Oncogenes Nei virus a DNA

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Gli oncogeni virali
Oncogenes
Nei virus a
DNA
Virus tumorali a DNA
Virus oncogeni Famiglia
del virus
tumori causati
nell’uomo
dimensioni del
genoma (kb)
Virus tumorali a DNA
Virus dell’epatite B
Papova v. (SV40 e Polyoma)
Papilloma v.
Adenovirus
Epstein Barr Herpes
cancro del fegato
nessuno (in animali solo)
carcinoma cervicale
nessuno
linfoma di Burkitt
(carcinoma nasofaringeo)
sarcoma di kaposi
3
5
8
35
100-200
5
Virus tumorali a RNA
Retrovirus
leucemia T dell’adulto
9
1
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La attività trasformante di un virus dipende da
uno o più geni che appartengono al genoma virale
L’oncogene causa dei cambiamenti che convertono
la cellula normale in una cellula trasformata
•  Virus
a DNA
(studi sulla trasformazione oncogena
delle cellule, scoperta oncosoppressori)
•  Retrovirus
(hanno permesso la scoperta degli
oncogèni)
VIRUS A DNA
Come trasforma un virus oncogeno a DNA?
2
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Ciclo vitale latente
Virus
Cellula
Integrazione (generalmente)
EARLY FUNCTIONS- Virus-specifiche espresse - No virus
maturi
Variazioni delle proprietà della cellula ospite TRASFORMAZIONE
Cell is said to be virally transformed
Trasformazione
Tra le diverse proprietà alterate della
CELLULA TRASFORMATA si ha:
•  perdita del controllo proliferativo (perdita
dell’inibizione da contatto in cellule in
coltura)
•  Invasione della matrice extracellulare
•  Mobilità
•  Ridotta adesione
•  Le cellule trasformate spesso contengono
aberrazioni cromosomiche
3
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Virus oncogeni a DNA
genoma virale a DNA
DNA polimerasi
DNA-dipendente
(Codificata dal Virus
o dall’ospite)
RNA polimerasi
codificata
dall’ospite
mRNA virale
proteine virali
Virus oncogeni
Famiglia
del virus
tumori causati
nell’uomo
dimensioni del
genoma (kb)
cancro del fegato
nessuno
carcinoma cervicale
nessuno
linfoma di Burkitt
3
5
8
35
100-200
Virus tumorali a DNA
Virus dell’epatite B
Papova v. (SV40 e Polyoma)
Papilloma v.
Adenovirus
Epstein-Barr (herpesvirus)
(carcinoma nasofaringeo)
sarcoma di Kaposi
Virus tumorali a RNA
Retrovirus
leucemia T dell’adulto
9
4
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PAPOVAVIRUS: specie-specifici
PA: papillomavirus
PO: polyomavirus
VA: vacuolizzanti
•
•
•
•
•
•
•
2 generi:
2 generi
Virus senza pericapside
40-50 nm di diametro
72 capsomeri con 5-7 proteine
struttura icosaedrica
DNA bicatenario circolare di 5-8 Kb
Sede di replicazione: nucleo
Sono citocidi
PAPILLOMAVIRUS
DNA
5 Kb
Non crescono in coltura
Oncogeni nell’ospite naturale
POLIOMAVIRUS 6
DNA
3,3 .10
Crescono in vitro
Potere oncogeno dubbio
Papilloma HPV
8Kb Closed
CircularDNA
•  causano
tumori naturali nell’animale
•  causano verruche benigne
•  sono ubiquitari
•  epiteliotropici - la maggior parte dei tumori umani derivano
da cellule epiteliari (carcinomi)
• 90% dei Tumori : cervice uterina, vulvare, pene………
• 10% of human cancers (16% in female) are HPV-linked
5
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Papilloma
Virus
Papilloma
Il loro capside è di 55 nm, possiedono 7.900 paia di basi.
•  51 tipi identificati - i più comuni sono i tipi 6 e 11 (basso rischio)
•  per lo più tumori cervicali (cervice uterina), vulvari e penieni,
ASSOCIATI ai tipi 16 e 18 (70% dei tumori penieni),31,33,45
Infetta cheratinociti, entrando attraverso INTEGRINE ALFA6
STUDI EPIDEMIOLOGICI :
HPV 16 e HPV 18 trasformano i cheratinociti umani
6
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Caratteristiche del capside
72 capsomeri
60 esavalenti - 12 pentavalenti
2 proteine strutturali:
-  L1 proteina capsidica
maggiore peso molecolare
di 55 kd rappresenta l’80%
delle proteine capsidiche
-  L2 proteina capsidica minore
peso molecolare di 70 kd
rappresenta il restante 20%
delle proteine capsidiche
7
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CANCRO DELLA CERVICE
è il secondo cancro prevalente
-  è la quinta causa di morte nelle donne (breast, colon, lung, endometrial)
-  circa 470.000 nuovi casi sono diagnosticati ogni anno con un’età di 52 anni
per lo sviluppo del tumore
- 
I fattori di rischio per lo sviluppo del tumore sono:
•  Infezioni persistenti con Papilloma Virus (HPV) ad alto rischio
•  Un largo contatto con partners infetti
•  Co-infezioni con virus dell’immunodeficienza umana (HIV-1)
•  Immunosoppressione
•  Fumo
• L'esposizione, durante la gestazione, a un farmaco chiamato dietilstilbestrolo
(DES), prescritto a molte donne tra il 1938 e il 1971 per prevenire gli aborti
spontanei.
• L'infezione da clamidia o da virus herpes simplex di tipo 2 (tipi diversi di
malattie sessualmente trasmissibili).
Organizzazione del genoma e
proteine virus indotte
LCR
E6
E7
E1
E2
E4
E5
L2
L1
0
7906
• L1
Proteina capsidica maggiore (attacco alle cellule)
• L2
Proteina capsidica minore
• E1
Replicazione DNA virale, stato episomico del DNA
• E2
Replicazione DNA virale, controllo trascrizione
• E4
Legame citocheratine, assemblaggio, coilocitosi
• E5 Trasformazione cellulare (lega recettori EGF,
PDGF)
• E6
Trasformazione cellulare (lega p53)
• E7
Trasformazione cellulare (lega pRb)
8
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CIN cervical intraepithelial neoplasia
PROTEINE
E1
-  Proteina di 65 kDa
-  Attività ATPasica ed elicasica 3’-5’ reclutata da E2 all’origine
virale dove riconosce sequenze ricche in AT
- Forma complessi con E2 sull’origine di replicazione inducendo
una distorsione nel DNA virale che facilita il reclutamento di altre
molecole E1 e il distacco di E2
-  Si assembla in un doppio anello esamerico, aiutato
dall’associazione con proteine heat shock (es. Hsp40 e Hsp70)
-  Lega proteine importanti per la replicazione come RPA
(Replication Protein A) e la DNA polimerasi alfa-primasi cellulare
9
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E2
E2
-  Proteina di 50 kDa
-  E’ una DNA binding protein che riconosce, attraverso il
dominio C-ter e sottoforma di dimero, un motivo palindromico
(AACCg(N4)cGGTT) nella regione LCR
-  Lega E1 attraverso il dominio N-ter
-  Ancora gli episomi virali ai cromosomi mitotici per la corretta
segregazione
-  Può formare un complesso con i fattori trascrizionali C/EBP
che regolano diversi promotori associati al differenziamento
cellulare
-  Agisce anche come fattore trascrizionale e regola il promotore
precoce:
•  A bassi livelli E2 agisce come attivatore trascrizionale
•  Ad alti livelli E2 reprime il promotore bloccando il legame dei
fattori trascrizionali (es. TFIID e SP-1)
- Over-produzione di E2 porta ad apoptosi p53 indipendente
E4
-  Proteina di fusione
E4-E5
-  L’ORF è priva del codone di inizio AUG e quindi usa la
sequenza d’inizio di E1 formando proteine E1-E4
-  La sua rimozione blocca gli eventi tardivi, quindi si pensa
sia coinvolta nell’uscita del virus
E5
-  Proteina transmembrana che risiede soprattutto nel RE
-  Può associarsi alla pompa vacuolare ATPasi ed ostacola
il processo di acidificazione dell’endosoma à aumenta
riciclo dei recettori per EGF (epidermal growth factor)
10
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E5
In presenza della proteina E5, il numero degli EGFR
aumenta
Interazione tra E5 e l’ATPasi tipo V
Oncogene (2001) 20
Ligandi EGF-like di poxvirus
Viral-Cbl ( senza RING domain)
T654 phosphorylation
E5 papilloma inibisce ATPasi dell’endosoma
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E6 151aa
E6
- Ruolo di proteina anti-apoptotica in quanto lega p53 e ne
media la degradazione in sinergia con E6-associated protein
E6AP
- Compromette la risposta cellulare al danno al DNA
permettendo l’accumulo di mutazioni secondarie
- Media la proliferazione cellulare e contribuisce allo sviluppo di
metastasi tumorali, provocando la distruzione della normale
adesione cellulare
-  Attiva l’espressione della subunità catalitica della
telomerasi
Proteasomal Degradation of p53 by Human Papillomavirus E6
Oncoprotein Relies on the Structural Integrity of p53 Core
DomainPLoS ONE 6(10): e25981. doi:10.1371/journal.pone.
0025981 (2011)
E6+p53+E6-AP Ubiquitin-protein ligase E3A (UBE3A)
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E7 98aa
E7
- La presenza di E7 porta ad una caratteristica ritenzione
dei nuclei in tutti gli strati epiteliali infettati
-  Si associa alla pRb (retinoblastoma) impedendone
l’associazione col fattore trascrizionale E2F, il quale va a
transattivare proteine cellulari richieste per la
replicazione virale
-  Si associa anche ad altre proteine come:
• Deacetilasi istoniche ( causando spegnimento soppressori)
• Inibitori della chinasi ciclina dipendente p21CIP1 e p27,
(guidando le cellule alla mitosi)
• Insieme con E6 aumenta CATENINE Nucleari
• E7 dei ceppi ad alto rischio hanno 10X affinita di
legame per pRB
Human Papillomaviruses Activate the ATM DNA Damage
Pathway for Viral Genome Amplification upon Differentiation
J. Virol. September 2012 vol. 86 no. 17 9520-9526
These results indicate that
DNA repair factors
involved in homologous
recombination are
recruited to episomal
copies of HPV and are
used for virus replication
ATM activation leads to the phosphorylation of
many substrates at sites of DNA damage,
including Chk2, BRCA1, and NBS1, as well as
the histone H2A variant H2AX (referred to as
γH2AX)
13
3/29/15
skip
14
3/29/15
Ann Surg Oncol. 2011 Jul;18(7):2057-65. doi: 10.1245/s10434-010-1523-0. Epub 2011 Feb
24.
Inhibition of p600 expression suppresses both invasiveness and anoikis resistance of
gastric cancer.
Sakai H, Ohuchida K, Mizumoto K, Cui L, Nakata K, Toma H, Nagai E, Tanaka M.
Le PI3-like Ser/Thr chinasi svolgono un ruolo centrale
come trasduttori della risposta di danno al DNA
3056!
1!
ATM!
2644!
1!
ATR!
3031!
1!
ATX/SMG1!
1!
4128!
DNA-PK!
1!
2549!
mTOR/FRAP!
TRRAP!
3830!
1!
FAT!
PI3-K! FATC!
Tali proteine sono altamente conservate nell’evoluzione.
15
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ATM è presente nella cellula come dimero inattivo.
In seguito a danno del DNA ATM subisce un cambio conformazionale
che ne induce l’attività chinasica e l’autofosforilazione in Ser1981
che determina il rilascio dal dimero di due molecole di monomero
autofosforilate ed attive in grado di mediare la fosforilazione di substrati
sia in prossimità dei DSB DOUBLE STRAND BREAKs che piu’ genericamente nel nucleo.
From Bakkenist and Kastan, 2003, Nature
Il complesso MRN MRE11/Rad50/NBS1
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restart
vaccino
Cervical-intraepithelial neoplasia
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Virus
Oncogene
Polyoma
T antigen early
DNA 6kb
Papilloma DNA 8kb
E6, E7, E5 early
Adeno DNA 37kb
E1A, E1B, early
Le oncoproteine di Papilloma:E6
150aa, BAK
UBE3A: E6 Associated
HECT Ubiquitin ligase
850aa
P53
Minichromosome maintanance protein
The expression of this protein alone immortalizes several human cell types
HECT= Homolog to E6 Carbossi Terminal
18
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Degradazione di p53: E6 +E6 ubiquitin protein
ligase E3A (human papilloma virus E6-associated protein, Angelman
syndrome)
"   Per superare l’attività pro-apoptotica di p53, E6 lega p53 in un
complesso ternario con la Hect ubiquitin ligasi E6-AP (Homologous E6Associated Protein C-terminal)
"   Questo porta all’ubiquitinazione di p53 e alla sua degradazione da
parte del proteasoma 26S
"   La vita media di p53 risulta ridotta da molte ore a meno di 20’ nei
cheratinociti
EPIGENETIC DESEASES : uniparental disomy; deletion
IMPRINTED LOCI
Il 15 paterno deve funzionare in questo locus
Prader-Willi: mental retardation, insaziable appetite.
PWS is caused by the absence of segment 11-13 on the long arm of the
paternally derived chromosome 15.
small ribonucleoprotein N (SNRPN) involved in mRNA processing
Angelmann syndrome:
neurogenetic disorder characterized by mental retardation, abnormal gait,
speech impairment, seizures, and an inappropriate happy demeanor that
includes frequent laughing, smiling, and excitability “happy puppet syndrome”.
Absence of the same segment as PWS on the maternal chromosome 15.
UBE3A codes for an E6-AP ubiquitin ligase
Il 15 materno deve funzionare nel cervello in questo locus
19
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Ub
AMP ATP
Attivazione
E2
E1
E1
E2
p53
p53
p53
E6
E6
E3 AP
E6
E6
AP
p53
Proteasome complex
E3
E6
AP
E6
UBIQUITINA
76 RESIDUICONSERVATA da
lievito a uomo
C-TERMINAL GLYCIN linked to
Epsilon-side chain of lysin
20
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proteasome
3-25 aa
530 human genes for E3 Ub-ligase
110 human genes for deubiquitylating enzymes
E2 recognition site
IpoFosforilata
5'-TTTC[CG]CGC-3'RB1
E2-F1/DRTF1
complex
P21 WAF1 inibitore delle kinasi ciclina dipendenti----| Cdk2/Cyclin E
Cdk2/cyclinA ; controllo ciclo cellulare a tutti gli stadi
E2F growth-promoting transcription factor----> INK4/ARF ( che protegge p53) The Human ARF Cell Cycle Regulatory
Gene Promoter Is a CpG Island Which Can Be Silenced by DNA Methylation
and Down-Regulated by Wild-Type p53
21
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P16
Mediate p53 independent
Cell-cycle arrest
( G1-S)
Inhibit All phases of cell cycle. P53activated
22
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Inibitori ciclo cellulare
P53-dependent
23
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ARF MDM2 P53
Murine Double Minute
Mdm RING
24
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synopsis
VIRAL
ONCOGENIC
PROTEINS
Le oncoproteine di Papilloma:E6,
E7
25
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The Human Papillomavirus type 16 E7 oncoprotein associates!
with the cullin 2 ubiquitin ligase complex, !
which contributes to degradation of the Retinoblastoma !
tumor suppressor!
E7 65aa
E7 is detected in 97% of cervical cancer
Human Papillomavirus Type 16 E7 Oncoprotein Associates
with the Cullin 2 Ubiquitin Ligase Complex, Which
Contributes to Degradation of the Retinoblastoma Tumor
Suppressor▿
Ring Finger Protein RBx1 binds E2
E7 is a specific substrate adaptor
26
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Una F-box protein
FWD1 media la
proteolisi
Della CATENINA
beta e su CDK del
ciclo cellulare
27
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Cullins are a family of hydrophobic proteins that act as
scaffolds for ubiquitin ligases (E3).
SKP1,Cullin1, Fbox
SCF
http://smart.embl-heidelberg.de/
28
3/29/15
CONVERGENT EVOLUTION
E 7 DI PAPILLOMA
E1A DI ADENO 5 (anche p300)
LARGE T ANTIGEN DI SV40 (anche p53 e
p300)
SONO ONCOPROTEINE VIRALI CAPACI DI
SEQUESTRARE O INATTIVARE pRB
Lo legano solo se ipo-fosforilato,
concentrandosi sull’unica forma di Rb che
inibisce la crescita e blocca le cellule in G1
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3/29/15
LxCxE
Lee, nature 1998
Il Retinoblastoma legato al peptide virale che lo blocca
E7 di papilloma
E7
30
3/29/15
Figure 8.21a The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Figure 8.21b The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
31
3/29/15
Virus oncogeni SV40
Famiglia
del virus
tumori causati
nell’uomo
dimensioni del
genoma (kb)
cancro del fegato
nessuno ??
carcinoma cervicale
nessuno
linfoma di Burkitt
3
5
8
35
100-200
Virus tumorali a DNA
Virus dell’epatite B
Papova v. (SV40 e Polyoma)
Papilloma v.
Adenovirus
Epstein-Barr (herpesvirus)
(carcinoma nasofaringeo)
sarcoma di Kaposi
Virus tumorali a RNA
Retrovirus
leucemia T dell’adulto
9
Polyoma 5Kb
Polyoma virus trasforma cellule quando il genoma è incompleto Sono
necessarie funzioni precoci
• Simian virus 40 - sarcomi nel criceto neonato, trasformazione
•  Polioma umani (JC and BK) - sarcoma della scimmia, leucemia murina
trasformazione
JC= LEUCOENCEFALOPATIA MULTIFOCALE PROGRESSIVA Fatale
demielinizzazione in immunocompromessi (brain)
BK= Nefropatie, tropismo per epitelio genito-urinario in trapiantati
Merkel Cell Carcinoma (tumore neuroendocrino da UV)
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3/29/15
Merkel cell carcinoma (MCC) Neuroectodermal tumor"
Cause: MERKEL CELL POLYOMA VIRUS"
Occurs most often on the sun-exposed face, head, and neck; old people, "
Immunosuppressed people"
Merkel cells or Merkel-Ranvier cells are oval receptor cells found
in the skin of vertebrates that have synaptic contacts with
somatosensory afferents
"
La poliomelite : da virus a RNA
Picornavirus tipo Brunhilde 1,2,3
Il virus per I vaccini è
stato passato su una
quarantina di colture di
rene di scimmia rhesus e
di African Green monkey
kidney cells Vaccino di Jonas Salk 1955-60: virus
ucciso in formalina = IPV inattivato da
iniettare
Vaccino Albert Sabin: Ceppi di poliovirus attenuati= OPV orale
1960:SV40 è stato il quarantesimo virus trovato nelle
cellule renali di scimmia utilizzate per crescere I vaccini.
Se iniettato in hamster causa tumori
33
3/29/15
Il problema dell’SV40
poliomavirus dei macachi
•  Causa tumori cerebrali negli animali da laboratorio
•  Trasforma le cellule in coltura
•  L’ agT lega p53 e la inattiva •  1955-1962: presente nel vaccino antipolio iniettato a 10 milioni di bambini in
Europa e America
•  1960-1961: presente nel vaccino anti adenovirus: vaccinato tutto l’ esercito
americano
•  Sequenze di SV40 trovate in tessuti tumorali umani
•  3-4% della popolazione umana ha anticorpi anti SV40
•  Trovato nello sperma di uomini non vaccinati in quel periodo (!?)
virus SV40
grows in growth-arrested, terminally differentiated cells
SV40 must drive cells into the S phase!! It can rarely
integrate Permissive cells:
Grows in arrested cells,
Needs S phase genes
Transformed cells:
No growth,
T antigen continously
Produced
Abortive Transformation:
Replication, no late function
Dilution of T antigen,
Return to normal growth-arrested state
34
3/29/15
Il virus SV40
SV40
Ciclo produttivo (litico) in cellule permissive
Monkey Kidney
Trasformazione di cellule non permissive
Mouse fibroblast
Le cellule trasformate da polyoma
o adenovirus
Contengono geni virali EARLY
integrati a caso nel
Genoma cellulare
Large T antigen esamer
P300
+ p53
T antigen
pCBP transc.cofactor
35
3/29/15
large T and small t antigens are
products of the same gene
generated by alternative splicing
and they share an 82 amino acid Nterminus
SV40
PP2A---P85SH2
RB + p53
Papova lead to p53discovery
Large T
Anti-tumor serum
Recognize a protein
Present in mouse embryonal
Carcinoma cell F9
without SV40
Levine, Cell 1979
p53
CoIP with LargeT
36
3/29/15
SV40 T antigen usa J domain e
LxCxE motif per legare RB J Domain
pRB binding to T antigen and chaperones.
Sullivan C S , and Pipas J M Microbiol. Mol. Biol. Rev.
2002;66:179-202
37
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Large T antigen usa un
meccanismo da chaperon per
staccare E2f da Retinoblastoma
HEAT
SHOCK
70
RB
38
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SV40
SV40 infection leads to telomerase activity, overexpression
of Notch-1 which promotes cell cycle progression
and upregulation of insulin-like growth factor (IGF) Small t antigen of SV40 comprises 174 amino acids.
The region between residues 97-103 interacts with the
PP2A phosphatase. This interaction reduces the ability
of PP2A to inactivate ERK1 and MEK1 protein,
Kin.Sup.Ras1 scaffold and to inactivate Myc.
Activates trascription of Cyclin D, A.
SV40 large tumor antigen (Tag) blocks RB and
RASSF1A (causing accumulation of D cyclins).
Large T ATPase domain Binds p53 DNA-binding
domain
Protein Phosphatase 2A
Raf:KSR1: MEK:
PP2A
(C36kDa:A65kDa: B)
Small Tantigen
Proliferation
ERK
Large Tantigen----| p53
Myc
Retinoblastoma
Loss of heterozygosity (LOH) at chromosome 11q22-q24
(PPP2R1B regolatory) has been associated with lung,
colon, breast, cervical, head and neck, and ovarian
cancers, as well as melanoma
The major RB phosphatases are PP1 and PP2A
39
3/29/15
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17608567 2007 PLoS
?
Overall Structure of SV40 Small T in Complex with the A Subunit
of PP2A (structural subunit)
A cartoon illustration of the “front” and “top” views of the PP2A A
subunit–SV40 ST complex. The scaffold Aα subunit of PP2A, the
J domain, and the unique domain of SV40 ST are colored blue,
green, and magenta, respectively. In addition, two zinc ions in the
ST unique domain are yellow. ST interacts with the intrarepeat
loops of HEAT repeats 3–7 of PP2A A subunit.
PP2A is a trimeric protein : B regulatory subunitC CATALYTIC
Binding to
B (REGULATORY)
Subunit of PP2A
Is INHIBITED
PP2A a reluctant suppressor
•  PP2A è inibito (non specificatamente) da
okadaic acid che è un promotore di tumori
•  PP2A viene inibita da small t antigen (Sv40
e polyoma) ed Adeno E4orf4 40
3/29/15
PP2A as a Positive Effector of RAS Signaling defosforilando
Siti critici di Raf-1 e KSR1
PP2A is important for maintaining the phosphorylation
status of all pocket proteins during cell cycle progression
by counteracting CDKs
41
3/29/15
CONVERGENT EVOLUTION
E7 DI PAPILLOMA
E1A DI ADENO 5
LARGE T ANTIGEN DI SV40-large T ha
anche un J domain
SONO ONCOPROTEINE VIRALI CAPACI DI
SEQUESTRARE O INATTIVARE pRB
Lo legano solo se ipo-fosforilato
42
3/29/15
synopsis
Virus oncogeni:Adeno
Famiglia
del virus
tumori causati
nell’uomo
dimensioni del
genoma (kb)
cancro del fegato
nessuno ??
carcinoma cervicale
nessuno ?
linfoma di Burkitt
3
5
8
35
100-200
Virus tumorali a DNA
Virus dell’epatite B
Papova v. (SV40 e Polyoma)
Papilloma v.
Adenovirus
Epstein-Barr (herpesvirus)
(carcinoma nasofaringeo)
sarcoma di Kaposi
Virus tumorali a RNA
Retrovirus
leucemia T dell’adulto
9
43
3/29/15
ADENOVIRUS 35Kb
Elevato potere oncogeno negli animali:
Adenocarcinoma
Il genoma virale viene integrato parzialmente
Funzioni precoci
E1A , E1B55, E1B19 = Oncogeni
Oncoproteine di adeno
Virus
Gene cellulare
Oncogene
Polyoma
Large T antigen Retinoblastoma e p53
DNA 6kb
PP2A phosphatase
Small T antigen
Papilloma DNA 8kb
E6, E7 P53 e Rb rispettivamente
Adeno
Rb E1A, DNA 37kb
E1B-55K+ E4orf6
P53 e PP2A
E1B-19K inactivates BAK e BAX
antiapoptosi
44
3/29/15
skip
Cullins are a family of hydrophobic proteins that act as
scaffolds for ubiquitin ligases (E3).
SKP1,Cullin1, Fbox
SCF: ubiquitinazione
Proteine del cell
cycle, catenine
S-phase kinase associated (cycECDK2)
RING-finger
Ubiquitin-conjugating-E2 ligase
http://smart.embl-heidelberg.de/
http://string-db.org/version_8_2/
45
3/29/15
synopsis
46
3/29/15
Virus oncogeni
Famiglia
del virus
tumori causati
nell’uomo
dimensioni del
genoma (kb)
Virus tumorali a DNA
Virus dell’epatite B
Papova v. (SV40 e Polyoma)
Papilloma v.
Adenovirus
Epstein-Barr (herpesvirus)
cancro del fegato
nessuno
carcinoma cervicale
nessuno
linfoma di Burkitt
(carcinoma nasofaringeo)
sarcoma di Kaposi
3
5
8
35
100-200
Virus tumorali a RNA
Retrovirus
leucemia T dell’adulto
9
HERPES 200Kb
Evidenze notevoli di un ruolo nei tumori umani
•  Alcuni con elevato potere tumorigeno nell’animale
•  Il DNA virale è ritrovato in una piccola percentuale delle cellule
tumorali: meccanismo “hit and run”
HHV-8 (Human Herpes V-8) Sarcoma di Kaposi
•  Virus di Epstein-Barr-EBV
•  Linfoma di Burkitt
•  Tumore Nasofaringeo
• Linfomi delle cellule B in immunodepressi
•  Mononucleosi
Infettiva
•  Trasforma linfociti B umani in vitro
47
3/29/15
Kaposi sarcoma
Prior to the onset of AIDS, Kaposi
sarcoma was confined to
Mediterranean and Jewish descent and
correlated with mitochondrial DNA.
Probably transmitted through saliva.
Is an opportunistic pathogen and is
now the fourth most common
infection induced cancer worldwide.
1872 dermatologo ungherese Moritz Kohn Kaposi: proliferazione di Cellule endoteliali
Sarcoma di Kaposi ( dr Moritz Kaposi 1872)
Herpes Virus Umano 8, HHV-8
Sarcoma di Kaposi: il DNA virale è ritrovato con frequenza
elevata in tutte le forme epidemiologiche del sarcoma.
L’analisi del genoma ha rivelato la presenza di un gene
omologo di Interleuchina-6 (vIL-6, growth factor)
E di viral homologue of D-type cyclins(K-cyclin).
Disfunzioni dei meccanismi di regolazione dell’espressione di questa
citochina sono state correlate con la patogenesi di linfomi delle cellule B
oltre che
del sarcoma di Kaposi
48
3/29/15
A genetic switch
Gene expression profiling to answer the
question “ What cells it arises from”
OLD: Kaposi sarcoma affects cells of skin,
express Lymphatic-endothelial genes.
NEW: Kaposi infects Human Vascular
Endothelial Cells
(HUVECs) and transcriptionally reprogram
the cells to became lymphatic vessel cells
inducing also blood vessel endothelial cell
genes Kaposi Sarcoma: Tumore
angioproliferativo a forte
componente infiammatoria
Tumore in individui immunodepressi,
il virus infetta cellule endoteliali
vascolari e le riprogramma in
linfatiche le cellule esprimono
marcatori endoteliali
In gene-expression analysis
si caratterizzano geni
LEC =lymphatic endothelial
o BEC = blood vessel
endothelial cells
49
3/29/15
HH8 Human Herpesvirus8-Kaposi: champion autocrine
Proteine virali che influenzano proteine cellulari:
HHV-8 LANA-1 represses the pro-apoptosis transcriptional
activity of p53
HHV-8 Anti-apoptotic vFLIP prevents the activation of the
Fas death receptor pathway and blocks caspase 8
K cyclin (D like) blocks RB and overrides host cell-cycle
growth arrest Proteine virali che mimano proteine cellulari (autocrino):
HHV-8 PDGF, TGFbeta, VEGFR3, vIL-6, angiopoietin2,
podoplanin CD206,
LYMPHATIC-ENDOTHELIAL ASSOCIATED LIGANDS and their
RECEPTORS all in one
Espressione cellulare modificata dal virus:
Overespressione omeobox gene PROX1= espressione di geni
per il differenziamento dell’endotelio vascolare del derma
in endotelio linfatico
50
3/29/15
Herpes virus Epstein-Barr EBV 172 kb: EBV Burkitt Lymphoma
Infetta linfociti B quiescenti o
cellule epiteliali (scarsamente litico)
Attivazione di cellule B quiescenti
che vengono indotte a proliferare
(Ricombinazione Ag dipendente?)
Traslocazione bilanciata reciproca
braccio lungo cromosoma 8 (Myc)
e 14 (IgH)
produzione EBNA-4 riduce p53 e
quindi è ANTIAPOPTOTICO Linfoma di Burkitt asiatico
51
3/29/15
Villi
ILEO
Placche di Pleyer
Linfoma di Burkitt africano
Tumore mascella o orbita
endemico
Starry sky cielo stellato: piccole cellule B non aderenti e macrofagi con cell
tumorali
Uno dei tumori a crescita più rapida
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3/29/15
Etiological agents
EBV Epstein Barr Virus"
"
• 1961 Denis Burkitt presenta in Inghilterra un tumore dei
bambini africani (Linfoma di Burkitt). 8 bimbi su 100.000.
Influenza del clima e zona malarica"
• 1964 Epstein, Barr, Achong individuano il virus in
tessuto neoplastico"
• 1968 EBV viene riconosciuto agente eziologico della
mononucleosi"
• 2004 EBV ha specificità per cellule epiteliali e B ed
induce una proliferazione incontrollata (immortalizzazione
e trasformazione) . EBNA1 induce degradazione di p53
(antiapoptosi), LMP1aumenta Bcl2, Antigene attivazione
B (CD40) e diminuisce geni della differenziazione 53
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Reciprocal Translocation in Burkitt
Burkitt’s hymphomas 8;14- 2;8- 8;22:
Heavy (75%), kappa (9%) or lambda (16%) chains of immunoglobulin
TRASLOCAZIONI
che mettono un gene sotto un promotore forte
Specific chromosal abnormalities in specific cancers
Burkitt lymphoma 8;14- 2;8- 8;22:
heavy, kappa or lambda chains of immunoglobulin translocated
with MYC(A transcription factor is activated)
Acute leukemia in infants ( myelocytic or lymphocytic):
Acute Myeloid Leukemia AML T(8;21 RUNX.Myc)
MLL (mixed lineage leukemia) T(9;11 MLLT3-MLL)
is a homeobox gene: cellule immature, immortali
( telomerase indotta)
B-Chronic lymphocytic leukemia:
t(2;18) (14;18)(18;22)BCL2 gene is
activated (antiapoptotico) and ATM is
inactivated ( pro-apoptotic)
Celllule vecchie che non muoiono
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3/29/15
I riarrangiamenti dei geni per IgG
Catene pesanti
Presumibilmente I riarrangiamenti/ traslocazioni sono
causati dal malfunzionamento della recombinasi
55
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modello
Modello della trasformazione
causata da virus a DNA
La espressione costitutiva
di oncogeni trasforma
la cellula eliminando I normali
controlli
del ciclo cellulare: i soppressori
Virus oncogeni: EPATITE
Famiglia
del virus
tumori causati
nell’uomo
dimensioni del
genoma (kb)
Virus tumorali a DNA
Virus dell’epatite B HBV
cancro del fegato
Papova v. (SV40 e Polyoma)
nessuno
Papilloma v.
carcinoma cervicale
Adenovirus
nessuno
Epstein-Barr (herpesvirus)EBV linfoma di Burkitt
(carcinoma nasofaringeo)
sarcoma di Kaposi
3
5
8
35
100-200
Virus tumorali a RNA
Retrovirus
leucemia T dell’adulto
9
56
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EPATITE /Hepatitis B Virus
Hepadnaviridae
HBV portatori cronici di HBV (positivi al test di HBsAg nel
siero,400 milioni) hanno un
rischio di sviluppare un tumore del fegato da 5 a 100 volte
maggiore dei non portatori; ed è stato stimato che la
cronicità dell’infezione è responsabile del 60% dei casi di
tumore primitivo del fegato nel mondo (67% dei casi nei
Paesi in via di sviluppo)
Trasmissione: sangue ed altri fluidi
HCV Epatite C , Flaviviridae (RNA) è la causa più frequente di malattia cronica
del fegato nel mondo occidentale; 200 milioni portatori. Trasmissione: sangue
EPATITE B
Epidemiologia:
Forte correlazione fra HBV ( 3.2 Kb, 4 ORF) e il carcinoma
epatocellulare
Cina: 1 milione di nuovi casi di carcinoma epatocellulare all’anno
Taiwan: il rischio relativo di carcinoma è 217 x rispetto ai non portatori
• Problema sanitario importante
•  il 10% della popolazione nei Paesi in via di sviluppo è
portatore cronico
• Lungo periodo di latenza (<30 anni)
MICROINFIAMMAZIONI CRONICHE cause long term damage
to tissues resulting in large scale cell regeneration which
increases the chances of natural mutation in proto-oncogenes
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3/29/15
EPATITE B pararetrovirus
Virus dell’Epatite B hepadnavirus
Genoma a DNA
RNA polimerasi II
Provirus a RNA
Enzima dell’ospite
Trascrittasi Inversa
hepatitis B surface antigen, or HBsAg"
hepatitis B e antigen (HBeAg),"
X protein"
Viral polymerase"
Core proteins"
Genoma a DNA
Enzima virale
4 geni epatite
Surface
Polymerase
Core
ORF X
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HBV X protein against p53
sequestered in cytoplasm • The National Academy of Sciences of the USA
• Hepatitis B virus X protein and p53 tumor suppressor interactions in the modulation of
• apoptosis
• Lynne W. Elmore,* Amy R. Hancock,* Shau-Feng Chang,� Xin W. Wang,*
•  Seung Chang,� Christiana P. Callahan,* David A. Geller,ｧ Hans Will,� and Curtis C. Harris*
• Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 December 23; 94(26):
Oncogene. 2001 Jun 21;20(28):3620-8.
Hepatitis B virus X mutants derived from human hepatocellular carcinoma retain the ability
to abrogate p53-induced apoptosis
.Huo TI, Wang XW, Forgues M, Wu CG, Spillare EA, Giannini C, Brechot C, Harris CC.
59
3/29/15
HBVx protein
Putative nuclear targets of HBx: ATF-2/CREB
transcriptional factors, RNA polymerase subunit RPB5,
tumor suppressor protein p53 , TATA binding protein
(TBP), a putative DNA repair protein UV-DDB , TFIIH
and RNA polymerase II
A number of cytoplasmic activities attributed to HBx: the
activation of Ras/Raf/mitogen-activated protein (MAP)
kinase, MEKK1/Jun kinase, protein kinase C signal
transduction pathways 60
3/29/15
IPOTESI tumorigenesi del virus
EPATITE 1.  Tumori da inserzione del virus nel DNA cellulare
2.  Produzione di proteine oncogene : proteina X 3.  Infiammazione cronica che induce rigenerazione
X induce vascolarizzazione (angiopoietina), reprime apoptosi (interagisce con survivin e inibisce p53)
In infezioni con HBV c’è metilazione dei promotori delle MHC classeII
e scarsa presentazione antigeni da linfociti B, monociti e neutrofili
12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate"
(DAG mimetic?)
FAST RESPONDER
Aspirina
Infiammazione e tumori
61
3/29/15
Prostaglandine H2
L’attivazione di NF-κB è associata con il cancro colonrettale.
COX-2, un gene target di NF-κB, è responsabile della sintesi inducibile
delle prostaglandine durante l’infiammazione.
Inibitori di NF-κB possono prevenire la progressione al cancro
colonrettale attraverso l’inibizione dell’espressione di COX-2.
Un’assunzione costante di aspirina per lunghi periodi o di altri inibitori
di COX-2 (10-15 anni) è stato dimostrato ridurre il rischio relativo di
cancro colonrettale del 40-50%.
L’uso di sulindac sulphide induce apoptosi delle cellule cancerose
colonrettali, perché inibisce l’attività di IKK.
La curcumina riduce la carcinogenesi del colon perché potente inibitore
di IKK.
Altri inibitori di NF-κB o IKK come sulphasalazine, mesalamine,
glucocorticoidi, methotrexate vengono impiegati nel trattamento delle
malattie infiammatorie, croniche dell’intestino.
62
3/29/15
Can Aspirin slow cancer progression?
Prostaglandin E2 promotes intestinal tumor growth via DNA
methylation Nat Med 2012;18:224-226 Xia D.., Dubois RN
1- PGE2 induces synthesis of DNA Methyltransferase enzymes
2- These methylate and transcriptionally silence tumor suppressor
genes
3- in murine tumor model (colon cancer) if you use Colecoxib
(inhibitor of ciclooxigenase-2), tumor is reduced
4- if you use azacitidine (demethylating agent), tumor is reduced
5- Colecoxib + Azacitidine= pharmacologically synergistic
Curcumina inibitore di IKK Curcumina è
C21H20O6, è
conosciuta anche
come diferuloilmetano
TURMERIC
Il Turmerico è un componente del gruppo botanico della Curcuma, facente parte della
famiglia del ginger e dello zenzero: le Zingiberaceae.
La radice ed il rizoma (parte del fusto sotterraneo) della pianta Curcuma longa
vengono schiacciati e polverizzati.
La polvere ottenuta è usata in tutto il mondo come ingrediente principale del curry,
e contiene circa il 2% di Curcumin
63
3/29/15
http://www.genome.jp/kegg-bin/
show_pathway?hsa05203+6714
There is a strong association between viruses and the
development of human malignancies. We now know that at least
six human viruses, Epstein-Barr virus (EBV), hepatitis B virus
(HBV), hepatitis C virus (HCV), human papilloma virus (HPV),
human T-cell lymphotropic virus (HTLV-1) and Kaposi's
associated sarcoma virus (KSHV) contribute to 10-15% of the
cancers worldwide. Via expression of many potent oncoproteins,
these tumor viruses promote an aberrant cell-proliferation via
modulating cellular cell-signaling pathways and escape from
cellular defense system such as blocking apoptosis. Human
tumor virus oncoproteins can also disrupt pathways that are
necessary for the maintenance of the integrity of host cellular
genome. Viruses that encode such activities can contribute to
initiation as well as progression of human cancers.
64
3/29/15
Epo= eritropoietina
eritropoietina
Gp55 spleen focus-forming virus/ Friend
murine leukemia virus
Eritroleucemia da iperattivazione del recettore della
eritropoietina: tumore autocrino 65
3/29/15
Tumore da campione:
eritrocitosi benigna SHP1- Immortalizing or Trasforming?
-E’ molto difficile stabilire linee cellulari stabili da tumori primari
Per studiare i tumori (ricerca di base)
Per selezionare un vaccino contro i tumori (gene therapy)
Perchè cellule trasformate non crescono per sempre in vitro ?
Perchè cellule immortalizzate non causano tumori? 66
3/29/15
Le colture cellulari primarie
hanno una crescita limitata
Senescenza dopo 40
duplicazioni
L’immortalizzazione
di alcune cellule risulta
in colture stabilizzate
Le cellule immortalizzate possono
essere “trasformate”
da ulteriori mutazioni e dall’infezione
con virus oncogeni
Primary Culture= growing cells taken from tissue
Cell Line= A primary culture when it is transferred into the next culture vessel (passaging). Cells grow till SENESCENCE
(physiological stresses in vitro).
Immortal Cell Line= Most human cancer express telomerase, but either cannot be cultured or undergo senescence. They must be transformed with VIRAL GENES that sequester p53 or RB.
Cells will senescence later (CRISIS), they do not show contact inhibition
Continous cancer cell lines= Only highly aggressive cancers or some
metastasis have accumulated genetic changes necessary to immortalize
In vitro
67
3/29/15
- Carcinoma depend on stromal support
- Often cells that thrive in culture are fibroblast, that grow with PDGF in serum
- Tumors resemble wounded tissues that do not heal. Tumor activate the
Physiological wound healing program
-Platelet clog = TGF-beta1, PDGF
-Fibroblast are attracted and release Matrix metalloproteinasses
- neutrophils, monocytes , macrophages= TGF-beta1, TGF-alfa
- Epithelial cell >>EMT>>>MET
- myofibroblast that pull wound sides together
68
3/29/15
rland Science 2007)
69
3/29/15
I geni dell’immortalità:
telomerasi
Immortal cells will not cause tumors in
immunocompromised animals. Furthermore,
they will generally only grow as a single
layer of cells in a dish, exhibiting what is
known as contact inhibition
Transformation is essentially loss of
contact inhibition, the ability to sometimes
grow in the absence of survival factors and
the ability to divide without being
specifically instructed to do so from outside
the cell
1)  Geni che inattivano soppressori cellulari
Replicative senescenze: cells stop dividing, are metabolically active,
Form a2) 
monolayer,
enlarge
Oncogeni
the cytoplasm, express acidic beta-galactosidase
Senescenze
3)  Telomerasi Human fibroblasts acidic beta-gal positive
Metabolically active, non dividing cells
70
3/29/15
Crisis: telomere shortening, breakage-fusionbridge-, karyotipic caos
Per formare un tumore
Le cellule debbono
essere
immortali e
trasformate
71
3/29/15
1) Anti tumor-suppressor
SV40 Large Tantigen lega Rb, lega p53
Human papilloma E6 che lega p53, E7
che lega Rb
Adenovirus E1A che lega Rb ed E1B
che lega p53
Polyoma large T antigen che lega Rb
Mutanti di p53
Immortalizing and trasforming genes: Cancer cells need to become immortal in
order to form tumors
2) Oncogenes/Proliferation stimulating genes: Myc, Bmi-1, Ras, Raf, se overespressi, GOF
3) Telomerasi, per impedire l’accorciamento dovuto ad
incompleta replicazione del 5’
72
3/29/15
Accorciamento dei telomeri : Quando viene rimosso il primer Dell’ultimo frammento del Leading Strand, rimane un gap al 5’ ed il 3’ è più lungo
73
3/29/15
Ripetuto 250-1000 volte, producendo
3-20 kilobasi in cui le G in 3’ sono protruding
74
3/29/15
Mammalian telomeres contain a duplex array of telomeric repeats bound to the telomeric
repeat–binding factors TRF1 and TRF2:
The CAP (cappuccio) The telomeric complex (CAP) allows cells to distinguish random DNA breaks and natural
chromosome ends.
Inhibition of TRF2 results in immediate activation of the ATM/ p53–dependent DNA
damage checkpoint pathway, leading to cell cycle arrest and apoptosis (Karlseder et al.,
1999). A telomeric DNA model containing
3 kb of unique sequence DNA
followed by 2 kb of repeating
TTAGGG sequence with a 150–200
nt 3’ G strand overhang was
incubated with human TRF2
protein. Werner Syndrome, Autosomal Recessive, progeroid, 8p12
locus RecQL2
The finite replicative life span of human cells in vitro, the
Hayflick phenomenon (Hayflick, 1965), is due to the
stochastic loss of replicative ability in a continuously
increasing fraction of newborn cells at every generation.
Normal human fibroblasts achieve approximately 60
population doublings in culture, while Werner syndrome
cells usually achieve only about 20 population doublings.
The protein encoded is a HELICASE that binds replication forks, Holliday junction. Essential for genome integrity, DNA break response,
resolving of stalled replication.
75
3/29/15
STEM CELLS and CANCER CELLS
Fine cromosoma 5’ CCCTAA---3’ CENTROMERO
3’
GGGTTGGGATT-------------------------------5’
Ripetuto250-1000 volte, le G sono protruding
5’ CCCTAA---3’ CENTROMERO
3’ GGGTTGGGATT-------------------------------5’
5’CCCAACCCAA
CCCTAA---3’ CENT GGGTTGGGATT--------------5’
GGGTT
5’ CCCTAA---3CE
5’CCCAACCCAA
3’ GGGTTGGGTTGGGATT-- 5’
3’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
3’-AAUCCC-5’ RNA in telomerasi
5’- TTAGGG-3’
La telomerasi è una trascrittasi inversa che sintetizza DNA copiando RNA
76
3/29/15
Telomere shortening,
by limiting the
replication potential,
creates an obstacle to
the accumulation of a
large population of
cancer cells
77
3/29/15
HeLa
P53 IS LOW
HCT 116
RAS mutations
CDKN2A
p.R24fs*20
c.68_69insG
Variant
of unknown origin Homozygous
905936 CTNNB1 p.S45del c.133_135delTCT Variant of unknown
origin
Heterozygous
905936 KRAS
p.G13D c.38G>A Reported in another cancer
sample as somatic Heterozygous
905936 MLH1
p.S252* c.755C>A Variant of unknown origin
Homozygous
905936 PIK3CA p.H1047R c.3140A>G
Reported in another
cancer sample as somatic
Heterozygous
78
3/29/15
LoVO Adenocarcinoma colon
APC 2 mutazioni Diverse in eterozigosi
KRAS G13D eterozigosi
Stress e tumori
“tumore” definisce un complesso di patologie derivate dalla
crescita incontrollata di cellule, in qualche modo alterate
in modo multifattoriale,
sono necessarie almeno quattro alterazioni geniche perché una
cellula umana normale diventi neoplastica (Hahn 1999).
1- l'attivazione della telomerasi che porta la cellula all'immortalità
2- l'inibizione di geni oncosoppressori (p53, RB, BRCA1-2, FHIT,
per evitare Senescenza ed apoptosi
3- l'attivazione di oncogeni (ras, myc, apc, DCC, HER2, EGFR),
4- l'inibizione dell’apoptosi o morte cellulare programmata (bcl-2, bax)
5- l'attivazione dell’angiogenesi (VEGF, PDGF).
“stress”, definito da sindrome generale da adattamento,con
aumento di catecolamine, cortisolemia, neurotrasmettitori, ormoni,
sembra influenzare principalmente
il sistema immunitario (Riley 1981, Page 1994, Ben Eliyau 1991),
i meccanismi di riparazione del DNA o di induzione dell’apoptosi (Kiecolt-Glaser 1999)
79
3/29/15
80