Diapositiva 1 - Istituto Superiore di Sanità
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Effetti delle LDL ossidate sull’uptake del glucosio in cellule adipocitarie mature Beatrice Scazzocchio Centro Nazionale per la Qualità degli Alimenti e per i Rischi Alimentari Istituto Superiore di Sanità INSULINO-RESISTENZA • L’insulino-resistenza viene definita come una ridotta capacità dell’insulina nel regolare l’omeostasi del glucosio in tessuti specifici • E’ comunemente associata a patologie quali obesità, diabete di tipo II, ipertensione e aterosclerosi • L’insulino resistenza può avere una base genetica ma può anche essere influenzata da fattori acquisiti o ambientali. Scarsa attività fisica Eccesso ponderale Fumo di sigaretta INSULINO-RESISTENZA Localizzazione viscerale Dieta iperlipidica dell’adipe Uso di farmaci (es. glucocorticoidi) INSULINO-RESISTENZA La ridotta sensibilità all’insulina può dipendere da vari difetti molecolari. Tali difetti sono possono coinvolgere: eterogenei e • il recettore insulinico • la catena di segnale insulinico trasduzione del GLUT-4 GLUT 4 Il GLUT 4 è la molecola trasportatrice del glucosio principalmente espressa nel tessuto adiposo e nel muscolo. E’ stato ipotizzato che alterazioni quantitative o qualitative del GLUT 4 possano contribuire alla patogenesi dell’insulinoresistenza. Infatti studi sull’espressione dell’mRNA del GLUT4 nel tessuto adiposo hanno dimostrato una riduzione dei livelli di questo trasportatore nei pazienti diabetici tale da giustificare la ridotta responsività del tessuto all’azione dell’ormone. Insulina e uptake del glucosio Insulina Glucosio Recettore Insulinico GLUT4 Membrana Plasmatica PKCζ/λ PI 3-Chinasi IRS Y-P SH2 p85 p110 Y-P SH2 Jiang et al, J Clin Invest, 1999 modificato PI 3-P PDK1 Akt/PKB Vescicola di GLUT4 Membrana plasmatica Flotillina Insulina Caveolina CAP APS Cbl crk TC10 C3G Actina da Watson RT et al, Endocr Rev 2004, modificato ? Poiché il contenuto plasmatico delle oxLDL aumenta in corso di obesità, diabete di tipo II e arteriosclerosi, e avendo le oxLDL un ruolo attivo come modulatrici delle diverse attività cellulari (apoptosi, proliferazione, differenziamento), abbiamo voluto valutare il ruolo delle oxLDL sull’uptake del glucosio indotto dall’insulina negli adipociti maturi. Disegno Sperimentale Le 3T3-L1 sono state utilizzate al 14° giorno di differenziamento. Per l’esperimento di uptake del glucosio le cellule sono state lasciate per 4h senza siero e senza glucosio e trattate contemporaneamente con oxLDL. Al termine delle 4h le cellule vengono trattate con: • insulina 1µM per 30’; • 2 DG marcato per 45’; • 2 lavaggi in PBS freddo; • permeabilizzazione con TRITON X 0.5% in PBS per 15’ • prelevati 200 µl; • Lettura al β-counter in liquido di scintillazione; • Correzione per l’uptake aspecifico in presenza di florizina oxLDL CTR mRNA AP2 140 120 120 100 100 % rispetto CTR % rispetto CTR 140 80 60 40 20 0 CTR INS oxLDL 0.1 mg/ml mRNA leptina 80 60 40 20 0 CTR INS oxLDL 0.1 mg/ml RISULTATI mRNA GLUT-4 2DG uptake 120 300 100 200 * 150 100 % rispetto CTR % rispetto CTR 250 * 60 40 50 20 0 0 CTR INS *p<0.005 vs INS ^p<0.001 vs CTR oxLDL 0.1 mg/ml ^ 80 CTR INS oxLDL 0.1 mg/ml RISULTATI GLUT4 (proteina di membrana) % rispetto CTR 300 * 250 200 * 150 100 ^ 50 ^ 0 CTR *p<0.001 vs CTR ^p<0.001 vs INS INS oxLDL 0.1 mg/ml % rispetto CTR RISULTATI 120 100 80 60 40 20 0 URIDINA CTR oxLDL 0.1 mg/ml Membrana plasmatica IKKβ P IkB IkB p50 p65 IkB p50 proteasoma p65 p50 NUCLEO p65 RISULTATI * p<0.005 vs ins ^ p<0.001 vs oxLDL % rispetto CTR 2DG uptake 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 ^ * ctr ins oxLDL0.1mg/ml in NFkB in NFkB+oxLDL RISULTATI Western-blot NFkB e IkB 600 NFkB IkB 200 180 500 160 % rispetto CTR % rispetto CTR 400 300 200 100 140 120 100 80 60 40 20 0 0 CTR INS oxLDL 0.1 mg/ml CTR INS oxLDL 0.1 mg/ml % rispetto CTR mRNA PPARγ 100 50 0 CTR INS oxLDL 0.1 mg/ml CONCLUSIONI Le oxLDL inducono insulino resistenza in 3T3L1 adipociti: • diminuendo dall’insulina l’uptake del glucosio indotto • diminuendo la trascrizione genica del GLUT 4 • diminuendo la traslocazione del GLUT 4 alla membrana plasmatica CONCLUSIONI % rispetto CTR Western-blot IRS-1 * 8,00 6,00 4,00 ^ 2,00 0,00 CTR * p<0.001 vs CTR ^ p<0.001 vs INS INS oxLDL 0.1 mg/ml CONCLUSIONI Le oxLDL possono quindi modulare il segnale di trasduzione dell’insulina : • intervenendo direttamente in uno dei vari step del signaling insulinico che termina con la traslocazione del GLUT 4 sulla membrana plasmatica (es. IRS1, PKC, Akt, p38 MAPK, PI3K.); • oppure, tramite il fattore di trascrizione NFkB. In questa ipotesi NFkB, riducendo la trascrizione del PPARγ, responsabile della trascrizione dei geni dell’adipogenesi, provoca indirettamente la downregolazione del messaggero del GLUT 4. Collaborazioni Rosaria Varì Massimo D’Archivio Roberta Di Benedetto Carmelina Filesi Claudio Giovannini Roberta Masella Carmela Santangelo Traslocazione del GLUT 4 da Watson RT et al, Endocr Rev 2004 RISULTATI Produzione di ROS intracellulare (unità arbitrarie) ROS 250 200 DHR 123 150 DHE 100 50 0 CTR INS oxLDL 0.1 mg/ml
