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Al Consiglio Nazionale delle Ricerche
Direzione Generale
Ufficio Paesi Industrializzati - Organismi Int.li
P.le Aldo Moro, 7
00185 ROMA
Oggetto: Relazione sull’attività svolta, Short-Term Mobility 2008
Titolo: Applicazione dell’RNA interference nello studio della genomica funzionale di specie ortive
Stato dell’arte
La Reverse Genetics (genetica inversa) rappresenta la via preferenziale per lo studio della
funzione biologica di geni e consiste nel produrre un genotipo mutante e nell’esaminarne il
corrispondente fenotipo. La scoperta dell’RNA interference (RNAi), o del silenziamento genico
mediato da RNA a doppio filamento (dsRNA), ha aumentato la potenzialità e l’efficienza della
genetica inversa. Per molto tempo si è attribuita all’RNA la sola funzione di messaggero, come
intermediario nell'espressione genica o come elemento strutturale, catalitico e decodificante nei
processi di sintesi delle proteine. L’RNAi può essere utilizzata per attribuire un significato
funzionale alle sequenze geniche reperite ex novo o disponibili nelle banche dati.
Il fenomeno dell' RNAi è stato osservato in un gran numero di organismi. Esso interviene a
livello post-trascrizionale coinvolgendo la degradazione dell’RNA messaggero, e rappresenta un
meccanismo di difesa cellulare conservato nel corso dell’evoluzione. L’RNAi è innescato da
dsRNA che causano la degradazione sequenza-specifica di un mRNA bersaglio omologo. I
mediatori della degradazione sono dei piccoli duplex di RNA o “small interfering RNA” (siRNA),
prodotti da un lungo RNA a doppio filamento, tramite taglio enzimatico.
La generazione di piante transgeniche per l’analisi genica funzionale è un processo lungo e
laborioso. Un’alternativa all’espressione genica stabile nelle piante è l’espressione transiente in
singole cellule o tessuti. L’espressione transiente di geni (endogeni o esogeni), oggetto del presente
programma, mediata da Agrobacterium tumefaciens con l' “agro-infiltrazione” in tessuti di piante, è
la scelta più agevole ed è uno strumento valido in esperimenti di analisi funzionale. L’approccio
riduce i tempi nell’analisi dei geni d’interesse.
Nel laboratorio del Prof Granell è stata messa a punto per la prima volta in frutti di pomodoro
l’agro-infiltrazione, strumento essenziale per l’analisi di costrutti che possano interferire col
processo di sviluppo della pianta.
Obiettivi
1. L’utilizzo del silenziamento genico indotto da virus (VIGS).
2. L’acquisizione della tecnica di agro-infiltrazione in piante ortive (carciofo, pomodoro) per
l’espressione transiente di geni esogeni e/o endogeni.
3. L'uso di Tobacco Rattle Virus come vettore virale in specie ortive.
Attività svolta
Il soggiorno di studio ha permesso di avviare un rapporto di collaborazione fra i due Istituti, le
cui attività di ricerca sono per molti aspetti orientate verso obiettivi simili. Il laboratorio ospitante
infatti utilizza tecniche avanzate di genomica (sequenziamento), trascrittomica (analisi dei geni
espressi in determinati stati fisiologici) e metabolomica (analisi dei metaboliti prodotti in
determinate condizioni), nello studio di specie vegetali con particolare interesse nel pomodoro,
agrumi e Arabidopsis.
Lo sviluppo di tecniche come il silenziamento genico indotto da virus è stato molto agevolato
dall’utilizzo del tobravirus, Tobacco Rattle Virus (TRV). Questo è un virus bipartito, costituito
dall’RNA1 che codifica la polimerase, necessaria per la replicazione virale, e l’RNA2 che oltre a la
proteina di movimento e la proteina capsidica presenta il gene responsabile della trasmissione a
carico di nematodi vettori. Quest’ultimo gene è stato manipolato con tecniche del DNA
ricombinante che hanno permesso la sostituzione con un sito multiplo di clonaggio, dando luogo al
vettore pTRV2. Nel laboratorio del Prof Granell è stato ulteriormente modificato il pTRV2, con la
tecnologia Gateway, con l’inserimento delle cassette rfa_verB che ha permesso di generare un
vettore di destinazione Gateway. Questo vettore permette d’inserire frammenti da utilizzare nel
silenziamento genico, ovviando i passaggi di taglio e saldatura, propri delle tecniche attuali di
biologia molecolare, che rappresentano delle procedure lunghe e laboriose. Questa tecnica utilizza il
sistema di ricombinazione sito specifica del batteriofago Lambda. Le sequenze d’interesse sono
state dapprima clonate in un vettore “entry” per essere dopo ricombinate con vettori di destinazione,
per l’espressione in diversi organismi sperimentali. Nel caso specifico si sono utilizzate specie
vegetali, allo scopo di individuarne particolari vie metaboliche.
Nel laboratorio del Prof Granell sono stati individuati diversi geni che possono essere coinvolti
nelle vie metaboliche degli aromi del frutto del pomodoro, che vengono saggiati attraverso
l’agroinfiltrazione dei frutti. La tecnica messa a punto, utilizzata durante il soggiorno della relatrice,
ha previsto il clonaggio di 4 frammenti genici nel vettore pTRV2GW, da utilizzare nella
agroinfiltrazione dei frutti di pomodoro. La tecnica prevede l’utilizzo dei frutti dopo tre settimane
dall’antesi. I costrutti inseriti nel pTRV2GW sono stati allevati nel ceppo C58 di Agrobacterium
tumefasciens, e fatti crescere per 2 giorni a 28°C, con agitazione a 180 rpm. La coltura batterica
viene quindi portata ad una densità ottica di 0.05 (600 nm).
In seguito è stata preparata una miscela di pTRV1 + pTRV2GW-GOI (Gene Of Interest) 1:1,
inoculando quindi almeno 10 frutti per costrutto, considerando la stessa quantità di frutti inoculati
con il vettore senza il GOI, per valutare l’effetto del virus.
In conclusione, il soggiorno ha permesso di apprendere la tecnica sviluppata presso il
laboratorio del Prof. Granell, e di adattarla alle particolari esigenze dei progetti di ricerca realizzati
presso l’IGV di Bari.
Mariella Matilde Finetti Sialer
Bari, 1 Luglio 2008