La tecnologia del DNA ricombinante
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rDNA is NOT Whole Animal
Cloning
Recombinant DNA is a tool in
understanding the structure,
function, and regulation of genes
and their products
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• The objectives of Recombinant DNA
technology include:
– Identifying genes
– Isolating genes
– Modifying genes
– Re-expressing genes in other hosts or
organisms
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• These steps permit scientists and
clinicians to:
– Identify new genes and the proteins they
encode
– To correct endogenous genetic defects
– To manufacture large quantities of specific
gene products such as hormones, vaccines,
and other biological agents of medical interest
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restriction animation.exe
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Sebbene esistano enzimi di restrizione con siti di riconoscimento degenerati (per es. BsiEI
riconosce la sequenza 5'-CGPuPyCG-3' dove Pu e Py rappresentano "qualunque purina" e
"qualunque pirimidina“), la maggior parte degli enzimi di restrizione utilizzati nell'ingegneria
genetica riconoscono sequenze specifiche che tagliano in tre modi diversi:
• Generando estremità piatte (blunt)
Es. SmaI
↓
5'-CCC-3'
5'-CCCGGG-3'
3'-GGG-5'
3'-GGGCCC-5'
↑
• Generando estremità coesive (sticky) sporgenti al 5' (5' protuding)
5'-GGG-3'
3'-CCC-5'
Es. EcoRI
↓
5'-G-3'
5'-GAATTC-3'
3'-CTTAA-5'
3'-CTTAAG-5'
↑
• Generando estremità coesive (sticky) sporgenti al 3' (3' protuding)
Es. PstI
↓
5'-CTGCAG-3'
3'-GACGTC-5'
↑
5'-CTGCA-3'
3'-G-5'
5'-AATTC-3'
3'-G-5'
5'-G-3'
3'-ACGTC-5'
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Estrazione di frammenti di DNA da gel
Dopo aver digerito un DNA con enzimi di restrizione ed averne separato i
frammenti risultanti su gel di agarosio, il passo seguente di solito consiste
nell’excidere dal gel, con un bisturi, specifiche bande corrispondenti a geni o
porzioni di DNA di nostro interesse e purificarle da gel.
Esistono molti sistemi per purificare bande da gel, tra cui:
•
•
•
•
•
•
elettroeluizione
colonne a scambio ionico
gel-filtration
ultrafiltrazioni
agarosio a basso punto di fusione
ecc. ecc.
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VETTORI DI CLONAGGIO
Dai plasmidi batterici naturali sono derivati i vettori di clonaggio, le cui caratteristiche essenziali sono
• Origine
di replicazione
• Marcatore
selezionabile
• Siti
di restrizione unici
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Sottoponendo il vettore e l’inserto a trattamento con terminal transferasi con due
deossiribonucleotidi diversi le due molecole diventano complementari tra loro e
possono essere ligate.
vettore
inserto
Terminal transferasi
+ dGTP
5'-P
HO-3'GGGGGG
vettore
Terminal transferasi
+ dCTP
GGGGGG3'OH
5'-P
5'-P
HO-3'CCCCCCCC
inserto
CCCCCC3'OH
5'-P
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Filling in
Nel corso dei clonaggi può capitare di dover trasformare estremità coesive
sporgenti al 5' o al 3‘ in estremità piatte, sintetizzando le basi mancanti nel
filamento incompleto al 5' (filling in), oppure eliminando quelle sporgenti al
3' (trimming)
Esempio 1: estremità “sticky” 5' protuding (es.EcoRI)
In questo caso la tecnica d’elezione consiste nel cosiddetto “ filling in” che
consiste nel “riempire” una estremità sporgente al 5' con la Klenow
5'P
3'OH
G 3'OH
C AATTC
dTTP
dATP
dGTP
5'P
5'P
3'OH
G TTAAG
C AATTC
3'OH
5'P
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T/A cloning di prodotti di PCR
La maggior parte delle polimerasi termostabili utilizzate nella PCR, possiedono una
debole attività di tipo terminal trasferasico e aggiungono un residuo di adenosina
alla
estremità 3' dei propri prodotti di amplificazione
5'-P
HO-3 A
A-3'OH
5'-P
Sebbene questa caratteristica ostacoli il
clonaggio dei prodotti di amplificazione, è
stata vantaggiosamente sfruttata in una
serie di vettori commerciali, i cosiddetti
vettori T/A, che vengono forniti già
linearizzati e che possiedono un residuo
di timidina alle loro estremità 3'. I residui
3' terminali di T del vettore si appaiano
con le A dei prodotti di amplificazione
rendendo così possibile il clonaggio dei
prodotti di PCR.
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- Inserto fino 500 Kb
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Vettori di clonaggio.
Gran parte degli straordinari progressi ottenuti dalla biotecnologia e dalla biologia molecolare, dipendono
dall'acquisizione della capacità di amplificare e propagare indefinitivamente i geni.
Clonare un gene significa isolarlo da un genoma ed inserirlo in un vettore capace di replicarsi in un certo
ospite (di solito E.coli o lievito).
Esistono diversi tipi di vettori di clonaggio, ciascuno con vantaggi e svantaggi.
La principale considerazione da fare é relativa alle dimensioni dell'inserto di DNA che ogni vettore può
accettare.
PLASMIDI
da 0,1 a 10 Kb
FAGI
da 8 a 22 kb
COSMIDI
da 32 a 45 kb
BAC
da 75 a 300 kb
YAC
da 100 a 2000 kb
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Tavola riassuntiva dei principali metodi di trasferimento genico
Protoplasti
Batteri
Elettroporazione
trasformazione chimica con CaCl2
Elettroporazione
fusione di protoplasti
coniugazione batterica
Piante
elettroporazione
trasferimento mediato da Agrobacterium
cannoncino balistico
fusione di protoplasti
Celule animali
Lieviti
PEG
Elettroporazione
DEAE-destrano
PEG
Elettroporazione
DEAE-destrano
CaPO4
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Libreria genomica e di cDNA
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Progenitor
cells
Endoderm
ES cell
Pancreatic
cell
Hepatocyte
Myoblast
Mesoderm
B cell
Totipotent cell
Ectoderm
Neuron
Epithelial cell
Pluristratified
