Obiettivo 1.

Obiettivo 1. Bar coding di specie e coltivazioni vegetali
Descrizione. Applicheremo a materiale vegetale di diversa origine una versione rinnovata del
metodo TBP (da Tubulin-Based Polymorphism), capace di tipizzare specie e varietà vegetali
utilizzando come sorgenti di polimorfismo genetico entrambi gli introni presenti delle beta-tubuline
vegetali (Breviario et al. 2007). Il metodo cTBP (da combinatorial TBP) è già stato applicato con
successo diagnostico a livello di varietà a non meno di 12 specie vegetali diverse (gimnosperme ed
angiosperme). Si tratta di una versione efficace di ILP (Intron Length Polymorphism) che in quanto
tale ha svariati pregi tra cui quello di essere un marker funzionale, perché riflette variazioni
geniche, di essere altamente trasferibile tra specie vegetali diverse, di non richiedere alcuna
informazione preliminare sulle sequenze genomiche di innesco della reazione, di essere rapido
facile riproducibile e, non da ultimo, di rilasciare dati di tipizzazione genetica di semplice lettura.
Queste caratteristiche lo rendono da una parte trasferibile ad Enti ed Aziende impegnate a
certificare la qualità e l’origine dei prodotti alimentari, da un’altra un punto ideale di partenza per
studi evolutivi sulle specie eucariotiche. Per questo, il TBP può essere considerato un serio
candidato alla individuazione di un DNA bar code per specie vegetali la cui definizione rimane al
momento problematica al contrario di quanto accade negli organismi animali dove è il gene CO1
di origine mitocondriale a fungere da DNA bar code. Il cTBP sarà applicato a quelle specie vegetali
per le quali si è raccolto a tutt’oggi interesse (vedi sotto) ma sarà disponibile a qualunque richiesta
di tipizzazione dovesse pervenire nel corso di attuazione del progetto. Il cTBP sarà così applicato
alla tipizzazione genetica di diverse specie ed ibridi di rosa, in collaborazione con florovivaisti liguri
e lombardi; alla tipizzazione di varietà di fagiolo, in collaborazione con il CRA di Montanaso
lombardo e alla tipizzazione di areali di pascolo lombardi, in collaborazione con ARAL, costituiti da
composizioni diverse e diverso apporto nutritivo di una trentina di diverse specie vegetali. Il
metodo originale TBP è protetto dal brevetto PCT/IT99/00415, WO0039334, di proprietà del CNR.
L’applicazione in ambito florovivaistico ha già trovato credito nell’assegnazione di una borsa
Ingenio da parte di Finlombarda spa della durata di 8 mesi senza copertura delle spese di
laboratorio e dal titolo Kit diagnostici di varietà vegetali.
Il TBP verrà inoltre applicato all’analisi dei mangimi così come proposto in un progetto presentato
alla Regione nell’ambito del piano di ricerca triennale 2007-2009. Come colà descritto, il TBP si
presta in modo particolarmente efficace ad individuare le diverse componenti vegetali presenti nei
mangimi perché la reazione diagnostica è innescata da primers “universali” per le specie vegetali,
tali da funzionare anche sul DNA di specie e varietà di cui non si ha alcuna informazione
preliminare. Ciò è dovuto alla struttura conservata dei geni delle beta-tubuline di pianta, dove gli
introni sono sempre e comunque collocati allo stesso punto della sequenza codificante, e alla alta
conservazione delle sequenze bersaglio perché coincidenti con la sequenza che codifica per domini
aminoacidici di assoluta necessità per il funzionamento della tubulina, il prodotto di sintesi del gene
che è coinvolto nella divisione cellulare. Solo un sistema come il TBP, o analoghi, è “interspecifico”
nel senso che la sua abilità di discriminare e tipizzare è trasferibile tra le specie. In altre parole la
stessa miscela di inneschi funziona sulle diverse specie producendo i relativi quadri speciespecifici. Nei mangimi questo si traduce nella contemporanea individuazione della loro
composizione genetica, in specie. Il TBP verrà adottato come strumento diagnostico per la
certificazione genetica dei mangimi a vantaggio della sicurezza alimentare degli animali e della
valorizzazione dei pascoli e delle diete. L’analisi dei mangimi si avvarrà della cooperazione con
l’ARAL che garantirà i campionamenti ed i prelievi ed istruirà gli operatori della filiera dei mangimi.
Risultati preliminari promettenti sono già stati raccolti in esperimenti condotti su diverse diete
alimentari monospecie somministrate a gruppi sperimentali di capre nell’ambito del progetto in
corso IDENTILAT, finanziato dal MIPAF.
Gli studi condotti con il cTBP sulle diverse specie presenti in mangimi ed erbe da pascolo, nonché
quelli su rosa e fagiolo, forniranno l’indicazione se il marcatore nucleare rappresentato dagli introni
delle beta tubuline può essere considerato come un valido bar-code di organismi vegetali. Questa
possibilità sarà verificata utilizzando in parallelo, sullo stesso materiale di analisi, il marcatore
plastidico matk (gene cloroplastico per la maturasi k) considerato oggi una delle poche sequenze di
DNA vegetale potenzialmente idonee per la definizione di un barcode di efficacia equivalente a
quella del gene della citocromo ossidasi 1 (CO1) degli organismi animali.
Attività ed articolazione temporale
Primo anno. Verrà condotta l’analisi con il TBP di varietà di rosa ed ibridi di rosa messi a
disposizione da floricoltori liguri (Patrucco, Diano Marina) e lombardi (Locatelli, Bergamo). I dati
raccolti saranno analizzati per la loro idoneità a definire una immediata certificazione genetica a
bande e per ricostruire le relazioni filogenetiche tra le varietà.
Verrà condotta l’analisi con il TBP su diverse varietà di fagiolo con il fine di caratterizzarle con un
semplice quadro di bandeggio genetico. I dati raccolti serviranno anche alla ricostruzione delle loro
relazioni filogenetiche
Verrà organizzata la raccolta di diversi campioni di erbe da pascolo da areali ed alpeggi variamente
dislocati nel territorio lombardo. Ogni campione verrà catalogato e da ogni campione verrà
estratto il DNA genomico per sottoporlo alla successiva analisi con il TBP
Verrà organizzata la raccolta di campioni di mangimi rappresentativi delle diete alimentari di
allevamenti, o ditte di produzione, presenti e registrati nel territorio lombardo. Verrà estratto il
DNA genomico da ciascuno di questi campioni. Contestualmente, verranno allestiti controlli di
riferimento per le singole specie dichiarate presenti nei mangimi , dalle quali verrà anche ottenuto
il profilo di bandeggio con il TBP.
Secondo anno. Verrà applicato il TBP sui DNA genomici preparati dai diversi campioni di erbe di
pascolo. Si confronteranno i profili di bandeggio raccolti alla ricerca di quadri caratteristici e
diagnostici di ciascuna miscela. Con l’ausilio di campioni di riferimento, verrà ricostruito il quadro di
composizione delle diverse miscele di erbe da pascolo.
Verrà applicato il metodo TBP ai DNA estratti dai diversi campioni di mangimi. Ne verrà valutata la
composizione in specie facendo riferimento ai campioni di controllo monospecie già tipizzati al
primo anno. Per ciascun mangime verrà quindi definita una etichettatura genetica distintiva da
inserire in una banca dati di riferimento.
Terzo anno. Verranno portate a termine le analisi di classificazione genetica dei mangimi e delle
erbe da pascolo. Verranno adottati o sviluppati programmi informatici per la raccolta ed
elaborazione dei dati ottenuti con il TBP. Verrà creata una banca dati di riferimento del profilo
genetico di una cinquantina di specie tra erbaceee, oleaginose ed essenze foraggere utilizzate e
distribuite nel territorio lombardo. L’elaborazione dei risultati condurrà alla costruzione-definizione
di un codice a barra o numerico rappresentativo delle componenti genetiche del mangime o
dell’erba da pascolo analizzati.
Milestones
M2.1 cTBP su varietà ed ecotipi di fagiolo : ricostruzione delle relazioni filogenetiche (12 mesi).
M2.2 cTBP dei polimorfismi presenti in specie e ibridi di rosa. Ricostruzione delle relazioni
filogenetiche (24 mesi).
M2.3 Procedura di identificazione della componente genetica vegetale dei mangimi (24 mesi).
M2.4 Correlazione tra i quadri polimorfici ottenuti nei DNA delle erba da pascolo con il cTBP con la
loro collocazione geografica ed il loro valore nutritivo (30 mesi).
M2.5 Determinazione di codici a barre e/o numerico per ciascun mangime sottoposto ad analisi
(36 mesi).
Risultati attesi - Deliverables
D2.1.1 Certificazione di identità genetica di specie e ibridi di rosa condotta con il marcatore
molecolare cTBP ( combinatorial Tubulin-Based-Polymorphism) di origine nucleare, rivelatore di
polimorfismi di lunghezza presenti negli introni dei geni della famiglia delle beta-tubuline.
D2.1.2 Certificazione di identità genetica di varietà ed ecotipi di fagiolo condotta con il cTBP.
D2.1.3 Tipizzazione genetica delle erbe da pascolo in areali lombardi condotta con cTBP.
D2.1.4 Individuazione di marker vegetali utili alla definizione di un DNA bar code valido e distintivo
per tutte le specie vegetali. Saranno utilizzati un marcatore del DNA di origine nucleare (cTBP) ed
uno di origine plastidica (mat k : gene del cloroplasto per la maturasi K).
D 2.1.5 Scheda tecnica dei mangimi analizzati, tipizzati per il loro contenuto genetico con un codice
a barre e/o numerico.
Iniziative per il trasferimento delle conoscenze
• Relazioni Tecniche. Lezioni di divulgazione agli operatori della filiera. Presentazione del
metodo cTBP attraverso corsi e seminari. Pubblicazioni scientifiche. Formazione di
personale tecnico per aumentare la possibilità di affidare a laboratori autorizzati i compiti di
controllo e certificazione. Stesura di opuscolo riassuntivo dei risultati ottenuti con una
scheda tecnica per ciascun varietà vegetale che riporti il profilo genetico ottenuto con il
TBP. Contatti con aziende e produttori interessati a tutelare il loro prodotto con la
certificazione genetica.
Esecutori e partners
• IBBA-CNR, Milano
• ARAL
Potenziali fruitori dei risultati
• Costitutori di varietà ornamentali e Aziende Florovivaistiche (singole e in consorzi)
• Aziende Agricole (singole e in consorzi)
• Industrie produttrici di mangimi (materie prime e premiacele)
• Consorzi di produzione DOP e altri marchi
• Associazioni Allevatori
• Istituzioni di controllo e vigilanza alimentare sul territorio lombardo
• Associazioni Consumatori
• Studiosi di Ecologia, Tassonomia ed evoluzionistica vegetale
Ricadute conoscitive e sul settore agroalimentare lombardo
Le ricadute sono molteplici. Innanzitutto quella di sviluppare ed applicare un metodo di facile ed
affidabile certificazione genetica dei prodotti dell’agroalimentare che porrebbe la regione
Lombardia in una situazione di oggettiva avanguardia in ambito nazionale. In tal senso un
beneficio importante ed indiretto è quello di aumentare la fiducia del consumatore verso i
prodotti, i produttori e gli organismi di controllo della regione cui competono analisi e
certificazione. Per quel che riguarda i mangimi, identificare il contenuto in specie vegetali dei
mangimi con un metodo innovativo che ha caratteristiche di facile lettura ed applicabilità, facile
trasferibilità agli operatori tecnici del settore, costi di applicazione contenuti, rapidità ed affidabilità
di esecuzione. L’etichettatura genetica dei mangimi basata su questo metodo sarebbe certamente
un valore aggiunto di garanzia del prodotto, della sua composizione, della sua qualità e del suo
valore merceologico. Per quel che riguarda le erbe da pascolo, si profila la possibilità di tipizzare gli
areali di pascolo nella loro composizione specifica in relazione alle caratteristiche nutrizionali.
Beneficio è anche la formazione del personale ricercatore assunto per eseguire il progetto. Per
quanto riguarda le analisi di laboratorio si vuole sottolineare il fatto che il loro costo è molto
competitivo rispetto al mercato, nonostante siano tutelate da una esclusiva di esercizio. Infine, la
possibilità di applicare il cTBP a vasto raggio, su un numero considerevole di specie, siano esse
pure o miscelate (mangimi , erbe da pascolo), fornirà i risultati necessari a validare l’uso della
sequenza intronica dei geni delle beta-tubuline come DNA barcode per le specie vegetali, un
risultato che, se acquisito, sarebbe di grande interesse anche per la nuova botanica sistematica,
quella basata sulla filogenesi molecolare.