MISURE AFM DI INTERAZIONI SPECIFICHE PROTEINA-ANTICORPO C. Ascoli Istituto di Biofisica del C.N.R., Via S. Lorenzo 26, 56127 PISA Il microscopio a forza atomica (AFM), nato come strumento dedicato all'imaging topografico di superfici, è stato utilizzato fin dal 1990 per lo studio delle forze superficiali fra punta e campione. Più recentemente è iniziato l’utilizzo di questo strumento nella misura di interazioni specifiche, ovvero di forze che si instaurano solo fra particolari coppie di molecole; tali forze sorgono dalla cooperazione di diverse tipi di forze, resa possibile dalla geometria complementare delle molecole interessate. Le interazioni specifiche sono alla base della selettività dei processi biologici a livello molecolare, dal riconoscimento antigene-anticorpo all’interazione tra catene complementari durante la sintesi del DNA o la sua decodifica. I primi studi di interazioni specifiche hanno permesso di misurare la forza del legame avidina-biotina (Florin et al., Science, 264:415; 1994) o il rilassamento che avviene quando una molecola si srotola. La misura delle interazione specifiche si ottiene analizzando le curve forza-distanza. Facendo una scansione verticale si misurano le interazioni punta-campione mentre la punta si sta avvicinando al campione e mentre se ne allontana. In una curva forza-distanza si distinguono varie parti: la retta degli zeri, quando l’interazione è praticamente nulla, il jump-to-contact, quando le forze attrattive di tipo elettrico prendono il sopravvento e la retta di contatto dove predominano le forze repulsive e punta e campione si muovono in modo quasi solidale. Nella curva in allontanamento le stesse situazioni sono ripercorse all’indietro, ma il jump-offcontact avviene più tardi per l’instaurarsi di legami aspecifici durante la fase di contatto. Se il campione e la punta sono funzionalizzati con molecole complementari nelle curve forza-distanza in allontanamento sono visibili altre discontinuità, con una forma specifica e riconoscibile: sono dovute alla rottura di legami specifici. E’ possibile riconoscere questi salti, anche in modo semiautomatico, e studiarne la statistica. Questo permette di ottenere informazioni sulla distribuzione statistica delle forze a cui il legame si rompe e di studiare anche la cinetica di formazione. Questo è stato fatto a Pisa utilizzando una particolare tecnica di acquisizione che permette di ottenere sequenzialmente le curve forza-distanza su tutta l'area esaminata (Cappella et al., Nanotechnology 8:82, 1997), e inoltre variando indipendentemente sia la velocità della scansione verticale che il tempo durante il quale punta e campione rimangono in contatto. Le interazioni specifiche studiate sono quelle fra proteine leganti dell'olfatto (OBP) (Pelosi, Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol., 29:99, 1994), fissate covalentemente su piastrine di silicio, e un loro anticorpo specifico legato alla punta. I campioni e le punte sono stati trattati presso l'Istituto di Industrie Agrarie dell’Università di Pisa. E’ stato trovato che la probabilità che la proteina ed il suo anticorpo si leghino dipende dal tempo di contatto tra punta e campione, che è stato variato da alcuni millisecondi ad alcuni secondi. Inoltre è possibile ricavare dall’analisi dei risultati il numero di anticorpi che si sono fissati sulla punta.