Oligonucleotidi naturali e modificati, applicazioni

Perché sintetizzare per via
chimica gli oligonucleotidi?
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Molte sono le utilizzazioni di oligonucleotidi
sintetizzati chimicamente..…
Oligonucleotidi sintetici servono:
¾ in molti esperimenti in biologia molecolare ed in
biochimica, nonché in diagnostica medica
¾ come modelli per studi strutturali sugli acidi nucleici
¾ come potenziali farmaci in terapie “geniche”
¾ come molecole base per la costruzione di nanomateriali
Oligonucleotidi come modelli di acidi
nucleici: studio delle possibili
conformazioni del DNA e dell’RNA
Gli acidi nucleici possono assumere
molte conformazioni (polimorfismo del
DNA e dell’RNA)
Strutture non usuali del DNA
Sequenze particolari di DNA possono
formare TRIPLEX (o triple eliche)
Strutture non usuali del DNA
Strutture non usuali del DNA:
cruciformi (A) e forma H del DNA (B)
Strutture non usuali del DNA
Forma H del DNA
(tripla elica + single strand)
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Immagine ricavata mediante microscopia a forza atomica (AFM) di H-DNA
(tripla elica intramolecolare di DNA+DNA a singolo filamento in un tratto di
DNA di sequenza ripetuta (GAA)42•(TTC)42. Immagini simili sono state ottenute
per H-DNA formati da sequenze Py•Pu ripetute del gene PKD1.
Strutture non usuali del DNA
Triplex “non canoniche” formate da
oligonucleotidi sintetici
Strutture non usuali del DNA
Due triplex modello (con inversione
di polarità 3’-3’) messe a
confronto
P = legame 3’-3’
fosfodiestereo, che
consente l’inversione
di polarità
Strutture non usuali del DNA
Modelli molecolari delle due
strutture triplex
Strutture non usuali del DNA
La spettroscopia CD dà informazioni dirette sul
tipo di conformazione assunta da un acido
nucleico (o un frammento di acido nucleico)
Lo spettro CD di una struttura triplex presenta un
minimo diagnostico a λ = 220 nm
Strutture non usuali del DNA
Due sistemi triplex 24-mer con inversione 3’-3’
a confronto
Strutture non usuali del DNA
Stabilità di triple eliche di
DNA a confronto
Profili DSC della triplex 24-mer CT al
variare del pH: a) pH = 7.0; b) pH = 6.6;
c) pH = 6.4; d) pH = 6.2; e) pH = 6.0.
Strutture non usuali del DNA
Strutture triplex possono generarsi a
partire da una duplex preformata, ma
non solo….
Strutture non usuali del DNA
Filamenti ricchi di Guanine possono
formare strutture G-quadruplex
Modello di una G-quadruplex
Tetrade di Guanine
Strutture non usuali del DNA
Le G-quadruplex presentano molte
topologie di strutture
C5'
C2'
Base
C4'
O
C3'
C1'
C2'-endo
Base
C3'
C5'
C4'
O
C1'
C2'
C3'-endo
Strutture non usuali del DNA
G-quadruplex mono-molecolari
Strutture non usuali del DNA
Un oligonucleotide che si struttura in
una quadruplex ben studiata:
l’aptamero della trombina
Loop
Modelli molecolari del cofattore
dell’eparina II complessato con la
trombina e con l’aptamero della trombina
Oligonucleotidi come farmaci in
terapie geniche: possibili approcci
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Strategia antisenso
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Strategia antigene
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Oligonucleotidi come aptameri
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Ribozimi
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RNAi (RNA interference)
Flusso delle informazioni geniche
in cellula
mRNA
DNA
proteina
Oligonucleotidi antisenso e
oligonucleotidi antigene
Approccio antisenso nella regolazione
dell’espressione genica
ODN
antisenso
mRNA
duplex
DNA-RNA
DNA
proteina
Meccanismo d’azione degli oligonucleotidi
antisenso: 1) inibizione fisica della traduzione
e/o 2) attivazione delle RNasi-H endogene
Approccio antigene nella regolazione
dell’espressione genica
ODN
a n t ig e n e
mRNA
triplex
proteina
DNA
Applicazioni non-antisenso e
non-antigene:
Oligonucleotidi come “aptameri”
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Si dicono aptameri molecole sintetiche in
grado di legarsi in maniera selettiva e con
elevata affinità a specifiche sequenze di
acidi nucleici, generate mediante un
processo di selezione in vitro di ampie
librerie combinatoriali di oligonucleotidi
sintetici (SELEX).
Gli aptameri possono riconoscere: DNA,
RNA, proteine, piccole molecole organiche.
Presentano un notevole potenziale
terapeutico, ma possono rivelarsi utili anche
per scopi diagnostici.
Gli aptameri possono legare (cioè riconoscere)
non solo macromolecole!
Esempi: aptamero dell’arginina (a) e della citrullina (b)
SELEX: “Selective Evolution of Ligands by EXponential enrichment”
T7 RNA polymerase
SELEX applicata su miscele in soluzione
Questa metodologia è
molto efficace se
applicata a proteine
che, una volta legate
al loro target
specifico, formano un
complesso insolubile!
PCR: Polymerase Chain Reaction
(Kary B.Mullis, 1983, Premio Nobel per la Chimica 1993)
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Denaturazione del DNA duplex a 97 °C.
Aggiunta di oligonucleotidi “primer” complementari e
contemporaneo abbassamento della T a 55-60 °C, per
favorire l’ibridizzazione dei DNA single strand con le
molecole “primer”.
Estensione del “primer” a 72 °C e formazione di DNA
a doppia elica da parte di una DNA polimerasi
termostabile (Taq polimerasi, isolata dal batterio
termofilo Thermophilus aquaticus).
(da notare: le DNA polimerasi comuni si denaturano alle alte temperature e non sono più attive!)
Ciclo della PCR
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SELEX: solo oligonucleotidi “naturali”?
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Il metodo SELEX consente di preparare
opportune librerie di RNA anche modificati, tali
da mostrare maggiore resistenza enzimatica e
maggiore affinità con il target, sempre che le
modifiche introdotte siano tollerate dalla RNA
polimerasi T7 (trascrittasi inversa).
In alternativa, è possibile preparare RNA
modificati chimicamente sfruttando approcci di
sintesi classica a partire da una molecola già
selezionata come lead compound mediante SELEX.
Nucleosidi modificati tollerati dalla
RNA polimerasi T7
RNA come ribozimi: specifiche sequenze di
RNA promuovono l’idrolisi di specifici mRNA;
quest’attività è catalitica!
Small interference RNA (RNAi)
Oligonucleotidi sintetici impiegati in
genomica ed in diagnostica medica
¾ Identificazione di malattie genetiche complesse.
¾ Sviluppo di farmaci
1) specifici per genotipo;
2) specifici per combattere le cause di una
malattia piuttosto che i suoi sintomi.
¾ Determinazione di mutazioni/polimorfismi.
¾ Test genetici (riconoscimento)
DNA microarrays/microchips
Frammenti di DNA a singolo filamento e sequenza prestabilita sono ancorati
ad una matrice solida. Filamenti complementari si ibridizzano specificamente
alle sonde immobilizzate e le duplex così formate possono essere rivelate sia
qualitativamente sia quantitativamente.
DNA microarrays/microchips
9 Utilizzando target opportunamente marcati (con
probe fluorescenti o con radioattivo) è possibile
misurare quantitativamente il livello di ibridizzazione
(cioè la quantità di catene oligonucleotidiche
complementari che si sono legate ad uno specifico
target).
9 Si definisce array una matrice di prodotti,
realizzabile grazie a tecniche di sintesi miniaturizzate
– basti pensare che sono stati fabbricati microarray
di DNA con circa 400000 sonde oligonucleotidiche
diverse legate su una superficie di un pollice quadrato!
Agenti fluorescenti che possono essere
coniugati a oligonucleotidi
DNA microarrays/microchips
Molecular Beacons
Micro-array ad alta densità
Array ad alta densità di cDNA
Importanza degli oligonucleotidi
modificati e/o coniugati
Opportune modifiche chimiche sono
essenziali per applicazioni in vivo di
oligonucleotidi sintetici
Si possono avere
modifiche degli
oligonucleotidi a
livello:
a) del legame
fosfodiestereo;
b)
c)
delle unità di
ribosio o di 2’deossiribosio;
delle nucleobasi;
d) modifiche
terminali, meglio
indicate come
coniugazioni.
Perché modificare gli oligonucleotidi ?
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1)
2)
Le modifiche di un oligonucleotide possono avere
lo scopo di:
Aumentarne l’affinità nei confronti del target
molecolare (coniugazione con molecole intercalanti,
uso di basi modificate, legami internucleosidici non
carichi);
Aumentarne la biodisponibilità, che significa:
a) più facile penetrazione in cellula, mediante
uso di carrier molecolari, e
b) maggiore resistenza alle nucleasi, mediante
modifiche ai legami internucleosidici che
non sono attaccati dalle fosfodiesterasi.
Alcune possibili modifiche dello
scheletro oligonucleotidico
Modifiche dello scheletro di un
oligonucleotide: legami internucleosidici di
tipo fosforotioato e fosforoditioato
Caratteristiche degli oligonucleotidi
fosforotioato
Altri esempi di oligonucleotidi
modificati: modifiche dello zucchero
Confronto fra capacità di ibridizzazione,
stabilità in vivo ed attività biologica di
12-mer naturali e modificati
Come aumentare l’affinità di un filamento
oligonucleotidico nei confronti del suo target
biologico: uso di intercalanti
Un intercalante
può essere
complessato ad
un
oligonucleotide,
o anche legato
covalentemente;
esso aumenta le
interazioni di
Base-stacking
Alcuni intercalanti del DNA
Peptide Nucleic Acids (PNA): mimici
del DNA a struttura peptidica
Struttura dei monomeri di PNA
1) Nucleobase;
2) Linker
carbossimetilenico;
I PNA possono essere
sintetizzati usando la
chimica dei peptidi
(strategia Boc o Fmoc)
3) scheletro di N-2amminoetilglicina
Un metodo di veicolazione in cellula per
gli oligonucleotidi prevede l’uso di
liposomi
Sezione di un liposoma, formato da
fosfolipidi