Metodi analitici per la
ricerca dei virus enterici
negli alimenti
El b
Elisabetta
Suffredini
ff d
Istituto Superiore di Sanità
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Tor
T Vergata
V
t – 15.04.2014
15 04 2014
Istituto- Superiore
di Sanità
- Roma
Roma
La Sapienza
1717-0101
-2008
DSPVSA
1
Virus enterici trasmessi da alimenti
Vi
Virus che
h causano gastroenteriti:
t
t iti Rotavirus,
R t i
Adenovirus
Ad
i
tipo 40 e 41 e i Calicivirus (NoV e SaV)
Virus dell’epatite entericamente trasmessa: HAV e HEV
Virus che si replicano nell’intestino umano, ma che
causano malattia dopo essere migrati in altri organi,
come il sistema nervoso centrale o il fegato: Enterovirus
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA 2
VIRUS
V
US - caratteristiche
ara
r
• Oltre 120 tipi di virus enterici
• Irregolarmente sferici, diametro variabile da 25 nm
((Picornavirus)
cornav rus) a 75 nm (Rotavirus)
(Rotav rus)
• Singola catena ad RNA, doppia catena ad RNA
(Rotavirus),
(Rotavirus) doppia catena DNA (Adenovirus)
• Specificità d’ospite
• Infettività variabile (dose infettante generalmente 1010100 unità virali; eliminati con le feci in grande quantità
(108-1010 /g)
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA 3
Regolamento (CE) 2073/2005
consideranda
N° 22:
“ I criteri microbiologici fissati nel presente regolamento
devono poter essere riveduti e modificati,
modificati, se necessario,
necessario
per tenere conto dell’evoluzione nei settori della
sicurezza
s cur zza a
alimentare
m ntar e della
a microbiologia
m cro o og a degli
g alimenti,
a m nt ,
ossia dei progressi scientifici, tecnologici e metodologici
metodologici,,
dei cambiamenti nei livelli di p
prevalenza e contaminazione
e nella percentuale di consumatori sensibili,
nonché degli eventuali risultati che emergono dalla
valutazione dei rischi.”
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA 4
Regolamento (CE) 2073/2005
consideranda
N° 23:
“ In particolare,
particolare è opportuno che i criteri per i virus
patogeni nei molluschi bivalvi vivi siano fissati quando i
metodi
di d’analisi
d’
li i sono statii sufficientemente
ffi i
messii a
punto.. …”
punto
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA 5
Metodi di ricerca dei virus
Mi
Microscopia
i elettronica
l tt
i
Saggi immunoenzimatici (ELISA)
Colture cellulari
Metodi molecolari
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA 6
Metodi di ricerca dei virus
HEV
Microscopia
M
croscop a elettronica
ttron ca
HAV
AdV
RV
AV
Istituto Superiore di Sanità - Roma
NoV
DSPVSA 7
Metodi di ricerca dei virus
metodica
LOD
caratteristiche
EM/IEM
10 6-7
individuazione di tutti i ceppi virali
scarsa praticità
ti ità / economicità
i ità
scarsa sensibilità
ELISA
10 4-6
individuazione solo di alcuni ceppi
pp virali
praticità
scarsa sensibilità
24
(RT) PCR
10 2-4
(RT)-PCR
rt-(RT)-PCR 10 0-1
colture
10 0
colt re
cellulari
i di id i
l di alcuni
l i ceppii virali
i li
individuazione
solo
sensibilità
non disponibili tutti i virus
scarsa praticità
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA 8
Metodi di ricerca dei virus
ELISA
EL
S / ssist.
st. immunoenzimatici
mmuno nz mat c
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA 9
Metodi di ricerca dei virus
metodica
LOD
caratteristiche
EM/IEM
10 6-7
individuazione di tutti i ceppi virali
scarsa praticità
ti ità / economicità
i ità
scarsa sensibilità
ELISA
10 4-6
individuazione solo di alcuni ceppi
pp virali
praticità
scarsa sensibilità
24
(RT) PCR
10 2-4
(RT)-PCR
rt-(RT)-PCR 10 0-1
colture
10 0
colt re
cellulari
i di id i
l di alcuni
l i ceppii virali
i li
individuazione
solo
sensibilità
non disponibili tutti i virus
scarsa praticità
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA10
Metodi di ricerca dei virus
((RT)-PCR
)
con
convenzionale
nz ona o real-time
r a tm
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA11
Metodi di ricerca dei virus
((RT)-PCR
)
con
convenzionale
nz ona o real-time
r a tm
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA12
Metodi di ricerca dei virus
metodica
LOD
caratteristiche
EM/IEM
10 6-7
individuazione di tutti i ceppi virali
scarsa praticità
ti ità / economicità
i ità
scarsa sensibilità
ELISA
10 4-6
individuazione solo di alcuni ceppi
pp virali
praticità
scarsa sensibilità
24
(RT) PCR
10 2-4
(RT)-PCR
rt-(RT)-PCR 10 0-1
colture
10 0
colt re
cellulari
i di id i
l di alcuni
l i ceppii virali
i li
individuazione
solo
sensibilità
non disponibili tutti i virus
scarsa praticità
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA13
Metodi di ricerca dei virus
Colture
o tur c
cellulari
u ar
AdV
HAV
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA14
Metodi di ricerca dei virus
metodica
LOD
caratteristiche
EM/IEM
10 6-7
individuazione di tutti i ceppi virali
scarsa praticità / economicità
scarsa sensibilità
ELISA
10 4-6
individuazione solo di alcuni ceppi virali
elevata praticità
scarsa sensibilità
( )
(RT)-PCR
10 2-4
rt-(RT)-PCR 10 0-1
colture
10 0
cellulari
individuazione solo di alcuni ceppi virali
elevata sensibilità
non disponibili per tutti i virus
scarsa praticità
i ià
verifica infettività
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA15
Metodi di ricerca dei virus
Microscopia
Mi
i elettronica
l
i
Saggi immunoenzimatici (ELISA)
S
Sensibilità
ibilità
Matrice
Colture cellulari
Virus difficilmente o affatto coltivabili
Metodi molecolari
METODO DI ELEZIONE
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA16
Metodi:
CEN/TC275/WG6/TAG4
2004: istituzione del gruppo CEN/TC275/WG6/TAG4
“Horizontal method for detection of Norovirus
and Hepatitis A virus in food by RT-PCR
RT-PCR”
(ISO
ISO 1521615216-1 e 15216
15216--2)
Definizione metodi di riferimento per NV (GGI e GGII) e HAV:
• Superfici
• Frutta e vegetali
• Acqua
• Molluschi bivalvi
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA17
Applicazione
pp
della PCR
su matrici alimentari
Natura complessa e non omogenea del campione
Basso numero di virus presenti
Concentrazione del virus (matrice-dipendente)
(matrice dipendente)
E t
i
ifi
i
NA ((rimozione
i
i
iinibenti)
ib ti)
Estrazione
e purificazione
(R t t
(Retrotrascrizione
i i
e)) PCR (sensibilità
(
ibilità & specificità)
ifi ità)
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA18
PCR su matrici alimentari:
trattamento del campione
Natura complessa e non omogenea del campione
Basso numero di microrganismi presenti
Concentrazione del virus (matrice
(matrice-dipendente)
dipendente)
> differenza con le altre analisi molecolari
> differenza con le altre analisi microbiologiche
colturali
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA19
PCR su matrici alimentari:
trattamento del campione
> Soft fruits & vegetables: riduzione i piccoli pezzi,
gg con tampone
mp
(controllo
(
del p
pH),
),
lavaggio
centrifugazione, PEG, centrifugazione
> Acqua in bottiglia: filtrazione, “lavaggio filtro” e
contenitore
t it
((controllo
t ll pH),
H) centrifugazione
t if
i
> MBV: dissezione tessuto, omogenizzazione, digestione,
centrifugazione
Fino al 70% del tempo analitico nella preparazione
del campione > organizzazione & automazione
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA20
PCR su matrici alimentari:
trattamento del campione
recupero
HAV
NoV GI
NoV GII
lab
L2
L3
L4
L5
L6
S1
S2
L2
L3
L4
L5
L6
S1
S2
L2
L3
L4
L5
L6
S1
S2
1
-
+
-
-
+
-
+
-
-
-
-
+
+
-
-
-
+
-
+
+
+
2
-
+
-
-
+
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
+
+
-
3
-
+
-
-
+
+
+
-
-
-
-
+
+
+
-
-
+
-
+
+
+
4
-
-
-
-
+
+
+
-
-
-
-
+
+
-
-
-
-
-
+
+
-
5
-
+
-
-
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
+
+
-
6
-
+
-
-
+
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
+
+
-
7
-
+
-
-
+
-
-
-
-
-
-
+
+
-
-
-
+
-
+
+
-
8
-
+
-
-
+
-
+
-
-
-
-
+
+
-
-
-
+
-
+
+
+
ref
-
+
-
-
+
+
+
-
-
-
-
+
+
+
-
-
+
-
+
+
+
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA21
PCR su matrici alimentari:
trattamento del campione
• Utilizzo di un “controllo di processo” (virus)
• Calcolo del recupero dalla matrice, valutazione
processo di estrazione e
dell’efficacia del p
concentrazione del virus
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA22
PCR su matrici alimentari:
estrazione degli AN
Varietà delle matrici
Volumi
Target (DNA/RNA)
Automazione
Estrazione e p
purificazione AN (rimozione
inibenti))
(
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA23
PCR su matrici alimentari:
estrazione degli AN
Frutta e vegetali:
vegetali:
fenoli
polisaccaridi
pectina
polifenoli
xylano
Molluschi:
Molluschi:
glicogeno
g
polisaccaridi
alghe
al
ghe
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA24
PCR su matrici alimentari:
estrazione degli AN
• > Sistema di estrazione: guanidina tiocianato +
silice, Vol estraibile/Vol eluizione
HAV
ext
L2
1
2
3
4
ref
L4
L5
L6
L6
S1
S2
L2
L3
L4
L5
L6
S1
S2
68% 37%
91% 97% <1
9% -7%
13%
Avg32%: 42%51%
(range
131)
74%
53%
29%
84%
11%
6%
1%
1%
0%
9%
1%
7%
15%
18%
16%
5%
2%
7%
2%
2%
0%
11%
NT
82%
83%
78%
86% 107% 104% 88% 115% 116% 72%
66%
60%
76%
59%
56%
17%
50% 104% 101% 89%
99% 117% 40%
50%
29%
62%
44% 131% 101% 102%
S1
S2
L2
L3
L4
7%
35% 120% 123% 74%
NoV GII
L5
64%
L3
NoV GI
84%
NT
NT
NT
NT
NT
NT
69%
77%
77%
56% 66%(range
48% 84% 88%
49% 61% 93%
- 99)
Avg61%: 90%69%
44 68%
100% 149% 105% 97% 87% 63% 83% 145% 139% 141% 120% 128%
Avg : 79% (range 10 - 149)
81% 70% 76% 87% 73% 10% 87% 98% 100% 66% 53% 10%
96%
Avg : 101% (range 50 - 165)
86% 53% 109% 50% 83% 111% 86% 81% 153% 77% 99%
147% 163% 165% 112% 68%
96%
80% 105% 88% 129% 118% 153% 94%
105% 106% 102% 110% 82%
52%
87%
89%
45%
99%
80% 100% 29%
40%
81%
87% 107% 90%
66%
91%
101% 94% 105% 82%
71%
27%
44%
56%
87%
27%
94% 109% 125%
90% 132% 100% 130% 108%
97% 103% 105% 106% 121% 102% 102% 112% 108% 115% 103% 104% 63%
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA25
PCR su matrici alimentari
alimentari:
estrazione degli AN
• Utilizzo di un controllo esterno di amplificazione
((RNA di sintesi))
• Calcolo dell’efficienza di amplificazione,
p
valutazione dell’efficacia del processo di
estrazione degli acidi nucleici e rimozione degli
inibenti
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA26
PCR su matrici alimentari:
amplificazione
Varianti genetiche
Livelli di contaminazione
Amplificazione
((inclusività e sensibilità))
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA27
Metodi di PCR adottati per la
determinazione
d
i
i
di virus
i
enterici
i i neii molluschi
ll
hi
PubMed review (2010):
•
•
•
•
•
•
•
•
•
NoV
HAV
Enteric viruses
Enterovirus
Adenovirus
Rotavirus
Astrovirus
HEV
Aichivirus
70
55
46
36
14
14
11
2
1
> Scelta
real-time
real-
> Definizioni regioni
da amplificare
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA28
GIII
GI
GII
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA29
Retrotrascrizione e PCR:
one-step
q
p
TaqMan
probes:
FAM-TAMRA ((NoV)) GI - GII
FAM-MGB (HAV)
NoV
5’VPG
ORF 1
NV Proteine non strutturali
(hel-prot-polimerasi)
ORF 2
Proteina capsidica
Istituto Superiore di Sanità - Roma
ORF 3
AAA3’
Proteina strutturale
DSPVSA30
PCR su matrici alimentari:
amplificazione
• > primers/probe pubblicati
• > inclusività (sulle varianti)
DSPVSA
Istituto Superiore di Sanità - Roma
31
PCR su matrici alimentari:
amplificazione
> primers/probe pubblicati
> inclusività (sulle varianti)
> esclusività (altri virus – incluso controllo di processo –
flora microbica)
> LOD (kit per analisi clinica vs. analisi su alimenti)
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA32
PCR per la ricerca/quantizzazione
di virus in matrici alimentari:
kfl
t d analitico
liti
workflow
metodo
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA33
NoV
Controllo
processo
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA34
Efficienza di estrazione:
controllo di processo
Caratteristiche:
- Virus coltivabile
- Caratteristiche strutturali simili al target
- Non presente naturalmente nella matrice
- Assenza di interferenza nelle PCR
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA
virus virus
process control
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA36
Controllo di p
processo / recupero
p
• 5 l
campione
vs.
5 l virus CP
Ct = Ct camp – Ct virus CP
R = 2-Ct x d
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA
process control
recupero dal campione
Stima della quantità di virus nel campione
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA38
Efficienza di estrazione NA:
controllo di inibizione
Caratteristiche:
q
target
g
- Sequenza
- Acidi nucleici di sintesi (puri)
- Quantizzato/quantizzabile
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA
plasmide con
nserto d
di ssintesi
ntes
inserto
promotore RNA
polimerasi
estrazione
del plasmide
con inserto
coltura
trasformazione
E. coli
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA
sito di taglio
enzimaico
i i
linearizzazione
del plasmide
standard a
RNA
trascrizione in
vitro seq a RNA
digestione
g
DNA
quantizzazione
spettrofotometrica
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA
virus virus
process control
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA42
Controllo di inibizione / efficienza di PCR
• 5 l campione
• +
• 1 l RNA
RNA-EC
EC
vs.
5 l H2O
+
1 l RNA
RNA-EC
EC
Ct = Ct camp – Ct stand
E = 2-Ct
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA
virus
efficienza della PCR
Stima della quantità di virus nel campione
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA44
Determinazione del target
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA
virus virus
process control
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA46
virus
virus virus
process control
numero di copie del target analizzato
+
efficienza della PCR
+
recupero dal campione
Stima della quantità di virus nel campione
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA47
ASSESSMENT OF SHELLFISH VIRAL CONTAMINATION IN ITALY: QUALITATIVE AND QUANTITATIVE DATA
VENETO (Northern Adriatic sea)
Year
Species
n
HAV
(%)
NoV (%) †
2008‐2009
Tapes
Mytilus
Crassostrea
24
23
23
(70)
0
0
0
11 (45.8)
14 (60.9)
11 (45.8)
(51 4)
(51.4)
† NoV results are considered as “presence of either GI or GII”
copies/g †
Mytilus (n=14)
Tapes (n=11)
Crassostrea (n=11)
MIN
4,8E+01 *
1,4E+01 *
1,5E+02
MAX
3,1E+04
1,4E+05
2,2E+04
geom MEAN
1,8E+03
4,9E+03
2,0E+03
4,7E+01 ‐ 1,1E+04
3,3E+02 ‐ 7,4E+04
4,2E+02 ‐ 9,6E+03
range (geom mean±DS)
(geom mean±DS)
† NoV results are considered as “sum of GI and GII”;
* estimated values (LOQ GI: 175-260 copies/g; LOQ GII: 120-180 copies/g)
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA48
ASSESSMENT OF SHELLFISH VIRAL CONTAMINATION IN ITALY: QUALITATIVE AND QUANTITATIVE DATA
GULF OF NAPLES (Thyrrenian sea)
Year
Species
2007‐2010
Mytilus
M til
Mytilus
Mytilus
others
‐ class A
‐ class
l
B
‐ retailers *
‐ retailers *
n
NoV (%) †
58
59
19+16
7+4
(=163)
13 (22.4)
47 (79 7)
47 (79.7)
27 (77.1)
7 (63.6)
† NoV results are considered as “presence of either GI or GII”; * registered + street vendors Years 2009
Years 2009‐‐2010
copies/g †
Mytilus
M
til ‐ cl.A
lA
(n=6)
Mytilus
M
til ‐ cl.B
lB
(n=21)
Mytilus
y
‐
retailers
(n=25)
th ‐ retailers
t il
others
(n=6)
MIN
3,6E+01 *
3,8E+01 *
1,0E+01 *
2,8E+01 *
MAX
7,4E+02
1,3E+05
2,4E+06
1,6E+04
geom MEAN
2,0E+02
3,4E+03
4,8E+03
1,7E+03
1,4E+01 ‐ 7,8E+02
2,1E+01 ‐ 4,3E+04
2,6E+01 ‐ 6,4E+04
2,0E+01 ‐ 1,5E+04
range (geom mean±DS)
(geom mean±DS)
† NoV results are considered as “sum of GI and GII”
* estimated values (LOQ GI: 175‐260 copies/g; LOQ GII: 120‐180 copies/g)
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA49
ASSESSMENT OF SHELLFISH VIRAL CONTAMINATION IN ITALY: QUALITATIVE AND QUANTITATIVE DATA
OUTBREAKS
La Spezia
Time
NoV
days
copies/g †
batch 28.12.2012
0
5,2E+03
b h
batch 09.01.2013
+11
5,9E+03
batch 13.02.2013
+46
2,9E+03
batch 26.02.2013
+59
5,3E+02
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA50
Istituto Superiore di Sanità - Roma
DSPVSA51
