Effetti delle LDL ossidate sull’uptake
del glucosio in cellule adipocitarie
mature
Beatrice Scazzocchio
Centro Nazionale per la Qualità degli Alimenti e per i
Rischi Alimentari
Istituto Superiore di Sanità
INSULINO-RESISTENZA
• L’insulino-resistenza
viene
definita
come una ridotta capacità dell’insulina
nel regolare l’omeostasi del glucosio in
tessuti specifici
• E’ comunemente associata a patologie
quali obesità, diabete di tipo II,
ipertensione e aterosclerosi
• L’insulino resistenza può avere una base
genetica
ma
può
anche
essere
influenzata da fattori acquisiti o
ambientali.
Scarsa attività fisica
Eccesso
ponderale
Fumo di sigaretta
INSULINO-RESISTENZA
Localizzazione
viscerale
Dieta iperlipidica
dell’adipe
Uso di farmaci (es.
glucocorticoidi)
INSULINO-RESISTENZA
La ridotta sensibilità all’insulina può
dipendere
da
vari
difetti
molecolari.
Tali difetti sono
possono coinvolgere:
eterogenei
e
• il recettore insulinico
• la catena di
segnale insulinico
trasduzione
del
GLUT-4
GLUT 4
Il GLUT 4 è la molecola trasportatrice del glucosio
principalmente espressa nel tessuto adiposo e nel muscolo.
E’ stato ipotizzato che alterazioni quantitative o qualitative
del GLUT 4 possano contribuire alla patogenesi dell’insulinoresistenza.
Infatti studi sull’espressione dell’mRNA del GLUT4 nel
tessuto adiposo hanno dimostrato una riduzione dei livelli di
questo trasportatore nei pazienti diabetici tale da
giustificare la ridotta responsività del tessuto all’azione
dell’ormone.
Insulina e uptake del glucosio
Insulina
Glucosio
Recettore
Insulinico
GLUT4
Membrana Plasmatica
PKCζ/λ
PI 3-Chinasi
IRS
Y-P SH2
p85 p110
Y-P
SH2
Jiang et al, J Clin Invest, 1999 modificato
PI 3-P
PDK1
Akt/PKB
Vescicola
di GLUT4
Membrana
plasmatica
Flotillina
Insulina
Caveolina
CAP
APS
Cbl
crk
TC10
C3G
Actina
da Watson RT et al, Endocr Rev 2004, modificato
?
Poiché il contenuto plasmatico delle oxLDL
aumenta in corso di obesità, diabete di tipo
II e arteriosclerosi, e avendo le oxLDL un
ruolo attivo come modulatrici delle diverse
attività cellulari (apoptosi, proliferazione,
differenziamento), abbiamo voluto valutare il
ruolo delle oxLDL sull’uptake del glucosio
indotto dall’insulina negli adipociti maturi.
Disegno Sperimentale
Le 3T3-L1 sono state utilizzate al 14° giorno di differenziamento.
Per l’esperimento di uptake del glucosio le cellule sono state
lasciate per 4h senza siero e senza glucosio e trattate
contemporaneamente con oxLDL.
Al termine delle 4h le cellule vengono trattate con:
• insulina 1µM per 30’;
• 2 DG marcato per 45’;
• 2 lavaggi in PBS freddo;
• permeabilizzazione con TRITON X 0.5% in PBS per 15’
• prelevati 200 µl;
• Lettura al β-counter in liquido di scintillazione;
• Correzione per l’uptake aspecifico in presenza di florizina
oxLDL
CTR
mRNA AP2
140
120
120
100
100
% rispetto CTR
% rispetto CTR
140
80
60
40
20
0
CTR
INS
oxLDL 0.1 mg/ml
mRNA leptina
80
60
40
20
0
CTR
INS
oxLDL 0.1 mg/ml
RISULTATI
mRNA GLUT-4
2DG uptake
120
300
100
200
*
150
100
% rispetto CTR
% rispetto CTR
250
*
60
40
50
20
0
0
CTR
INS
*p<0.005 vs INS
^p<0.001 vs CTR
oxLDL 0.1 mg/ml
^
80
CTR
INS
oxLDL 0.1 mg/ml
RISULTATI
GLUT4 (proteina di membrana)
% rispetto CTR
300
*
250
200
*
150
100
^
50
^
0
CTR
*p<0.001 vs CTR
^p<0.001 vs INS
INS
oxLDL 0.1 mg/ml
% rispetto CTR
RISULTATI
120
100
80
60
40
20
0
URIDINA
CTR
oxLDL 0.1 mg/ml
Membrana plasmatica
IKKβ
P
IkB
IkB
p50
p65
IkB
p50
proteasoma
p65
p50
NUCLEO
p65
RISULTATI
* p<0.005 vs ins
^ p<0.001 vs oxLDL
% rispetto CTR
2DG uptake
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
^
*
ctr
ins
oxLDL0.1mg/ml
in NFkB
in NFkB+oxLDL
RISULTATI
Western-blot NFkB e IkB
600
NFkB
IkB
200
180
500
160
% rispetto CTR
% rispetto CTR
400
300
200
100
140
120
100
80
60
40
20
0
0
CTR
INS oxLDL 0.1 mg/ml
CTR
INS
oxLDL 0.1 mg/ml
% rispetto CTR
mRNA PPARγ
100
50
0
CTR
INS
oxLDL 0.1 mg/ml
CONCLUSIONI
Le oxLDL inducono insulino resistenza in 3T3L1
adipociti:
• diminuendo
dall’insulina
l’uptake
del
glucosio
indotto
• diminuendo la trascrizione genica del GLUT 4
• diminuendo la traslocazione del GLUT 4 alla
membrana plasmatica
CONCLUSIONI
% rispetto CTR
Western-blot IRS-1
*
8,00
6,00
4,00
^
2,00
0,00
CTR
* p<0.001 vs CTR
^ p<0.001 vs INS
INS
oxLDL 0.1 mg/ml
CONCLUSIONI
Le oxLDL possono quindi modulare il segnale
di trasduzione dell’insulina :
• intervenendo direttamente in uno dei vari
step del signaling insulinico che termina
con la traslocazione del GLUT 4 sulla
membrana plasmatica (es. IRS1, PKC, Akt,
p38 MAPK, PI3K.);
• oppure, tramite il fattore di trascrizione
NFkB. In questa ipotesi NFkB, riducendo
la trascrizione del PPARγ, responsabile
della trascrizione dei geni dell’adipogenesi,
provoca
indirettamente
la
downregolazione del messaggero del GLUT 4.
Collaborazioni
Rosaria Varì
Massimo D’Archivio
Roberta Di Benedetto
Carmelina Filesi
Claudio Giovannini
Roberta Masella
Carmela Santangelo
Traslocazione del GLUT 4
da Watson RT et al, Endocr Rev 2004
RISULTATI
Produzione di ROS
intracellulare (unità arbitrarie)
ROS
250
200
DHR 123
150
DHE
100
50
0
CTR
INS
oxLDL 0.1
mg/ml
