LEUCEMIA MIELOMONOCITICA GIOVANILE
STUDIO CITOFLUORIMETRICO DELLA TRASDUZIONE DEL SEGNALE
IPERSENSIBILITÀ AL GM-CSF E PROFILI DI FOSFORILAZIONE DI STAT 5
Cecchetti C. - Gaipa G. - Bugarin C. - Farina F. - Stasia A. - Realini S.- Borin L. - Biondi A. - Pogliani E.M.
INTRODUZIONE
RISULTATI
La leucemia mielomonocitica giovanile (JMML) è una rara malattia
della prima infanzia a prognosi estremamente sfavorevole di natura
emopoietica clonale con caratteristiche sia mielodisplastiche che
mieloproliferative.
In vitro i progenitori dei monociti-macrofagi del sangue periferico dei
pazienti affetti mostrano una straordinaria capacità di proliferare
spontaneamente in coltura. È stato dimostrato che la proliferazione
spontanea in vitro è regolata principalmente dal fattore di crescita
stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF). L’aberrante
mieloproliferazione sembrerebbe derivare dalla disregolazione nella
via di segnale del GM-CSF. La coltura in metilcellulosa delle cellule
mononucleate che formano colonie di granulociti-macrofagi (CFU-GM)
in assenza di fattori di crescita esogeni è considerato un criterio
importante nella diagnosi di JMML.
Tuttavia, per avere i risultati del test CFU-GM che confermano la
diagnosi di JMML è necessario attendere 3-4 settimane. Poiché il
trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche è la sola terapia
potenzialmente curativa per la JMML, è importante una diagnostica
tempestiva e accurata.
Diversi studi hanno fornito l’evidenza che l’ipersensibilità al GM-CSF
nei pazienti con JMML è causata da aberrazioni nel pathway di segnale
di JAK-STAT. STAT è un fattore di trasduzione del segnale che promuove
sopravvivenza e proliferazione cellulare. La citofluorimetria (CFM) con
tecnica multiparametrica ha dimostrato nuove potenzialità per
quantificare i livelli intracellulari di proteine attivate, ossia fosforilate.
SCOPO DELLO STUDIO
- Studiare mediante analisi citofluorimetrica multiparametrica a livello
di singola cellula il profilo di fosforilazione di STAT5 come parametro
surrogato della ipersensibilità delle cellule di JMML nei confronti del
GM-CSF e verificarne il possibile impatto nell’iter diagnostico delle
JMML
- Verificare il possibile impatto dei risultati nell’iter diagnostico delle
JMML
- Verificare la fattibilità e la riproducibilità di una metodica citofluorimetrica
multiparametrica di analisi dei segnali di fosforilazione
MATERIALI E METODI
Sono stati analizzati 12 campioni di midollo osseo di pazienti affetti da
JMML (età compresa tra 3 mesi e 4 anni, sesso M) e 17 campioni di
controllo freschi e criopreservati. Le cellule mononucleate ottenute
mediante Ficoll venivano, scongelate, stimolate con GM-CSF a
concentrazioni crescenti, fissate, permeabilizzate e successivamente
marcate con anticorpi monoclonali legati a fluorocromi specifici. I
campioni venivano poi acquisiti al citofluorimetro e analizzati secondo
un pannello di anticorpi monoclonali a 7 colori.
Analisi della fosforilazione di STAT 5
Nell’analisi del campione non stimolato si stabilisce un valore soglia di STAT5 sotto al quale si
presume che essa sia fosforilata ad uno stato basale (quadrante Q3-1). Sopra di esso si misura
la fosforilazione indotta dallo stimolo. Quindi, per ogni concentrazione di GM-CSF (non stimolato
- 0.01 ng/mL - 0,1 ng/mL - 1 ng/mL - 10 ng/mL) si prendono in esame la percentuale di eventi
sopra al valore soglia stabilito, ossia quelli osservati nel quadrante Q4-1 che sono tradotti in
percentuale nel pannello in basso a destra (% parents). Essa sarà progressivamente maggiore
in ragione della dose del GM-CSF, in ciascuna popolazione di interesse.
Iperfosforilazione di STAT5
Misurazione della fosforilazione di STAT5 nei pazienti con JMML. Percentuale dell’incremento
della fosforilazione di STAT5 in risposta a dosi crescenti di GM-CSF nelle cellule CD34+/CD33+
Nel grafico a sinistra sono stati analizzati separatamente i campioni freschi (n°5 campioni) e i
campioni criopreservati (n° 7 campioni) di pazienti affetti da JMML Essi sono stati confrontati con
campioni freschi (n°17 campioni) e criopreservati (n°18 campioni) di controlli sani. Di essi sono
indicati i valori medi e le barre di errore. A destra sono stati messi a confronto tutti i campioni
JMML (freschi + criopreservati) con tutti i campioni di controllo (freschi + criopreservati).
I precursori mieloidi (CD34+/CD33+) dei pazienti con JMML mostrano
una marcata iperfosforilazione di STAT5 rispetto ai controlli. Infatti, già
alla dose minima di GM-CSF (0,01 ng/mL), si osserva un aumento
della percentuale della risposta, con valori compresi tra 1 e 2%. Anche
alle dosi successive, (0,1ng/ml, 1ng/ml, 10ng/ml) l’incremento delle
cellule che esprimono p-STAT5 resta al di sopra dei valori osservati
nei campioni di controllo. Queste differenze sono statisticamente
_ ng/mL di GM-CSF (P-value da
significative al 99% a tutte le dosi <1
0 a 0,0013).
Analizzando i campioni freschi separatamente dai campioni
criopreservati non si sono evidenziate differenze statisticamente
significative.
CONCLUSIONI
La fosforilazione di STAT5 in risposta alle basse dosi di GM-CSF nei
precursori mieloidi di pazienti con JMML risulta significativamente più
elevata rispetto ai soggetti di controllo. Poiché questa proteina si trova
a valle del recettore del GM-CSF, abbiamo ipotizzato che STAT5 possa
rappresentare un parametro surrogato dell’ipersensibiltà delle cellule
JMML al GM-CSF e che quindi l’iperfosforilazione di questa proteina
possa essere una caratteristica tipica delle JMML. Questa osservazione
apre la possibilità di integrare tale parametro nell’iter diagnostico delle
JMML. I vantaggi dell’analisi citofluorimetrica rispetto alla coltura in
metilcellulosa sono: un basso numero di cellule richieste per l’analisi,
ricchezza del numero di dati e delle informazioni statistiche, distinzione
di sottoinsiemi cellulari specifici all’interno di popolazioni eterogenee
di cellule (immunofenotipo di antigeni superficiali e intracellulari), analisi
di parametri multipli all’interno di una singola cellula. Inoltre analizzando
il pathway di segnale a livello della cellula singola, consente di misurare
lo stato a riposo e lo stato attivato (dopo stimolo) delle proteine di
segnale. In tal modo si possono ricavare informazioni sulla localizzazione
e sulla natura delle alterazioni presenti nelle cellule tumorali rispetto
alla controparte normale. Nel nostro studio abbiamo dimostrato inoltre
che l’analisi citofluorimetria è possibile anche nei campioni criopreservati.
Ciò rende possibile uno studio retrospettivo più ampio che consenta
di valutare una possibile correlazione tra mutazione genetica e profilo
di fosforilazione di JAK-STAT.
