Lezione 1 - Docenti.unina

Programma di Microbiologia Molecolare (8 crediti)
Introduzione: Replicazione - Trascrizione - Traduzione in Eubatteri ed Archea
Parte 1:
Regolazione dell’espressione genica in Eubatteri ed Archea
Parte 2:
Ciclo litico e lisogenico nel batteriofago lambda
Ciclo cellulare nei procarioti
Esempi di differenziamento microbico
Parte 3:
Interazione tra batteri ed organismi animali
Batteri patogeni
Batteri commensali
Parte 4:
Virus e funghi patogeni
Parte 5:
Interazione tra batteri ed organismi vegetali
Batteri patogeni
Batteri simbiontici
Biologia dei microrganismi
Dehò & Galli
Casa Editrice Ambrosiana
Sezione B
Cap. 13 Regolazione dell'espressione genica
Cap. 14 Divisione cellulare e differenziamento
Cap. 16 Analisi globale delle cellule batteriche
Sezione D
Cap. 18 Interazioni tra batteri
Cap. 19 Interazioni con gli organismi animali
Cap. 20 Interazioni con gli organismi animali: Patogenesi
Cap. 21 Meccanismi di difesa dell'ospite:Immunità innata
Cap. 22 Meccanismi di difesa dell'ospite:Immunità adattativa
Cap. 23 Interazioni con organismi vegetali
Microbiologia molecolare e cellulare
Maresca
Edizioni McGraw-Hill
Microrganismi patogeni
Cap. 6 - Patogenicità e virulenza
Cap. 7 - Batteri patogeni
Cap. 8 - Farmaci antibatterici e loro bersagli molecolari
Cap. 9 - Genomi e regolazione dell’espressione genica degli eucarioti
Cap. 10 - Funghi patogeni per l’uomo
Cap. 11 - Farmaci antifungini e loro bersagli
Cap. 12 - Parassiti
Cap. 13 - Farmaci antiparassitari
NON COMPRATE appunti di questo corso perchè:
- sono fatti da vostri colleghi, non da me;
- si riferiscono a corsi di anni precedenti;
- le figure che faccio vedere a lezione sono disponibili online gratuitamente.
Esame orale
Alberi filogenetici
Alla radice dell'albero ci deve
essere un progenitore
comune (LUCA: Last
Universal Common
Ancestor) che
presumibilmente doveva
avere i caratteri presenti oggi
in tutti e 3 i domini: struttura
cellulare, codice genetico,
replicazione, trascrizione e
sintesi proteica, metabolismo
energetico
Phyla
lo spessore del cuneo indica il numero di specie contenute mentre la lunghezza rappresenta la divergenza
filogenetica. I cunei gialli sono gruppi per i quali non si conoscono specie coltivabili in laboratorio (quindi
mai isolate ma solo dedotte sulla base di sequenze di DNA)
1. 
2. 
3. 
4. 
5. 
6. 
7. 
Dominio = comprende tutti i Phyla
Phylum = costituito da più classi
Classe = costituito da più ordini
Ordine = costituito da più famiglie
Famiglia = comprende generi affini
Genere = insieme di specie diverse ma che hanno in comune una
o più proprietà fondamentali
Specie rappresenta l’unità di base . Comprende batteri che hanno
comuni caratteri morfologici, colturali, biochimici, antigenici …
Archaean Phylogeny :
- the Euryarcheota are probably the best known, including many methaneproducers and salt-loving archaeans;
- the Crenarcheota include those species that live at the highest temperatures
of any known living things, though a wide variety have recently been discovered
growing in soil and water at more moderate temperatures;
- the Korarcheota are only known from their DNA sequences -- nothing more is
known about them yet since they have only recently been discovered.
Programma di Microbiologia Molecolare (8 crediti)
Introduzione: Replicazione - Trascrizione - Traduzione in Eubatteri ed Archea
Parte 1:
Regolazione dell’espressione genica in Eubatteri ed Archea
Parte 2:
Ciclo litico e lisogenico nel batteriofago lambda
Ciclo cellulare nei procarioti
Esempi di differenziamento microbico
Parte 3:
Interazione tra batteri ed organismi animali
Batteri patogeni
Batteri commensali
Parte 4:
Virus e funghi patogeni
Parte 5:
Interazione tra batteri ed organismi vegetali
Batteri patogeni
Batteri simbiontici
monomero del DNA
5'
3'
5’ il nucleotide monofosfato è il monomero
del filamento di acido nucleico (molecola
polimerica finale) mentre il nucleotide
trifosfato ne è il precursore
3’ Nella doppia elica di DNA i 2 filamenti contrapposti sono antiparalleli
3'
5'
3'
5'
Nei Procarioti il genoma è costituito, in genere, da un unico cromosoma circolare
doppia elica
Nei Procarioti il genoma è costituito, in genere, da un unico cromosoma circolare
doppia elica
superavvolta
compattato
da proteine
histone-like
1. La replicazione è semiconservativa
2. La replicazione è bidirezionale
(Cairns, 1961) Negli Eucarioti ci sono inizi di replicazione multipli per ciascun cromosoma
Negli Archea si trova una
situazione mista, con
alcune specie che hanno
un’origine di replicazione
unica ed altre che hanno
più origini di replicazione
per l’unico cromosoma
origini di replicazione
Pyrococcus abyssi:
1 origin of replication
Sulfolobus solfataricus:
3 functional origins
Sulfolobus acidocaldarius:
3 functional origins
La replicazione del DNA di alcuni
plasmidi (di Eubatteri) avviene con
un meccanismo diverso detto
“rolling circle”: un filamento della
doppia elica viene interrotto,
staccato dall’altro filamento (che
rimane circolare). Entrambi i
filamenti funzionano da stampo per
la replicazione di filamenti
complementari
3. La replicazione è semidiscontinua
DNA replication can be divided in three steps:
•  Initiation
•  Elongation
•  Maturation
Initiation
Identification of the origin of replication
ORIGIN RECOGNITION COMPLEX (ORC)
Origin of replication in Eubacteria
►  single
►  AT-rich
►  Contains
inverted repeat (IR) elements
oriC ORIGIN RECOGNITION
COMPLEX (ORC)
legame
cooperativo
Eubatteri
ORIGIN RECOGNITION COMPLEX (ORC)
PRE-REPLICATION COMPLEX
Helicases, SSB, Primase
Initiation
Identification of the origin of replication
ORIGIN RECOGNITION COMPLEX (ORC)
Unwinding of the supercoiled DNA-helix
DNA HELICASE
PRE-REPLICATION
COMPLEX
Stabilisation of the single-stranded DNA (ssDNA)
SINGLE STRAND BINDING PROTEIN (SSB)
Generation of an RNA-primer
RNA PRIMASE
ORIGIN RECOGNITION
COMPLEX (ORC)
pre-replication
complex
ORIGIN RECOGNITION
COMPLEX (ORC)
L'inizio della replicazione è un processo
strettamente regolato
L'inizio della replicazione è un processo
strettamente regolato
L'inizio della replicazione è un processo controllato
In Escherichia coli esistono almeno 3 meccanismi di controllo:
1) controllo della disponibilità dell'origine di replicazione (oriC) o sequestro
transitorio di oriC.
la proteina SeqA si lega al DNA sia nella regione oriC dove compete con DnaA sia
nella regione del promotore di dnaA
L'inizio della replicazione è un processo controllato
In Escherichia coli esistono almeno 3 meccanismi di controllo:
2) controllo della disponibilità di DnaA
a circa 470 kb di distanza da oriC c'è una regione di DNA (datA=DnaA titration A) in
grado di legare ad alta efficienza 300 molecole di DnaA.
Quando questo sito è duplicato (poco dopo l'inizio della replicazione) circa 600
molecole di DnaA saranno legate e quindi meno molecole di proteina potranno
iniziare una nuova replicazione. Questo fenomeno contribuisce a dilazionare la
formazione di nuovi inizi di replicazione.
datA
datA
datA
datA
datA
L'inizio della replicazione è un processo controllato
In Escherichia coli esistono almeno 3 meccanismi di controllo:
3) controllo della disponibilità di DnaA in forma attiva
DnaA in forma attiva è associata all'ATP. Il passaggio dalla forma attiva (DnaAATP) a quella inattiva (DnaA-ADP) è mediato da diversi fattori proteici (DARS1, 2 e
Hda)
pre-replication
complex:
- Helicases
- SSB
- Primases
ORIGIN RECOGNITION
COMPLEX (ORC)
Helicases
Vital to all living organisms.
There is a great variety of helicases (14 identified so far in E. coli, 24 in human
cells).
They separate the two strands of a nucleic acid double helix using the energy
derived from ATP hydrolysis.
They move along one strand with a directionality specific to each enzyme (3'-5' or
5'-3').
PRIMASE
DNA primase is a form of RNA polymerase and a product of the dnaG gene.
In bacteria primase binds to the DNA helicase forming a complex called the
primosome.
Primase is activated by DNA helicase and synthesizes a short RNA primer
approximately 11±1 nucleotides long, to which new nucleotides can be
added by DNA polymerase. Primase is of key importance in DNA replication
because no known DNA polymerases can initiate the synthesis of a DNA
strand without initial RNA primers.
H. sapiens DNA primase
B
ppp5’
3’
MW
Primer length
Pri1: 49 kDa
Pri2: 58 kDa
11-14 nt
62 kDa
4-5 nt
65 kDa
10-12 nt
Pri1: 41 kDa
Pri2: 46 kDa
7-14 nt
T7 Phage DNA primase
Primase
domain
Helicase
domain
NNCTGGG
5’
3’
5’
E. coli DNA primase (DnaG)
ppp5’
P. furiosus DNA primase
ppp5’
RNA primasi
DNA replication can be divided in three steps:
•  Initiation
•  Elongation
•  Maturation
At the beginning of elongation DNA polymerase binds to the RNA primase, which
indicates the starting point for the replication. DNA polymerase can only synthesize
new DNA from the 5’ to 3’ (of the new DNA).
Elongation
At the beginning of elongation DNA polymerase binds to the RNA primase, which
indicates the starting point for the replication. DNA polymerase can only synthesize
new DNA from the 5’ to 3’ (of the new DNA).
Because of this, the DNA polymerase can only travel on one side of the original
strand without any interruption. This original strand, which goes from 3’ to 5’, is
called the leading strand. The complement of the leading strand, lagging strand,
is replicated in a discontinous fashion originating the so-called Okazaki fragments.
Le DNA polimerasi batteriche
Famiglia A: modello DNA pol I E. coli.
3’- 5’ (proof-reading) /5’-3’ (rimozione primers) esonucleasi,
Famiglia B: modello DNA pol II E. coli.
3’-5’ esonucleasi, presenti in batteri, archea, virus, eucarioti
Famiglia C: modello DNA pol III E. coli.
Oloenzima, core enzimatico costituito da una subunità polimerasica, una
esonucleasi (proof-reading) (3’-5’), ed una necessaria per l’assemblaggio
dell’enzima
DNA polymerase III
DNA polymerase III holoenzyme is the primary enzyme complex involved in
prokaryotic DNA replication.
The complex has high processivity (i.e. the number of nucleotides added per
binding event).
Being the primary holoenzyme involved in replication activity, the DNA Pol III
holoenzyme also has proof-reading capabilities that correct replication
mistakes by means of exonuclease activity working 3'->5'.
DNA Pol III is a component of the replisome, which is located at the
replication fork.
Il meccanismo di "correzione delle bozze" non è l'unico modo per correggere
errori fatti durante la replicazione o indotti dall'esterno (per esempio dai raggi
UV). Esistono in tutte le cellule "meccanismi di riparo" dei danni al DNA.
Martedi 14 marzo
ore 9-11 Aula A8
dr. Anna Valenti
Istituto di Bioscienze e BioRisorse (IBBR)
CNR
via Pietro Castellino 111
Napoli
DNA replication can be divided in three steps:
•  Initiation
•  Elongation
•  Maturation
Maturation (Okazaki Fragments)
Each Okazaki fragment is initiated near the replication fork at a RNA primer
created by primase, and extended by DNA polymerase III. The primer is later
removed by nucleases such as Ribonuclease H (RNAse H) and a domain of DNA
polymerase I. The excised RNA bases are replaced with DNA by DNA polymerase
I in prokaryotes. Adjoining fragments are then linked together by DNA ligase, using
phosphodiester bonds, to create a continuous strand of DNA.
Primase
DNA polymerase III
Primase
DNA polymerase III
DNA polymerase III Primase
Primase
DNA polymerase III
DNA polymerase III Primase
RNAse H
DNA polymerase I
DNA ligase
Ligase
DNA ligase links together DNA strands that have double-strand breaks (a
break in both complementary strands of DNA) creating the phosphodiester
bond to fully repair the DNA.
The mechanism of DNA ligase in connecting broken DNA strands is to form
covalent phosphodiester bonds between 3' hydroxyl ends of one nucleotide
with the 5' phosphate end of another.
5’ -­‐ AGTCTGATCTGACT GATGAGTATGCTAGTGCT 3’ OH 5’ P -­‐ 3’