et al., 1995] o utilizzando tossine, quali la 6‐idrossi‐dopamina (6‐
OHDA) [Brenner et al., 1987] e la 1‐metil‐4‐fenil‐1,2,3,6‐tetraidropiridina (MPTP) |18| INTRODUZIONE [Hallman et al., 1985], non completamente specifiche per i neuroni noradrenergici e i cui effetti perturbano anche neuroni che utilizzano la dopamina o la serotonina come neurotrasmettitore [Hu et al., 1991a; Engelbrecht et al., 1994]. Maggior specificità si è ottenuta mediante l’introduzione della N‐(2cloroetil)‐N‐etil‐2‐bromobenzilamina (DSP‐4) [Jonsson et al., 1981]. Anche questa tossina ha però dimostrato di non essere completamente selettiva. La sua somministrazione sistemica determinava infatti una deplezione dei neuroni serotoninergici [Hallman et al., 1984]. Solo negli anni ’90 del secolo scorso è stata introdotta una nuova immunotossina specifica per i neuroni no‐
radrenergici, Anti­Dopamine­Beta­Hydroxylase­Saporin (αDBHsap). Questa tossina è il risultato della coniugazione di un anticorpo contro la Dopamina β‐idrossilasi e della Saporina [Picklo et al., 1994; Wrenn et al., 1996]. La Saporina, estratta dalla Saponaria officinalis [Lappi et al., 1985], fa parte della famiglia di proteine inattivanti i ribosomi (RIP) di tipo 1 [Davis e Wiley, 1989] le quali inibiscono, legandola, la subunità 60S dei ribosomi eucariotici. La Saporina è dotata di una tossicità molto bassa in quanto non è in grado di penetrare facilmente all’interno delle cellule [Davis e Wiley, 1989], per questo viene coniugata a vari anticorpi in mo‐
do da aumentarne la citotossicità e la specificità [confronta Wiley, 1992]. L’enzima DBH, come già accennato, è implicato nella produzione di Noradrenalina ed è normalmente localizzato nel citoplasma. Esso però si sposta sulla membrana cel‐
lulare durante il rilascio del neurotrasmettitore. Quando l’immunotossina giunge in prossimità della cellula, la parte immunoglobulinica riconosce e lega l’antigene di su‐
perficie ed il complesso risultante viene endocitato e trasportato in modo retrogrado fino al soma dove la Saporina, staccatasi, si lega al ribosoma, inibendo la sintesi pro‐
teica e determinando la morte per apoptosi della cellula [Studelska e Brimijoin, 1989]. Grazie a questo meccanismo, quindi, l’immunotossina possiede un’elevata spe‐
cificità per i soli neuroni noradrenergici centrali che vengono efficacemente lesionati dopo iniezione i.c.v. nel ratto adulto [Wrenn et al., 1996]. Tuttavia non sono al presen‐
te disponibili dati circa gli effetti dell’immunotossina sul sistema noradrenergico in via di sviluppo, nel quale le proiezioni efferenti dai suoi neuroni vanno incontro a marcate variazioni plastiche. |19| INTRODUZIONE 1.1.8. Interazione con Altri Sistemi Neurotrasmettitoriali Naturalmente l’innervazione Noradrenergica non è la sola a regolare i processi co‐
gnitivi. Numerose evidenze dimostrano come nella regolazione dei processi di ap‐
prendimento e memoria il Sistema Noradrenergico interagisca in modo stretto con altri sistemi neurotrasmettitoriali, tra cui il serotoninergico [Birthelmer et al., 2003] e ancor di più il Sistema Colinergico del Prosencefalo Basale [Jackisch et al., 2008; Scheiderer et al., 2008] [vedi 1.2.4] 1.2. Il Sistema Colinergico del Prosencefalo Basale Il Sistema Colinergico del Prosencefalo di Base (Basal Forebrain) è parte di un con­
tinuum molto più ampio di cellule colinergiche distribuite lungo tutto il SNC, dalle porzioni rostrali dello Striato fino, caudalmente, ai motoneuroni spinali [Woolf, 1991]. Tale struttura sembra regolare fenomeni quali l’attenzione e l’apprendimento ed è stata implicata nelle alterazioni cognitive presenti in diverse patologie neurolo‐
giche e neuropsichiatriche quali la AD, il morbo di Parkinson (di cui sembra ormai stabilita la natura di deficit non esclusivamente motorio [Ibarretxe‐Bilbao et al., 2009]) e la schizofrenia [Heimer et al., 1991; Dunnett e Fibiger, 1993; Everitt e Rob‐
bins, 1997]. 1.2.1. Anatomia Il Prosencefalo Basale è composto da diversi nuclei neuronali situati sulle superfici mediali e ventrali degli emisferi cerebrali, fra questi nuclei vi sono il Setto Mediale (MS), le branche orizzontali (hDBB) e verticali (vDBB) della Banda Diagonale di Bro‐
ca, e il Nucleo Basale Magnocellulare (NBM) (Fig. 1‐2), l’omologo dei Nuclei Basali di Meynert nei primati [Zaborszky et al., 1997; Zaborszky et al., 1999]. Queste aree sono composte da diversi sottotipi neuronali, fra i quali si distinguono neuroni colinergici, |20| INTRODUZIONE GABAergici, peptidergici, e probabilmente anche glutamatergici [Zaborszky et al., 2002]. All’interno di questa struttura i neuroni colinergici danno origine al cosiddetto Si‐
stema Colinergico del Prosencefalo Basale (Basal Forebrain Cholinergic System) il qua‐
le proietta verso varie strutture limbiche e corticali [Woolf, 1991]. Fig. 1.2 Il Sistema Colinergico del Prosencefalo di Base del Ratto Nella rappresentazione schematica su piano sagittale si noti in A come il Setto Mediale (MS) e la Banda Diagonale di Broca (vDBB e hDBB) innervino principal‐
mente l’Ippocampo. In B, si noti come le cellule colinergiche del Nucleo Basale Magnocellulare (NBM) innervino tutti i territori corticali (PF; PAR; TEMP; OCC). I neuroni del MS, la parte più rostrale di questo sistema, inviano le loro fibre coli‐
nergiche (ma anche GABAergiche) alla corteccia cingolata ed entorinale, zone ritenute fondamentali nei processi di memoria ed attenzione, ed inoltre, attraverso la fimbria |21| INTRODUZIONE ed il fornice dorsale, forniscono le afferenze colinergiche alle zone CA1 e CA3 e del DG dell’ ippocampo [Raisman, 1966; Lewis e Shute, 1967]. Alle stesse zone proietta anche la vDBB la quale manda alcune fibre anche all’ipotalamo ed ai bulbi olfattivi, aree in‐
nervate anche dall’hDBB [Mesulam et al., 1983]. I neuroni colinergici dei NBM inner‐
vano invece in maniera diffusa la Neocorteccia e l’Amigdala [Page e Sofroniew, 1996; Smiley et al., 1999] (Fig. 1.2). Le proiezioni da questa struttura nei primati presentano un’organizzazione più complessa, probabilmente in relazione alla maggior specializ‐
zazione funzionale delle zone da essa innervate che si osserva in queste specie [Ridley e Baker, 1991]. 1.2.2. Lo Sviluppo del Sistema Colinergico Basale Nel ratto, i neuroni colinergici del Prosencefalo di Base si originano secondo un gradiente caudo‐rostrale, fra il dodicesimo (E12) e il sedicesimo (E16) giorno dal concepimento. Più o meno contemporaneamente, tra E13 e E17, e seguendo lo stesso modello spaziale, migrano attivamente dalla regione germinativa periventricolare fi‐
no alle loro destinazioni finali [Semba e Fibiger, 1988; Brady et al., 1989]. Giunti nelle strutture che occuperanno nella vita adulta, tali cellule incominciano ad esprimere i marker tipici dell’attività colinergica, ossia l’acetilcolinesterasi (AChE) [Eckenstein e Sofroniew, 1983] e la Colina‐acetiltransferasi (ChAT) [Armstrong et al., 1987] nonché il recettore a bassa affinità per il Nerve Growth Factor (p75NTR) [Yan e Johnson, 1988]. Già da E15 i neuroni del sistema colinergico basale incominciano ad emettere fibre che raggiungono le specifiche regioni terminali in Ippocampo e Corteccia attorno alla nascita. La maturazione delle proiezioni è però completa solamente verso la quarta settimana post‐natale [Milner et al., 1983; Koh e Loy, 1989]. Nello stesso periodo an‐
che la maturazione dei marker colinergici viene completata [Coyle e Yamamura, 1976; Hohmann e Ebner, 1985]. |22| INTRODUZIONE 1.2.3. Le Funzioni del Sistema Colinergico del Prosencefalo Basale Come discusso in precedenza per il Sistema Noradrenergico, lo studio delle funzio‐
ni del Sistema Colinergico Basale è stato basato sull’osservazione degli effetti del blocco farmacologico (di cui si parlerà più avanti) o della lesione dei suoi neuroni. Questi esperimenti sono stati condotti, nella maggior parte dei casi, allo scopo di co‐
struire un modello per la AD basato sulla nota ipotesi colinergica [vedi 1.3.5]. Una prima tecnica utilizzata per valutare il ruolo delle afferenze dal MS sulle fun‐
zioni cognitive è stata quella di interrompere la via colinergica setto‐ippocampale ef‐
fettuando una resezione delle fibre che transitano per il fimbria‐fornice. Questo insulto determina la degenerazione retrograde dei neuroni colinergici che, attraverso questa via, proiettano i loro assoni. Questo tipo di lesione, quando effettuata bilate‐
ralmente, provoca negli animali evidenti deficit cognitivi in test comportamentali qua‐
li il Radial Arm Maze [Bratt et al., 1995] ed il Morris Water Maze [Nilsson et al., 1987]. Un limite di questo modello, tuttavia, è rappresentato dal fatto che attraverso il fim‐
bria‐fornice passano anche fibre noradrenergiche provenienti dal LC e serotoninergi‐
che provenienti dai nuclei del Raphe oltre che le GABAergiche derivanti dallo stesso MS [McDonald e Overmier, 1998] rendendo poco specifica la deafferentazione risul‐
tante. Ciò nonostante, tale procedura di lesione si è rivelata preziosa in studi mirati all’analisi degli eventi di sprouting compensatori nelle proiezioni setto‐ippocampali [Gage et al., 1983; Leanza et al., 1993]. Maggiore successo si è ottenuto mediante l’utilizzo di vari tipi di tossine iniettate all’interno del SNC. Nei primi lavori in questo campo venivano utilizzate delle eccito‐
tossine, quali l’acido ibotenico, iniettate direttamente nei nuclei basali magnocellulari di ratto. Mediante queste lesioni si ottenevano deficit in numerosi test comportamen‐
tali quali il Morris Water Maze, il Passive Avoidance ed il Delayed Non­Matching­to­
Position [Fibiger, 1991]. Effettuando, però, la lesione con tossine più specifiche, quali l’acido α‐amino‐3‐idrossi‐4‐isoxasole‐propionico (AMPA), molti di questi effetti appa‐
rivano ridotti o inesistenti [Page et al., 1991]. Al contrario lesioni eccitotossiche a li‐
vello del MS, usando acido quinolinico [Leutgeb e Mizumori, 1999] o AMPA |23| INTRODUZIONE [McAlonan et al., 1995], hanno permesso di indurre deficit in test per la valutazione della Working Memory [vedi 3.3.2 – Radial Arm Water Maze], uno dei disturbi cogniti‐
vi propri dell’AD. Anche questi metodi si sono però rivelati piuttosto deludenti per la scarsa specificità verso i neuroni colinergici delle tossine impiegate. Gli effetti osser‐
vati, infatti, avrebbero potuto essere dovuti alla simultanea distruzione di sistemi neurotrasmettitoriali diversi da quello colinergico [Auld et al., 2002]. Nemmeno l’utilizzo di un composto ritenuto più specifico per i neuroni colinergici, quali lo ione Etilcolina Aziridinio (AF64A), si è dimostrato efficace in quanto già a concentrazioni relativamente basse tale tossina produceva nei siti di iniezione danni tissutali consi‐
derevoli [Schliebs et al., 1996]. Un notevole avanzamento nello studio delle funzioni del Sistema Colinergico del Prosencefalo di Base si è avuto grazie all’introduzione della IgG 192­saporin (192sap). Questa tossina, il cui principio di funzionamento è simile a quello della già citata α‐
DBHsap, è il risultato della coniugazione di un anticorpo monoclonale diretto contro p75NTR, espresso specificamente sulla membrana dei neuroni colinergici del MS, DBB e NBM [Yan e Johnson, 1989], e la Saporina. La 192sap è in grado di distruggere selet‐
tivamente i neuroni colinergici del MS, delle hDBB e vDBB e del NBM. Ad alte dosi, la tossina è stata vista agire tuttavia anche su parte delle cellule del Purkinje nel cervel‐
letto [Heckers et al., 1994; Waite et al., 1994; Leanza et al., 1995]. L’introduzione della 192sap, specifica per i neuroni colinergici del Prosencefalo Basale, oltre a confermare il ruolo primario svolto dal Sistema Colinergico Basale nel‐
le funzioni cognitive, ha dimostrato come, per determinare deficit apprezzabili, sia necessaria una deplezione di fibre colinergiche prossima a circa l’80‐90% in Corteccia ed Ippocampo ed una riduzione della stessa entità dei neuroni colinergici del NBM, in caso di lesioni sito‐specifiche a questa struttura.[Torres et al., 1994; Waite et al., 1994; Leanza et al., 1995], ossia deplezioni molto simili a quanto osservato in tessuti post mortem di pazienti affetti da AD. Lesioni specifiche al solo MS, invece, sembrano dare esiti lievi o inconsistenti [Torres et al., 1994; Walsh et al., 1996; McMahan et al., 1997]. Le lesioni mediante iniezione intracerebroventricolare (i.c.v.) della 192sap, effet‐
tuate in animali adulti, hanno dimostrato che essa produce un deficit al Morris Water |24| INTRODUZIONE Maze superiore a quello che si ha nel caso di lesioni elettrolitiche con radiofrequenza [vedi Hepler et al., 1985] o eccitotossiche al MS/DBB o al NBM o con lesioni combina‐
te degli stessi centri; mentre un deficit cognitivo di entità simile si osserva in ratti con la resezione bilaterale del fimbria‐fornice o in ratti anziani [Nilsson et al., 1992b]. A‐
nalogamente, la lesione selettiva causa una performance deficitaria nei test di evita‐
mento passivo [Leanza et al., 1995]. Alcuni studi hanno contestato però la validità di questo modello esponendo due osservazioni: innanzitutto la 192sap colpisce, come già riportato sopra, parte dei neuroni del Purkinje del Cervelletto ed inoltre i dati su lesioni parenchimali di MS e NBM hanno fornito risultati contrastanti in quanto ripor‐
tano deficit molto meno marcati [Baxter et al., 1995; Chappell et al., 1998]. Nonostan‐
te ciò le lesioni con 192sap costituiscono ad oggi il sistema più utilizzato, selettivo ed efficace nello studio sperimentale del ruolo funzionale del sistema colinergico basale e del deficit cognitivo legato alla AD. Da quanto sopra riportato si evince che i neuroni colinergici del prosencefalo di base sono coinvolti, oltre che nei fenomeni di apprendimento e memoria [Pizzo et al., 2002], anche nei processi di attenzione. In particolare, si suppone che esso dia la ca‐
pacità all’animale di rispondere in modo corretto alle richieste che gli vengono poste dal test comportamentale [Baxter e Chiba, 1999]. Il Sistema Colinergico Basale sembra essere coinvolto, oltre che nelle già citate fun‐
zioni cognitive, anche nello sviluppo del SNC. Evidenze sperimentali hanno messo in evidenza il fatto che l’Acetilcolina ha un ruolo fondamentale nello stabilire le esatte connessioni sinaptiche in reti neurali che nell’adulto sono alla base di complesse fun‐
zioni cognitive [Berger‐Sweeney, 1998]. Inoltre, è stato osservato che un corretto svi‐
luppo temporale dell’innervazione colinergica della corteccia è fondamentale per lo sviluppo delle funzioni cognitive e della struttura corticale stessa [Bachman et al., 1994]. Infine, lesioni perinatali al sistema colinergico basale mediante 192sap hanno dimostrato come queste determinino un’alterazione nella citoarchitettura della cor‐
teccia ed un ridotto spessore di alcuni strati corticali [Ricceri et al., 2002]. Tali lesioni, tuttavia, non determinano deficit cognitivi di rilievo [Leanza et al., 1996]. Ciò ha fatto apparire il sistema colinergico come uno sistemi chiave, anche se probabilmente non il solo, nello sviluppo corticale [Berger‐Sweeney, 2003]. |25| INTRODUZIONE 1.2.4. Acetilcolina e Noradrenalina Nel prendere in considerazione le funzioni dei vari sistemi neurotrasmettitoriali non si può non tenere conto delle numerose interrelazioni che intercorrono tra di essi [Birthelmer et al., 2003; Briand et al., 2007; Jackisch et al., 2008]. In particolare un numero crescente di osservazioni indica l’esistenza di una sinergia fra l’innervazione colinergica e quella noradrenergica nella regolazione dei fenomeni cognitivi. Per prima cosa è bene sottolineare che il NBM ed il MS possiedono entrambi una ricca innervazione noradrenergica [Carnes et al., 1990; Smiley et al., 1999; Espana e Berridge, 2006] fornita da fibre provenienti dal LC che terminano sui dendriti e sul soma dei neuroni colinergici del Prosencefalo Basale [Jones e Cuello, 1989; Espana e Berridge, 2006]. Infatti è stato osservato che la Noradrenalina è in grado di attivare il neuroni colinergici tramite recettori di tipo α1 e β [Fort et al., 1995]. Inoltre è stato osservato che sui neuroni noradrenergici del LC sono presenti recettori nicotinici per l’Acetilcolina di tipo α4 [Bitner et al., 1998; Fiorillo e Williams, 2000; Cucchiaro e Commons, 2003] e α7 [Bitner et al., 1998] che regolano verosimilmente il rilascio di Noradrenalina [Yoshida et al., 1980; Anderson et al., 2000; Cucchiaro e Commons, 2003], pur non potendosi escludere il coinvolgimento di recettori muscarinici [Briand et al., 2007]. Da sottolineare, infine che recettori presinaptici noradrenergici sono presenti sui terminali colinergici e viceversa [Vizi e Kiss, 1998; Jackisch et al., 2008; Scheiderer et al., 2008]. Altri studi hanno dimostrato come Acetilcolina e Noradrenalina siano in grado di regolarsi l’un l’altra sia in vitro [Mantovani et al., 1983; Tanganelli et al., 1989] che in vivo [Nilsson et al., 1992a; Vizi e Kiss, 1998; Kiss et al., 1999]. Innanzitutto è stato os‐
servato che agendo sui recettori noradrenergici si può modificare il rilascio di Acetil‐
colina; difatti, già alla fine degli anni ’70 del ̕900, fu riportato che, nella cavia, la somministrazione sistemica di Noradrenalina determinava un’inibizione del rilascio di Acetilcolina [Beani et al., 1978]. Studi di microdialisi hanno poi evidenziato come agonisti e antagonisti dei recettori α1 e α2 modifichino il rilascio di Acetilcolina in Corteccia durante alcuni fenomeni sensoriali [Moroni et al., 1983; Tellez et al., 1997]. In particolare la somministrazione di agonisti α1 nel Prosencefalo Basale determina |26| INTRODUZIONE un aumento della risposta evocata dall’udito [Berntson et al., 2003], mentre l’effetto contrario si osserva somministrando nella stessa regione antagonisti α1 [Knox et al., 2004]. Inoltre l’inibizione del reuptake della Noradrenalina determina un aumento del rilascio di Acetilcolina con conseguente miglioramento della performance in di‐
versi test cognitivi [Tzavara et al., 2006]. In aggiunta, studi elettrofisiologici hanno os‐
servato che la somministrazione di Noradrenalina o di agonisti dei recettori α, in dosi che solitamente non producono effetti, determina un forte potenziamento della rispo‐
sta della Corteccia Somatosensoriale all’Acetilcolina [Waterhouse et al., 1980; Water‐
house et al., 1981]. Anche lesioni a carico del Sistema Noradrenergico determinano l’aumento del rila‐
scio, sia basale che evocato, di Acetilcolina, probabilmente come risposta compensa‐
toria [Jackisch et al., 2008]. Infatti nel Mild Cognitive Impairment si osserva una riduzione nel numero dei neuroni del LC [Kalinin et al., 2007] e un aumento dell’attività dell’Acetilcolina in Corteccia e Ippocampo [DeKosky et al., 2002]. D‐altra parte sono stati osservati aumenti significativi del contenuto di Noradrenalina in ratti lesionati con la 192sap sia in età adulta [Harrell et al., 2005] che nei primi giorni di vi‐
ta [Leanza et al., 1996]; anche questi probabilmente legati ad eventi compensatori in‐
dotti dalla lesione. Interessante poi notare che la rimozione dell’innervazione noradrenergica da un lato aumenta gli effetti amnesici dati dalla Scopolamina [Decker e Gallagher, 1987], dall’altro annulla l’effetto di memory enanching prodotto dai farmaci colinomimetici [Huygens et al., 1980]. Allo stesso modo, la rimozione dell’innervazione noradrener‐
gica centrale blocca il miglioramento della performance data dai farmaci colinomime‐
tici in animali con lesioni al NBM, blocco che viene superato somministrando Clonidina, un agonista noradrenergico [Haroutunian et al., 1990]. Inoltre in scimmie anziane con deficit dell’innervazione noradrenergica del Prosencefalo, la lesione del Sistema Colinergico Basale determina la comparsa di deficit cognitivi più marcati [Ha‐
routunian et al., 1990]. Acetilcolina e Noradrenalina intervengono simultaneamente e a volte indissolu‐
bilmente, anche in altri processi cognitivi. Per esempio, vi è un’azione sinergica dei due neurotrasmettitori nell’aumentare la probabilità della formazione di una LTP in‐
|27| INTRODUZIONE dotto elettricamente nella Corteccia Visiva [Brocher et al., 1992]. Inoltre, nel consoli‐
damento della memoria e nel rinforzo comportamentale, dove Acetilcolina e Nora‐
drenalina hanno ruoli fondamentali, esse necessitano delle rispettive innervazioni per un corretto funzionamento [Bergado et al., 2007; Liu e Liang, 2009]. Infine, alcuni au‐
tori ritengono che sia il Sistema Noradrenergico a dare inizio alle risposte comporta‐
mentali e colinergica indotte da stimoli esterni [Berridge e Waterhouse, 2003]. Un’ulteriore conferma della stretta sinergia che intercorre tra Sistema Colinergico e Noradrenergico è data dall’osservazione che alcuni dei recettori di questi neurotra‐
smettitori, i recettori muscarinici M1 e i recettori α1, agiscono sulla medesima prote‐
ina G (Gαq) [Porter et al., 2002; Hague et al., 2003] con conseguente induzione della LTD nelle zone CA1 e CA3 dell’Ippocampo. Ma ancora più interessante è il fatto che una debole stimolazione di entrambi questi due recettori, singolarmente non suffi‐
ciente a generare effetti sul neurone postsinaptico, riesce ad indurre l’attivazione del‐
la LTD, suggerendo che Noradrenalina e Acetilcolina possono operare di concerto per agire sulla plasticità sinaptica [Scheiderer et al., 2008]. 1.3. La Malattia di Alzheimer La malattia di Alzheimer è una patologia neurodegenerativa di eziologia ignota che normalmente colpisce persone con un età superiore ai 60 anni. La malattia prende il nome dallo psichiatra tedesco Alois Alzheimer il quale nel 1906, durante un convegno a Monaco, presentò per la prima volta la sindrome clini‐
co‐patologica riscontrata su una donna cinquantenne (Auguste D.) [Maurer et al., 1997]. Passeranno però più di cinquant’anni prima che questa sindrome venisse rico‐
nosciuta come una delle principali cause della demenza senile. Sempre alla fine degli anni ’60 del secolo scorso, grazie all’introduzione del microscopio elettronico, Michael Kidd e Robert Terry descrissero le caratteristiche delle due principali lesioni associa‐
te all’Alzheimer, le placche senili e gli ammassi neurofibrillari [Selkoe, 2001]. |28| INTRODUZIONE In Europa l’AD rappresenta il 54% delle forme di demenza con una prevalenza nel‐
la popolazione ultra‐sessantacinquenne del 4.4%, con un andamento che aumenta con l’età, e risulta maggiore nelle donne. Nella sola Italia sono stati stimati circa 492'000 casi all’anno (fonte: Istituto Superiore di Sanità). Questa alta incidenza nella popolazione anziana, associata all’aumento della vita media nei paesi sviluppati, è uno dei motivi per cui ad oggi l’AD è una delle patologie maggiormente studiate. 1.3.1. Generalità Il morbo di Alzheimer è caratterizzato da un progressivo declino delle funzioni co‐
gnitive, in particolare riguardo la memoria di eventi remoti o recenti, il linguaggio, la capacità di giudizio, l’attenzione e le funzioni esecutive come pianificazione e organiz‐
zazione [Marien et al., 2004]. Questi disturbi comportamentali progrediscono, come già accennato, durante il corso della malattia [Kawas, 2003]e vengono accompagnati da modificazioni comportamentali e apatia già dai primi stadi della malattia seguiti, nelle fasi più tardive, da psicosi e agitazione [Mega et al., 1996]. Alterazioni ai sistemi motori e sensoriali restano invece poco comuni fino agli ultimi stadi della malattia [McKhann et al., 1984]. Il dato neuropatologico più rilevante nei malati di Alzheimer è rappresentato da una massiccia perdita neuronale e sinaptica a livello di vari sistemi neurotrasmettito‐
riali. In particolare viene colpito il sistema colinergico basale ma alterazioni impor‐
tanti si osservano anche a livello dei sistemi che usano come neurotrasmettitore la noradrenalina, la serotonina, il glutammato, la sostanza P e la somatostatina, mentre rimangono sostanzialmente inalterati il sistema dopaminergico e quelli utilizzanti neuropeptidi [Haroutunian et al., 1990; Zaborszky et al., 1993; Smiley et al., 1999; Dringenberg, 2000; Marien et al., 2004]. Caratteristiche istopatologiche della malattia sono la presenza di placche senili e‐
xtracellulari e di ammassi neurofibrillari intracellulari (neurofibrillary tangles), loca‐
lizzati principalmente nell’Amigdala, nell’Ippocampo e nella corteccia entorinale del |29| INTRODUZIONE lobo temporale, con una minor propagazione alle zone parietali e frontali della cor‐
teccia associativa [Mesulam, 1996]. Le placche senili (o placche amiloidi) sono una delle caratteristiche proprie della malattia e sono oggi considerate il segno cardinale che permette la diagnosi differen‐
ziale di Alzheimer post­mortem. Esse sono composte da aggregati filamentosi del pep‐
tide β Amiloide (Aβ), un peptide generato dal taglio proteolitico della Proteina Precursore dell’Amiloide (APP). Nelle placche amiloidi in particolare si ritrova il pep‐
tide terminante con l’amminoacido 42 della sequenza proteica (Aβ1‐42), la quale è molto più idrofobica, e quindi particolarmente propensa a formare aggregati, della forma terminante con l’amminoacido 40 della catena proteica (Aβ1‐40) fisiologicamen‐
te più abbondante e comunque presente all’interno delle placche [Jarrett et al., 1993]. Gli ammassi neurofibrillari sono composti da aggregati di filamenti che occupano la maggior parte del citoplasma perinucleare. Sin dal 1985 studi biochimici e immu‐
nocitochimici hanno dimostrato che questi filamenti sono composti da Tau, una pro‐
teina normalmente associata ai microtubuli [Brion et al., 1985]. Successivamente studi elettroforetici hanno mostrato come negli ammassi neurofibrillari Tau si pre‐
senti in una forma altamente fosforilata [Lee et al., 1991]. Queste formazioni non si ritrovano però solamente nell’Alzheimer ma anche in altre malattie neurodegenerati‐
ve, la quasi totalità delle quali non presenta placche di tipo amiloide, con caratteristi‐
che biochimiche molto simili se non indistinguibili. Analogamente esistono dei rari casi di Alzheimer definiti “tangle poor” nelle quali queste formazioni sono molto ri‐
dotte. Ciò ha fatto supporre che esse siano solamente lesioni secondarie a diverse pa‐
tologie a carico del cervello, una delle quali sarebbe appunto l’accumulo di Aβ [Selkoe, 2001]. Nei pazienti affetti da AD il descritto stress ossidativo e l’eccitossicità da glutamma‐
to potrebbero ulteriormente contribuire alla degenerazione neuronale, tuttavia, se‐
condo recenti ipotesi, tali eventi sembrerebbero essere soltanto manifestazioni neuropatologiche secondarie della malattia [Cummings, 2004]. |30| INTRODUZIONE 1.3.2. Fisiopatologia Il meccanismo fisiopatologico che porta alla comparsa della malattia di Alzheimer è tuttora ignoto, a questo riguardo sono state però formulate diverse teorie. L’Ipotesi Colinergica. La prima ipotesi proposta per spiegare i deficit cognitivi dei pazzienti affeti da AD è quella colinergica. L’importanza della funzione colinergica nei processi di apprendi‐
mento e memoria era, di fatto, nota sin dagli inizi degli anni ‘70 del ̕900 [Deutsch, 1971]. Successivamente, studi di carattere farmacologico hanno dimostrato come il blocco dei meccanismi colinergici in giovani primati determini un calo delle capacità cognitive paragonabile a quello che si osserva nelle persone anziane o colpite da de‐
menza. [Drachman e Leavitt, 1974; Drachman e Sahakian, 1980]. A ciò si è aggiunta l’evidenza che farmaci colinomimetici riducono significativamente i deficit mnemonici in soggetti anziani o colpiti dalla malattia di Alzheimer [Bartus, 1979; Drachman e Sa‐
hakian, 1980; Christie et al., 1981]. Inoltre, è stato osservato che, in pazienti affetti da questa malattia, a livello di corteccia e ippocampo si ha una severa deplezione (60‐
90%) della ChAT, l’enzima biosintetico dell’Acetilcolina, nonché una riduzione del 30‐
90% nel numero dei neuroni colinergici nel nucleo basale di Meynert [Bowen et al., 1976; Davies e Maloney, 1976; Geula e Mesulam, 1989]. Infine, il grado di denerva‐
zione colinergica osservata post mortem in pazienti affetti da AD si è visto correlare positivamente con la gravità del deficit cognitivo misurato nei pazienti mentre in vita [Wilcock et al., 1982; DeKosky et al., 1992]. Sulla base di queste ultime osservazioni, la AD è stata da allora considerata una malattia derivata da un deficit di innervazione colinergica portando alla formulazione della cosiddetta ‘Ipotesi Colinergica della Disfunzione Geriatrica della Memoria’ [Bar‐
tus et al., 1982; Coyle et al., 1983]. L’Ipotesi Amiloide L’ipotesi amiloide è di più recente introduzione e ha tratto impulso dagli svluppi delle tecniche di biologia molecolare. Essa focalizza la sua attenzione su produzione, |31| INTRODUZIONE smaltimento e accumulo extracellulare dell‐Aβ [Hardy e Selkoe, 2002]. A favore di quest’ipotesi vi è l’evidenza che mutazioni a carico della Proteina Precursore dell’Amiloide portano a forme familiari di Alzheimer ad esordio precoce; inoltre tutte le altre mutazioni associate alla malattia determinano un aumento nella produzione di Aβ. Anche la Trisomia 21 (sindrome di Down) determina nei soggetti affetti una demenza precoce legata alla fatto che essi possiedono tre copie del gene codificante l’APP [Cummings, 2004]. Inoltre l’overespressione di APP in modelli transgenici di topo determina la comparsa di placche simili a quelle presenti nei malati di AD asso‐
ciata a deficit di apprendimento e memoria [Cummings, 2004]. La tossicità della Aβ sarebbe dovuta alla sua capacità di auto‐aggregazione che porta alla formazione di o‐
ligomeri, che a loro volta si uniscono a formare aggregati intermedi. Questi aggregati sarebbero alla base della tossicità che la Aβ ha sulle cellule, come osservato in espe‐
rimenti in vitro [Querfurth e LaFerla]. Un’ulteriore evidenza del ruolo centrale del Aβ nell’insorgenza della malattia è da‐
ta dal fatto che la proteina derivante dal allele E ε4 per l’apolipoproteina E, noto per essere associato ad una maggior probabilità di insorgenza dell’Alzheimer, determina una più rapida deposizione delle placche amiloidi [Butterfield et al., 2002]. La formazione degli aggregati neurofibrillari, lo stress ossidativo, l’eccitossicità da glutammato, l’infiammazione e l’attivazione della cascata apoptotica sarebbero dun‐
que da considerare come conseguenze secondarie della deposizione di Aβ [Hardy e Selkoe, 2002]. Il malfunzionamento cellulare e la morte delle cellule in specifici nuclei di neuroni sarebbero quindi responsabili dei deficit a livello dei sistemi colinergico, noradrenergico e serotoninergico [Palmer et al., 1988; Pappas et al., 2000a]. Ipotesi alternative indicano come fattore scatenate alcune anomalie nel ruolo fisio‐
logico della proteina Tau, i metalli pesanti, fattori vascolari o infezioni virali [Cum‐
mings, 2004]. 1.3.3. La Terapia Pur essendo una delle patologie più studiate, non è fino ad ora disponibile un trat‐
tamento ottimale in grado di bloccare o rallentare il decorso della malattia nei pazien‐
|32| INTRODUZIONE ti affetti da AD. Ciò molto probabilmente è legato al fatto che ad oggi l’esatto percorso patogenetico di questa malattia non è del tutto chiaro. I farmaci oggi in uso si distinguono in base agli obiettivi che si propongono. Da una parte si cerca di arrestare o rallentare l’evoluzione della degenerazione neuronale dall’altro si cerca di migliorare le prestazioni cognitive. I farmaci che cercano di migliorare le performance cognitive si basano sull’importanza attribuita al sistema colinergico. Questo gruppo di sostanze è compo‐
sto infatti pressoché esclusivamente dagli inibitori dell’acetilcolinesterasi, l’enzima responsabile della degradazione della Acetilcolina a livello delle sinapsi. Inibendo questo enzima si aumenta la disponibilità locale di Acetilcolina e quindi la trasmissio‐
ne colinergica da parte dei neuroni residui. I farmaci appartenenti a questa categoria oggi utilizzati nella pratica clinica sono la Tacrina, il Donepezil, la Rivastigmina e le Galantamina [Cummings, 2004; van Marum, 2008]. Per quanto molto diffusi, i farmaci colinomimetici hanno avuto tuttavia un successo piuttosto limitato, molto probabil‐
mente a causa del fatto che essi prendono in considerazione solamente uno fra i tanti sistemi che vengono colpiti da questa patologia, sono solo modestamente efficaci e non sono privi di effetti collaterali. I farmaci che si pongono come obiettivo il rallentamento della progressione della malattia, pur utilizzando diverse strategie terapeutiche, una volta introdotti nelle spe‐
rimentazione clinica non hanno portato ai risultati sperati. Fra queste terapie molte puntano ad agire contro la presunta tossicità del Aβ, cercando di inibirne la produ‐
zione, di aumentarne la degradazione o impedirne l’aggregazione [Kisilevsky et al., 2004; Wang et al., 2004; van Marum, 2008]. Uno studio in particolare ha proposto l’impiego della vaccinazione contro il frammento Aβ1‐42. Tuttavia, pur rivelandosi effi‐
cace nei modelli animali, questa strategia è stata abbandonata per gli eccessivi effetti collaterali quando impiegata in trial clinici [Schenk et al., 1999; Orgogozo et al., 2003]. Alcuni risultati si sono avuti somministrando ai pazienti alte dosi di vitamina E, la quale sembra migliorare l’evoluzione della malattia dovuta ai danni da stress ossidati‐
vo. Sotto attenta osservazione sono ora trattamenti che cercano di colpire l’eccitossicità da glutammato o i processi infiammatori tipici dell’AD [Cummings, 2004]. L’unico farmaco di questa categoria entrato nella pratica clinica è la Memanti‐
|33| INTRODUZIONE na. La Memantina è un debole o moderato antagonista dei recettori NMDA per il Glu‐
tammato che sembra in grado di promuovere il recupero delle funzioni cellulari ridu‐
cendo l’eccitossictà da glutammato. La sua efficacia è tuttavia molto limitata e per questo motivo essa viene sempre più utilizzata in concomitanza delle classiche tera‐
pie colinomimetiche [van Marum, 2008]. 1.3.4. Alzheimer e Sistema Noradrenergico Come sopra riportato, l’impiego dei farmaci colinomimetici nella terapia per l’Alzheimer ha incontrato un successo solo parziale [Mohs et al., 1985; Scarpini et al., 2003], questo fatto contrasta con la capacità di questi farmaci di normalizzare la per­
formance cognitiva in animali con lesioni eccitotossiche [Haroutunian et al., 1986]. Un problema di queste terapie, che utilizzano un approccio puramente colinergico, è rappresentato dal fatto che, come precedentemente accennato, l’AD potrebbe non es‐
sere solo un deficit colinergico. Infatti, negli ultimi anni, sta suscitando interesse il ruolo svolto da altri sistemi, tra cui il noradrenergico e, più precisamente, dalle proiezioni ascendenti dal LC. In pazienti affetti da AD, questa regione presenta una perdita di cellule noradre‐
nergiche attorno al 60%, con effetti più marcati nella zona centrale del LC [German et al., 1992]. La portata di questa perdita neuronale è stata riportata in alcuni studi co‐
me paragonabile [Lyness et al., 2003] se non superiore, [Zarow et al., 2003] a quelle viste nel sistema colinergico. Inoltre, la perdita neuronale a livello del LC, più che quella che si ha nei nuclei basali, correla con la durata della malattia [Marien et al., 2004], il grado di demenza ed il numero di placche senili e aggregati neurofibrillari [Bondareff et al., 1987]. Alcuni ritengono che questa perdita neuronale sia conse‐
guenza di un processo degenerativo retrogrado, generato dalle lesioni all’origine delle varie forme di demenza, a carico dei processi assonali delle cellule del LC. Infatti nell’AD la deplezione dei neuroni noradrenergici si concentra nella zona più centrale del LC dove si trovano i neuroni che proiettano alle zone maggiormente interessate dalla deposizione di Aβ, ossia Ippocampo e Corteccia frontale e temporale [Marcyniuk et al., 1986]. Quest’ipotesi è in contrasto però con l’evidenza che tale deplezione man‐
|34| INTRODUZIONE chi in pazienti con un danno vascolare cerebrale ai quali è stata diagnosticata una demenza multi‐infartuale [Mann et al., 1982] ed in pazienti sottoposti a leucotomia prefrontale [Lohr e Jeste, 1988]. Anche la concentrazione di Noradrenalina risulta ridotta in molte aree cerebrali di soggetti con un esordio precoce della malattia [Rossor et al., 1984; Francis et al., 1985] e con un deterioramento cognitivo grave [Adolfsson et al., 1979]. Inoltre, in pa‐
zienti affetti da AD si è osservato un aumento nell’espressione dei recettori noradre‐
nergici in Corteccia e Ippocampo [Kalaria et al., 1989] e della Tirosina Idrossilasi (TH), l’enzima limitante nella produzione della Noradrenalina, nelle cellule rimanenti del LC [Szot et al., 2006]. Queste evidenze, unite a quelle riguardanti la presenza di fe‐
nomeni di sprouting nelle zone adiacenti all’area dendritica del LC e nelle fibre nora‐
drenergiche dell’Ippocampo, fanno supporre il tentativo, da parte del Sistema noradrenergico perturbato, di mantenere l’integrità funzionale delle connessioni at‐
traverso interventi compensatori [Szot et al., 2006]. Ulteriori evidenze del deficit noradrenergico nella patologia di Alzheimer derivano da studi sulla DBH, i cui livelli in ippocampo e nella corteccia prefrontale risultano si‐
gnificativamente diminuiti nei tessuti autoptici derivati da soggetti colpiti da Alzhei‐
mer rispetto a quelli di soggetti normali di pari età; l’attività di questo enzima nei tessuti analizzati tuttavia non correla con la perdita neuronale del LC o con le perfor­
mance ottenute in test cognitivi [Cross et al., 1981]. Negli ultimi anni, infine, molti studi anno posto in luce una stretta correlazione fra la neurodegenerazione a carico del LC e il metabolismo del Aβ. Heneka e collaboratori [2002] sono stati i primi ad osservare come effettuando una deplezione del Sistema Noradrenergico simultaneamente alla somministrazione in Corteccia di Aβ1‐42 preag‐
gregata si induceva un notevole aumento della risposta infiammatoria mediata dal Aβ, un fenomeno tipico della AD. In seguito è stato osservato come lesioni simili determi‐
nino, in animali transgenici recanti la forma mutata dell’APP umana, un considerevole aumento della risposta infiammatoria, della deposizione di placche amiloidi, un au‐
mento della neurodegenerazione in Corteccia ed Ippocampo ed un peggioramento delle funzioni cognitive [Heneka et al., 2006; Kalinin et al., 2007]. In questi animali si possono osservare anche variazioni dell’attività neuronale in vivo mediante l’utilizzo |35| INTRODUZIONE della Tomografia ad Emissione di Positroni (PET), molto simili a quelle riscontrate nei pazienti affetti da AD [Heneka et al., 2006; Winkeler et al., 2008]. Resta tuttavia da chiarire se sia la degenerazione dei neuroni noradrenergici a determinare un aumen‐
to della deposizione di placche amiloidi o viceversa. Da diversi lavori emerge come la neurodegenerazione a carico del LC sia almeno contemporanea alla deposizione degli aggregati amiloidi [Guerin et al., 2007]. Inoltre è stato osservato che in pazienti affetti da AD si ha una precoce degenerazione dei neuroni noradrenergici forse dovuta alla presenza nel LC di numerosi ammassi neurofibrillari [Grudzien et al., 2007]. Si è per‐
ciò ipotizzato che la rimozione dell’innervazione noradrenergica porti da un lato all’inibizione della Neprilisina, un enzima coinvolto nella degradazione del Aβ, come si osserva negli animali lesionati con DSP‐4, e dall’altro alla mancata fagocitosi del Aβ; infatti, studi in vitro, hanno dimostrato come la Noradrenalina stimoli la fagocitosi del Aβ1‐42 da parte della microglia [Kalinin et al., 2007]. La degenerazione del Sistema Noradrenergico, infine, è stata proposta come ele‐
mento cruciale per la diagnosi differenziale fra le demenze neurodegenerative e quel‐
le di origine vascolare, infatti nell’AD la degenerazione a carico del LC è notevolmente più marcata rispetto alle demenze di origine vascolare [Haglund et al., 2006]. 1.3.5. Modelli Animali Ad oggi non esiste un modello di malattia di Alzheimer, che presenti tutte le carat‐
teristiche funzionali e istopatologiche tipiche di questa malattia. I modelli fin’ora pro‐
posti possono essere raggruppati in tre grandi categorie: gli animali anziani, i modelli basati sull’ipotesi colinergica, a loro volta suddivisi in modelli farmacologici e di le‐
sione, ed i modelli transgenici Gli animali anziani Numerosi studi hanno riportato nei roditori anziani (18‐24 mesi e oltre) gravi alte‐
razioni nei processi di apprendimento e memoria molto simili a quelli dei pazienti [Bartus, 1980]. Agli studi sui modelli murini sono seguiti approcci che utilizzavano primati non umani, dimostrando anche in questi modelli che l’invecchiamento porta‐
|36| INTRODUZIONE va a deficit di memoria paragonabili a quelli dell’AD [Bartus, 2000]. Proprio i primati anziani si sono rivelati degli ottimi modelli per lo studio dell’efficacia delle prime te‐
rapie farmacologiche che hanno portato all’introduzione nella pratica clinica dei far‐
maci colinomimetici [Davis et al., 1979]. Dal momento che solo raramente questi animali presentano placche amiloidi o ag‐
gregati fibrillari, e che solo in una parte degli animali si sviluppano deficit cognitivi, oltre alle difficoltà e ai costi che si devono sostenere per stabulare questi animali per lunghi periodi, l’utilizzo di questi modelli risulta molto problematico. Modelli Basati sull’ipotesi Colinergica: Modelli Farmacologici e Lesivi I primi modelli di AD basati sull’ipotesi colinergica della malattia [Bartus et al., 1982], hanno previsto la somministrazione negli animali di farmaci, quali la scopola‐
mina o l’atropina, che inibiscono la trasmissione colinergica mediata da recettori mu‐
scarinici. Questi studi hanno dimostrato che la somministrazione di antagonisti muscarinici determina deficit di Memoria Spaziale, assimilabili a quelli descritti nelle fasi precoci di AD [Murphy e Boast, 1985], in numerosi test comportamentali, quali il Radial Arm Maze ed il Morris Water Maze [Buresova et al., 1986]. Analogamente, an‐
che in primati non umani la somministrazione di scopolamina porta a problemi cogni‐
tivi simili a quelli osservati negli animali anziani [Bartus, 1978]. D’altro canto secondo alcune interpretazioni, gli anti‐muscarinici non agirebbero direttamente sulla memo‐
ria bensì ridurrebbero la discriminazione degli stimoli alterando i processi sensoriali [Kirk et al., 1988]. Inoltre i recettori muscarinici sono ampiamente distribuiti lungo tutto il SNC per cui è presumibile che inibendoli si intervenga su un ampio spettro di funzioni anatomicamente poco definibili. Infatti la forma metilata della scopolamina, che non passa la barriera emato‐encefalica, appare ridurre comunque le performance in test cognitivi [Auld et al., 2002]. Metodi alternativi per valutare l’effetto del sistema colinergico basale nell’AD han‐
no previsto la distruzione, più o meno selettiva di questa struttura. Degli effetti com‐
portamentali, ed in particolare dei deficit nei test per valutare i fenomeni di apprendimento e memoria, indotti da queste lesioni si è già precedentemente parlato |37| INTRODUZIONE [vedi 1.2.3] sottolineando gli esiti contrastanti che si sono ottenuti, e ciò dà ulteriore sostegno all’ipotesi che, pur necessaria, la perdita dei neuroni colinergici del Prosen‐
cefalo Basale potrebbe non essere sufficiente a determinare deficit cognitivi rilevanti. Ne consegue che un modello che cerchi di replicare i problemi di apprendimento e memoria tipici della AD dovrebbe prevedere l’induzione non solo di lesioni colinergi‐
che ma la produzione delle lesioni multi‐sistemiche tipiche dell’AD [Marien et al., 2004]. Da notare, però, come, in ratti a cui è stata effettuata una lesione mediante somministrazione di 192sap, si osserva un aumento nella produzione della APP [Le‐
anza, 1998; Lin et al., 1998] i cui livelli vengono normalizzati dal ripristino dell’attività colinergica mediante somministrazione di agonisti muscarinici [Lin et al., 1998] o dal trapianto di cellule embrionali [Aztiria et al., 2009]. Queste osservazioni pertanto danno sostegno all’ipotesi di un coinvolgimento primario del danno coliner‐
gico in questa malattia anche attraverso un’azione sull’espressione e/o metabolismo delle proteine/peptidi amiloidi. Le alterazioni neurochimiche ed istopatologiche pro‐
prie della malattia potrebbero pertanto concorrere nel determinare i deficit cognitivi. La comprensione di tali interazioni sarà una grande sfida per il futuro. Modelli transgenici I principali modelli transgenici di AD si basano sul presupposto che il Aβ costitui‐
sca un ruolo chiave nella patogenesi della malattia; nel genoma di questi animali sono stati quindi inseriti dei costrutti che determinano la sovraespressione di APP, prese‐
nilina 1 o presenilina 2 umane recanti delle mutazioni che, nell’uomo, provocano for‐
me familiari di AD [Duyckaerts et al., 2008]. Sono stati inoltre sviluppati dei doppi transgenici per APP e Presenilina 1. Questi modelli presentano diverse caratteristiche che possono essere ricondotte all’AD: come depositi di Aβ, placche senili, strutture simili agli ammassi neurofibrillari, e perdite neuronali, che però non si accompagnano sempre a deficit di tipo colinergico e/o a problemi cognitivi. Inoltre, molti di questi processi patologici precedono la deposizione del Aβ tanto da far supporre che più che tossico, il loro ruolo sia compensatorio o protettivo, forse legando e/o inattivando tossine endogene o esogene presenti nel cervello [Robinson e Bishop, 2002]. Infine nell’ultimo decennio è stato introdotto un nuovo topo recante i geni umani mutati per |38| INTRODUZIONE APP, Presenilina 1 e Tau. Questo animale presenta nel tempo la formazione di placche senili e disfunzioni sinaptiche simili a quelle presenti nei pazienti affetti da AD [Oddo et al., 2003]. Un modello alternativo prende in considerazione l’importanza del Fattore di Cre‐
scita Neurale (Nerve Growth Factor ‐ NGF) nell’AD. Questo animale transgenico e‐
sprime un anticorpo ricombinante che neutralizza l’NGF. Qualche tempo dopo la nascita in questi animali è presente una degenerazione colinergica progressiva dovu‐
ta alla mancata esposizione dei colinergici all’NGF, da cui dipendono. Essi, inoltre, manifestano un deterioramento cognitivo associato ad alterazioni simili a quelle os‐
servate nei pazienti affetti da AD, tra le quali deposizione di placche senili e ammassi neurofibrillari in Corteccia e Ippocampo [Capsoni et al., 2000]. Anche in questo mo‐
dello quindi la neurodegenerazione precede la comparsa di depositi di Aβ facendo in‐
tuire per la AD un percorso patogenetico indipendente da questa proteina [Marien et al., 2004]. 1.4. Neurogenesi Adulta Fino a metà degli anni sessanta si pensava che il SNC fosse qualcosa di fisso, immu‐
tabile e che le capacità di compensare alcuni danni fosse esclusivamente a carico delle nuove connessioni effettuate dai neuroni sopravissuti. Questa ipotesi era suffragata in particolar modo dalle affermazioni del noto neuroanatomista Santiago Ramon y Cajal che scriveva: “Nei centri nervosi dell’adulto le vie nervose sono in qualche modo fisse, finite ed immutabili. Ogni cosa può morire, ma nulla può rigenerare. Ispirati da alti ide­
ali, si deve lavorare per impedire o modulare il graduale decadimento dei neuroni, per superare la quasi invincibile rigidità delle loro connessioni nervose” [Ramón y Cajal, 1914]. Quest’affermazione fu smentita quando, nel 1965, Altaman e Das [1965] pubblica‐
rono uno studio nel quale mediante l’utilizzo di Timidina triziata venivano identifica‐
te cellule neoformate con morfologia neuronale nei bulbi olfattivi e nel Giro Dentato |39| INTRODUZIONE dell’Ippocampo di ratti adulti. Da allora, fenomeni di neurogenesi sono stati osservati in numerose altre specie di mammiferi, dal coniglio [Gueneau et al., 1982], al gatto Wyss [Wyss e Sripanidkulchai, 1985], al topo [Kempermann et al., 1997], a primati non umani [Gould et al., 1999b], fino a quando Eriksson e colleghi [1998] hanno di‐
mostrato fenomeni neurogenetici nell’ippocampo umano (Fig. 1.3). A questi dati si sono sommati quelli di lavori che hanno permesso di isolare in di‐
verse zone del SNC delle cellule staminali neurali [Gottlieb, 2002]. Fig. 1.3 Dimostrazione della neurogenesi ippocampale umana. Immagine tratta dal primo lavoro del gruppo in cui si dimostra la presenza di nuovi neuroni nel cervello umano adulto. In rosso i neuroni marcati con NeuN, in verde le cellule BrdU positive ed in blu le cellule gliali marcate per GFAP; nell’ultima immagine si può notare una cellula dove colocalizzano le colorazioni per BrdU e NeuN, ciò sta a indicare la presenza di un nuovo neurone. [da Eri‐
ksson et al., 1998] 1.4.1. Le Cellule Staminali Neurali Le cellule staminali neurali (Neural stem cells – NSC) sono cellule multipotenti che, come tutte le cellule staminali, hanno la capacità di autorigenerarsi (self­renewal) ed effettuare una divisione cellulare asimmetrica dando origine a cellule diverse da esse; devono inoltre derivare dal tessuto nervoso o essere in grado di generare tessuto nervoso Gage, 2000 [Gage, 2000]. Le NSC adulte sono state isolate in diversi siti all’interno del SNC, oltre a quelli classicamente riconosciuti come neurogenici, cioè la zona sub‐granulare del DG dell’ippocampo (Sub Granular Zone – SGZ) e la zona sub‐ventricolare (Sub Ventricular Zone – SVZ) McKay, 1997 [McKay, 1997; Gage, 2000]. NSC sono state nei bulbi olfattivi |40| INTRODUZIONE [Pagano et al., 2000], nella retina [Tropepe et al., 2000], nella superficie che intercor‐
re fra Corpo Calloso e Ippocampo [Seri et al., 2006] e nel Midollo Spinale [Chi et al., 2007]. Ancora controversi sono invece i dati che indicherebbero la presenza di nuove cellule all’interno della corteccia (Abrous et al., 2005). Le NSC adulte non sembrano possedere la plasticità tipica delle cellule staminali embrionali, infatti solo in rari casi si è osservato come esse possano generare cellule somatiche diverse [Weissman, 2000]. È stato perciò proposto che, mentre la maggior parte delle NSC adulte sia regionalmente e temporalmente determinata, esistano al‐
cune cellule staminali all’interno del SNC, forse di origine non neuronale, che possie‐
dono grande plasticità e che sono in grado di produrre diversi tipi cellulari [Temple, 2001]. Fig. 1.4 La nicchia neurogenetica nella Zona SubGranulare (SGZ) I Progenitori Neurali di Tipo I e II del Giro Dentato (DG) danno origine a Progeni‐
tori Neuronali che sono ancora in grado di effettuare un limitato numero di du‐
plicazioni. Questi daranno origine ai nuovi neuroni granulari dell’ippocampo. [Modificato daImayoshi et al., 2009] Ad oggi, l’ipotesi più accreditata sull’identità delle NSC è che a svolgere questo compito siano dei particolari astrociti [Alvarez‐Buylla e Lim, 2004] i quali formereb‐
bero, all’interno delle zone neurogeniche ed assieme a cellule endoteliali, delle specia‐
li nicchie di cellule staminali [Palmer et al., 2000] [Doetsch, 2003]. In particolare, nella SGZ esisterebbero due tipi di progenitori neurali: NSC di Tipo I e di Tipo II, entrambi positivi alla Nestina e alla Superossidodismutasi di tipo II |41| INTRODUZIONE (Sox2). Le cellule di Tipo I sono positive alla Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) e presentano processi radiali che si estendono in tutta la zona granulare e processi più brevi tangenziali allo strato molecolare del DG. Le cellule di Tipo II, invece, non e‐
sprimono GFAP, presentano processi più brevi [Suh et al., 2007] e sarebbero generate dalle cellule di Tipo I [Fukuda et al., 2003] (Fig.1.4) 1.4.2. Proliferazione e Migrazione Come già accennato le zone in cui si sono osservati fenomeni neurogenetici nei mammiferi sono principalmente due la zona sub ventricolare e la zona sub‐granulare del DG dell’ippocampo. Fig. 1.5 Fenomeni di proliferazione emigrazione di nuovi neuroni in SVZ e Ippocampo Le cellule neoformate della SVZ, attraverso la Via Migratoria Rostrale, si spostano ai Bulbi Olfattivi dove divengono neuroni GABAergici maturi. I neuroni neoforma‐
ti nella SGZ, invece, migrano all’interno della Zona Granulare ed emettono le loro proiezioni verso la zona CA3 dell’Ippocampo [Modificato da Ming e Song, 2005]. |42| INTRODUZIONE I neuroni neoformati della SVZ poco dopo la loro formazione intraprendono un lungo processo di migrazione. Essi infatti si spostano lungo le pareti dei ventricoli la‐
terali sino a immettersi lungo la Via Migratoria Rostrale (Rostral Migratory Stream ‐ RMS) e raggiungere i bulbi olfattivi, in gruppi di cellule associate. Tali cellule in segui‐
to si disperdono singolarmente ed in modo radiale nei bulbi stessi [Ming e Song, 2005] diventando interneuroni GABAergici [Shepherd et al., 2004]. Questa via migra‐
toria è stata osservata in tutte le specie di mammiferi studiate, dai roditori ai primati con l’unica eccezione dell’ uomo [Sanai et al., 2004]. I neuroni della SGZ, invece, mi‐
grano solamente dalla SGZ alla parte più interna della Zona Granulare proiettando quindi i loro assoni verso la zona CA3 del Ippocampo [Zhao et al., 2006]. 1.4.3. Funzioni della Neurogenesi Ippocampale La funzione della neurogenesi ippocampale a tutt’oggi non è molto chiara, tanto che alcuni ritengono che le NSC non siano altro che le vestigia evolutive di specializ‐
zazioni presenti in animali filogeneticamente antichi come gli invertebrati (ad esem‐
pio la planaria) e i pesci [Sanchez Alvarado e Newmark, 1998]. Il suo essere ubiquitaria in tutte le specie di vertebrati fa però supporre che essa abbia invece un ruolo funzionale preciso. Da questo punto di vista, evidenze crescenti suggeriscono un ruolo centrale delle nuove cellule nelle funzioni di apprendimento e memoria. Il primo indizio di un coinvolgimento delle cellule neoformate nell’Ippocampo nei fenomeni di apprendimento e memoria è dato dal fatto che essa avviene in una strut‐
tura, quale l’Ippocampo, chiaramente implicato in processi cognitivi; in particolare si è osservato che i nuovi neuroni, si integrano nei circuiti neuronali preesistenti [Came‐
ron e McKay, 2001] anzi essi verrebbero integrati preferenzialmente in alcuni di que‐
sti circuiti [Imayoshi et al., 2009] e determinerebbero un aumento nel numero di neuroni e nel volume del DG [Imayoshi et al., 2008]. Inoltre molti dei fattori che de‐
terminano deficit nell’apprendimento ippocampo‐dipendente, quale quello osservabi‐
le nel Morris Water Maze, determinano un corrispondente calo nella neurogenesi; per contro molti fattori che aumentano la neurogenesi migliorano anche l’apprendimento ippocampo‐dipendente cha a sua volta sembra aumentare la formazione di nuovi |43| INTRODUZIONE neuroni a livello della SGZ[Gross, 2000]. A riguardo, è stata notata una correlazione tra il numero di nuovi neuroni presenti nell’ippocampo e le abilità di apprendimento nelle diverse ceppi di topi [Kempermann e Gage, 2002], mentre la mancanza della Neurotrofina 3 (NT3) determina alterazioni sia del differenziamento neuronale dei nuovi neuroni sia della memoria spaziale [Shimazu et al., 2006]. Un’ulteriore confer‐
ma di un possibile coinvolgimento delle cellule neoformate in funzioni cognitive viene dall’osservazione che esse sembrane essere reclutate preferenzialmente permetter il processamento delle informazioni durante l’apprendimento Ippocampo‐dipendente. Ciò verosimilmente in quanto possiedono caratteristiche elettrofisiologiche uniche dovute alla loro particolare plasticità in determinati stadi della maturazione e quindi alla loro capacità di formare più connessioni e più rapidamente [Gould et al., 1999c; Gross, 2000; Ma et al., 2009]. Altre prove del possibile coinvolgimento della neuroge‐
nesi nell’apprendimento derivano da studi che ne prevedono la soppressione. Si è in‐
fatti osservato che inibendo la formazione di nuovi neuroni mediante tecniche anche molto diverse tra loro, dall’inibizione della proliferazione cellulare mediante la som‐
ministrazione sistemica di Metilazossimetanolo acetato all’inibizione mediante l’utilizzo di vettori lentivirali delle vie molecolari che portano alla neurogenesi, si ot‐
tiene un peggioramento della performance in vari test di apprendimento e memoria spaziale [Shors et al., 2002; Snyder et al., 2005; Imayoshi et al., 2008; Zhang et al., 2008; Jessberger et al., 2009] ed una riduzione della plasticità sinaptica [Saxe et al., 2006]. Meno chiaro è il ruolo specifico che questi neuroni hanno nei fenomeni di appren‐
dimento e memoria. Partendo dal presupposto che la vita media di questi neuroni può durare da pochi giorni a molti mesi [Gould et al., 1999a] si è ipotizzato che essi siano coinvolti nello stoccaggio temporaneo della memoria, dopo di che essi andrebbero in‐
contro o a degenerazione o a modificazione delle loro connettività [Gould et al., 1999c; Gross, 2000]. Un’altra ipotesi suggerisce che questi neuroni siano invece im‐
plicati nel richiamo di ricordi remoti in maniera dipendente dal contesto; a sostegno esistono evidenze circa la sopravvivenza molto lunga di alcuni neuroni [Abrous et al., 2005]. Circa il fatto che gli input che dal DG giungono alla zona CA3 dell’Ippocampo sono coinvolti nel recupero della memoria spaziale [Brun et al., 2002; Nakazawa et al., |44| INTRODUZIONE 2002] è stato osservato che il blocco della neurogenesi possa essere coinvolto mag‐
giormente nel richiamo della memoria piuttosto che nella sua acquisizione [Imayoshi et al., 2008]. Un’altra interessante ipotesi, infine, associa la la presenza di cellule neo‐
formate alla cosiddetta ‘riserva cognitiva’, utile al rallentamento del declino cognitivo [Kempermann, 2008]. Saranno quindi necessari ulteriori studi per valutare l’effettiva influenza dei nuovi neuroni in questi processi. 1.4.4. Regolazione della Neurogenesi Ippocampale Diversi studi hanno dimostrato come la neurogenesi ippocampale adulta possa es‐
sere regolata agendo sia su fattori interni che esterni all’animale stesso. Un ruolo importante è svolto dal background genetico, infatti topi di ceppi diversi presentano un diverso tasso di neurogenesi [Kempermann et al., 1997; Kempermann e Gage, 2002], inoltre anche l’età degli animali sembra influire: si osserva difatti un ridotto numero di neuroni neoformati nell’Ippocampo di ratti [Kuhn et al., 1996] o scimmie [Gould et al., 1999b] anziani. Ancora, un ruolo molto importante è svolto dai fattori di crescita, alcuni di essi infatti inducono un marcato aumento nella neuroge‐
nesi ippocampale, com’è il caso ad esempi per il BDNF [Lee et al., 2002], l’Insulin­like Growth Factor­I (IGF‐I) [Aberg et al., 2000], l’Heparin­Binding Epidermal Growth Fac­
tor (HB‐EGF) [Jin et al., 2002a] ed il Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) [Jin et al., 2002b] [per maggiori informazioni vedi Lee e Son, 2009]. Anche gli ormoni rego‐
lano questo processo, in particolare gli ormoni corticosteroidi che deprimono forte‐
mente la proliferazione di nuove cellule nell’Ippocampo [Cameron e Gould, 1994]; al contrario gli estrogeni sembrano possedere un effetto positivo [Tanapat et al., 1999]. Tra i farmaci in grado di modulare la formazione di nuovi neuroni gli oppiacei a‐
vrebbero un effetto fortemente deprimente [Eisch et al., 2000], mentre gli antidepres‐
sivi [Malberg et al., 2000] ed il litio [Chen et al., 2000] avrebbero un effetto positivo. Nel loro insieme questi dati fanno intuire come la neurogenesi sia un fenomeno complesso alla cui regolazione fisiologica partecipano diversi fattori, rendendo molto difficoltoso lo studio delle singole componenti. |45| INTRODUZIONE Tre sono i fattori esterni che appaiono regolare i processi proliferativi ippocampa‐
li. Il principale sembra essere lo stress, infatti scimmie [Gould et al., 1997] o ratti [Pham et al., 2003] sottoposti ad condizioni di stress psicosociale presentano marcate riduzioni nel numero delle nuove cellule nella SGZ, ciò probabilmente a seguito dell’attivazione dell’asse ipotalamo‐ipofisi‐surrenale con la conseguente produzione di ormoni steroidei corticosurrenalici. È stato visto, inoltre, come l’ambiente influenzi notevolmente la neurogenesi ippocampale: infatti, topi inseriti in un ambiente con in‐
terazioni sociali aumentate hanno dimostrato tassi di proliferazione neuronale signi‐
ficativamente superiori ai topi stabulati in condizioni non stimolate [Kempermann et al., 1998]. Lo stesso effetto positivo si ottiene se agli animali viene permesso di svol‐
gere dell’esercizio fisico volontario [van Praag et al., 2002]. Infine un ultimo fattore che determina un aumento della neurogenesi è l’apprendimento ippocampo‐dipendente che determina un raddoppiamento dei nuovi neuroni nella SGZ, mentre le forme di apprendimento ippocampo‐indipendenti non sembrano incidere su questi processi proliferativi [Gould et al., 1999a]. 1.4.5. Sistemi Colinergico e Noradrenergico e Neurogenesi Ippocampale Nella neurogenesi ippocampale un ruolo regolatorio importante viene svolto dai neurotrasmettitori. Diversi studi hanno dimostrato come alcune di queste molecole determinino un aumento o una riduzione nel numero di cellule neoformate nell’ippocampo. Il glutammato, il principale neurotrasmettitore eccitatorio del cervel‐
lo, sembra regolare negativamente la neurogenesi attraverso il sottotipo recettoriale NMDA. Infatti gli agonisti specifici determinano un calo di nuove cellule mentre il trat‐
tamento con antagonisti dei recettori NMDA ne determina l’aumento [Cameron et al., 1995; Nacher et al., 2001]. Al contrario i sistemi serotoninergico e dopaminergico sembrano avere un effetto positivo sulla proliferazione neuronale [Gould, 1999; Ho‐
glinger et al., 2004; Van Kampen e Robertson, 2005]. L’effetto regolatorio dell’innervazione colinergica sulla neurogenesi ippocampale è un fenomeno ormai assodato. Infatti diversi tipi di lesione ai neuroni del Prosencefalo |46| INTRODUZIONE Basale determinano una riduzione delle cellule neoformate nella SGZ dell’Ippocampo. Questo si è visto sia nel caso di lesioni eccitotossiche [Van der Borght et al., 2005], sia a seguito di rimozione selettiva dei neuroni colinergici in ratti adulti mediante l’utilizzo dell’immunotossina 192sap [Cooper‐Kuhn et al., 2004] che determinava i‐
noltre un simultaneo declino della memoria spaziale [Mohapel et al., 2005; Aztiria et al., 2007]. Il meccanismo di tale regolazione potrebbe essere recettore‐mediato: la stimolazione dei recettori muscarinici per l’Acetilcolina, presenti anche sui progenito‐
ri del DG [Mohapel et al., 2005], in animali lesionati con la 192sap, infatti, determina un aumento nella formazione di nuove cellule nell’Ippocampo [Van Kampen e E‐
ckman, 2009]. In effetti, è stato osservato come la stimolazione con agonisti muscari‐
nici determini nelle NSC del DG una rapido aumento dell’attività del Ca2+ intracellulare [Itou et al., 2010]. È da notare tuttavia che, al contrario, la stimolazione dei recettori nicotinici sembra avere l’effetto opposto determinando un ulteriore calo della neurogenesi ippocampale [Van Kampen e Eckman, 2009]. Poco è ancora noto sulla regolazione noradrenergica della neurogenesi ippocam‐
pale adulta. Alcuni farmaci antidepressivi che bloccano il reuptake della Noradrenali‐
na sembrano determinare un aumento della proliferazione cellulare nell’Ippocampo [Popovik e Haynes, 2000]. È stato dimostrato anche che agonisti dei recettori α1, pre‐
senti nel DG [Szot et al., 2005], sono in grado di aumentare la proliferazione in vitro di precursori neuronali embrionali [Hiramoto et al., 2006]. Ma solo uno studio, finora, ha riportato il marcato calo della neurogenesi ippocampale (63%) dopo lesione di que‐
sto sistema effettuate mediate somministrazione sistemica di 6OHDA [Kulkarni et al., 2002]. Pertanto ulteriori studi che utilizzino deplezioni noradrenergiche maggior‐
mente selettive saranno necessari per approdare ad informazioni più conclusive. 1.4.6. Neurogenesi e Malattia di Alzheimer Le eventuali relazioni fra AD e neurogenesi sono ancora oggetto di dibattito. Gli studi fin’ora condotti infatti hanno dato esiti contrastanti. In vitro si è osservato come la Aβ1‐42 induca apoptosi nei neuroni maturi [Mattson et al., 1998] ma ancora poco chiaro è l’effetto che essa ha sui neuroni proliferanti. Quel che sembra certo è che |47| INTRODUZIONE l’effetto può variare a seconda degli stati di aggregazione del peptide: monomerico, oligomerico e fibrillare [Waldau e Shetty, 2008]. Da considerare è inoltre anche il possibile ruolo della proteina Tau iperfosforilata, che sembra promuovere la forma‐
zione di nuovi neuroni nell’Ippocampo [Hong et al., 2009]. Anche lo studio sui modelli animali di AD ha dato esiti contrastanti. Se infatti il primo studio in tal senso su animali recanti la APP umana mutata indicava un aumen‐
to della neurogenesi [Jin et al., 2004a], studi su animali recanti la Presenilina 1 (PS1) umana mutata e su animali con doppia mutazione PS1/APP hanno rilevato dei deficit nel numero di nuovi neuroni e nella maturazione neuronale [Wen et al., 2004; Verret et al., 2007; Zhang et al., 2007]. Anche lo studio su tessuti autoptici provenienti da pazienti affetti da AD non ha da‐
to risposte definitive. Se da un lato infatti alcuni autori hanno evidenziato in questi tessuti un aumento nell’espressione di marker tipici dei neuroni immaturi [Jin et al., 2004b], altri studi non hanno riportato differenze significative in tessuti autoptici de‐
rivanti da pazienti affetti da AD giovanile [Boekhoorn et al., 2006]. Inoltre in tessuti post mortem di pazienti affetti da AD è presente un numero minore di precursori neu‐
ronali in quali, inoltre, tendono ad andare in senescenza in minor tempo [Ziabreva et al., 2006]. |48| SCOPI 2. Scopi della Tesi Da quanto detto, emerge che il Sistema Noradrenergico è implicato in ambiti fun‐
zionali tra loro distanti, dal controllo dei pattern locomotori a livello spinale a quello, più complesso, dei processi cognitivi. Certamente lo studio del ruolo svolto da tale si‐
stema ha tratto vantaggi dall’introduzione della Anti­Dopamine Beta Hydroxylase­
Saporin, che permette la rimozione altamente selettiva ed efficace dei neuroni nora‐
drenergici [Wrenn et al., 1996]. Tuttavia ancora ignoti sono gli effetti della sommini‐
strazione di questa immunotossina sul SNC di animali in via di sviluppo, nei quali sono ancora attivi meccanismi di plasticità legati alla maturazione post‐natale del si‐
stema noradrenergico del LC Gli scopi della presente tesi sono pertanto i seguenti: Studiare gli effetti della somministrazione perinatale della αDBHsap sull’innerva‐
zione noradrenergica spinale e valutarne specificità e stabilità nel lungo termine. Verificare se questo modello di denervazione noradrenergica determini a livello spinale le condizioni ideali per la sopravvivenza e l’integrazione funzionale di Pre‐
cursori Neurali embrionali, in linea con studi precedenti che utilizzavano tecniche lesive diverse. Indagare gli effetti della rimozione, perinatale o adulta, del sistema noradrenergico su diversi aspetti della funzione cognitiva, quali quelli legati alla Reference e Working Memory. Esplorare le possibili interazioni fra i Sistemi Colinergico Basale e Noradrenergico nella regolazione dei fenomeni di apprendimento e memoria e verificare se la ri‐
mozione di uno o entrambi questi sistemi neurotrasmettitoriali abbia un effetto |49| SCOPI funzionale sulla sopravvivenza dei neuroni neoformati del Giro Dentato dell’Ippocampo. È noto infatti che la Neurogenesi ippocampale adulta è stretta‐
mente legata ai fenomeni di apprendimento e memoria e che i fattori che regolano uno di questi fenomeni sovente sono in grado di regolare in maniera simile anche l’altro. |50| MATERIALI & METODI 3. Materiali & Metodi 3.1. Animali e condizioni di allevamento Tutte le procedure adottate sono conformi alla normativa in materia di sperimen‐
tazione animale in vigore in Italia (DDL 116/92) e alle direttive dell’Unione Europea (86/609/EEC) ed hanno avuto l’approvazione del Comitato Etico dell’Università degli Studi di Tieste. Sono state utilizzate inoltre tutte le possibili precauzioni al fine di ri‐
durre le sofferenze e il numero di animali usati. I ratti, di ceppo Wistar, sono stati forniti dallo Stabulario dell’Università degli Studi di Trieste e mantenuti presso la medesima struttura per tutto il tempo degli esperi‐
menti. Tutte le cucciolate sono state mantenute con la madre fino al 21° giorno di vita (1 cucciolata per gabbia). Dopo lo svezzamento, gli animali, divisi per sesso, sono stati stabulati a gruppi di 2‐3 in gabbie di Plexiglass trasparente con un ciclo di luce/buio di 12 ore e cibo ed acqua ad libitum. 3.2. Design Sperimentale Il presente lavoro è stato suddiviso in 4 distinti esperimenti ciascuno dei quali prende in considerazione un aspetto particolare. |51| MATERIALI & METODI 3.2.1. Esperimento 1: Caratterizzazione della Lesione Neonatale con αDBHsap Nel primo esperimento sono stati valutati gli effetti e la specificità di dosi crescenti di Anti­Dopamine Beta Hydroxylase­Saporin (acquistata presso Advance Targeting System, CA, USA) iniettata bilateralmente nei Ventricoli Laterali (i.c.v.). In questo e‐
sperimento sono stati utilizzati un totale di 72 ratti, equamente divisi fra maschi e femmine, provenienti da 8 diverse cucciolate e mantenuti come descritto in prece‐
denza. Gli animali sono stati suddivisi casualmente in 6 gruppi. Gli animali dei primi 3 gruppi sono stati trattati con l’immunotossina αDBHsap diluita in 5+5 μl di PBS sterile ad una delle seguenti dosi: 0.25 μg (n=12), 0.50 μg (n=12) e 1.00 μg (n=12). Ad un ul‐
teriore gruppo di animali, con la medesima tecnica, è stata iniettata la tossina 6‐
Idrossi dopamina (6OHDA) (Sigma) alla dose di 110 μg –in 5+5 μl di soluzione fisio‐
logica addizionata con 0.2 mg/ml di acido L‐Ascorbico (Sigma). Ad un gruppo di animali di controllo (veicolo) è stato iniettato i.c.v. lo stesso volume di PBS sterile ( n=8) o di soluzione fisiologica addizionata di acido L‐Ascorbico (n=8). A questi animali si è ag‐
giunto un ulteriore gruppo di animali non soggetti ad alcuna operazione (intatti; n=8). A 5 settimane dalla lesione metà degli animali di ogni gruppo è stata sacrificata me‐
diante perfusione intracardiaca e i cervelli e i midolli spinali raccolti per le successive analisi post mortem. I rimanenti animali sono stati sacrificati con la medesima proce‐
dura a 40 settimane dalla lesione. 3.2.2. Esperimento 2: Trapianto di Progenitori Neurali in Midollo Spinale Da diversi anni il nostro laboratorio è interessato allo studio dei meccanismi di in‐
tegrazione funzionale di precursori monoaminergici trapiantati nel SC deafferentato o depleto [Leanza et al., 1999; Gulino et al., 2007]. Questo esperimento ha pertanto in‐
teso verificare se questo modello di denervazione noradrenergica spinale, introdotto nell’esperimento precedente, fosse idoneo per creare, a livello del Midollo Spinale, le condizioni ideali per la sopravvivenza e l’integrazione di Precursori Neurali embrio‐
nali, in linea con studi precedenti che utilizzavano tecniche lesive diverse. In partico‐
|52| MATERIALI & METODI lare, si è voluto investigare se questi Progenitori Neurali fossero in grado di maturare e ristabilire almeno parzialmente l’innervazione noradrenergica. A questo scopo 20 animali sono stati lesionati mediante somministrazione i.c.v. di 0.50 μg di αDBHsap in 5+5 μl di PBS sterile (ossia la dose ottimale selezionata nell’esperimento 1) nel loro 4° giorno di vita post‐natale (P4). Quattro giorni dopo la lesione (P8) ad un gruppo di a‐
nimali lesionati (n=12) ha ricevuto impianti di Precursori Neurali derivanti da LC di embrioni al 13° ‐ 14° giorno di vita embrionale (E13/14) a livello delle Corna Ventrali della zona lombare del SC,. Sono stati utilizzati inoltre 2 gruppi di controllo: uno con animali non operati (intatti; n=6) ed uno a cui sono stati iniettati i.c.v. a P4 5+5 μl di PBS sterile (veicolo; n=6). Gli animali, equamente divisi fra maschi e femmine, prove‐
nienti da 3 diverse cucciolate, sono state stabulati con la madre fino P21 e quindi divi‐
si a gruppi di 4. A circa 40 settimane dalla lesione gli animali sono stati sacrificati mediante perfusione intracardiaca e i cervelli e i midolli spinali raccolti per le succes‐
sive analisi istochimiche post mortem. 3.2.3. Esperimento 3: Effetti Comportamentali della Rimozione del Sistema Noradrenergico Lesioni Neonatali Allo scopo di studiare gli effetti della rimozione selettiva neonatale del Sistema No‐
radrenergico sulla funzione cognitiva, sono stati utilizzati 24 ratti, provenienti da 2 cucciolate, mantenute come precedentemente descritto, equamente distribuiti fra maschi e femmine. A metà di questi animali (n=12) a P4 è stata effettuata una lesione noradrenergica mediante somministrazione i.c.v. di 0.50 μg di αDBHsap in 5+5 μl di PBS sterile. I restanti animali sono stati suddivisi in 2 gruppi, uno costituito da anima‐
li non operati (intatti; n=6) ed uno trattato a P4 sono con 5+5 μl di PBS sterile (veico‐
lo; n=6). Gli animali sono stati stabulati con la madre, una cucciolata per gabbia, fino ad 1 mese di vita e quindi separati e stabulati in gruppi di 2. A 3 mesi dall’operazione glia animali sono stati sottoposti a test comportamentali somministrati in sequenza e utili per evidenziare deficit nell’apprendimento spaziale (Morris Water Maze ) e nella |53| MATERIALI & METODI Memoria di Lavoro (Radial Arm Water Maze). A conclusione delle sessioni di analisi comportamentale, gli animali sono stati sacrificati mediante perfusione intracardiaca e i cervelli prelevati e processati per le successive analisi istologiche. Lesioni Adulte Allo scopo di valutare gli effetti comportamentali della rimozione in età adulta del Sistema Noradrenergico del complesso LC/SubC, sono stati utilizzati 16 ratti maschi adulti di peso compreso fra 250 e 300 g. La deplezione dei neuroni noradrenergici del complesso LC/SubC è stata effettuata iniettando stereotassicamente 0.2 μg di α‐
DBHsap disciolta in 0.5 μl di PBS sterile in nel LC di ciascun lato (n=8). Ad un ulteriore gruppo di animali sono stati iniettati nella stessa regione 0.5 μl di PBS sterile (veicolo; n=4), mentre un altro gruppo di animali non è stato operato (intatti; n=4). dopo le procedure chirurgiche, gli animali sono stati stabulati 2 per gabbia per circa 1 mese prima di essere testati, come sopra, al Morris Water Maze e quindi al Radial Arm Wa­
ter Maze. Quindi gli animali sono stati sacrificati ed i cervelli raccolti per le analisi i‐
stologiche. 3.2.4. Esperimento 4: Effetti di Lesioni Combinate Colinergica e Noradrenergica Effetti Comportamentali Gli effetti comportamentali della rimozione simultanea dei Sistemi Colinergico e Noradrenergico sono stati studianti utilizzando 63 ratti provenienti da 6 cucciolate. Gli animali sono stati suddivisi in 4 gruppi. Gli animali del primo gruppo (Doppia Les; n=15) sono stati sottoposti a lesione dei neuroni noradrenergici del LC/SubC e di quelli colinergici del Prosencefalo Basale. A tale scopo sono state iniettate i.c.v. en‐
trambe le immunotossine αDBHsap e IgG 192­Saporin (192sap) alla dose di 0.50 μg in 5+5 μl di PBS sterile. Da studi preliminari effettuati presso il nostro laboratorio si è osservato che solubilizzando e somministrando contemporaneamente le immunotos‐
sine nella stessa soluzione si otteneva un marcato calo dell’efficacia delle lesioni. Per questo motivo le immunotossine sono state somministrate in maniera controbilancia‐
|54| MATERIALI & METODI ta a 3 giorni di distanza l’una dall’altra, la prima a P3 e la seconda a P6. A metà degli animali è stata somministrata prima l’immunotossina noradrenergica e quindi a P6 quella colinergica, all’altra metà degli animali, invece, le tossine sono state sommini‐
strate nell’ordine opposto: a P3 la 192sap e a P6 la αDBHsap. Lo stesso ordine è stato mantenuto anche nel caso della singola lesione colinergica (n=17) o noradrenergica (n=15). I questi casi l’immunotossina è stata somministrata, nelle dosi sopra riporta‐
te, in due momenti diversi (a P3 o a P6) senza che ciò determinasse variazioni anato‐
miche o funzionali di rilevo. Infine anche in questo esperimento sono stati previsti di animali non sottoposti ad alcuna procedura di microchirurgia (intatti, n=8) o animali cui si è somministrato i.c.v. il solo PBS sterile (veicolo, n=8) Gli animali sono stati te‐
stati, a circa 3 mesi dalla lesione, usando i medesimi test (Morris Water Maze e Radial Arm Water Maze. Al termine delle sessioni comportamentali parte degli animali veni‐
va sacrificata tramite perfusione intracardiaca. Effetti sulla Neurogenesi Ai rimanenti animali, 3 per gruppo, 2 settimane dopo la fine del test è stata som‐
ministrata Bromo‐deossiuridina (BrdU) per via intraperitoneale alla dose di 200 mg/
kg. Gli animali sono stati quindi sacrificati 3 settimane dopo la somministrazione di BrdU con l’intento di studiare gli effetti sulla sopravvivenza dei neuroni neoformati nel DG dell’ippocampo denervazione colinergica, noradrenergica o combinata. 3.3. Procedure in vivo 3.3.1. Procedure di Microchirurgia Lesioni Neonatali Le lesioni neonatali sono state somministrate il 4° e, nel caso delle doppie lesioni, il 3° e/o il 6° giorno dopo la nascita (P3 o P6) a ratti anestetizzati mediante ipotermia (mantenimento in ghiaccio per 3‐5 minuti). Le immunotossine o la 6OHDA (Esperi‐
mento 1) sono state somministrate mediate microsiringa Hamilton da 10 l alle se‐
guenti coordinate: Antero‐posteriore (AP) ‐ 0.6 mm, Laterale (L) ± 0.8 mm, verticale |55| MATERIALI & METODI (V) ‐ 2.1 mm usando come punto di riferimento il Bregma e la superficie cutanea cra‐
niale [Leanza et al., 1996]. Le coordinate sono state individuate in esperimenti preli‐
minari. Dopo l’intervento chirurgico, e prima di riporre la gli animali con le rispettive ma‐
dri, i neonati sono stati riscaldati sotto una lampada a incandescenza per riportarli al‐
la loro normale temperatura corporea Lesioni in Animale Adulto Le lesioni noradrenergiche adulte sono state effettuate mediante iniezione stereo‐
tassica dell’immunotossina αDBHsap direttamente nel LC di entrambi i lati. Fig. 3.1 Siti di iniezione della tossina αDBHsap nell’animale adulto Le lesioni noradrenergiche su animali adulti sono state effettuate mediante inie‐
zioni bilaterali della tossina αDBHsap direttamente nel LC. In rosso i siti di inie‐
zione. [Modificato da Paxinos e Watson, 1998] |56| MATERIALI & METODI In breve, dopo essere stati posti in anestesia profonda con Cloralio Idrato 0.5% (7 ml/
Kg; Fluka) gli animali sono stati montati su un apparato stereotassico (Kopf). Me‐
diante una siringa di precisione Hamilton da 1 l, 0.4 g di αDBHsap disciolti in 0.5 + 0.5 l di fisiologica sterile sono stati iniettati alle seguenti coordinate stereotassiche: AP: ‐9.8 mm; L: ±1.2 mm (dal Bregma) e V: ‐5.8 mm (dalla dura madre) [Secondo l’atlante stereotassico Paxinos e Watson, 1998] (Fig3.1) Gli animali operati sono stati tenuti alla temperatura di 37°C fino al loro risveglio e quindi sottoposti a trattamento antibiotico (Baytril ® 1l/ml) per i successivi tre gior‐
ni. Trapianto di Progenitori Neurali derivanti da LC embrionali La sospensione cellulare ricca in Progenitori Neurali noradrenergici è stata prepa‐
rata secondo quanto riportato in precedenza [Leanza et al., 1999] seguendo la proce‐
dura delle sospensioni cellulari di Björklund e collaboratori [Bjorklund et al., 1983]. In breve, il LC in via di sviluppo è stato prelevato bilateralmente dal ponte di embrio‐
ni di ratto Wistar a E13‐E14 (Crown­to­Rump Lenght – CRL: 9‐13 mm) (Fig. 3.2) e po‐
sto in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Life Tecnologies). Fig. 3.2 Embrione al 13° giorno di vita embrionale Nel’immagine si vede un embrione di ratto al 13° giorno di vita embrionale (E13). Col quadrato rosso è identificata la zona in cui si trova il LC in via di sviluppo che è stato prelevato bilateralmente per preparare la sospensione cellulare da im‐
piantare in SC. |57| MATERIALI & METODI Il tessuto è stato dissociato senza ricorrere a digestione enzimatica [Bjorklund et al., 1986] e risospeso in un volume finale di 6 μl/LC in modo da ottenere una sospen‐
sione cellulare di 30'000 cellule/μl con una vitalità di circa l’80%, come confermato mediante l’analisi al Trypan Blue. I ratti da trapiantare a P8 (e precedentemente lesionati a P4) sono stati anestetiz‐
zati nuovamente mediante ipotermia. La 12a vertebra toracica è stata esposta e, tra‐
mite un trapano operatorio, è stato praticato un piccolo foro nella vertebra stessa al fine di rendere accessibile il segmento midollare L2. Mediante un capillare di vetro (OD 50‐70 μm), 2 μl di sospensione cellulare sono stati iniettati unilateralmente alle seguenti coordinate: L ‐0.4 mm, V ‐0.8 mm usando come riferimenti rispettivamente l’arteria sagittale e la dura madre. Gli animali sono stati quindi riportati a temperatu‐
ra corporea ponendoli nelle vicinanze di una lampada ad incandescenza prima di ve‐
nire riportati alla madre. 3.3.2. Test Comportamentali Il Morris Water Maze è una procedura per lo studio e dell’apprendimento e della memoria spaziali nel ratto introdotta da R. Morris nel 1984 [Morris, 1984]. Oggi que‐
sto test è divenuto uno di test comportamentali d’elezione per lo studio del ruolo dei vari sistemi neurali nelle funzioni cognitive in quanto di facile somministrazione e di alta affidabilità. Il Morris Water Maze, come originariamente concepito, viene utilizzato per lo stu‐
dio della memoria spaziale (Reference Memory), mentre per studiare altri aspetti della memoria sono nati da esso diverse varianti. Una di queste, denominata Radial Arm Water Maze, sarà qui utilizzata per lo studio della Working Memory (memoria di lavo‐
ro). Test Motori Allo scopo di verificare la possibile insorgenza di deficit motori aspecifici indotti dalle lesioni, gli animali sono stati preliminarmente sottoposti a semplici test motori [Leanza et al., 1998; Antonini et al., 2009]. Questi consistevano nel valutare la loco‐
|58| MATERIALI & METODI mozione ed il sostegno lungo un’asse di legno mantenuta orizzontale o inclinata a 45°. Anche la locomozione su griglia è stata valutata, verificano la capacità dell’animale di muoversi agevolmente su di essa sia in orizzontale che quando inclinata. Morris Water Maze Il Morris Water Maze fornisce indicazioni sulla capacità di orientamento spaziale degli animali e sulla velocità e accuratezza nell’apprendere una determinazione posi‐
zione basandosi esclusivamente su riferimenti esterni allo spazio di nuoto (extramaze cues). A tale scopo l’animale viene posto in una vasca riempita d’acqua situata in un ambiente contenente oggetti che l’animale può usare per l’orientamento nel tentativo di localizzare una piattaforma sommersa. Dopo averla localizzata casualmente, l’animale si posizionerà su questa piattaforma ed identificherà i punti di riferimento utili all’orientamento. In tal modo motivato, l’animale migliorerà progressivamente con il ripetersi del test il tempo e la distanza di nuoto necessari per trovare la piatta‐
forma. In presenza di deficit cognitivi gli animali non riusciranno ad utilizzare i rife‐
rimenti ambientali e non miglioreranno significativamente nel tempo e nello spazio. Fig. 3.3 Schema della vasca del Morris Water Maze La vasca è stata suddivisa idealmente in 4 quadranti di uguali dimensioni deno‐
minati NW, NE, SW e SE; al centro di ogni quadrante è stata identificata un area di 20 cm di diametro denominata annulo (indicati in figura dai cerchi verdi trat‐
teggiati); al centro dell’annulo di SW è stata posizionata la piattaforma, qui indi‐
cata con un cerchio rosso. |59| MATERIALI & METODI L’apparato sperimentale utilizzato nella presente tesi (Fig. 3.3) comprende una va‐
sca circolare dal diametro di 140 cm inserita in una stanza contenente riferimenti di forma e colore vario (poster, finestre, luci, etc.). Quattro punti (identificati convenzio‐
nalmente come N, S, W, E) servono come siti di rilascio degli animali e suddividono idealmente la vasca in quattro quadranti di eguali dimensioni. Al centro di ciascun quadrante è identificata un’area di circa 20 cm di diametro, denominata annulo, al centro della quale potrà essere posta la piattaforma. La vasca viene riempita di acqua a temperatura ambiente (20°C) ed al centro di uno dei quattro annuli (nel nostro caso SW) viene posizionata una piattaforma del diametro di 15 cm la cui estremità supe‐
riore rimane sotto il pelo dell’acqua per circa 1,5‐2 cm di modo che l’animale non la possa vedere ma possa urtarla nuotando. La traiettoria di nuoto dell’animale è seguita e registrata da una telecamera inter‐
facciata ad un PC mediante un software di videotracking (Anitacker, DGTech) il quale fornisce inoltre il tempo, la distanza e la velocità inpiegati dall’animale per localizzare la piattaforma, dati che verranno registrati e poi utilizzati per l’analisi off­line. Nel giorno che precede l’inizio dei test ogni animale è stato lasciato nuotare libe‐
ramente per 60 secondi al fine di farlo familiarizzare con l’ambiente e di ridurre lo stress derivato dall’esposizione al test. Durante il Morris Water Maze il ratto è stato sottoposto quotidianamente, per 7 giorni consecutivi, a 4 trial (Place Test). In ognuno dei trial l’animale è stato rilasciato da uno dei quattro punti di partenza previsti, secondo un ordine casuale, con il muso rivolto verso il bordo della vasca. Gli animali hanno avuto a disposizione 60 secondi per ritrovare la piattaforma nascosta trascorsi i quali l’animale viene posizionato so‐
pra di essa dall’operatore se non vi è giunto spontaneamente; il ratto viene quindi la‐
sciato sulla piattaforma per 20 secondi prima di essere posizionato nel punto di partenza successivo. Spatial Probe Trial L’ultimo giorno, alla fine del quarto trial, gli animali sono stati sottoposti allo Spa­
tial Probe Trial il cui scopo è quello di valutare l’efficacia e la precisione dell’ appren‐
dimento raggiunto con il Place Test. Nello Spatial Probe Trial, la piattaforma viene |60| MATERIALI & METODI tolta dalla vasca e l’animale, rilasciato dal punto opposto a dove questa si trovava, è lasciato nuotare liberamente per 60 secondi. Il tempo e la distanza in ognuno dei quadranti ed il numero di collisioni con ciascuno dei quattro annuli vengono registra‐
ti e successivamente analizzati. Radial Arm Water Maze Olton[1983] ha introdotto la distinzione fra Memoria di Lavoro (Working Memory) e Memoria Spaziale (Reference Memory), che quindi possono essere distinte in base alla maggiore o minore stabilità delle informazioni in esse contenute e alla complessi‐
tà del loro processamento [Domjan, 1993]. Nel corso dell’esecuzione di un taskdi Working Memory, l’animale deve elaborare le informazioni che ha acquisito nel tempo per applicarle ad una nuova situazione; deve pertanto operare un confronto tra le contingenze attuali e le azioni compiute di re‐
cente ed adattare di conseguenza le sue risposte. Ciò richiede all’animale un maggiore sforzo cognitivo rispetto ai processi propri della Reference Memory che fanno riferi‐
mento a situazioni che non variano nel corso dei vari trial. In questo senso Baddeley definisce Working Memory una serie di operazioni utili a un sistema per il manteni‐
mento temporaneo e la manipolazione delle informazioni durante l’esecuzione di dif‐
ferenti compiti cognitivi [Baddeley, 1986]. Per valutare la Working Memory sono state utilizzate nel tempo diverse strategie: fra le principali è da segnalare il Radial Arm Maze [Olton, 1983]. Questo test è stato ampiamente utilizzato [Vann e Aggleton, 2005] ma, essendo somministrato su base asciutta, ha il limite di non poter escludere l’uso di riferimenti non spaziali quali gli odori anche quando le superfici vengono pulito ad ogni trial. Diversi studi hanno im‐
piegato inoltre una modificazione del Morris Water Maze in cui la posizione della piat‐
taforma viene cambiata di giorno in giorno [Lehmann et al., 2000]. Più recentemente è stato introdotto un protocollo sperimentale che integra i due sistemi sopra elencati, il Radial Arm Water Maze [Arendash et al., 2001; Pappas et al., 2005]. Nel protocollo utilizzato nel nostro laboratorio il labirinto acquatico è stato suddi‐
viso in 6 corridoi simmetrici (Fig.3.4). La piattaforma è stata posizionata alla fine di uno dei corridoi ed il ratto viene rilasciato in modo casuale dall’estremità di uno di |61| MATERIALI & METODI essi con il muso rivolto verso la parete della vasca. Per ogni trial viene quindi misura‐
to il tempo in cui l’animale ritrova la piattaforma, per un massimo di 60 secondi tra‐
scorsi i quali, se il ratto non riesce a localizzarla, viene posto sulla piattaforma dallo sperimentatore. Per osservare se l’animale sia in grado di elaborare le informazioni acquisite nei giorni precedenti (requisito fondamentale per valutare la Working Me­
mory) la posizione della piattaforma viene cambiata ogni giorno secondo una sequen‐
za casuale. Una volta che il ratto trova la piattaforma viene lasciato su di essa per 20 secondi prima di proseguire con il trial successivo. La valutazione delle abilità di Working Memory prevede pertanto l’analisi del miglioramento della performance all’interno dei trial dello stesso giorno. Fig. 3.4 Schema della Vasca del Radial Arm Water Maze Durante il Radial Arm Water Maze vengono creati 6 corridoi simmetrici. Nella va‐
sca la piattaforma (nell’immagine indicata con un cerchio rosso) viene posiziona‐
ta ogni giorno all’estremità di un corridoio diverso. Per l’analisi accurata dei dati del Radial Arm Water Maze è stato utilizzato anche un parametro che misura la velocità di apprendimento fra il primo ed il secondo trial (Savings) definito dalla formula [Netto et al., 1991]: Savings
(t1 t 2)
100 t1
Dove t1 è la media del tempo impiegato dagli animali per ritrovare la piattaforma durante il primo trial mentre t2 è il tempo impiegato nel secondo trial. |62| MATERIALI & METODI 3.3.3. Sacrifici Alla fine del periodo sperimentale gli animali, posti in anestesia profonda mediante Cloralio Idrato 5% (Fluka) alla dose di 7 ml/kg, sono stati perfusi per via transcardiaca con 100 ml di soluzione fisiologica a temperatura ambiente. I cervelli e, negli esperi‐
menti 1 e 2, i Midolli Spinali sono stati quindi rapidamente rimossi e post‐fissati nella stessa soluzione al 4% di paraformaldeide over/night e successivamente mantenuti in una soluzione al 20% di saccarosio in tampone fosfato 0.2 M per 24‐48 ore sempre ad una temperatura di 4°C. 3.4. Procedure Ex vivo 3.4.1. Processamento del Tessuto Utilizzando un microtomo congelatore (Leitz Wetzlar) sono state preparate 4 serie di sezioni orizzontali del midollo toraco‐lombare. Otto serie di sezioni coronali dalle regioni comprese tra la corteccia frontale e l’Ipocampo caudale (dal piano stereotassi‐
co +4.2 mm al piano ‐4.3 mm rispetto al Bregma) e, più caudalmente dalle regioni comprendenti il LC (dal piano ‐8.5 mm al piano ‐10.5 mm) Le sezioni, da 40 μm, sono state conservate in una soluzione di criopreservazione, composta da glicerolo ed eti‐
lenglicolo in tampone fosfato, a ‐20°C fino al momento del processamento. 3.4.2. Procedure Istologiche Colorazione Istochimica per le fibre AChE positive Per valutare gli effetti delle lesioni su cellule e fibre colinergiche è stato applicato il protocollo di Hedreen [Hedreen et al., 1985] (derivato dal metodo di Karnovsky e Ro‐
ots [1964]) che permette una localizzazione selettiva dell’enzima Acetilcolinesterasi |63| MATERIALI & METODI nei neuroni e nei processi colinergici permettendone una visualizzazione microscopi‐
ca di notevole qualità e chiarezza. Dopo aver lavato le sezioni in tampone acetato a pH 6.0 ed eliminato tutti residui di liquido di criopreservazione, le sezioni sono state incubate con una soluzione di citra‐
to di sodio, ferricianuro di potassio, solfato di rame e Acetiltiocolina ioduro (Sigma) in sodio acetato al quale è stato aggiunta dell’Etopropaziana (Sigma) per inibire le este‐
rasi aspecifiche. In questo passaggio l’Acetilcolinesterasi, grazie alla sua attività enzi‐
matica, trasforma l’Acetiltiocolina ioduro in tiocolina che riduce il ferrocianuro di potassio il quale crea un complesso di colore scuro. Nei successivi passaggi la colora‐
zione viene intensificata mediante incubazioni con ammonio solfuro al 4% e nitrato d’argento al 0,1%. Le sezioni sono state montate quindi su vetrini gelatinizzati e co‐
perte con vetrino coprioggetto mediante l’utilizzo del medium di montaggio DPX (Sigma). Immunoistochimica Nei diversi esperimenti sono state effettuate colorazioni immunoistochimiche per Dopamnima Beta Idrossilasi (DBH), Tirosina Idrossilasi (TH), Colina Acetiltransferasi (ChAT), Serotonina (5HT) e Bromo‐Deossiuridina (BrdU) mediante un protocollo standard in free floating utilizzando il complesso Avidina‐Biotina‐Perossidasi. In bre‐
ve, le perossidasi endogene vengono inattivate mediante il trattamento con una solu‐
zione di metanolo al 10% e perossido di idrogeno (H2O2) al 3% in tampone fosfato (PBS, pH 7.4) per 10 minuti. Quindi le sezioni vengono preincubate con siero decom‐
plementato della specie che produce l’anticorpo secondario (vedi Tabella 3.1) al 5% e Triton X100 (Sigma) allo 0.3% in PBS per 1 ora e poi esposte over­night a temperatu‐
ra ambiente (RT) all’anticorpo primario (vedi Tabella 3.1) diluito con siero al 2% e Triton X100 allo 0.3% in PBS. Dopo un ulteriore incubazione di 1 ora a RT con l’anticorpo secondario (vedi Tabella 3.1) diluito 1:200 in una soluzione simile alla precedente, le sezioni sono state esposte per 1 ora al complesso Avidina‐Biotina‐
Perossidasi (ABCkit – Vector) e quindi la reazione è stata sviluppata mediante una so‐
luzione allo 0.025% di Diaminobenzidina (DAB – Sigma) in PBS attivata da H2O2 0.03% per 3‐5 minuti. Le sezioni sono state quindi montate su vetrino, disidratate e |64| MATERIALI & METODI coperte con vetrino coprioggetto mediante l’utilizzo di DPX (Sigma). Da sottolineare che, per la colorazione immunoistochimica per la BrdU, all’inattivazione delleperossi‐
dasi endogene viene fatto precedere l’esposizione dell’antigene (Antigen Retrieval) ef‐
fettuato incubando le sezioni per 30 miunti a 60° in una soluzione 1N di acido Cloridico. Antigene Animale Fornitore Anticorpo Primario Diluizione Anticorpo Primario Anticorpo Secondario Siero DBH topo (monoclonale) Pel Freez 1:1000 Horse anti‐Mouse Vector cavallo TH coniglio (policlonale) Immunological Sciences 1:1000 Goat anti‐Rabbit Vector capra 5HT coniglio (policlonale) BIOMOL 1:2000 Goat anti‐Rabbit Vector capra 1:1000 Horse anti‐Mouse Vector cavallo 1:40 Goat anti‐Mouse Vector capra ChAT topo Immunological (monoclonale) Sciences BrdU ratto (monoclonale) Oxford Biotechnology Tab 3.1 Anticorpi utilizzati nelle procedure immunoistochimiche Vengono riportati, per ogni antigene, l’animale in cui è stato prodotto l’anticorpo primario, il fornitore e la diluizione di utilizzo. Viene poi riportato l’anticorpo se‐
condario ed il siero utilizzati. 3.4.3. Analisi microscopiche Analisi microscopiche sono state condotte sulle sezioni contenenti le regioni del prosencefalo di base e del LC/SubC per visualizzare gli effetti delle diverse immuno‐
tossine rispettivamente sui sistemi colinergico e noradrenergico. In particolare è sta‐
ta effettuata una valutazione semiquantitativa della deplezione dei diversi tipi cellulari in queste strutture. |65| MATERIALI & METODI Densitometria delle fibre DBH immunoreattive e AChE positive Le variazioni nella densità di innervazione noradrenergica spinale o colinergica ip‐
pocampale e corticale sono state valutate mediante analisi densitometrica compute‐
rizzata (Scion Image 4.0, W. Rasband, NIMH). Le sezioni spinali o quelle comprendenti Corteccia ed Ippocampo (otto per ogni animale) processate rispettivamente mediante colorazione immunoistochimica per DBH o istochimica per l’AChE e selezionate in maniera costante, sono state acquisite usando una fotocamera digitale (Nikon). Campi di misurazione di dimensioni costanti (~0.5 mm in diametro) sono stati sovrapposti bilateralmente alle regioni campionate; ai valori di ciascuna regione sono stati sot‐
tratti i valori di densità di fondo misurata in aree normalmente prive di fibre immu‐
noreattive (regioni di sostanza bianca spianle o Corpo Calloso). Conta delle cellule neoformate La quantificazione delle neoformate è stata effettuata contando bilateralmente le cellule immunoreattive per la BrdU nella Zona Granulare del DG dell’Ippocampo. Le conte sono state effettuate su ogni ottava sezione coronale di cervello dal piano–2.00 mm al piano –4.25 mm (rispetto al Bregma). Il numero totale di cellule ippocampali neoformate nel cervello è stato quindi stimato moltiplicando per 8 (la frazione delle sezioni raccolte sul totale delle serie prodotte) il numero di cellule BrdU‐positive con‐
tate. 3.4.4. Analisi Statistiche I dati delle analisi comportamentali,delle densità ottiche e delle cellule neoformate sono stati processati statisticamente con test di analisi della varianza (ANOVA), fatto‐
riali (one­way ANOVA) o per misure ripetute (repeated measures ANOVA). Dove risul‐
tasse appropriato, queste analisi sono state affiancate da un Fisher’s PLSD post­hoc test per confronti appaiati. Tutte le analisi sono state condotte in Statview 4.0 per Ma‐
cintosh (JMP, Cary) e le differenze sono state ritenute significative per p<0.05. |66| RISULTATI 4. Risultati I test motori effettuati non hanno rivelato deficit di tipo motorio in nessun animale. Analogamente, nei soggetti lesionati non sono state rilevate variazioni di peso corpo‐
reo o altri segni che rilevassero uno stato di sofferenza. Gli animali intatti e quelli trattati con il solo veicolo non differivano in nessuno dei parametri anatomici o comportamentali analizzati. Per tale motivo, in alcuni esperi‐
menti, i soggetti sono stati raggruppati in un unico gruppo dei controllo. 4.1. Esperimento 1 Caratterizzazione della Lesione Neonatale con αDBHsap 4.1.1. Dose/Risposta Il trattamento con αDBHsap nei primi giorni di vita non ha determinato variazioni che facessero pensare a danni tissutali aspecifici quali gliosi, allargamento dei ventri‐
coli o gravi anormalità strutturali, in linea con quanto riportato dopo lesioni simili sul ratto adulto [Jasmin et al., 2003] o dopo lesione neonatale con 192sap [Leanza et al., 1996]. Tuttavia, due animali trattati con la dose più alta dell’immunotossina (1.00 μg) sono stati persi entro le prime 24 ore post‐lesione. Cinque settimane dopo la lesione, nelle regioni pontine contenenti la le aree del LC/SubC si è potuto osservare un drammatico calo dell’immunoreattività per la DBH negli animali lesionati rispetto agli animali di controllo, ad indicare una grave deple‐
zione dei neuroni noradrenergici in questa struttura (Fig 4.1). La deplezione dei neu‐
roni noradrenergici è apparsa chiaramente dose dipendente. Infatti, se negli animali trattati con 0.50 μg o 1.00 μg di αDBHsap si osservavano una deplezione pressoché completa dei neuroni del LC, i ratti cui è stata somministrata una dose minore di im‐
munotossina (0.25 μg) presentavano una riduzione nel numero di neuroni noradre‐
|67| RISULTATI nergici meno marcata e la presenza di un numero significativo di fibre positive per la DBH risparmiate dalla lesione. L’iniezione i.c.v. di 6OHDA determinava, come previ‐
sto, una deplezione massiva dei neuroni e delle fibre noradrenergiche in LC e SubC (Fig. 4.1‐F). Fig. 4.1 Effetti della somministrazione perinatale di αDBHsap La somministrazione i.c.v. di dosi crescenti di αDBHsap in ratti a P4 determina una deplezione di neuroni DBH positivi nella regione del complesso Locus Cœru‐
leus/Sub Cœruleus (LC/SubC). La somministrazione di 0.25 μg di immunotossina (C) ha effetti modesti. Si noti la presenza di neuroni e fibre residue. Al contrario dosi più alte di immunotossina (0.50 μg (D) e 1.00 μg (E)) determinano una de‐
plezione pressoché completa dei neuroni DBH positivi del LC. La somministrazio‐
ne i.c.v. in animali neonati di 110 μg di 6OHDA (F) provoca una lesione di entità simile con qualche sparso elemento cellulare risparmiato. Nessuna differenza si osserva invece fra gli animli intatti (A) e gli animali che hanno ricevuto l’iniezione i.c.v. del solo veicolo (B) (Scale bar 200 μm). |68| RISULTATI Fig. 4.2 Effetti della somministrazione perinatale di di αDBHsap sull’innervazione nora‐
drenergica del Midollo Spinale Le immagini in campo scuro mostrano come somministrando i.c.v. dosi crescenti di αDBHsap in ratti a P4 si determini una riduzione dose dipendente delle fibre noradrenergiche (DBH positive). In particolare la deplezione è pressoché comple‐
ta quando vengono somministrati 0.5 μg (D) o 1.00 μg (E)di immunotossina, mentre si osserva un certo numero di fibre residue negli animali cui sono stati somministrati 0.25 μg di αDBHsap (C). Anche la somministrazione i.c.v. di 110 μg di 6OHDA determina una deplezione pressoché completa delle fibre noradrener‐
giche in SC (F), mentre nessuna differenza rispetto agli animali intatti (A) si osser‐
va nei ratti cui è stato iniettato il solo veicolo (B). (Scale Bar 200 μm) |69| RISULTATI Questa riduzione dose dipendente nel numero di neuroni noradrenergici si riflette sulla densità di fibre noradrenergiche (DBH positive) osservabili nel Midollo Spinale di questi animali. Infatti gli animali trattati con dosi intermedie o alte di immunotos‐
sina o 6OHDA presentano una deplezione pressoché completa delle fibre DBH positi‐
ve nelle porzioni toraco‐lombari del SC (Figg. 4.2, 4.3). Al contrario gli animali trattati con dosi basse di αDBHsap (0.25 μg) presentano una perdita parziale delle fibre no‐
radrenergiche in questa zona, quantificabile attorno al 50% dopo analisi densitome‐
trica (Fig. 4.3) 4.1.2. Effetti a Lungo Termine Densità Fibre DBH positive
70
60
50
40
30
20
10
0
Breve‐termine
Lungo‐termine
Intatto 0.25 µg 0.50 µg 1.00 µg 6OHDA Fig. 4.3 Effetti a breve e a lungo termine della somministrazione di αDBHsap La somministrazione i.c.v. di una dose pari a 0.25 μg di αDBHsap determina una significativa riduzione sia dell’immunoreattività per DBH nella regione del LC/SubC (A) che dell’innervazione noradrenergica in SC (C). Tuttavia a lungo ter‐
mine (40 settimane) si osserva un aumento della densità di fibre noradrenergiche nelle regioni spinali (D) ed un aumento dell’immunoreattività per DBH nella re‐
gione del LC/SubC (B). La lesione con dosi maggiori di αDBHsap (0.50 μg o 1.00 μg) o cin 110 μg di 6OHDA si dimostrano stabili nel tempo come si nota osserva‐
no il grafico riportante la densità delle fibre noradrenergiche in SC a 5 (breve‐
termine) o 40 settimane (lungo‐termine) dalla lesione. ( indica un calo signifi‐
cativo della densità di fibre noradrenergiche rispetto agli intatti p<0.05) |70| RISULTATI Come già detto, la somministrazione di 0.50 μg e 1.00 μg di immunotossina deter‐
mina, a 5 settimane, una deplezione pressoché completa dei neuroni noradrenergici del LC e delle fibre nelle regioni target. A tali dosi la lesione si dimostra stabile, infatti a 40 settimane dalla lesione la perdita noradrenergica si presenta praticamente inal‐
terata (Grafico in Fig.4.3). Al contrario, negli animali trattati con basse dosi di immu‐
notossina (0.25 μg), la modesta ma evidente riduzione di fibre noradrenergiche nelle regioni spinali a 5 settimane è seguita, a 40 settimane, da un significativo aumento dell’immunoreattività per DBH indicativo di eventi di reinnervazione compensatoria. Infatti la densità di fibre noradrenergiche nel SC di questi soggetti a 40 settimane post‐lesione è molto prossima al normale (Fig.4.3). Ciò fa presupporre dei fenomeni di sprouting negli assoni che risparmiati dalla lesione. 4.1.3. Specificità della Lesione La specificità della lesione è stata analizzata valutando gli effetti dell’immunotossi‐
na su gruppi neuronali, diversi dal noradrenergico, che vengono solitamente colpiti da tossine come la 6OHDA e la DSP4. Dall’analisi delle sezioni comprendenti la Sub­
stantia Nigra colorate per TH si è potuto osservare che la αDBHsap anche a dosi alte (1.00 μg) non determina variazioni di rilievo nel numero e nella distribuzione delle cellule dopaminergiche. Al contrario in questa zona si osserva una marcata riduzione del numero di cellule immunoreattive per TH negli animali trattati con la 6OHDA (Fig.4.4‐A,B,C). Anche il numero di neuroni adrenergici della zona C1 non subisce va‐
riazioni a seguito del trattamento con l’immunotossina ma cala significamente in se‐
guito alla lesione con 6OHDA (Fig.4.4‐D,E,F). Infine una lieve riduzione nel numero di neuroni serotoninergici del Raphe Magno si può osservare negli animali trattati con 6OHDA mentre il numero di tali cellule appare invariato negli animali lesionati con αDBHsap (Fig.4.4‐G,H,I). Questi dati confermano quindi l’alta selettività della α‐
DBHsap che anche ad alte dosi (1.00 μg) non sembra avere effetti su neuroni diversi da quelli noradrenergici. |71| RISULTATI Fig.4.4 specificità della lesione neonatale La somministrazione di alte dosi (1.00 μg) di αDBHsap non determina variazioni di rilievo nel numero dei neuroni dopaminergici della Substantia Nigra (B), di quelli adrenergici della zona C1 (E) e di quelli serotoninergici del Raphe Magno (H) rispetto ai controlli (A, D, G). Al contrario la somministrazione di 6OHDA de‐
termina una deplezione neuronale a carico dei neuroni dopaminergici (C), adre‐
nergici (F) e serotoninergici (I). (Scale Bar 500 μm). 4.2. Esperimento 2 Trapianto di Progenitori Neurali in Midollo Spinale Al fine di valutare se una lesione perinatale con αDBHsap fornisse un ambiente permissivo per la crescita di progenitori neurali, sospensioni cellulari provenienti da LC embrionale (E13) sono stati impiantati nel SC lombare (L2) di animali lesionati a P4 con 0.5 μg di αDBHsap, infatti esperimenti preliminari, in linea con precedenti os‐
|72| RISULTATI servazioni [Gage e Bjorklund, 1986; Gage e Fisher, 1991], non hanno mostrato una sopravvivenza cellulare aprezzabile dopo trapianto in animali integri (dati non pre‐
sentati). Fig. 4.5 Trapianti di Progenitori Neurali noradrenergici in Midollo Spinale denervato mediante αDBHsap Gli impianti presentano al loro interno cellule noradrenergiche (DBH positive) (immagine in campo chiaro – CC) ben integrate nel tessuto ospite con fibre che dall’impianto passano nella sostanza grigia e bianca del Midollo Spinale (immagi‐
ne in campo scuro – CS). (Scale Bar 100 μm) Fig. 4.6 Trapianti di Progenitori Neurali noradrenergici in Midollo Spinale denervato mediante αDBHsap Ad alto ingrandimento i neuroni noradrenergici (immunoreattivi per DBH) si pre‐
sentano singolarmente (a destra) o riuniti in cluster (a sinistra). Si notino i nume‐
rosi processi molto ramificati, indice della vitalità delle cellule impiantate. (Scale Bar 100 μm) |73| RISULTATI A 40 settimane dall’intervento, gli animali presentano impianti vitali e ben posi‐
zionati nella sostanza grigia midollare. All’interno del trapianto sono state osservate numerose cellule positive alla DBH, marker tipico dei neuroni noradrenergici. Queste cellule si presentavano singole o in cluster neuronali e venivano osservate formare ricchi plessi di fibre immunoreattive (Fig.4.6). L’impianto si presentava anatomicamente ben integrato, non creava alcun danno tissutale o infiammatorio ed era attraversato da dense reti di fibre noradrenergiche che dalla zona del trapianto si portavano nella sostanza grigia e bianca del tessuto o‐
spite (Fig.4.5). Queste fibre non restavano confinate nelle vicinanze dell’impianto ma decorrevano lungo il SC sia caudalmente che rostralmente per più di 10‐15 mm dal sito dell’impianto stesso (Fig.4.7). Inoltre nelle zone prossime al trapianto si osserva‐
va come l’innervazione noradrenergica raggiungesse una densità di fibre paragonabi‐
le, e in qualche caso superiore, a quella osservata in animali normali (Fig.4.8). Fig. 4.7 Trapianti di Progenitori Neurali noradrenergici in Midollo Spinale denervato mediante αDBHsap Le fibre noradrenergiche emesse dal trapianto (t) si estendono per diversi milli‐
metri (> 10‐15 mm) lungo il Midollo Spinale fornendo un’innervazione noradre‐
nergica anche a zone relativamente distanti dall’impianto stesso. (Scale Bar 200 μm) |74| RISULTATI Fig. 4.8 Trapianti di Progenitori Neurali noradrenergici in Midollo Spinale denervato mediante αDBHsap Il trapianto di Progenitori Neurali noradrenergici in Midollo Spinale denervato mediante somministrazione di αDBHsap (E), determina un aumento dell’innervazione noradrenergica nelle zone adiacenti all’impianto (t) che deter‐
mina una densità di fibre noradrenrgiche paragonabile, se non superiore (F), a quella che si riscontra nell’animale intatto (D). In A‐C sono rappresentate le re‐
gioni del LC/SubC dell’animale intatto (A), lesionato (B) e lesionato e trapiantato (C). (Scale Bar 100 μm) |75| RISULTATI 4.3. Esperimento 3 Effetti Comportamentali della Rimozione del Sistema Noradrenergico 4.3.1. Lesioni neonatali La somministrazione di αDBHsap in ambito perinatale determina la deplezione quasi completa (>90%) dei neuroni noradrenergici presenti nel complesso LC/SubC (Fig.4.1). Questa deplezione dei neuroni dl LC determina una calo dell’innervazione noradrenergica oltre che nel SC (come precedentemente riportato) anche nelle regio‐
ni rostrali, in particolare nell’Ippocampo dove si osserva una scomparsa pressoché completa delle fibre noradrenergiche (Fig.4.9) Fig. 4.9 Effetti della somministrazione neonatale di αDBHsap sull’innervazione nora‐
drenergica di Corteccia e Ippocampo Negli animali intatti in Corteccia Fronto‐Parietale (A) e Giro Dentato dell’Ippocampo (C) vi è una cospicua innervazione noradrenergica. La lesione con αDBHsap determina in entrambe le zone una denervazione noradrenergica pres‐
soché completa (B in Corteccia Fronto‐Parietale, D in Giro Dentato).(Scale Bar 200 μm) |76| RISULTATI Morris Water Maze I tempi medi impiegati dagli animali per localizzare la piattaforma sommersa nel Reference Memory Test sono illustrati nella Fig.4.10. In generale si osserva che tutti i gruppi migliorano la loro performance nel corso del test impiegando per ritrovare la piattaforma più di 30 secondi al primo giorno e meno di 10 al settimo. Si osservano però delle differenze significative (Repeated Measure ANOVA p<0,01) tra i diversi gruppi nella modalità e nella velocità di apprendimento. Il gruppo degli intatti e i trat‐
tati con PBS dimostrano di imparare velocemente, tanto da dimezzare, fra il primo ed il secondo giorno, il tempo in cui trovano la piattaforma. Al contrario gli animali trat‐
tati con αDBHsap, pur raggiungendo già al quinto giorno una performance uguale a quella degli altri gruppi, dimostrano un ritardo nell’apprendimento con una latenza significativamente maggiore al secondo, terzo e quarto giorno di test rispetto ai nor‐
mali (p<0.01). Una situazione simile si può osservare analizzando la distanza percorsa dagli ani‐
mali per ritrovare la piattaforma (Fig.4.10). Se nel primo giorno di test essi percorre‐
vano dai 6 m agli 8 m all’ultimo giorno di test la media è stata minore di 2 m. Anche in questo caso inoltre si osserva come gli animali lesionati con αDBHsap imparino in maniera significativamente (p<0.01) meno rapida rispetto a gli altri tre gruppi, in par‐
ticolare si ha un aumento della distanza percorsa dal secondo al quarto giorno di test, mentre la performance diviene simile al normale dal 5° giorno in poi. La velocità di nuoto invece è risultata simile in tutti i gruppi, con una media di 0.19 m/s (dati non presentati). Ciò, assieme ai risultai dei test motori, indica l’assenza di alterazioni motorie che potrebbero influenzare la performance nel test. |77| RISULTATI Distanza (m)
Morris Water Maze
Distanza
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
1
2
3
Latenza (s)
Intatto
4
Giorno
5
Veicolo
6
aDBH‐sap
7
Latenza
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
1
2
3
4
5
6
7
Giorno
Fig. 4.10 Effetti della rimozione neonatale del Sistema Noradrenergico sulla Reference Memory (Place Test) La deplezione neonatale del Sistema Noradrenergico determina un lieve deficit nelle abilità di Reference Memory che si manifesta con un significativo aumento ( p<0.05) della distanza e del tempo necessari a ritrovare la piattaforma nei primi giorni di test. Negli ultimi 3 giorni, tuttavia, la performance degli animali le‐
sionati si approssima a quella dei soggetti di controllo. |78| RISULTATI Spatial Probe Trial Come si può osservare dai tracciati riportati in figura 4.11 tutti gli animali, avendo raggiunto livelli normali negli ultimi giorni del Place Test, presentano una strategia di ricerca spaziale. Per questo motivo nessuna differenza tra i diversi gruppi è stata rile‐
vata nello Spatial Probe Trial (p>0.05). Infatti sia gli animali di controllo che gli ani‐
mali lesionati nuotavano preferibilmente nel quadrante dove in precedenza era posizionata la piattaforma (SW) effettuando un numero di collisioni con l’annulo po‐
sto in questo quadrante un numero di volte significativamente maggiore rispetto alle collisioni con gli annuli posti nelle altre posizioni. Fig. 4.11 Spatial Probe Trial Tutti gli animali, dopo 7 giorni di test al Morris Water Maze, presentano una stra‐
tegia di ricerca spaziale concentrando il loro nuoto nel quadrante ed in particola‐
re nell’annulo in cui in precedenza era posizionata la piattaforma (indicata dal cerchio rosso). La linea blu indica il percorso compiuto dall’animale durante lo Spatial Probe Trial. Si noti l’assenza di differenze tra i gruppi. Radial Arm Water Maze Tutti gli animali hanno dimostrato di migliorare la loro performance nel Working Memory Test; da una latenza per trovare la piattaforma di 40 – 50 secondi nel primo trial si è infatti giunti a 15 – 25 secondi nell’ultimo trial. Anche qui si sono osservate tuttavia alcune differenze; gli animali di controllo miglioravano marcatamente la loro performance dal primo al secondo trial, quelli con lesione noradrenergica, invece, |79| RISULTATI manifestavano un miglioramento molto meno marcato e differivano significativamen‐
te dai precedenti (p<0.01) non raggiungendo in nessun caso una performance para‐
gonabile a quella dei controlli. Tali differenze sono state confermate anche dall’analisi dei dati in termini di Savings che appaiono significativamente ridotti negli animali le‐
sionati con αDBHsap rispetto al gruppo di controllo (p<0.01). Infatti, mentre gli ani‐
mali di controllo apprendevano velocemente, e riducevano la latenza dal primo al secondo trial, gli animali lesionati presentavano un miglioramento fra primo e secon‐
do trial molto meno marcato (Fig.4.12). Radial Arm Water Maze
Latenza
60
60
Savings
50
50
40
Latenza (s)
40
30
20
20
10
10
0
0
1
2
Controllo
3
Trial
4
αDBHsap
*
30
5
Controllo
αDBHsap
Fig. 4.12 Effetti della lesione neonatale sulla Working Memory La lesione determina un marcato calo della performance al Radial Arm Water Maze. Si noti in particolare il mancato miglioramento dei soggetti tra il primo ed il secondo trial (Savings) ( indica una performance significativamente peggiore rispetto ai controlli; p<0.05) |80| RISULTATI 4.3.2. Lesioni Adulte Effetti Anatomici Lesionando animali adulti mediante la somministrazione di αDBHsap direttamente in entrambi i LC si ottiene una deplezione dei neuroni noradrenergici del complesso LC/SubC pressoché completa (Fig.4.13). Questo dato è in accordo con quanto riporta‐
to precedentemente dopo lesioni i.c.v. ad animali adulti [Wrenn et al., 1996], confer‐
mando l’efficacia e la selettività del trattamento. Fig. 4.13 Effetti anatomici della lesione noradrenergica adulta con αDBsap La somministrazione di αDBHsap nel LC di animali adulti determina una deple‐
zione pressochè completa dei neuroni noradrenergici (immunoreattivi per TH) nella regione del LC/SubC (C). Al contrario la somministrazione del solo veicolo (B) non determina alcun effetto se comparato con gli animali intatti (A). (Scale Bar 500 μm) Morris Water Maze e Spatial Probe Trial Dall’analisi dei tempi e delle distanze necessarie agli animali per ritrovare la piat‐
taforma sommersa durante il Morris Water Maze emerge chiaramente che tutti gli a‐
nimali sono in grado di apprendere rapidamente. Inoltre nessuna differenza è stata trovata fra gli tra il gruppo degli animali lesionati in età adulta con la αDBHsap e i gruppi di controllo (intatti e veicolo) (Fig.4.14). |81| RISULTATI Morris Water Maze
Distanza
9
8
Distanza (m)
7
6
5
4
3
2
1
0
1
2
3
4
Giorni di Test
Intatti
5
6
Veicolo
7
αDBHsap
Latenza
60
Latenza (s)
50
40
30
20
10
0
1
2
3
4
Giorni di Test
5
6
Fig. 4.14 Effetti della lesione noradrenergica adulta sulla Reference Memory (Place Test) La rimozione del Sistema Noradrenergico mediante somministrazione in LC di αDBHsap non determina alcun deficit a carico della Reference Memory. Gli ani‐
mali lesionati, infatti, impiegano lo stesso tempo e la stessa distanza dei controlli per ritrovare la piattaforma sommersa. |82| RISULTATI Ciò fa ipotizzare che la rimozione del sistema noradrenergico in animali adulti non determini significative variazioni nella Reference Memory di questi animali. Ed in ef‐
fetti nemmeno analizzando i dati dello Spatial Probe Trial si è potuta osservare alcuna differenza tra i gruppi. Infatti tutti gli animali hanno dimostrato di possedere una strategia di ricerca spaziale concentrando le loro ricerche nel quadrante in cui in pre‐
cedenza era posizionata la piattaforma come si può osservare dai tracciati di nuoto riportati in figura (Fig.4.15). Fig. 4.15 Spatial Probe Trial L’assenza di deficit nel Place Test si riflette anche nello Spatial Probe Trial. Si noti come tutti gli animali nuotano preferenzialmente nel quadrante e nell’annulo in cui in precedenza era posizionata la piattaforma (indicata con un cerchio rosso). Ciò suggerisce l’assenza di deficit. Radial Arm Water Maze Analizzando il tempo impiegato per raggiungere la piattaforma sommersa nei 5 trial somministrati durante il Radial Arm Water Maze, si può osservare come gli ani‐
mali intatti e gli animali cui è stato somministrata l’immunotossina αDBHsap in età adulta apprendono meno efficacemente (p<0.05) degli animali di controllo tanto che al 5° trial presentano una performance simile a quella del 1° trial. Ciò è ancora più e‐
vidente se si analizza il coefficiente di apprendimento fra il 1° ed il 2° trail mediante il parametro dei Savings (Fig.4.16); dall’immagine si può osservare come gli animali le‐
sionati abbiano un tasso di apprendimento che è minore della metà se confrontato |83| RISULTATI con i gruppi di controllo. Il deficit nelle abilità di Working Memory in questi animali appare paragonabile a quello precedentemente osservato negli animali in cui il Si‐
stema noradrenergico veniva lesionato nei primi giorni postnatali. Nel loro insieme, quindi, i dati sembrano suggerire effetti differenziali della lesione (neonatale o adul‐
ta) sulla Reference e sulla Working Memory. Radial Arm Water Maze
35
Savings
30
25
20
15
10
5
0
Intatti
Veicolo
αDBHsap
Fig. 4.16 Effetti della rimozione del Sistema Noradrenergico in animali adulti sulla Working Memory La lesione adulta determina un deficit nella Working Memory, come si evince dall’analisi dei Savings fra il primo ed il secondo trial durante il Radial Arm Water Maze. ( p<0.05) |84| RISULTATI 4.4. Esperimento 4 Effetti di Lesioni Combinate Colinergica e Noradrenergica 4.4.1. Effetti Anatomici Come osservato negli esperimenti precedenti di questa tesi, la somministrazione della αDBHsap ad animali neonati determina una riduzione dell’immunoreattività per marker noradrenergici a livello del complesso LC/SubC superiore al 90‐95% indican‐
do una deplezione pressoché completa di cellule e fibre noradrenergiche nel SNC (Fig.4.17). Fig. 4.17 Effetti della somministrazione singola o combinata di αDBHsap e/o 192sap sui neuroni noradrenergici del LC La somministrazione di 192sap non determina alcuna variazione nel numero di neuroni noradrenergici (DBH‐immunoreattivi) nella regione del LC/SubC (B) se confrontato con gli animali di controllo (A). Al contrario, la somministrazione di αDBHsap da sola (C) o in combinazione con la 192sap (D) determina una deple‐
zione pressoché completa dei neuroni noradrenergici nel LC/SubC. (Scale Bar 100 μm) In modo simile, la somministrazione i.c.v. di 192sap in animali neonati determina una significativa riduzione (~ 75%) nel numero di neuroni colinergici a livello del MS ed del NBM (Fig.4.18). Questa deplezione dei neuroni appartenenti al Sistema Coli‐
nergico del Prosencefalo della Base si riflette sull’innervazione colinergica a livello di |85| RISULTATI Ippocampo e Corteccia Fronto‐Parietale. L’analisi della densità delle fibre positive per l’Acetilcolinestrasi (AChE) infatti rivela una riduzione dell’innervazione colinergica pari al 70‐80% circa negli animali sottoposti a lesione con la 192sap rispetto agli a‐
nimali di controllo (Fig.4.19). È da sottolineare infine come le due immunotossine siano altamente specifiche in quanto, almeno morfologicamente, non si osservano effetti sul sistema colinergico in seguito alla lesione noradrenergica e viceversa nessuna effetto sul LC si osserva a se‐
guito della somministrazione della 192sap (Figg.4.14, 4.19) Fig. 4.18 Effetti della somministrazione singola o combinata di αDBHsap e/o 192sap sui neuroni colinergici del MS/DBB e del NBM La somministrazione di αDBHsap non determina alcuna variazione nel numero di cellule colinergiche nel complesso MS/DBB (B) o nel NBM (F). Al contrario, la somministrazione neonatale di 192sap da sola (C; G) o in combinazione con la le‐
sione noradrenergica (D; H) porta ad una marcata riduzione (attorno al 70‐80%) dei neuroni colinergici nel MS, nella DBB (C;D) e nel NBM (G;H). A ed E si riferi‐
scono rispettivamente al complesso MS/DBB e al NBM di animali di controllo. (Scale Bar 200 μm) |86| RISULTATI Densitometri Fibre AChE positive
Densità relativa
80
60
Controllo
40
20
αDBHsap
192sap
Doppie Les
0
Cx
CA1
CA3
DG
E Fig. 4.19 Effetti della somministrazione di αDBHsap e/o 192sap sull’innervazione coli‐
nergica in Corteccia e Ippocampo La rimozione del Sistema Colinergico Basale in età neonatale porta ad una ridu‐
zione di circa il 70% nell’innervazione colinergica (AChE positiva) della Corteccia Fronto‐Parietale (Cx) e nelle varie zone dell’Ippocampo (DG, CA1 e CA3). Ciò si può osservare sia dalle immagini (C) che dal grafico riportante le analisi densito‐
metriche (E). Allo stesso modo anche la lesione combinata dei Sistemi Noradre‐
nergico e Colinergico Basale determina una riduzione simile nell’innervazione colinergica in queste zone (D). La somministrazione della solo αDBHsap (B) non determina alcuna significativa variazione nell’innervazione colinergica rispetto ai controlli (A). (Scale Bar in C 500 μm, inserto: 100 μm) ( p<005) |87| RISULTATI Infine si può osservare come somministrando entrambe le immunotossine si ot‐
tengano deplezioni neuronali e dell’innervazione terminale del tutto simili a quanto è possibile osservare a seguito delle singole lesioni (Figg.4.18, 4.19). Tale effetto tutta‐
via si manifesta solo nel caso di iniezioni differite. Iniettando una soluzione nella qua‐
le siano state disciolte simultaneamente le due tossine si osservano deplezioni meno marcate e inconsistenti (dati non presentati), forse a causa di interazioni chimiche tra i due coniugati che ne attenuerebbe l’efficacia. 4.4.2. Effetti Comportamentali Morris Water Maze Dall’analisi del tempo e della distanza necessari agli animali per ritrovare la piatta‐
forma sommersa si sono osservate differenze significative fra i diversi gruppi (p<0.05). Infatti, come precedentemente riportato in letteratura [Leanza et al., 1996], gli animali cui è stato rimosso il Sistema Colinergico Basale in ambito perinatale pre‐
sentano una performance sovrapponibile a quella degli animali di controllo. Questi a‐
nimali dimezzano fra il primo ed il secondo giorno il tempo e la distanza necessari per trovare la piattaforma e già al 4°/5° giorno di test dimostrano di conoscere con preci‐
sione la posizione della piattaforma impiegando circa 10 secondi a raggiungerla. Al contrario gli animali cui è stato rimosso il sistema noradrenergico e gli animali con la doppia lesione colinergica/noradrenergica presentano una performance significati‐
vamente peggiore rispetto agli animali di controllo ed ai lesionati con la sola 192sap; essi infatti dimezzano il tempo e la distanza necessari a ritrovare la piattaforma sommersa solamente fra i giorni 4 e 5. È da notare tuttavia che mentre gli animali con la singola lesione noradrenergica migliorano ancora la loro performance e giungano a livelli prossimi al normale nell’ultimo giorno, come del resto già precedentemente ri‐
portato, gli animali cui sono state somministrate entrambe le immunotossine già do‐
po il 5° giorno di test non presentano alcun miglioramento significativo della performance (Fig.4.20). |88| RISULTATI Morris Water Maze
Latenza
60
Latenza (s)
50
40
30
5
6
20
10
0
1
2
Controllo
3
αDBHsap
192sap
7
Doppie Les
Distanza
12
10
Distanza (m)
4
Giorno
8
6
5
6
4
2
0
1
2
3
4
Giorno
7
Fig. 4.20 Effetti della rimozione neonatale combinata dei Sistemi Noradrenergico e Coli‐
nergico sulla Reference Memory (Place Test) Gli animali con la doppia lesione colinergica e noradrenergica hanno una perfor‐
mance significativamente peggiore degli animali di controllo ( p<0.05) dal se‐
condo al settimo giorno di test. Gli animali con la sola lesione noradrenergica, invece, pur presentando un significativo ritardo nell’acquisizione della posizione della piattaforma rispetto ai controlli ( p<0.05) al settimo giorno migliorano la loro performance tanto da impiegare un tempo ed una distanza paragonabili a quelle dei controlli. Gli animali con la singola lesione colinergica invece non pre‐
sentano alcun deficit di rilievo. |89| RISULTATI Spatial Probe Trial La differenza fra gli animali con la singola lesione noradrenergica rispetto agli a‐
nimali cui sono stati rimossi sia il sistema colinergico che quello noradrenergico è an‐
cora più evidente analizzando i dati dello Spatial Probe Trial. Questo test, che mostra il grado ai apprendimento degli animali e fa emergere il possibile impiego di una stra‐
tegia di navigazione spaziale, ci mostra come gli animali intatti e gli animali con lesio‐
ne singola, sia essa colinergica o noradrenergica, nuotano preferenzialmente nel quadrante in cui in precedenza era posizionata la piattaforma (SW). Al contrario, gli animali con la doppia lesione colinergica‐noradrenergica nuotano in modo significati‐
vamente meno mirato rispetto ai controlli, ad indicare una minor forza della memoria acquisita. Lo stesso si può affermare analizzando il numero di collisioni con i quattro annuli che gli animali effettuano durante lo Spatial Probe Trial. Infatti gli animali con la doppia lesione collidono significativamente meno spesso degli animali degli altri gruppi con l’annulo in cui era posizionata la piattaforma, mentre nessuna differenza vi è nel numero di collisioni con gli altri annuli presenti nella vasca. Le stesse osserva‐
zioni possono essere effettuate anche analizzando i tracciati di nuoto dei singoli ani‐
mali (Fig.4.21). Questo dato sottolinea ulteriormente i deficit di apprendimento e memoria degli animali cui sono state somministrate entrambe le immunotossine. I dati inoltre indicano che rimuovendo simultaneamente i due sistemi colinergico e no‐
radrenergico si può ottenere un deficit che non è la semplice somma degli effetti della rimozione dei singoli sistemi neurotrasmettitoriali. |90| RISULTATI Spatial Probe Trial Distanza per quadrante
60
Distanza %
50
40
30
20
10
0
Controllo
SE
αDBHsap
192sap
SW (piattaforma)
NW
Doppie Les
NE
Collisioni con gli Annuli
9
Numero di Collisioni
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Controllo
αDBHsap
192sap
Doppie Les
|91| RISULTATI Fig. 4.21 Spatial Probe Trial Gli animali con la doppia lesione neonatale colinergica e noradrenergica durante lo Spatial Probe Trial nuotano significamente meno nel quadrante in cui in pre‐
cedenza era posizionata la piattaforma (SW) e collidono meno spesso con il ri‐
spettivo annulo ( p< 0.05). Ciò può essere osservato sia dai grafici che dai tracciati di nuoto (la linea blu indica il percorso dell’animale mentre il cerchio rosso indica la posizione della piattaforma durante l’allenamento). Radial Arm Water Maze Anche dall’analisi delle Performance nel Radial Arm Water Maze sono emerse diffe‐
renze significative fra i diversi gruppi testati nelle abilità di Working Memory. Tutti gli animali nel primo trial necessitano infatti di circa 40 secondi per trovare la posizione della piattaforma sommersa. Nei trial successivi vi è invece una significativa differen‐
za fra i vari gruppi. Gli animali con la singola lesione colinergica, ed in misura maggio‐
re gli animali cui è stata somministrata la αDBHsap da sola o in combinazione con la 192sap, necessitano di più tempo dei controlli per ritrovare la piattaforma sommersa, nei trial successivi al primo. Questo ritardo nell’apprendimento è ancor più evidente se si analizza il parametro dei Savings, il quale riporta il tasso di apprendimento fra il primo ed il secondo trial dei diversi gruppi di animali. Come si può osservare dall’immagine (Fig.4.22) gli animali con singola lesione colinergica hanno un tasso d’apprendimento ridotto di circa il 30% rispetto agli animali normali. Ancora maggio‐
re è il deficit degli animali con la singola lesione noradrenergica o con la lesione com‐
binata dei due sistemi neurotrasmettitoriali nei quali la performance è ridotta di circa il 50% (Fig4.22). Interessante notare come, in questo caso, non vi sia un effetto cumu‐
lativo, e tantomeno sinergico, delle due lesioni, infatti la rimozione dei entrambi i si‐
|92| RISULTATI stemi neurotrasmettitoriali determina un deficit del tutto paragonabile a quello servato rimuovendo il solo sistema noradrenergico. Radial Arm Water Maze
Latenza
50
45
40
‡
35
‡
Latenza (s)
30
‡
‡
25
20
15
10
5
0
1
2
Controllo
3
Trial
αDBHsap
4
5
192sap
Doppie Les
Savings
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Controllo
αDBHsap
192sap
‡
Doppie Les
Fig. 4.22 Effetti della rimozione neonatale combinata dei Sistemi Colinergico Basale e Noradrenergico sulla Working Memory La somministrazione neonatale di 192sap o αDBHsap, singolarmente o in combi‐
nazione, determina un calo della performance al Radial Arm Water Maze. Ciò si evince sia dal grafico del tempo utilizzato dall’animale per ritovare la piattaforma nei diversi trial, sia dall’analisi dai Savings fra il primo ed il secondo trial. (, e ‡ indicano differenza significativa rispetto ai controlli p<0.05) |93| RISULTATI 4.4.3. Effetti sulla Neurogenesi. Analizzando il numero totale di cellule immunoreattive per la BrdU nel DG dell’Ippocampo non è emersa alcuna significativa differenza fra i vari gruppi ad una accurata analisi dei. Si è infatti potuto stimare che in questa regione fossero sopravis‐
sute, dopo 3 settimane dalla somministrazione della BrdU, dalle 800 alle 1000 nuove cellule (Fig.4.23) 1400
Cellule BrdU positive
Cellule BrdU positive
1200
1000
800
600
400
200
0
Controllo αDBHsap 192sap Doppia Les
Fig. 4.23 Analisi stereologiche degli effetti della lesione del Sistema Noradrenergico e/o colinergico Basale sulla sopravvivenza dei neuroni neoformati in SGZ A 3 settimane dalla somministrazione di BrdU non si osserva alcuna significativa variazione nel numero totale di neuroni neoformati sopravissuti negli animali con la singola lesione noradrenergica (B) o colinergica (C), né negli animali cui sono stati rimossi entrambi i sistemi (D) rispetto ai controlli (A). (Scale Bar 50 μm) Tuttavia analizzando i campioni è stato osservato come la colorazione non si pre‐
sentasse in maniera uniforme nei vari gruppi. Infatti alcune cellule presentavano la tipica immunoreattività ben distribuita all’interno del nucleo (pattern definito come nucleare, Fig.4.24‐B) mentre in altre cellule solo una parte del nucleo si presentava immunoreattivo (pattern puntiforme, Fig.4.24‐C). Infine, sorprendentemente, una parte delle cellule presentava una immunoreattività diffusa a tutto il citoplasma in cui il nucleo rimaneva evidentemente non colorato (pattern citoplasmatico, Fig.4.24‐A). Analizzando la presenza relativa di questi diversi pattern di distribuzione dell’immunoreattività per BrdU nei diversi gruppi è emerso come negli animali nor‐
mali la maggior parte delle cellule BrdU positive presentasse un pattern nucleare. Al |94| RISULTATI contrario gli animali lesionati con la αDBHsap, con la 192sap o con entrambe le im‐
munotossine, presentavano un numero di cellule con immunoreattività citoplasmati‐
ca significativamente maggiore di quelle con colorazione nucleare o puntiforme. Nessuna differenza significativa si è invece osservata nel numero di cellule con im‐
munoreattività puntiforme tra i diversi gruppi di animali (Fig.4.24). Pattern immunoreattività per BrdU
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
Controllo αDBHsap
192sap Doppia Les
Citoplasmatica
Puntiforme
Nucleare
Fig. 4.24 Pattern di presentazione dell’immunoreattività per BrdU L’immunoreattività per BrdU esibisce pattern di localizzazione cellulare diversi: distribuita nel nucleo in modo uniforme (nucleare – B) o in maniera disomogenea (puntiforme – C) oppure spostata nel citoplasma (citoplasmatica – A). Negli ani‐
mali con la singola lesione colinergica o noradrenergica e negli animali con la doppia lesione vi è un significativo aumento nella percentuale di cellule con colo‐
razione citoplasmatica. Nei controlli invece la maggior parte delle cellule BrdU positive presenta una colorazione nucleare uniforme. |95| DISCUSSIONE 5. Discussione In questo lavoro è stato utilizzato un modello di deplezione del sistema noradre‐
nergico centrale basato sull’impiego di una tossina, la Anti Dopamine Beta Hydroxyla­
se­Saporin, costituita da un anticorpo monoclonale contro l’enzima DBH di ratto e da una tossina inattivante la subunità 60S dei ribosomi eucariotici. Questa immunotossi‐
na si è dimostrata essere molto efficace e selettiva nella distruzione delle cellule no‐
radrenergiche del SNC quando iniettata in animali adulti[Wrenn et al., 1996]. L’alta specificità di questa tossina è data dall’anticorpo, il quale riconosce la DBH ,un enzima espresso dalle cellule noradrenergiche che trasforma la dopamina in noradrenalina. Questo enzima si può trovare sia nel citoplasma che sulla membrana cellulare [Sab‐
ban et al., 1983]. In particolare, l’enzima viene esposto nell’ambiente extracellulare quando le cellule sono in attività e liberano noradrenalina [Weinshilboum e Axelrod, 1971]; quindi gli anticorpi che legano la forma di questo enzima esposta in membrana vengono endocitati e trasportati fino al corpo cellulare, dove la Saporina esercita la sua funzione tossica [Silver e Jacobowitz, 1979]. Ciò rende la αDBHsap estremamente più specifica rispetto ad altri metodi di lesione noradrenergica utilizzati finora quali la 6OHDA [Engelbrecht et al., 1994], utilizzata nel presente lavoro come tecnica lesiva di confronto, ma anche della più specifica DSP‐4 [Hallman et al., 1984]. Tali metodi in‐
fatti possono determinare delle deplezioni neuronali anche in sistemi centrali diversi da quello noradrenergico, rendendo problematica l’interpretazione dei dati funzionali emergenti. I risultati esposti negli esperimenti che compongono la presente tesi, nel complesso, evidenziano la grande importanza funzionale del Sistema Noradrenergico, in grado di influenzare simultaneamente attività diversificate che hanno luogo a |96| DISCUSSIONE grande distanza fra loro. Inoltre sottolineano l’affidabilità dell’approccio immunotos‐
sico nello studio di tali funzioni. 5.1. Caratterizzazione della Lesione Neonatale con αDBHsap Esperimento 1 Nessuno studio aveva finora investigato l’efficacia di questa tossina su un sistema ancora immaturo dove l’espressione dei diversi marker risulta in una certa misura di‐
namica e soggetta a variazioni legate alla maturazione delle proiezioni. Da questi stu‐
di emerge come la αDBHsap, iniettata i.c.v. a ratti in via di sviluppo (P4 ‐ P7) determini una deplezione dose‐dipendente dei neuroni DBH‐positivi nel complesso LC/SubC cui si associano marcate riduzioni nella densità di innervazione noradrener‐
gica sia a livello del Midollo Spinale, ma anche nel Giro Dentato dell’Ippocampo. Tale denervazione è risultata massima già alla dose di 0.5 g, mentre dosi più elevate de‐
terminavano una deplezioni di entità non dissimile. Nessun effetto si è riscontrato invece su altri gruppi neuronali quali quelli seroto‐
ninergici del Raphe Magno, quelli dopaminergici della Substantia Nigra e quelli adre‐
nergici della zona C1, anche dopo dosi elevate della tossina, in linea con quanto osservato dopo iniezione in animali adulti [Wrenn et al., 1996]. La lesione noradrenergica neonatale operata mediante la αDBHsap si distingue dall’equivalente lesione al sistema colinergico immaturo mediante l’utilizzo della IgG 192­Saporin. Infatti quest’ultima tossina iniettata nei primi giorni di vita dell’animale, pur essendo altamente selettiva ed efficace, determina una deplezione del sistema co‐
linergico non superiore al 70%, come precedentemente riportato [Leanza et al., 1996] e come osservato anche nel presente lavoro (vedi oltre). La deplezione noradrenergi‐
ca osservata dopo lesione neonatale, invece, è pressoché completa. Ciò può essere spiegato con il diverso pattern di sviluppo di questi due sistemi. Il LC si sviluppa infat‐
ti molto più precocemente ed esibisce già nei primi giorni di vita post‐natale livelli adulti di espressione dei marker tipici di questo sistema [Olson e Seiger, 1972; Lauder |97| DISCUSSIONE e Bloom, 1974]. D’altra parte, l’espressione dei marker colinergici del Prosencefalo Basale, in particolare l’immunoreattività per p75NTR [Eckenstein e Sofroniew, 1983] o l’espressione del mRNA corrispondente [Friedman et al., 1991], raggiunge la maturità solo dopo la seconda settimana post‐natale [Coyle e Yamamura, 1976; Milner et al., 1983; Hohmann e Ebner, 1985; Koh e Loy, 1989]. Per tanto si può supporre che, nei primi giorni di vita, vi sia una maggior densità dei siti di ancoraggio per la tossina αDBHsap rispetto a quanti ve ne siano per la 192sap e ciò spiegherebbe i diversi effet‐
ti della lesione ai due sistemi quando effettuati in ambito perinatale. Inoltre, a differenza di quanto osservato dopo lesione immunotossica del Sistema Colinergico Basale immaturo [si veda Leanza et al., 1996; Pappas et al., 1996], la ri‐
mozione completa del sistema noradrenergico si presenta molto stabile nel tempo, gli effetti, infatti, permangono immutati fino a 40 settimane post‐lesione. Una tale stabili‐
tà ha reso la procedura di lesione particolarmente adatta per lo studio degli effetti co‐
gnitivi della deplezione noradrenergica neonatale e anche della possibilità di ottenere una reinnervazione noradrenergica dopo impianto di Progentori Neurali del LC em‐
brionale. D’altra parte l’utilizzo di dosi relativamente più basse di immunotossina (0.25 μg) che provocano deplezioni solo parziali è seguito nel lungo periodo (40 set‐
timane) da un significativo recupero dell’innervazione noradrenergica terminale nel Midollo Spinale e nelle regioni rostrali. Questo recupero dell’innervazione noradre‐
nergica a seguito della lesione neonatale parziale del Sistema Noradrenergico è più rilevante rispetto a quanto osservato in precedenza dopo lesioni incomplete effettua‐
te in animali adulti [Gage et al., 1983; Fritschy e Grzanna, 1992; Leanza et al., 1993] suggerendo che, almeno in parte, esso possa dipendere dalla plasticità che i sistemi monoaminergici di proiezione diffusa presentano nelle prime fasi dello sviluppo. |98| DISCUSSIONE 5.2. Trapianto di Progenitori Neurali in Midollo Spinale Esperimento 2 Come osservato in studi precedenti, trapianti omotipici di LC embrionale in SC so‐
pravvivono bene, si sviluppano, esprimono marker noradrenergici, manifestano atti‐
vità sinaptica, sono in grado di proiettare le loro fibre a parecchi millimetri di distanza per reinnervare il SC denervato ed in alcuni casi appaiono migliorare aspetti propri dell’attività spinale come il controllo dei pattern locomotori [Bjorklund et al., 1986; Yakovleff et al., 1995; Gimenez y Ribotta et al., 1996; Leanza et al., 1999]. Questi impianti sembrano sopravvivere meglio ed emettere un maggior numero di fibre quando nel sito di impianto sia stata precedentemente rimossa parte dell’innervazione afferente [Gage e Bjorklund, 1986; Gage e Fisher, 1991]. Le cellule impiantate si sono inoltre dimostrate in grado di ripristinare l’innervazione noradre‐
nergica in prossimità dell’impianto con una densità che appare paragonabile a quella degli animali intatti. Questa reinnervazione promossa dai trapianti appare essere fun‐
zionale: le cellule noradrenergiche impiantate, infatti, riportano i livelli extracellulari di Noradrenalina a valori normali o oltre la norma sia quando impiantate in SC [Lean‐
za et al., 1999], sia quando impiantate in Ippocampo [Kalen et al., 1991; Cenci et al., 1993].Dati precedenti supportano l’idea che i neuroni impiantati possano essere re‐
golati da input derivanti dall’ospite, probabilmente gli stessi che normalmente agi‐
scono sui neuroni noradrenergici del LC regolandone l’attività [Leanza et al., 1999]. Ciò suggerisce che le cellule impiantate siano in grado di integrarsi funzionalmente nel tessuto ospite, infatti per ottenere un aumento del rilascio di Noradrenalina da parte dei trapianti in seguito alla stimolazione somatosensoriale è necessario si crei‐
no connessioni sinaptiche fra il trapianto ed elementi neuronali dell’ospite [Yakovleff et al., 1995; Gimenez y Ribotta et al., 1996]. Il rilascio regolato di Noradrenalina po‐
trebbe quindi giocare un ruolo importante nel ristabilirsi di alcuni riflessi e pattern motori, fenomeni che si osservano a seguito di trapianti di cellule noradrenergiche embrionali in SC [Buchanan e Nornes, 1986; Yakovleff et al., 1989; Moorman et al., 1990]. Tuttavia in quest’ultimo caso non può essere escluso del tutto che il recupero funzionale possa essere mediato da meccanismi che non prevedano il formarsi di |99| DISCUSSIONE connessioni fra ospite e impianto ma semplicemente l’aumento della concentrazione locale di Noradrenalina suggerendo quindi un meccanismo simile a quello della tra‐
smissione di volume [Ridet et al., 1993; Roudet et al., 1995]. In questo esperimento i Precursori Neurali noradrenergici sono stati osservati sopravvivere, svilupparsi e reinnervare i territori spinali denervati dell’ospite con migliore capacità rispetto a quanto osservato in esperimenti simili che utilizzavano procedure di lesione diverse [Leanza et al., 1999]. L’efficacia, la selettività e la stabilità della lesione immunotossi‐
ca, ancora una volta, ne suggeriscono l’affidabilità anche in studi di trapianti neurali. 5.3. Effetti Comportamentali della Rimozione del Sistema Noradrenergico Esperimento 3 La rimozione del sistema noradrenergico, durante i primi giorni di vita dell’animale o in età adulta, non sembra determinare deficit nelle abilità motorie, sen‐
soriali ed esplorative. Ciò è stato misurato durante gli esperimenti riportati nel pre‐
sente lavoro analizzando la performance in semplici test motori, la velocità di nuoto ed il numero totale di collisioni con gli annuli durante lo Spatial Probe Trial, ed è stato confermato quando agli animali è stato somministrato il Cue Test,ossia una sessione del Morris Water Maze durante la quale la piattaforma rimane visibile al di sopra del pelo dell’acqua. Durante questo test tutti gli animali, già al primo giorno hanno otte‐
nuto performance ottimali raggiungendo la piattaforma in meno di 10 secondi. I defi­
cit osservati sono quindi da attribuire esclusivamente a disturbi di tipo cognitivo. Come è emerso dagli studi effettuati nel presente lavoro la rimozione del sistema noradrenergico, effettuata in ambito perinatale o durante l’età adulta, determina solo pochi o nessun deficit di Memoria Spaziale. Al contrario, la medesima procedura cau‐
sa negli animali evidenti deficit nella Working Memory. Questo tipo di memoria infatti richiede l’uso di abilità cognitive più fini poiché l’animale deve mantenere tempora‐
neamente le informazioni dei trial precedenti e confrontarle con quelle relative ai |100| DISCUSSIONE trail in corso[Baddeley, 1986]. Questa osservazione è in accordo con alcune teorie che ritengono la Noradrenalina implicata nella riorganizzazione delle reti neurali. Secon‐
do tali teorie questo neurotrasmettitore permetterebbe la riorganizzazione delle connessioni fra neuroni al fine di adattare il comportamento a nuove condizioni am‐
bientali [Bouret e Sara, 2005; Sara, 2009]. È noto infatti che inducendo delle modifi‐
che in un ambiente conosciuto si ha un’attivazione del LC [Vankov et al., 1995; Sara, 1998] che agisce probabilmente stimolando i recettori noradrenergici presenti nel DG [Kitchigina et al., 1997]. Un ulteriore meccanismo nel quale la Noradrenalina sembra agire è quello del re‐
cupero della memoria [Sara e Devauges, 1988; Sara e Devauges, 1989], un aspetto molto importante nei processi cognitivi implicati nella Working Memory. È infatti que‐
sto evento che permette l’integrazione fra i circuiti neuronali preesistenti ed i nuovi stimoli ambientali cui l’animale è sottoposto [Tulving e Thompson, 1973]. Meno sem‐
plice da interpretare alla luce dei presenti risultati è il ruolo proposto per la Noradre‐
nalina nei fenomeni di consolidamento della memoria a medio periodo [vedi Sara, 2009], rimuovendo infatti il Sistema Noradrenergico, soprattutto quando ciò viene ef‐
fettuato in età adulta, non si osserva alcun problema nella memoria nel medio termi‐
ne come si può evincere dall’analisi dei dati ottenuti mediante il Morris Water Maze. È da notare tuttavia che se rimuovendo i neuroni noradrenergici del LC in animali adulti non si è osservato alcun deficit nelle abilità di Reference Memory, in sostanziale accordo con studi precedenti che utilizzavano tossine come la 6OHDA [Thomas e Palmiter, 1997] o la DSP‐4 [Decker e McGaugh, 1989]. Un lieve ma significativo ritar‐
do nell’apprendimento si è ottenuto al contrario effettuando una lesione simile in ambito perinatale. Nonostante in questa fase vi sia un picco nell’espressione dei marker noradrenergici, non è tuttavia pensabile ricondurre questa dissociazione ad una maggior efficacia della tossina nel cervello di animali neonati rispetto agli adulti poiché le analisi istologiche mostrano livelli simili di deplezione noradrenergica dopo lesioni neonatali o adulte. Si può dunque ritenere che il Sistema Noradrenergico non abbia un effetto diretto sui processi cognitivi, esso però potrebbe agire durante lo svi‐
luppo permettendo la corretta formazione delle reti neurali che in età adulta verran‐
no impiegate nei processi che regolano in particolare le abilità di Reference Memory. |101| DISCUSSIONE Ciò si accorda con l’idea secondo cui l’innervazione del LC potrebbe essere fondamen‐
tale per lo sviluppo di regioni, quali l’ippocampo, notoriamente implicate nei processi di apprendimento e memoria [Lauder e Bloom, 1974]. Studi futuri che con design spe‐
rimentali ad hoc potranno contribuire a chiarire tale ipotesi. 5.4. Effetti di Lesioni Combinate Colinergica e Noradrenergica Esperimento 4 Effetti Comportamentali Come riportato in precedenza [Leanza et al., 1996; Pappas et al., 1996], la lesione del Sistema Colinergico Basale nei primi giorni di vita non determina alcun deficit ap‐
prezzabile nella Memoria Spaziale degli animali. Tuttavia testando questi animali in task più complessi emergono lievi deficit cognitivi [Pappas et al., 2000b; Ricceri et al., 2002]. In linea con tali osservazioni, gli animali con lesione colinergica perinatale presentano un performance significativamente peggiore rispetto agli animali di con‐
trollo quando testi al Radial Arm Water Maze nel presente esperimento. Gli scarsi ef‐
fetti che si ottengono rimuovendo il Sistema Colinergico Basale in animali neonati, rispetto ai significativi deficit che si osservano effettuando una lesione simile in ani‐
mali adulti, potrebbero essere attribuiti alla plasticità tipica del Sistema Colinergico in via di sviluppo e/o all’intervento compensatorio di altri sistemi trasmettitoriali. In particolare, un ruolo importante sembra essere svolto dall’innervazione noradrener‐
gica dell’ippocampo. Infatti dopo lesione neonatale con 192sap si può osservare un aumento significativo nei livelli cerebrali di Noradrenalina [Leanza et al., 1996] oltre ad una proliferazione (ingrowth) di fibre noradrenergiche dell’Ippocampo [Pappas et al., 1996]. È pertanto verosimile che la Noradrenalina e l’Acetilcolina interagiscano funzionalmente per regolare fenomeni sottesi ai meccanismi di apprendimento e memoria. È stato ipotizzato che proprio questa cooperazione tra sistemi trasmettito‐
|102| DISCUSSIONE riali a proiezione diffusa (tra cui anche il serotoninergico) permetta di compensare la mancanza di uno di essi nel caso di patologie neurodegenerative o durante l’invecchiamento [Scheiderer et al., 2008].A sostegno di tale ipotesi, la rimozione si‐
multanea dei due sistemi in questione causa deficit nella Reference Memory più gravi di quelli ottenuti a seguito di lesioni singole. Ciò è rilevabile in modo significativo dall’analisi dello Spatial Probe Trial, ma si può osservare anche analizzando i dati del Morris Water Maze dove si osserva come gli animali con la singola lesione noradre‐
nergica migliorino progressivamente la loro performance fino a raggiungere i valori del controllo all’ultimo giorno di test. Al contrario, gli animali con la doppia lesione ri‐
chiedono fino all’ultimo giorno di test latenze e distanze significativamente maggiori per ritrovare la piattaforma sommersa e non dimostrano di aver appreso con la stes‐
sa efficacia dei controlli nello Spatial Probe Trail. Questo effetto sinergico delle inner‐
vazioni colinergica e noradrenergica sul controllo dei meccanismi di apprendimento e memoria è confermata da osservazioni, su primati non umani, nei quali solo la rimo‐
zione simultanea dei neuroni colinergici del Prosencefalo di Base e dei neuroni nora‐
drenergici è stata vista determinare deficit nella Working Memory mentre lesione del solo Sistema Colinergico, non determina problemi in questo aspetto della memoria [Dudkin et al., 2005]. Tuttavia, va osservato che gli effetti sulla Working Memory ri‐
portati nella presente serie di esperimenti sono forse da attribuire più alla rimozione dell’innervazione noradrenergica piuttosto che a quella colinergica ed inoltre su que‐
sto particolare aspetto della memoria non è stato rilevato un effetto sinergico della rimozione dei due sistemi neurotrasmettitoriali analizzati, in accordo con quanto precedentemente riportato [Pappas et al., 2000b]. È comunque da sottolineare come in quest’ultimo lavoro, in contrasto con i dati qui riportati, neppure la singola lesione noradrenergica determinava alcun effetto sulle abilità cognitive degli animali. Ciò tut‐
tavia potrebbe essere dovuto sia al tipo di lesione scarsamente selettiva per i neuroni noradrenergici impiegata in quello studio (iniezione sistemica di 6OHDA), oppure al protocollo sperimentale che prevedeva l’utilizzo del Radial Arm Maze, una tecnica che, come prima ricordato, non esclude l’utilizzo da parte dell’animale dell’olfatto come strategia di ricerca. |103| DISCUSSIONE Si può quindi concludere che i Sistemi Noradrenergico e Colinergico possano coo‐
perare nella regolazione di alcuni aspetti cognitivi, in particolare della Reference Me­
mory, e che tale cooperazione possa permettere una compensazione nel caso uno dei due sistemi neurotrasmettitoriali venga rimosso in un periodo, come quello immedia‐
tamente dopo la nascita, in cui essi sono dotati di un alto grado di plasticità. Effetti sulla Neurogenesi Come sopra ricordato, la formazione di nuove cellule nel DG dell’Ippocampo sem‐
bra essere strettamente legata ai processi che regolano l’apprendimento e la memo‐
ria. In particolare gli eventi neurogenetici potrebbero essere coinvolti nei fenomeni di stoccaggio a lungo termine della memoria [Abrous et al., 2005]. Per questo motivo, nel nostro lavoro, ci siamo concentrati sugli effetti della denervazione noradrenergica e/o colinergica dell’Ippocampo sulla sopravvivenza dei nuove cellule, le quali, come ampiamente riportato in letteratura, differenziano nella quasi totalità in neuroni ma‐
turi della zona Granulare in grado di proiettare fibre verso la zona CA3 dell’Ippocampo [vedi van Praag et al., 2002; Ming e Song, 2005]. Tale differenziamen‐
to neuronale non viene alterato dopo rimozione del sistema colinergico [Mohapel et al., 2005] o di quello noradrenergico [Kulkarni et al., 2002]. La lesione del Sistema Noradrenergico determina una diminuzione nella formazio‐
ne di nuovi neuroni a livello del DG dell’Ippocampo [Kulkarni et al., 2002]. Questo ca‐
lo nella proliferazione neuronale tuttavia non si riflette sul numero totale di cellule che sopravvivono a 3 settimane dall’iniezione di BrdU come osservato nel presente lavoro e come già descritto in letteratura [Kulkarni et al., 2002]. Allo stesso modo an‐
che la rimozione del Sistema Colinergico Basale mediante somministrazione di 192sap, quando effettuata in animali adulti, determina un forte calo della prolifera‐
zione neuronale che si riflette anche sul numero di nuovi neuroni che sopravvivono 4 settimane dopo la somministrazione di BrdU [Mohapel et al., 2005]. Nel presente la‐
voro si è osservato come a 3 settimane non vi siano significative differenze nel nume‐
ro totale di cellule BrdU positive tra i gruppi. Questo potrebbe essere dovuto agli stessi motivi per cui in questi animali non presentano deficit nella Reference Memory, ossia alla deplezione solo parziale (70%) che segue la lesione perinatale e/o a feno‐
|104| DISCUSSIONE meni compensatori verosimilmente a carico del Sistema Noradrenergico, che rifletto‐
no l’intrinseca plasticità dei sistemi in via di sviluppo [Leanza et al., 1996]. Un’osservazione molto interessante, tuttavia, riguarda i pattern di presentazione dell’immunoreattività per BrdU. Infatti nei preparati ottenuti nel presente lavoro l’immunoreattività per la BrdU esibiva diversi pattern di localizzazione, potendosi os‐
servare nel nucleo (dove presentava una disposizione nucleare o puntinata) o nel ci‐
toplasma, nel qual caso il nucleo appariva privo di immunoreattività. In particolare si è osservata una significativa differenza nel pattern di localizzazione dell’immunoreattività per BrdU fra gli animali di controllo e gli animali cui fosse stato rimosso il Sistema Colinergico Basale e/o quello Noradrenergico. Nel primo caso la maggior parte delle cellule presentava una colorazione di tipo nucleare uniforme, al contrario negli animali lesionati il numero di cellule con colorazione citoplasmatica era largamente superiore a quello delle cellule con colorazione nucleare uniforme o puntinata. Queste osservazioni sono in linea con quanto recentemente riportato, in vitro, da Sauerzweig e collaboratori [Sauerzweig et al., 2009]. Questi autori infatti hanno descritto una diversa distribuzione dell’immunoreattività alla BrdU (con le va‐
rianti nucleare, puntiforme e citoplasmatica) molto simile a quella osservata nel pre‐
sente lavoro. In particolare le cellule mostrerebbero un pattern nucleare uniforme nei giorni immediatamente successivi alla somministrazione della BrdU mentre la per‐
centuale di cellule con un distribuzione disomogenea (puntiforme) della BrdU nel nu‐
cleo andrebbe ad aumentare nel tempo; un andamento simile si osserverebbe inoltre anche nelle cellule neoformate nel DG di animali sottoposti a ictus sperimentale. An‐
cora più intrigante è il fatto che, a partire da 11 giorni dopo la somministrazione di BrdU, in colture cellulari di neuroni cominciano ad apparire cellule in cui l’immunoreattività alla BrdU è esclusivamente citoplasmatica, questo fenomeno pro‐
gredisce nel tempo tanto che a 25 giorni la quasi tutte le cellule presentano una colo‐
razione citoplasmatica [Sauerzweig et al., 2009]. L’incremento nel numero di cellule con BrdU citoplasmatica negli animali lesionati qui riportato potrebbe far pensare ad una aumentata degradazione del DNA indotta dalla lesione in queste cellule che sarebbero sofferenti e quindi in procinto di avviarsi verso un processo apoptotico. Tale eventualità appare di notevole interesse nono‐
|105| DISCUSSIONE stante dati in vitro riportati nell’unico studio finora pubblicato sull’argomento sem‐
brino smentire una colocalizzazione della colorazione citoplasmatica con marker a‐
poptotici [Sauerzweig et al., 2009]. Alternativamente, ma non necessariamente in contrasto, è possibile che la presenza citoplasmatica di BrdU rifletta il verificarsi di meccanismi di riparazione del DNA innescati dalla perdita di input afferenti. Tale ipo‐
tesi appare in linea con il ruolo protettivo della Noradrenalina e dell’Acetilcolina nei processi neuroinfiammatori [Carnevale et al., 2007; Brenner et al., 2008]. In mancan‐
za di questi neurotrasmettitori si avrebbe pertanto un aumento della risposta neu‐
roinfiammatoria che a sua volta, tramite l’attivazione della microglia, potrebbe portare ad un aumento delle Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS) [Block e Hong, 2005] e quindi a fenomeni di riparazione, a carico del DNA [Zadak et al., 2009]. 5.5. Conclusioni Il presente studio nel suo insieme ha contribuito ad analizzare ulteriormente il ruolo dell’innervazione noradrenergica in diversi processi fisiologici. In particolare la rimozione altamente selettiva ed efficace che si è potuta ottenere mediante l’utilizzo della Anti­Dopamine Beta Hydroxylase­Saporin ha permesso di analizzare gli effetti della denervazione noradrenergica nel Midollo Spinale e nelle regioni corticali e ippo‐
campali. Per quanto riguarda l’ambito spinale sono emerse due considerazioni impor‐
tanti: da un lato le grandi potenzialità di recupero del tessuto neonatale che nel lungo periodo, dopo lesioni incomplete del Locus Cœruleus, permettono di ottenere reinner‐
vazione spinale a livelli di densità quasi normali. Dall’altro, nel caso di lesioni com‐
plete, la possibilità di ristabilire una buona innervazione noradrenergica mediante impianto di Precursori Neurali noradrenergcici, precursori che trovano nel midollo selettivamente denervato condizioni per sopravvivere, maturare ed integrarsi miglio‐
ri di quelle osservate usando altri metodi di lesione. Per quanto riguarda l’innervazione noradrenergica superiore, ed in particolare quella ippocampale, è e‐
merso come essa sembri essere implicata, da un lato nei meccanismi che sottendono |106| DISCUSSIONE le abilità di Working Memory, e dall’altro nello sviluppo dei circuiti neurali che sono alla base della Reference Memory. Infine nel presente lavoro è stata riportata, forse per la prima volta in studi in vivo, la presenza di un’immunoreattività citoplasmatica per la BrdU, fenomeno che sembra legato a fenomeni apoptotici o infiammatori che aumentano verosimilmente a seguito della rimozione dell’innervazione noradrener‐
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