(Microsoft PowerPoint - Controllo Post

Controllo post-trascrizionale
dell’espressione genica
Livelli di controllo dell’espressione genica
Rivisitazione del concetto di gene
Per gli organismi eucariotici più evoluti il
‘dogma’ un gene = una proteina non vale per la maggior parte dei geni
-> possibilità di produrre mRNA alternativi a partire dallo stesso gene
dovuti a regolazione alternativa di:
•inizio della trascrizione
•terminazione della trascrizione
•splicing
Questi meccanismi sono spesso finemente regolati durante lo sviluppo e il
differenziamento dei diversi tessuti.
Percio’ più che di geni è corretto parlare di unità trascrizionali. Per molte
unità trascrizionali si assiste ad una combinazione di questi meccanismi,
con il risultato di una regolazione estremamente complessa.
Esempio di poliadenilazione alternativa
Anticorpi secreti
Anticorpi di membrana
Esempio di poliadenilazione alternativa: anticorpi
secreti o di membrana
Esempio estremo di splicing alternativo
Gene DSCAM di Drosophila
Come può essere controllato lo splicing?
Controllo del trasporto dell’RNA
Controllo della localizzazione dell’RNA
Controllo della
localizzazione dell’RNA e
sintesi locale delle proteine
http://www.lswn.it/biologia/articoli/Il_nobel_interferenza_RNA
Le Scienze web news
Il nobel per l’interferenza dell’RNA
Andrew Fire e Craig Mello, i due vincitori del Premio
Nobel 2006 per la Medicina e la Fisiologia.
I due biologi molecolari vengono premiati per aver scoperto uno dei
meccanismi fondamentali per il controllo dell’informazione genetica.
Regolare l’espressione genica
tramite molecole di RNA
• I batteri usano numerosi sistemi in cui dei frammenti
di RNA anti-senso vengono sintetizzati da un gene
separato e interferiscono
– Con la traduzione
– Con la stabilita’
– Con la terminazione del trascritto
• C.Elegans: small temporal RNAs
• Anche in eucarioti, l’espressione di frammenti di RNA
anti-senso di un gene porta ad inattivazione
dell’mRNA codificante, sia nel nucleo che nel
citoplasma:
NATURAL ANTI-SENSE TRANSCRIPTS (NATs)
NATURAL ANTI-SENSE TRANSCRIPTS
(NATs)
cis-NATs:
trascritti in cis da filamenti di DNA
opposti sullo stesso locus genomico
trans-NATs:
trascritti in trans da loci separati:
microRNA (miRNAs) = stRNAs
La scoperta dell’interferenza dell’RNA (RNA
interference)
• Fenomeni di interferenza con l’espressione genica mediati da RNA il
cui meccanismo era però ignoto sono stati notati fin dalla fine degli
anni ‘80 in diversi organismi, e battezzati con nomi diversi:
– piante: post-transcriptional gene silencing (PTGS)
co-soppressione
resistenza ai virus mediata da RNA
– Funghi: silenziamento (quelling in Neurospora)
• 1990: Co-soppressione: fenomeno per cui l’introduzione di un
transgene silenzia sia il transgene che il gene endogeno (petunie
transgeniche - Jorgensen, 1990, TIBs 8, 340)
• RNAi compresa solo dopo gli esperimenti di Fire e Mello (Fire et al.,
1998, Nature 391, 806) in C. Elegans
Scoperta dell’ RNAi nel nematode
Cenorabditis Elegans
• Nel 1998 Fire e Mello hanno osservato che l’RNA ds (a
doppio filamento) e’ molto piu’ efficace dell’RNA antisenso a singolo filamento nel sopprimere
l’espressione del gene bersaglio. L’osservazione è
nata da quello che nell’intenzione degli autori doveva
essere un controllo negativo!
• hanno quindi testato su diversi geni gli effetti di molecole
purificate senso o anti-senso, singolarmente oppure in
combinazione.
L’osservazione originale di Fire e Mello: l’RNA a
doppio filamento fenocopia un allele inattivato.
Contro il gene unc-22
= al fenotipo di
unc-22 inattivo
Fire et al., 1998, Nature 391, 806
Introduced mex3 dsRNA
eliminates endogenous mex3 RNA
Neg ctrl - no staining
antisense mex3 RNA
Pos ctrl - heavy staining
mex3 dsRNA
Fire et al 1998 Nature
Fire e Mello, scoperte chiave:
• l’ RNA anti-senso a singolo filamento agisce come
inibitore poco efficiente
• l’ RNA senso appaiato al suo RNA anti-senso e’ un
inibitore molto piu’ potente (presumibilmente agendo
come RNA ds cioè a doppio filamento)
• Fenotipi mutanti possono essere indotti efficacemente
solo con sequenze complementari a sequenze esoniche
-- suggerendo che il silenziamento avvenga a livello
post-trascrizionale
L’interferenza dell’RNA (o RNAi)
• processo mediante il quale RNAds silenzia, in modo sequenza-specifico, l’espressione di
geni omologhi attraverso l’appaiamento con l’mRNA bersaglio seguito dalla sua
degradazione: silenziamento post-trascrizionale.
•Meccanismo biochimico conservato (dalle piante, ai funghi, agli animali).
Probabilmente coinvolge piu’ di 10 geni (analisi genetica) e gruppi di proteine correlate
•Funzioni biologiche:
-Resistenza ai virus (piante)
-Silenziamento trasposoni
-Regolazione dell’espressione genica
•La sua funzione anti-virale e’ dimostrata chiaramente in piante (e insetti) dalla presenza
nei virus di geni che codificano soppressori dell’RNAi, importanti per la virulenza, mentre
non è ancora provata nei vertebrati.
•La sua funzione di silenziamento dei trasposoni e’ dimostrata dall’osservazione che
l’inattivazione di geni coinvolti nell’RNAi nei nematodi causa l’attivazione di molti
trasposoni nella linea germinale
Come funziona l’interferenza dell’RNA
Modello degli stadi dell’RNAi
RNAsi ATP-dip.
+ RISC (elicasi ATP-dip.)
Il dsRNA puo’ essere introdotto dall’esterno, interferendo cosi’
artificialmente con l’epressione del gene bersaglio
RNAsi ATP-dip.
+ RISC (elicasi ATP-dip.)
Interferenza dell’RNA:
•RNAi è un processo di silenziamento post-trascrizionale mediato
da RNAds
•Vista la sua conservazione dai funghi all’uomo, è logico pensare
che svolga funzioni biologiche fondamentali
•Funzioni biologiche note:
•Resistenza ai virus (piante, insetti)
•Silenziamento trasposoni
•Regolazione dell’espressione genica: i microRNA
I miRNA sono trascritti da RNAPol II come precursori
piu’ lunghi (pri-miRNA) con struttura a forcina, maturati
nel nucleo a pre-miRNA ed esportati nel citoplasma
Nel citoplasma, i pre-miRNA vengono maturati a miRNA
ad opera di DICER:
I miRNA maturi vengono inglobati in un complesso simile a RISC,
che svolge la doppia elica e viene guidato dal filamento anti-senso
sull’mRNA bersaglio, inibendone la traduzione
Quindi i miRNA regolano la trascrizione avvalendosi delle
stesse vie enzimatiche dell’interferenza dell’RNA.
I micro-RNA:
• La loro espressione e’ altamente regolata durante lo sviluppo
• regolano l’espressione dei geni bersaglio a livello della
traduzione, bloccando l’attacco del ribosoma -> non mediano la
degradazione dell’RNA bersaglio (tranne che nelle piante)
• L’omologia con l’RNA bersaglio e’ a livello della regione
3’UTR, e non e’ completa. Quando l’omologia e’ completa
mediano DEGRADAZIONE DELL’RNA BERSAGLIO
•Rappresentano un ulteriore livello di regolazione
dell’espressione genica!
Unita’ trascrizionali e geni codificanti
1997: predetti 100,000 geni nel genoma di mammiferi
2004: scoperti solo 25,000 geni (14,000 in C. Elegans, 17,000 in
Drosophila)
Cio’ nonostante il 62% del genoma e’ trascritto!
Ci sono 181,000 trascritti indipendenti:
• molti sono generati grazie all’uso di promotori, PA o splicing
alternativi
• circa la meta’ sono RNA non codificanti, molti NATs (70% delle
unita’ trascrizionali mappate si sovrappongono parzialmente con un
trascritto
opposto)
miRNAs:
~1%sul
deifilamento
geni eucariotici,
presenti in tutti i metazoi e
nelle piante
Drosophila: 78
C. Elegans: 116
A. thaliana: 112
homo sapiens: >300
Il nobel per l’interferenza dell’RNA
1) Scoperta di uno dei meccanismi fondamentali per il controllo
dell’informazione genetica, fino ad allora rimasto
completamente inosservato.
2) Questa scoperta apre immense prospettive terapeutiche
fornendo un nuovo approccio estremamente efficiente alla
cura di malattie mediante interferenza con l’espressione di
geni patologici