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La ricerca di anticorpi irregolari:
significato clinico e metodi a confronto
Silvia Ferrari
Marketing Manager, International - Immucor
Riassunto
Il perchè della ricerca anticorpale: accenni a HTR e HDFN
SIGNIFICATO CLINICO
Perchè la ricerca anticorpale?
HTR
Nei pazienti
“to prevent the transfusion of red cells that
will not survive normally in vivo”
(Issitt & Anstee ‘Applied Blood Group Serology’)
Per prevenire reazioni trasfusionali emolitiche
(HTR)
Incidenza anticorpi eritrocitari irregolari
Riscontrati nello 0.3-38%
• soggetti trasfusi
• donne in gravidanza
• soggetti trapiantati
• soggetti sottoposti a terapia
con sostanze immunogene
Incidenza e specificità
…e nella vostra realtà?
Schonewille et al.
Transfusion 1999;39:763-771
% formazione primo anticorpo
Rispetto alle unità trasfuse
(50% dopo 13 trasf)
Perchè la ricerca anticorpale?
HDFN - MEN
Necessaria per anticipare la diagnosi e la gestione di
un’immunizzazione che potrebbe causare MEN e danneggiare il
feto/neonato.
POSTULATI
 Gli anticorpi materni che attraversano la placenta e passano nel circolo
del feto possono causare distruzione delle emazie fetali ed emolisi
extravascolare.
 Alcuni anticorpi (specialmente l’anti-Kell) influenzano negativamente
l’eritropoiesi nel feto, peggiorando ulteriormente il quadro clinico.
 Anticorpi di classe IgM non attraversano la placenta – non causano
HDFN
Quali anticorpi evidenziare
SIGNIFICATO CLINICO
Anticorpi IgG
•
•
•
•
•
•
•
Monomeri con 2 siti di legame
Presenti in 4 sottoclassi (IgG1, 2, 3 e 4)
Normalmente reagiscono a caldo (37°C)
Vengono rilevati con test di Coombs (TAI)
Raramente attivano il complemento
Attraversano la placenta (carrier specifico)
Sono clinicamente significativi.
Anticorpi IgM
•
•
•
•
•
•
Pentameri (10 siti di legame)
Reagiscono generalmente a freddo (22°C o meno)
Reagiscono in vitro in test ad agglutinazione diretta
Spesso attivano il complemento
Non attraversano la placenta
Solitamente non sono clinicamente significativi.
Significato clinico degli anticorpi:
collegato alla loro specificità
(quasi sempre).
Ma ciascun anticorpo fa storia a sè...
Ig e significato clinico
Significato clinico e
specificità
Source: The Blood Group Antigen Factsbook
Significato clinico degli anticorpi
Include D, C,
c, E, e, Cw....
Include K, k,
Kpa, Kpb, Jsa,
Jsb....
Frequenza di formazione vs. Significato clinico
Group 3
D
Group 1
S
25%
f
Doa
Leb
C, Fya
E
N
20%
AgFreq x (1-AgFreq)
Antibody
potential
Lea, P1
Jkb
Jka
M
Group 2:
High significance but low
incidence
c
Dob
15%
Fyb
s
Cob
10%
K
Lua
Ge2/Ge3,
LW, Oka
5%
Kpa
Cw
Sc2
Group 4
0%
Group 1:
High significance and high
incidence
V
Lub, Yta
LOW
MAM, Lan,
Jra, Ata,
AnWj, Sc1
Hy, Jo, H,
Wra, Gy, Cra
Group 4:
Moderate significance
and low incidence
e
Coa
Vel
HIGH
Clinical significance
Source:
Daniels, et al, “The clinical significance of blood
group antibodies”, Transfusion Medicine, 2002; Reid, et al, The
Blood Group Antigen Facts Book, 2004; Roback, et al, AABB
Technical Manual, 2008.
VS, I
Group 3:
Moderate significance
and high incidence
Group 2
k, U, kx,
Jsa/Jsb,
Dia/Dib,
P/PP1Pk,
Wrb, Kpb,
Quali anticorpi devo evidenziare?
•
•
•
•
•
in fisiologica a TA
in fisiologica a 31°C
in albumina a 37°C
con emazie trattate e non trattate con enzima
in Coombs
Bei tempi......
........per i produttori di
reagenti
Quali anticorpi devo evidenziare?
Sono cambiati i tempi:
Analisi Costo/beneficio (Judd, Issitt)
Per ciascun test si studia il rapporto tra il costo e il tempo
operatore necessario rispetto al vantaggio clinico
L’attenzione si è spostata da “tutti gli anticorpi” a quelli
“Clinicamente Significativi”.
1980s - 1990s: analisi costo/beneficio
Judd WJ, Butch SH. ” Cost-containment in the blood bank: eliminating unnecessary
serological testing.” J Med Technol 1984;1:485-95.
Judd, Garratty: il focus diventa l’anticorpo clinicamente
significativo
IgG che reagiscono in LISS a 37°C
profili utilizzati per la routine = no
trasfusionali
incidenza di reazioni
Significato clinico degli anticorpi
Evoluzione della diagnostica pretrasfusionale
Ci si concentra sui test:
• in fisiologica a TA
• in fisiologica a 31°C
• in albumina a 37°C
• con emazie trattate e non trattate con enzima
• in Coombs
Si cominciano ad utilizzare campioni in EDTA scoagulati al
posto di campioni coagulati
(la “plasmologia” sostituisce la “sierologia”)
Ma, la plasmologia è sicura quanto la sierologia?
Sulla plasmologia …
Un po’ di storia
Le tecnologie in uso negli anni ‘60 e ‘70, non consentivano di
evidenziare alcuni anticorpi, soprattutto Kidd, anche
utilizzando sieri anti-globuline umane purificati
Questo tipo di anticorpi veniva descritto come:
«complemento dipendente»
Avere dei sieri anti-globuline umane ad ampio spettro era
considerato un vantaggio.
La porzione anti-Complemento era un must.
Sulla plasmologia …
Alla fine degli anni ‘80 è arrivata l’automazione
I sistemi automatici richiedono l’uso di campioni in
anticoagulante...
.... ma l’EDTA blocca l’attivazione del complemento
Si iniziarono ad approfondire studi sugli anticorpi «complemento
dipendenti” per capire se questo cambiamento poteva creare
problemi diagnostici…
Alcuni importanti lavori chiarirono definitivamente le idee
“IgG anti-Jka/Jkb antibodies are unlikely to fix complement”
Yates, Howell, Overfield, Voak, Downie & Austin
Transfusion Medicine (1998) 8:2 133-140
Sugli anticorpi freddi
“In patients who are to undergo operations involving induced hypothermia there is no need
to screen the serum at a temperature below 37°C. No convincing account has ever been
published of red cell destruction caused, during hypothermia by a red cell alloantibody
active in vitro only at a temperature below 37°C”
Non è necessario, in pazienti che necessitano operazioni per le
quali sia prevista l’ipotermia, eseguire uno screening su siero a
temperature inferiori ai 37°C.
Non è stato mai pubblicato alcun lavoro sufficientemente
convincente che riporti la distruzione delle emazie causata,
durante il periodo di ipotermia, da alloanticorpi reattivi in vitro
solo a temperature inferiori ai 37°C
Mollison’s “Blood Transfusion in Clinical Medicine”, 11th edition 2005
Sugli anticorpi reattivi solo verso emazie
trattate con enzima
• Alcuni anticorpi sono apparentemente rilevabili solo
utilizzando emazie trattate con enzima
• Alcuni di questi anticorpi sono clinicamente significativi
• Ma gli enzimi vanno comunque utilizzati in coppia con altre
metodologie perchè distruggono alcune strutture sulla
membrana eritrocitaria.
“Lack of clinical significance of ‘enzyme-only’ red cell alloantibodies”
PD Issitt, MR Combs, SJ Bredehoeft, M Helmer, L Joyner, L Lorentzen, C Remley, S Bullock, J Bumgamer et al.
Transfusion 33, 284 (1993)
Per prevenire 1 HTR hanno eseguito:
10,000 screen in enzima
128 pannelli ID
216 autoassorbimenti e hanno richiesto 163 unità
antigene neg
Conclusione:
“The use of protease treated cells for routine pretransfusion tests
creates far more work than the accrued benefits justify”
Meccanismo, in vivo, della reazione trasfusionale
SIGNIFICATO CLINICO
Come gli anticorpi causano la distruzione delle emazie? (in vivo) - 1
1. Reazione trasfusionale Intravascolare (AHTR):
Le IgM che si legano agli antigeni sulle emazie ne causano la lisi all’interno dei
vasi a seguito dell’attivazione della via classica del complemento.
Mollison ‘Blood
Transfusion in Clinical
Medicine’ 11th Ed. 2005
Chapters 10, 11 &12
Come gli anticorpi causano la distruzione delle emazie? (in vivo) - 2
Reazioni trasfusionali Extravasculari (DHTR)
Anticorpi rivolti verso altri antigeni eritrocitari che non appartengano al
sistema ABO, causano emolisi extravascolare (lisi in organi specifici e non nel
circolo ematico)
• Le emazie distrutte nel fegato
Anticorpi legano l’antigene ed
attivano il complemento (solo C3)
Anticorpi legano l’antigene
ma non attivano il
complemento
• Le emazie distrutte nella milza
La lisi è sempre causata dall’intervento dei macrofagi (fagocitosi - rilascio di
bilirubina; distruzione dell’eritrocita sulla superficie del macrofago - rilascio
di emoglobina)
Come gli anticorpi causano la distruzione delle emazie? (in vivo) - 3
I macrofagi hanno recettori per Fc delle IgG 1-3, ma non per le
IgM o per le IgG 4
Anticorpi
clinicamente non
significativi:
IgM (eccetto ABO) e
IgG 4
Anticorpi
clinicamente
significativi:
IgG1-3
Agglutinazione in colonna
TECNOLOGIE DIAGNOSTICHE
Agglutinazione in colonna
Le reazioni in provetta e in colonna:
agglutinazione in fase liquida
CAT/Gel Test
• Gel
(Bio-Rad, Grifols)
• Biovue (Ortho)
Le forze applicate alla reazione Ag-Ab
Gel/CAT: le forze di separazione che agiscono
negativamente sul legame ag-ab sono prodotte
dalla centrifugazione che “preme” le emazie
verso il basso
dalla matrice di gel sephadex o di biglie che
resiste alla discesa delle emazie stesse e ferma
l’agglutinato in superficie
Andiamo più a fondo - 1
Le forze di separazione applicate alla colonna distruggono gli
agglutinati deboli durante la fase di centrifugazione (questo è
stato descritto da diversa fonti bibliografiche).
Andiamo più a fondo - 2
Se il campione non viene
correttamente miscelato
con l’anticoagulante, i
frammenti di fibrina
chiudono gli spazi della
colonna che servono a far
scendere le emazie nelle
reazioni negative.
La reazione appare come
positiva o come campo
misto.
Test in fase solida Capture - il metodo
TECNOLOGIE DIAGNOSTICHE
Tecnologia Capture-R®
Solid Phase Red Cell Adherence
Capture-R® Ready-Screen e Ready-ID®
Dal globulo rosso
Alla membrana essiccata
Legata alla superficie del pozzetto
Gli antigeni essiccati sono stabili per
120 giorni dalla produzione
Le fasi della metodica
1
2
3
• 25µl di plasma del campione
•25µl di controllo negativo e positivo (eccetto
per CR3)
•50µl di Capture LISS (quando il campione
viene dispensato il Liss vira al BLU)
Le strip vengono incubate a
37C per 20 minuti
Rimozione di ogni componente
che non sia legata al
monostrato
Dispensazione di 50µl di Indicator
Red Cells
Centrifugazione ed interpretazione dei
risultati
45 sec @ 325g + 45 sec @ 500g
POSITIVO
NEGATIVO
Grading Chart – confronto tra metodi
Test in fase solida Capture
caratteristiche peculiari
1. Le forze applicate alla
reazione Ag-Ab
Pressure
500g
Shear
Capture: la centrifugazione esercita due
forze:
 “di separazione”
 pressione
massima possibilità di legame tra
antigene e anticorpo e tra le emazie
indicatrici e l’anticorpo stesso.
La combinazione tra pressione e forza di separazione separa molto
efficacemente le reazioni positive dalle negative
2. Specificità Capture R Indicator Cell
Emazie umane O Rh positive
Sensibilizzate con antiglobulina umana IgM
(clone 16H8 mouse IgM antibody antihuman IgG1, IgG2 e IgG3 ma non IgG4).
Capture R Indicator Cells
Emazie concentrate O positive
Vengono incubate con un IgG Anti-D,
e lavate per rimuovere l’eccesso
Le emazie sensibilizzate vengono
incubate con IgM Anti-Human
Globulin (clone 16H8 mouse IgM
antibody anti-human IgG1, IgG2
and IgG3), e poi lavate per rimuovere
l’eccesso.
3. Pannelli – Em. essiccate vs liquide
Emazie essiccate
Emazie liquide
Stabilità
Gli antigeni sulle emazie
rimangono stabili
Le emazie perdono potere
antigenico durante la vita utile
del pannello
Conservazione
Temperatura ambiente
4 °C
Shelf life
12 settimane
4 settimane
• NO dispensazione
• Meno reagenti da gestire (sptt
per l’identificazione)
• Da portare a TA prima dell’uso
• Più reagenti da gestire
• Emazie pronte sul fondo dei
pozzetti
• Gestione di apertura e chiusura
di tutti i flaconcini (rischio di
essiccamento, contaminazione
e scambio).
(S)Vantaggi
operativi
4. Lavaggio vs non lavaggio
• Campioni emolizzati: possono essere utilizzati senza problemi
sul risultato finale
• La fibrina viene rimossa: non è più causa di reazioni
falsamente positive
Gel card: la fibrina nel campione può formare una “rete” nella colonna, che blocca le
emazie e non consente la migrazione verso il fondo.
La reazione ha l’apparenza di un positivo o di un campo misto
Capture-R® Select: principio
Capture-R® Select: pozzetti rivestiti da un agente immunologico che immobilizza
le emazie del campione.
Capture-R®: Diagnostics for Red Cells
Capture-R® Ready-Screen®
Capture-R® Select
Capture-R® Ready-ID®
Capture-R® Ready EXTEND I e II
Monostrato di emazie pronte all’uso
Monostrato con emazie del
campione
•
Antibody Screening
(Pooled, 2, 3 and 4 cells)
•
•
•
Crossmatch IgG
DAT IgG
Extended Phenotype
•
Antibody Identification
(3 different ID-Panels)
•
Weak D
Test in fase solida Capture – Bibliografia
TECNOLOGIE DIAGNOSTICHE
2229 campioni per Ab-screening con Capture vs BioVue
“A comparison of two automated methods for the detection and identification of red blood cell
alloantibodies”
G.Garozzo, V. Licitra, R. Criscione, N. Comitini, C. Noto, R. Lomagno, D. Ruta, G. Spadola, V. Zago, P. Bonomo.
Blood Transfusion 2007; 5: 33-40
1
2
3
1479 pazienti candidati a
trasfusione + altri
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
78 campioni positivi
per entrambi i sistemi
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
5
6
7
8
9
10
11
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
11 Biovue Pos,
Capture Neg
1 x Anti-c
1 x Anti-V
1 x Anti-M
1 x Anti-Lea
1 x Anti-D+C
1 x Anti-E + K
+ 5 Non Identif
29
18 Capture Pos,
Biovue Neg
5 x Anti-D
2 x Anti-E
2 x Anti-K
2 x Anti-Kpa + others
1 x Anti-D+V
1 x Anti-c + Jkb
+ 5 Non identif
30
31
32
33
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
820 donatori + dializz.
4
12
50
89/107=
96/107=
83%
90%
107 campioni positivi rilevati impiegando
entrambi i sistemi (4,7% su tot)
62
63
64
65
66
Group 3
25%
f
Doa
20%
Leb
S
C, Fya
E
N
Lea, P1
D
Group 1
Jkb
Jka
M
Group 2:
High significance but low
incidence
c
Dob
15%
Antibody
potential
Group 1:
High significance and high
incidence
Fyb
AgFreq x (1-AgFreq)
s
10%
Cob
K
Lua
5%
Ge2/Ge3,
LW, Oka
Group 4
0%
Kpa
Cw
Sc2
V
Lub, Yta
LOW
Source:
Daniels, et al, “The clinical significance of blood
group antibodies”, Transfusion Medicine, 2002; Reid, et al, The
Blood Group Antigen Facts Book, 2004; Roback, et al, AABB
Technical Manual, 2008.
VS, I
MAM, Lan,
Jra, Ata,
AnWj, Sc1
Hy, Jo, H,
Wra, Gy, Cra
Group 4:
Moderate significance
and low incidence
e
Coa
Vel
HIGH
Clinical significance
Group 3:
Moderate significance
and high incidence
Group 2
k, U, kx,
Jsa/Jsb,
Dia/Dib,
P/PP1Pk,
Wrb, Kpb,
829 campioni per Ab-screening con Capture vs BioVue
1
2
829 pazienti ematologici
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
3
14
15
16
17
18
19
30 campioni positivi
per entrambi i sistemi
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
5
6
7
8
9
10
11
12
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
5 Biovue Pos,
Capture Neg
1 x Anti-D
1 x Anti-S
1 x Anti-M
1 x Anti-Lea
1 x Anti-Lua
27
28
29
20 Capture Pos,
Biovue Neg
1 x Anti-D
2 x Anti-C
2 x Anti-c
4 x Anti-E
1 x Anti-S
1 x Anti-Jkb
+ 9 MEA IgG
30
31
32
33
35/55
=64%
50/55
=91%
55 campioni positivi rilevati impiegando
entrambi i sistemi (6,8% su tot)
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
774 negativi concordanti
4
13
49
63
64
65
66
Group 3
D
Group 1
S
25%
f
Doa
Leb
C, Fya
E
N
20%
Lea, P1
Jkb
Jka
M
Antibody
potential
Group 2:
High significance but low
incidence
c
Dob
15%
Fyb
AgFreq x (1-AgFreq)
s
Cob
10%
K
Lua
Ge2/Ge3,
LW, Oka
5%
Kpa
Cw
Sc2
Group 4
0%
Group 1:
High significance and high
incidence
V
Lub, Yta
LOW
Source:
Daniels, et al, “The clinical significance of blood
group antibodies”, Transfusion Medicine, 2002; Reid, et al, The
Blood Group Antigen Facts Book, 2004; Roback, et al, AABB
Technical Manual, 2008.
VS, I
MAM, Lan,
Jra, Ata,
AnWj, Sc1
Hy, Jo, H,
Wra, Gy, Cra
Group 4:
Moderate significance
and low incidence
e
Coa
Vel
HIGH
Clinical significance
Group 3:
Moderate significance
and high incidence
Group 2
k, U, kx,
Jsa/Jsb,
Dia/Dib,
P/PP1Pk,
Wrb, Kpb,
Studio Comparativo Multicentrico
Capture vs Microcolonna - RAI e Identificazione
1.672 campioni
1.615 negativi
57 positivi (3.4%)
12
7
31
Immucor POS/
Immucor NEG/
Bio-Rad POS
positivi concordanti
(anche come
identificazione)
Bio-Rad NEG
3 anti-Jka
26
discordanti
3 anti-M
2 anti-D
1 anti-E
1 campione con
autoimmunità
nota
5 non ID
4 non ID
POS IMMUCOR
POS BIO-RAD
ANTI-D
ANTI-D
NON ID
ANTI-D+ANTI-E
ANTI-D+ANTI-Lea
NON ID
ANTI-E
NON ID
NON ID
ANTI-M
ANTI-D
ANTI-D
ANTI-Cw
NON ID
GLI ANTICORPI INSIDIOSI, UN ACCENNO
Anticorpi, significato diagnostico ed evanescenza
The persistence and evanescence of blood group alloantibodies in men.
CA Tormey, G Stack
Transfusion. 2009 Mar; 49(3):505-12. PMID: 19040411
Haemolytic Transfusion Reactions – UK data
SHOT Data on
Haemolytic
Transfusion
Reactions (2011)
Ricadute
cliniche
dell’immuniz
zazione
• E’ necessario utilizzare tecnologie più sensibili per intercettare tutti gli anticorpi che
potrebbero causare reazioni trasfusionali emolitiche
• ….
• E’ necessario conoscere i dati clinici del paziente perché l’attività trasfusionale sia il più
appropriata possibile.
Risposte
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
a
b
d
a
d
b
c
b
c
b
a
a
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
d
a
c,d,g,i,j,l,n
b
b
a
a
d
c
c
b
c
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
c
b
b
a
c
c
b