Stoico

an innovative diagnostic company
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CGH-array in PGD
Padova, 18-19 gennaio 2016
Pre-implantation Genetic Diagnosis (PGD) e Non Invasive Prenatal Testing (NIPT):
Nuove frontiere in diagnosi prenatale
Giusy Stoico
Molecular Genetics Product Specialist
Technogenetics s.r.l. (LO)
Diagnosi genetica preimpianto
Premesse
1. La specie umana è caratterizzata da una fertilità particolarmente bassa
a. 30% di probabilità di ottenere il concepimento al massimo della
propria capacità riproduttiva
b. 20% dopo i 35 anni
c. 10% oltre i 40
È quindi normale attendere anche diversi mesi prima del concepimento:
secondo l’Organizzazione Mondiale della Sanità si può parlare di
infertilità solo dopo 12/24 mesi di rapporti mirati non protetti senza
risultati.
In questo caso è consigliabile ricorrere a un centro specializzato, anche
perché la compromissione della capacità riproduttiva, oltre a
costituire un problema di carattere medico, tocca aspetti altrettanto
complessi di natura psicologica e sociale.
Giusy Stoico - Molecular Genetics
Product Specialist
Diagnosi genetica preimpianto
Premesse
2. L’incidenza di anomalie cromosomiche è direttamente proporzionale all’età
materna.
L’incidenza di embrioni aneuploidi aumenta proporzionalmente all’età della
donna
i. 63% tra i 36 - 37 anni di età
ii. 81% in età più avanzata.
Questi dati suggeriscono che la riduzione della potenzialità riproduttiva con
il progredire dell’età possa essere attribuita all’elevata percentuale di
embrioni con alterazioni cromosomiche.
IPOTESI: la tendenza a produrre embrioni cromosomicamente anomali può
rappresentare la causa del mancato impianto o di un aborto spontaneo,
analogamente a quanto accade nelle donne in età riproduttiva
Giusy Stoico - Molecular Genetics
avanzata.
Product Specialist
Età media delle pazienti PMA
Dati dal Registro Nazionale Procreazione Medicalmente Assistita
Giusy Stoico - Molecular Genetics
Product Specialist
Incidenza dell’aneuploidia negli
embrioni (trofoectoderma)
Per cromosoma
Da Franasiak et al., J Assist Reprod Genet , 2014
Giusy Stoico - Molecular Genetics
Product Specialist
Impatto dell’aneuploidia nella
riproduzione
L’aneuploidia ha un effetto negativo crescente nella
progressione dell’impianto/sviluppo
L’impianto e la % di successo della gravidanza diminuisce
progressivamente con l’aumento dell’età materna
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Product Specialist
Diagnosi genetica preimpianto
Studio dell'assetto cromosomico degli embrioni per il trattamento
delle pazienti EMA è stato applicato nel tentativo di incrementare le percentuali
di gravidanza in gruppi di pazienti caratterizzati da una performance riproduttiva
ridotta e/o per ridurre l’incidenza di aborti, ed anche ridurre il rischio di trasferire
embrioni con alterazioni cromosomiche (Wilton, 2002).
Aree applicative:
1. Diagnosi preimpianto e infertilità
Screening delle aneuploidie cromosomiche
2. Diagnosi preimpianto e rischio genetico
Analisi delle traslocazioni cromosomiche
Malattie monogeniche
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Product Specialist
24sure
24sure+
Karyomapping
BlueGnome/Illumina
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Product Specialist
Preimplantation Genetic Screening
Dalla letteratura…
PGS TRADIZIONALE
M-FISH
•X-Y-15-17
•13-16-18-21-22
•8-14-20
PGS INNOVATIVA
ARRAY CGH
SNP-ARRAY
vs
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Product Specialist
PGS tradizionale - Analisi FISH
Perchè la tecnologia FISH non è il gold standard per l’analisi
Numero limitato di cromosomi testati
Mosaicismo embrionale
Limiti tecnici del metodo
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Product Specialist
Screening aneuploidie - FISH
La FISH è stata ampiamente usata per indagare le aneuploidie, ma con un
successo limitato:
Può testare solo 5 – 9 cromosomi per volta
Difficoltà tecniche
Soggettiva con alta quota di falsi positivi
Bassa riproducibilità tra laboratori
Nel 2007, è stato dimostrato da molteplici studi RCTs che la FISH non era
efficace per questo scopo
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Product Specialist
Background
superamento dei limiti
Perchè pensiamo che le “nuove tecnologie” siano più
efficienti
Numero limitato di cromosomi testati
Tutti i 24 cromosomi analizzati simultaneamente con grande accuratezza.
Mosaicismo embrionale
Teoricamente “eliminato” allo stadio di blastocisti poichè tutte le
cellule sono trattate come singolo campione
Limiti tecnici del metodo
I metodi molecolari sono meno soggettivi e sensibili agli errori
tecnici
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Product Specialist
PGS innovativa- Analisi aCGH
L’analisi CGH array produce una diagnosi veloce e
realistica, usando una sola cellula embrionale, con un
miglioramento nel successo riproduttivo ben dimostrato.
Yang Z, et al; Mol Cytogenet. 2012;5:24.
Yang Z, et al; Mol Cytogenet. 2013;6:32
C’è una quota molto bassa di fallimenti della procedura,
che assicura una diagnosi per ogni embrione superiore al
99% e include informazioni su tutti i 24 cromosomi.
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Product Specialist
Scopi dell’utilizzo del 24sureTM
1.
Migliorare il successo dei cicli di IVF preferendo gli
embrioni euploidi per il transfer
2.
Supportare il transfer elettivo di un singolo embrione per
ridurre le gravidanze multiple
3.
Ridurre l’incidenza dell’aborto
4.
Ridurre il rischio di un bambino nato con un’anomalia
cromosomica
5.
Ridurre il tempo per instaurare una gravidanza
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Product Specialist
Scopi dell’utilizzo del 24sureTM
Migliorare il successo dei cicli di IVF preferendo gli embrioni euploidi per il
transfer
- Screening delle aneuploidie per tutti i cromosomi/ bracci
cromosomici a partire da:
- Cellule singole (globuli polari, blastomero),
- Cellule multiple (trofoectoderma)
Caratteristiche del Test
– facilmente interpretabile
– no evidenza di CNP / no analisi del fenotipo/ no risultati eticamente
opinabili (patologie a tarda insorgenza, predisposizione al cancro, piccoli
CNV/sbilanciamenti de novo di significato sconosciuto)
– Rapido (12-24 ore)
– basso costo per campione/ allestimento laboratorio
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Diagnosi preimpianto
INDICAZIONE 1
Analisi dell’assetto cromosomico per l’identificazione di aneuploidie
dell’embrione
Tale diagnostica viene comunemente chiamata PGS (Pre-Implantation Genetic
Screening), rivolta a:
Ripetuti fallimenti di impianto (≥ 3 cicli FIVET o ICSI)
Abortività ricorrente (≥ 3)
Mosaicismo cromosomico
Rischio di ricorrenza
Infertilità maschile grave (azoospermia)
Diagnosi preimpianto
INDICAZIONE 2
Identificazione di specifiche anomalie genetiche in coppie a rischio di
trasmissione di malattie Mendeliane (monogeniche) – Karyomapping - o
patologie cromosomiche note (numeriche o strutturali) – 24sure+.
La tecnica consente di escludere dal trasferimento in utero gli embrioni
geneticamente/cromosomicamente anormali (PGD).
Coppie infertili che sono portatrici sane di uno specifico
difetto genico o cromosomico
Coppie in cui uno dei partner è affetto da una specifica
malattia genetica o è portatore di anomalia cromosomica
(traslocazione bilanciata, reciproche e Robertsoniane).
Array CGH - piattaforma
1
2
PGS – 24sure
PGD – 24sure+
(preimplantation genetic screening)
(preimplantation genetic diagnosis)
Piattaforma (BAC) completa, dall’amplificazione all’hardware, per
l’analisi della singola cellula
Protocolli brevi – 12 ore dal campione al referto – risultati robusti e
chiari
Standard ampiamente accettato con numerose pubblicazioni/RCTs e più
di 350 000 campioni clinici analizzati ad oggi
Karyomapping - piattaforma
Caratteristiche
Descrizione
Numero di markers SNPs
300 000
Numero di campioni
12
Concentrazione DNA
50 ng/µl
Tipologia di saggio
Infinium Karyomapping
Strumento
HiScanSQ, HiScan, iScan
Piattaforma
BeadChip
completa
HumanKaryomap-12,
dall’amplificazione all’hardware, per l’analisi della singola cellula
Protocolli brevi – 24 ore dal campione al referto – risultati robusti e
chiari
Processamento overview
PB (day 0)
Blastomero (day 3)
Trofoectoderma (day 5)
Solo materno(80%)
Materno/paterno
Materno/paterno
8-16 per ciclo
6-8 per ciclo
4-6 per ciclo
No mosaicismo
Mosaicismo
Realizzata durante il ciclo
Realizzata durante il ciclo
Mosaicismo ma ad uno
stadio più tardivo
No parte dell’embrione
Analisi molto rapida
Lo screening genetico preimpianto (PGS) ha lo scopo di superare l’aneuploidia selezionando per
l’impianto solo gli embrioni euploidi.
Dibattito aperto su quale biopsia cellulare è più informativa
Protocollo 24sureTM
24sure BAC microarray
3226 BAC: cloni scelti in duplicato e ottimizzati rispetto alle
performance su più di 10 000 pazienti in analisi post-natali
Cloni disegnati per minimizzare la rilevazione dei CNP
utilizzando un database interno di più di 2 000 casi di pazienti
analizzati in aCGH
•
•
•
•
Amplification – SurePlex (Rubicon Genomics technology)
Labelling – BlueGnome Fluorescence labelling kit
Arrays – 24sure
Analysis software – BlueFuse Multi
Giusy Stoico - Molecular Genetics
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Protocollo 24sureTM
Rapido – risultati in ~ 12 ore dal ricevimento del campione
Permette di determinare il copy number di ogni cromosoma
Amplificazione (3 h)
2-5 µg DNA
Singola
Cellula
Marcatura (2 h)
lavaggi, asciugatura,
scansione (1 h )
Ibridazione (3 h o O/N)
Auto import e batch process nel Giusy Stoico - Molecular Genetics
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BlueFuse Multi
Protocollo 24sureTM
amplificazione
24sure - QC checkpoint
• Cellule 1, 2, 3, 4, 6 amplificate
correttamente
• Cellula 5 non amplificata
• Controllo negativo (acqua)
correttamente non amplificato
• Controllo positivo (100 pg di DNA
genomico femminile)
correttamente amplificato
• Tutti i campioni amplificati sono
stati marcati e ibridati
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Tecnologia CGH
DNA dell’embrione
DNA diploide
Trisomia Monosomia Normale
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24sureTM
Single channel technology
24sureTMplus
Dual channel technology
24sure +
Planner Sperimentale Step1
Inputare Dettagli del Paziente
Planner Sperimentale Step2
Batch import e analisi dei dati
Creazione
automatica
dell’import file
24sure V3 – risultati
Campione vs riferimento maschile
Campione vs riferimento femminile
Campione mostrato come dye-swap – notare sex-mismatch/match
Calling
calling per le aneuploidie
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Report
Stima della confidence nelle
calling per le aneuploidie
Calling automatiche
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24sure +
In quali casi?
24sure+ PGS dei prodotti derivati, conoscendo il cariotipo dei genitori
24sure+ array – 0.5Mb – copertura più alta nelle regioni sub-telomeriche / pericentromeriche
Applicazioni
Il 24sure+ si applica preferenzialmente nei casi di aborti ripetuti
dove si sospettano traslocazioni negli embrioni
Genitori portatori di traslocazioni bilanciate che si sottopongono
a cicli di IVF
Rileva sia le traslocazioni che le aneuploidie per ogni embrione
Utilizzabile per le traslocazioni reciproche / robertsoniane /
complesse, per le inversioni e i cromosomi ad anello
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Traslocazione Reciproca
t(2:5)(q21;q31)
Più alta risoluzione del 24sure+ che permette lo screening dei
prodotti derivati dai genitori portatori di traslocazione
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Risultati Concordanti
•
I risultati sono concordanti
con il cariotipo dei genitori
portatori della traslocazione
•
In questo caso le biopsie di
4 blastomeri al day 3
identifica lo stesso break
point, coerente al cariotipo
parentale t(2;22)
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Validazione
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ESHRE technical validation (2011)
5000 campioni, 500 cicli
6 centri RCT in progress
Secondo studio ESHRE
A seguito del successo ottenuto con il primo
studio ESHRE del 2011, il 24sure è stato
selezionato per la fase successiva: trial clinico
randomizzato, controllato, in doppio cieco che
coinvolge 600 coppie
5 centri PGD in Europa
Valutare l’impatto della PGS su PB sui nati vivi
L’aneuploidia negli ovociti in un ciclo è
predittiva dell’aneuploidia nei cicli successivi?
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Allestimento Laboratorio
Allestimento Laboratorio
PGD - Karyomapping
Analisi di linkage genomica ad alta densità dell’aplotipo
attraverso una piattaforma SNPs per la rilevazione
dell’ereditarietà dei difetti di singolo gene da una singola cellula
embrionale.
Utilizzabile per qualsiasi patologia monogenica
I campioni di partenza sono gli stessi della metodica in aCGH
Analisi dei dati attraverso il software BlueFuseMulti
Applicazione
Coppie con precedente figlio affetto
Coppie portatrici di difetto monogenico
Handyside et al (2010) J Med Genet 47, 651-658
Karyomapping
Padre
(portatore)
Madre
(portatrice)
Bambino Embrione 1 Embrione 2 Embrione 3 Embrione 4
(affetto) (non affetto) (portatore) (portatore) (affetto)
Karyomapping
OBIETTIVO
Determinare se gli embrioni ereditano gli stessi cromosomi dei
genitori e del riferimento (precedente figlio affetto)
ALGORITMO
1.Trovare i loci SNP informativi
2.Determinare
la fase comparando il genotipo dell’embrione al
genotipo di riferimento
3.Analisi con BlueFuse Multi
Karyomapping
Dalla letteratura…
Fino ad ora, la PGD è stata condotta esaminando l’ereditarietà
delle STR adiacenti a specifici loci. Ogni test STR per una
patologia genetica deve essere sviluppato individualmente per
ogni coppia che richiede l’analisi e per ogni patologia,
richiedendo settimane o mesi di lavoro e molta esperienza.
La PGD delle malattie monogeniche attraverso il karyomapping
non richiede lo sviluppo di un test specifico riducendo
notevolmente il tempo impiegato per l’analisi.
Come lavora il karyomapping?
Recuperando il DNA dai genitori e da un parente stretto
con uno stato noto di malattia (per esempio un
precedente figlio affetto), il metodo opera una
genotipizzazione degli SNPs.
Per ogni embrione, gli SNPs sono utilizzati per identificare
l’origine parentale dei cromosomi per tutti i loci.
Come lavora il karyomapping?
Una volta determinato il locus per la specifica malattia,
può essere determinato se il tratto di DNA parentale che
porta la mutazione combacia con il tratto del DNA
embrionale e a quel punto si definisce l’embrione affetto.
Se il DNA parentale mutato non combacia con il DNA
embrionale, allora l’embrione sarà considerato sano e
potrà essere un buon candidato per il transfer.
Karyomapping - Principio
Analisi genomica del trio di un set di circa 300 000 SNPs presenti
sull’array che possono assumere quattro valori:
AA, AB, BB, o NC (no call).
A = nucleotidi A e T
B = nucleotidi G e C
Identificazione degli SNPs informativi (circa 20-40%), cioè degli SNPs
sicuramente ereditati da uno dei due genitori.
A questo scopo, lo SNP di un genitore deve necessariamente avere un
genotipo eterozigote mentre l’altro dovrà essere omozigote.
In una tipica analisi saranno presenti circa 60,000–120,000
misurazioni cosiddette “phasing” con una spaziatura di 15.5 kb–31
kb.
Karyomapping
Esempio
Padre
Madre
Informativo?
1
AB
AA
Informativo per il padre
2
AB
BB
Informativo per il padre
3
AA
AB
Informativo per la madre
4
BB
AB
Informativo per la madre
5
AA
BB
Non informativo
6
AA
AA
Non informativo
7
AB
AB
Non informativo
8
BB
BB
Non informativo
9
BB
AA
Non informativo
L’allele informativo è rappresentato in rosso ed è utilizzato per capire la fase dello SNPs
dell’embrione rispetto al riferimento
Karyomapping
1.
2.
Embrione E Riferimento ereditano o non ereditano l’allele
informativo, allora erediteranno lo stesso cromosoma del genitore.
Embrione eredita l’allele informativo e il Riferimento non lo eredita
(o viceversa), allora erediteranno diversi cromosomi parentali.
Se l’embrione eredita lo stesso cromosoma del riferimento è detto in
fase, se l’embrione eredita un cromosoma diverso rispetto al
riferimento è detto non in fase (phasing relativo al riferimento)
Il risultato del phasing descrive in che modo ogni embrione eredita lo
stesso cromosoma del riferimento ad ogni localizzazione SNP
informativa.
Determina quali cromosomi sono ereditati dall’embrione rispetto al
riferimento.
Karyomapping - Tecnologia
I STEP: amplificazione del DNA proveniente dal blastomero o
dalla biopsia del trofoectoderma per ottenerne una quantità
utilizzabile per il protocollo Infinium.
II STEP: preparazione del DNA amplificato e di quello dei
genitori e del riferimento per l’ibridazione sul vetrino
HumanKaryomap-12 BeadChip.
Il protocollo completo comprensivo dell’amplificazione del
materiale di partenza necessita di 24 ore per essere
completato.
Karyomapping
Karyomapping - Tecnologia
Human Karyomap12 Workflow
Analisi dei dati
Riferimento
M
P
Embrione
M
Scenario ideale
P
Riferimento
M
P
Embrione
M
Scenario reale
P
Diagnosi
Riferimento
M
P
Embrione
M
P
AFFETTO
Diagnosi
Riferimento
M
P
Embrione
M
P
PORTATORE
PATERNO
Diagnosi
Riferimento
M
P
Embrione
M
P
NON
AFFETTO
BFM - Visualizzazione
BFM - Visualizzazione
BFM v4.3 - Karyomapping
Fornito come modulo separato
Casi allocati in un database dedicato
Caratteristiche dell’analisi:
Rilevazione Automatica degli aploblocchi
Karyotype view
Visualizzazione dei dati nelle regioni di interesse
Reports contenenti i dettagli del caso, la statistica dei dati nella
regione e nel campione
Inserimento guidato
Case View: monosomia
Courtesy of
Case View: trisomia
Courtesy of
Validazione del Karyomapping
Analisi retrospettiva di 44 casi per 26 PGD sono stati condotti in
collaborazione con sei laboratori
Un totale di 218 embrioni (75% Blastomeri e23% biopsie TE) sono
stati analizzati con il Karyomapping e confermati con l’analisi STR.
179 (82%) embrioni con risultati confrontabili all’analisi STR
18 (8%) embrioni con risultati migliori dell’analisi STR
13 (6%) embrioni con risultati significativi al Karyomapping ma
non significativi all’analisi STR
3 (1%) embrioni con eventi di crossover vicino al gene di interesse
e hanno dato risultati coerenti con l’analisi Karyomapping
Grazie per l’attenzione!
[email protected]
+39 335 7968125
Dr.ssa G. Stoico
Molecular Genetics Product Specialist
Technogenetics s.r.l. (LO)