TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Modena 18-19 novembre 2010
Varianti genomiche di significato incerto:
criteri per la caratterizzazione e
l’identificazione delle classi di rischio
V. Calò, A. Russo
Analisi genetica per la sindrome HBOC
Paziente con una forte storia familiare
Storia familiare
Valutazione del rischio e counseling
Counseling
Oncogenetico
Test genetico
Esito test
•
•
•
•
IC
valutazione psicosociale e supporto
Rischi del counseling
Educazione
Discussione del test genetico
IC
POSITIVO
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
DIAGNOSTICO
INDETERMINATO
INCONCLUSIVO
Rischio cumulativo di CaM e CaOv a 80 aa
CaM
Medio
Moderato
(Familiare)
(Sporadico)
Alto
(Ereditario)
85%
75
Range di
Rischio
56%
50
40%
BRCA1
&
CaOv
25
1,6%
15%
CaOv
50%
BRCA1
BRCA2
20%
10%
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
BRCA2
ANALISI MUTAZIONALE
Campione di sangue periferico
Estrazione del DNA
Amplificazione genica di tutti gli esoni
codificanti e delle zone di confine
esone- introne
dHPLC
Sequenziamento
automatico
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
ANALISI MUTAZIONALE
dHPLC
Campione di sangue periferico
Estrazione del DNA
Amplificazione
genica di tutti gli esoni
WT
codificanti e delle zone di confine
esone- introne
mutation
polymorphism
dHPLC
Sequenziamento
automatico
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
DS
CAA TAA
Gln Lys
Esito del test Genetico : risultato
INCONCLUSIVO
risultato
INCONCLUSIVO
Variante di significato sconosciuto “incerto”
(VUS)
Famiglia
277Si
BC 45
BC 53
BC 50
BC 40
BC 39
BRCA2-R2034C
Affected
Death
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Male
Female
Esito del test genetico: risultato
INCONCLUSIVO
TEST DIAGNOSTICO
probando con forte
storia familiare
INCONCLUSIVO
(criteri HBOC)
VUS identificata
Significato clinico
• Predisposizione genetica al CaM/CaO non confermata
• Rischio stimato sulla base della storia personale e familiare
• tutti i membri delle famiglie a rischio potrebbero essere
inseriti nei programmi di sorveglianza
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Esito del test genetico:
risultato INCONCLUSIVO
Risultato “Criptico”
• 20-30% dei tests BRCA riportano una VUS;
• Di solito mutazioni missenso ma anche delezioni/inserzioni in-frame e
mutazioni silenti con possibile effetto sullo splicing;
• Non è prevedibile l’effetto sulla funzione della proteina;
• VUS nuove o rare da interpretare;
• Nella regione codificante del gene o nella regione intronica oppure nelle
regioni 5’UTR o 3’UTR;
•Non sono state identificate VUS in entrambi i geni.
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Tipo e frequenza delle mutazioni nei geni BRCA
Significato funzionale
Rearrangements
3-5%
Small Insertions/
Deletions 1%
Deleterius
70/80%
Missense
25-30%
Synonim
3%
Frameshift
VUS
20-30%
IVS
15%
Missense
Deletions/Insertion
in frame
Nonsense
Splice (7%)
Missense (5%)
Rearrangement
IVS
Frameshift
30-40%
Nonsense
15-20%
Neutral 5%
Synonimus
Walsh et al.
JAMA, March 22/29, 2006—Vol 295, No. 12
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Database BIC (Breast Cancer Information Core), 2007
Interpretazione clinica delle VUS
Una VUS può complicare più che migliorare il processo
di valutazione del rischio.
Numero e tipi di parametri utili a studiarle.
Classificazione dei livelli di rischio dei portatori di
VUS.
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Linee guida per lo studio delle VUS
Forniscono un set di standards stabiliti per assistere i
ricercatori nella determinazione del significato clinico
delle VUS nei test genetici
http://cmgsweb.shared.hosting.zen.co.uk/BPGs/pdfs%20current%20bpgs/UV%20GUIDELINES%20ratified.pdf
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Linee guida per lo studio delle VUS
I database locus specifici (LSDB) sono collezioni accurate delle varianti di sequenza in un gene
specifico che causa un disordine mendeliano o un cambio fenotipico. (Cotton , 2008)
Lo IARC (Unclassified Genetic Variants Working Group) ha individuato nel BIC database
(http://research.nhgri.nih.gov/bic) il catalogo più adeguato per l’interpretazione delle
VUS dei geni BRCA.
Dati genetici, epidemiologici, patologici, in vitro e computazionali contribuiscono
all’interpretazione delle VUS.
(Couch et al., 2008, Goldgard et al., 2008, Hosfra et al., Spurdle et al., 2008, Tavtigian et al., 2008).
Un nuovo progetto di supporto è lo Human Variome Project (HVP).
Obiettivi : 1) standard per costruire i LSDB database,
2) validazione, quantizzazione e interpretazione dei dati,
3) trasparenza dei dati riportati
Greenblatt MS, Hum Mut, 2008
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Sistema di classificazione proposto per le VUS
Classe
Descrizione
1
Non patogenica (nessun significato clinico)
p< 0.001
2
Bassa patogenicicità (Basso significato clinico)
0.001< p > 0.049
3
Significato clinico incerto
0.05 < p > 0.949
4
Potenzialmente patogenica
0.95 < p > 0.99
5
Alta Patogenicità
p>0.99
Strategie di
Sorveglianza
Sorveglianza come da
risultato negativo
Sorveglianza come da
risultato negativo
Strategia scelta in
base alla storia
familiare ed altri
fattori di rischio
Sorveglianza per
pazienti ad alto rischio
Sorveglianza per
pazienti ad alto rischio
Plon SE , Hum Mut, 2008
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Standard di qualità
Lo staff di lavoro dovrebbe avere i requisiti minimi di
standard a livello internazionale (ISO 17025 e 15189).
Validazione dell’esecuzione del test di diagnostica
molecolare.
Approccio oggettivo alla nomenclatura di tutte le
varianti.
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Nomenclatura della mutazione
Prima tappa per una corretta interpretazione della
variante è la sequenza di riferimento da GeneBank
secondo le linee guida della Human Genome Variation
Society (HGVS). http://www.hgvs.org/mutnomen/
Nomenclatura
stabile, significativa e inequivocabile.
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Linee di evidenza
•
Letteratura, database di mutazione e di SNPs
•
Localizzazione della mutazione all’interno del gene
•
Analisi della variante in un gruppo controllo
•
Co-presenza di una mutazione deleteria
•
Co-segregazione della variante e della malattia all’interno della famiglia
•
Presenza varianti de-novo
•
Predizione in silico- missenso e effetti di splicing
•
Perdita di eterozigosità e dati patologici
•
RNA/splicing studies
•
Analisi biochimico/funzionale
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Letteratura, database di mutazione e di SNP
Database dedicati: HGMD, OMIM, dbSNP/Ensembl, ma
soprattutto BIC database e per la letteratura PubMED, Google
Scholar oppure Web of Science.
HGMD studia malattie ereditarie. Ogni variante si presenta una sola volta.
OMIM include le varianti di sequenza identificate nel gene di interesse riportando l’autore che
la identificata per la prima volta, la frequenza nelle popolazioni, il significato storico, ecc..
dbSNP/Ensemb è un catalogo generale della variazione del genoma in alcune specie e parte del
genoma. Le varianti includono SNP, inserzioni e delezioni, regioni che non variano.
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Localizzazione della mutazione all’interno del gene
C
III
Solo il 5% delle missenso nel dominio
"ring finger" del gene BRCA1 sono
patogene.
I
C
C
C
C
zn
II
C
H
zn
C
C
N
C
N
Ring domain P
BRCA1
3
9
10
P P
BRCT domains
12 5 6 7 8
12
11
14
13
19
BRCA2
1 2 3 45 6 7 89
10
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11
15
19 20 21
18
22
17
23
16
24
20 21 22 23 25 26
1415161718
24
27
Analisi della variante in un gruppo controllo
Consente di escludere la patogenicità: se la variante ha una
frequenza allelica superiore al 1% può essere considerata
una variante polimorfica con significato clinico neutro.
- Omogeneità etnica e numerica della stratificazione del gruppo
Tang TS., 1999
controllo.
Judkins et al.,Mut Res., 2 005
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Co-presenza in trans con una mutazione deleteria
Le VUS identificate in trans con mutazioni
patologiche riducono in parte il rischio di
malattia.(Hohenstein, 2001)
Tali dati sono relativamente disponibili.
41 VUS del gene BRCA1 furono escluse perché in
trans con mutazioni patogene e vennero considerati
SNPs di significato clinico neutro.
(Judkins et al.,C anRes, 2005)
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Tavtigian S.V. et al, Fam Cancer 2006
Co-segregazione della variante all’interno della famiglia
•
•
•
•
•
•
Provenienza etnica
Tempo lungo per l’analisi
Eredità poligenica
Penetranza/ espressivià/ fenocopie
Perdita di informazione clinica
Misura piccola della famiglia
Easton D.F. et al Am. J.Hum. Genet 2007
Goldgar D.E. et al Am. J.Hum. Genet 2004
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Conservazione degli aa tra le specie:
varianti missenso
Programmi disponibili di analisi in silico;
Clustal, SIFT, Polyphen, Align GVGD
etc..
Tavtigian S.V. et al, Hum. Mutat. 2008
Fleming, M.A et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003
Ramirez, C.J et al, Oncogene 2004
Abkevich, V. et al, J. Med. Genet. 2004
Spearman, A.D. et al, J. Clin. Oncol. 2008
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Effetti di predizione in silico dello splicing
Programmi disponibili dell’analisi in silico: Splicing sequences finder; EMBL
alternative splicing site; Fruitfly etc
www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html
www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2
www.genet.sickkids.on.ca/~ali/splicesitefinder.html
www.tigr.org/tdb/GeneSplicer/gene_spl.html
www.umd.be/SSF
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Considerazioni sulle IVS
•
Tessuto valido e appropiato per lo studio dell’RNA.
•
L’espressione biallelica confermata dagli studi in vitro di RNA ne esclude la patogenicità.
•
Pochi programmi consentono in base al sito intronico di analizzare la sequenza consensus.
5’
AGGURAGU
EX1
CTRAYY
3’
YYYYYYYYYYYYNCAG
INTRONE
EX2
EX1
Porzione di un mRNA
EX2
SITO DI SPLICING 5’
Sito donatore
SITO DI SPLICING 3’
Sito accettore GU
Punto di ramificazione
GU
A
Bonatti et al., 2006,
Spurdle S. et al., 2008
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Perdita di eterozigosità (LOH)
I tumori BRCA-pos. presentano LOH più frequentemente delle
forme sporadiche.
(Chenevix-Trench, G. et al .,Can Res. 2006; Osorio A. et al., Int.J. Cancer 2002; Osorio A. et al Hum Mut.,2007)
LOH può sostenere la patogenicità della VUS identificata.
Svantaggio: disponibilità del tessuto e incosistenza dell’assenza di
LOH.
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Dati patologici:
tumori BRCA1- e BRCA2-correlati
CaM associato a BRCA1 è spesso ER, PgR e HER2 neg., più
spesso basal like, con conte mitotiche alte e alto grado istologico.
(Hofstra R.M. et al Hum. Mutat. 2008;; Foulkes W.D. et al J.N.C.I 2003; Turner N. et al Nat. Rev. Cancer
2004)
CaM associati a BRCA2 sono di alto grado, hanno fenotipi
luminali e raramente overesprimono HER2.
(Spearman A.D. et al J.C.O. 2008; Bane A.L. et al ,Am J. Surg. Pathol. 2007)
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Valutazione dei metodi funzionali
I metodi biochimico-funzionali valutano l’impatto dei cambiamenti
amminoacidici nelle proteine BRCA1 e BRCA2.
E’ stato necessario sviluppare metodi multipli in funzione di
specifiche funzioni delle proteine in specifici domini.
Svantaggio:
- E’ raro che il laboratorio di diagnostica si occupi di analisi in vitro.
- Sensibilità e specifità dei metodi variano nei studi in vitro.
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Metodo funzionale per BRCA1/BRCA2
BRCA1
• Metodo dell’attività trascrizionale
• Attività di ubiquitina ligasi BARD1 correlata
BRCA2
• Metodo di riparo per ricombinazione omologa
• Amplificazione del centrosoma
Carvalho MA et al., 2007; Couch FJ et al.,2008;
Farrugia S et al., 2008)
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Valutazione degli effetti funzionali delle VUS
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Couch F.J. Et al., Human Mutation, 2008
Modelli integrati: Allineamento GVGD
Sito di allineamento Align-GVGD
Variazione di Grantham (GV)
GV=0: posizione è invariante
GV> ~60: sostituzione non conservativa è tollerata
Deviazione di Grantham (GD)
GD=0: sostituzione è all’interno del range osservato di variazione
GD> ~60: sostituzione è non-conservativa all’interno del range di
variazione
Website http://agvd.iarc.fr
Grantham, R. et al, Science 1974
Tavtigian, S.V. et al, Fam. Cancer 2006
Tavtigian, S.V. et al, Hum. Mutat. 2008
Easton, D.F. et al, Am. J. Hum. Genet. 2007
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Modelli integrati: Allineamento GVGD
o Metodo alternativo e multifattoriale esteso per la classificazione delle VUS
(GVGD+AR+ERS)
o migliore stima del rischio genetico
AR= ascertainment ratio
Misura del rischio genetico strettamente correlata ad un’ ODDS
RATIO ma applicata a varianti rare
ERS= enrichment ratio
Correlata a misure della variazione dei codoni, legata a
pressione evolutiva selettiva
Tavtigian, S.V. et al, Fam. Cancer 2006
Tavtigian, S.V. et al, Hum. Mutat. 2008
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Tavtigian et al., 2008
Modelli integrati
basati sulla combinazione di variabili differenti
Osservazioni epidemiologiche dirette: analisi di cosegregazione,
analisi di casi-controllo, storia personale e familiare, copresenza di
malattia e mutazione.
Misure indirette: conservazione dell’aa, severità del cambio aa,
evidenze dei metodi funzionali.
Goldgard D.E. et al, Am.J.Hum.Genet. 2004
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Modello integrato: VUS Predict
• Allineamento GVGD
• VUS Predict (storia personale, dati patologici, genotipo)
VUS
L22S
T37K
K45Q
Altamente conservata
Patogenica
Non conservata
Neutra
Cambi aa patogeni
C39R, C61G, C44S e C44Y
A-GVGD conferma che la sostituzione missenso è patogena
VUS Predict assegna una percentuale in favore dell’effetto
deleterio
Sweet K., Senter L. et al , Breast Cancer Res Treat 2010
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Il problema delle mutazioni VUS
Non sempre è possibile effettuare tutti gli step per ogni variante.
Tutte le analisi riassumono i risultati e decidono la probabile
patogenicità.
OBIETTIVO: offrire a tutti i pazienti la stessa
qualità di cura!
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
BRCA1 5177 T>A; H1686Q
• Sostituzione non riportata nel BIC;
• Allineamento con 9 sequenze ortologhe;
• LOH (probando, zie affette da CaM e CaO); non riscontrata nel
campione controllo ;
• Tutte queste osservazioni supportano la possibilità che la
variante H1686Q è …... patogena.
Giannini G. et al JCO 2008
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Y179C, F486L, N550H
c
c
VARIANTE
NON
CLASSIFICATA
Aminoacido
WT
Variazione
Aminoacidica
Y179C
F486L
c
N550H
C. Augello, Ann Oncol. 2006, Judkins ea lMutation
Research, 2005, Judkins et al. Cancer Res,2005
Caligo M.A. Hum. Mut, 2008
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
VARIANTI DI SIGNIFICATO CLINICO INCERTO
Variante di
sequenza
Esone
NT
Codone
Sostituzione
di base
Sostituzione
aminoacidica
Tipo di
Mutazione
N°
Pts
N° volte
in BIC
Y179C
8
655
179
A to G
Tyr/Cys
M
1
54
A622V
10
2093
622
C to T
Ala/Val
M
1
1
A521T
11
1680
521
G to A
Ala/Thr
M
2
2
V740L
11
2337
740
G to C
Val/Leu
M
1
1
Variante di
sequenza
Eson
e
NT
Codone
Sostituzione
di base
Sostituzione
aminoacidica
Tipo di
Mutazione
N°
Pts
N° volte
in BIC
A22T
2
292
22
G to A
Ala/Thr
M
1
0
IVS2-7T>A
3
296-7
-
T To A
-
IVS
1
2
Y42C
3
353
42
A to G
Tyr/Cys
M
1
141
T200I
7
827
200
C to T
Thr/Ile
M
1
0
A2466V
14
7625
2466
C to T
Ala/Val
M
1
48
T3013I
23
9266
3013
C to T
Thr/Ile
M
1
53
IVS24-16T>C
25
9485
-
T to C
-
IVS
2
6
IVS25-12T>G
26
9484
-
T to C
-
IVS
1
1
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
BRCA1
BRCA2
Rappresentazione dell’approccio multi-determinante
per la classificazione clinica delle BRCA-VUS
Calò V., et al ., Cancers 2010
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
Rappresentazione schematica di un possibile metodo di
analisi multi-parametrica suggerito
Calò V., et al . Cancers 2010
TUMORI EREDITARI: dalla biologia molecolare al trattamento
