Metodi analitici per la ricerca dei virus enterici
annuncio pubblicitario
Metodi analitici per la ricerca dei virus enterici negli alimenti El b Elisabetta Suffredini ff d Istituto Superiore di Sanità Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare Tor T Vergata V t – 15.04.2014 15 04 2014 Istituto- Superiore di Sanità - Roma Roma La Sapienza 1717-0101 -2008 DSPVSA 1 Virus enterici trasmessi da alimenti Vi Virus che h causano gastroenteriti: t t iti Rotavirus, R t i Adenovirus Ad i tipo 40 e 41 e i Calicivirus (NoV e SaV) Virus dell’epatite entericamente trasmessa: HAV e HEV Virus che si replicano nell’intestino umano, ma che causano malattia dopo essere migrati in altri organi, come il sistema nervoso centrale o il fegato: Enterovirus Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA 2 VIRUS V US - caratteristiche ara r • Oltre 120 tipi di virus enterici • Irregolarmente sferici, diametro variabile da 25 nm ((Picornavirus) cornav rus) a 75 nm (Rotavirus) (Rotav rus) • Singola catena ad RNA, doppia catena ad RNA (Rotavirus), (Rotavirus) doppia catena DNA (Adenovirus) • Specificità d’ospite • Infettività variabile (dose infettante generalmente 1010100 unità virali; eliminati con le feci in grande quantità (108-1010 /g) Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA 3 Regolamento (CE) 2073/2005 consideranda N° 22: “ I criteri microbiologici fissati nel presente regolamento devono poter essere riveduti e modificati, modificati, se necessario, necessario per tenere conto dell’evoluzione nei settori della sicurezza s cur zza a alimentare m ntar e della a microbiologia m cro o og a degli g alimenti, a m nt , ossia dei progressi scientifici, tecnologici e metodologici metodologici,, dei cambiamenti nei livelli di p prevalenza e contaminazione e nella percentuale di consumatori sensibili, nonché degli eventuali risultati che emergono dalla valutazione dei rischi.” Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA 4 Regolamento (CE) 2073/2005 consideranda N° 23: “ In particolare, particolare è opportuno che i criteri per i virus patogeni nei molluschi bivalvi vivi siano fissati quando i metodi di d’analisi d’ li i sono statii sufficientemente ffi i messii a punto.. …” punto Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA 5 Metodi di ricerca dei virus Mi Microscopia i elettronica l tt i Saggi immunoenzimatici (ELISA) Colture cellulari Metodi molecolari Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA 6 Metodi di ricerca dei virus HEV Microscopia M croscop a elettronica ttron ca HAV AdV RV AV Istituto Superiore di Sanità - Roma NoV DSPVSA 7 Metodi di ricerca dei virus metodica LOD caratteristiche EM/IEM 10 6-7 individuazione di tutti i ceppi virali scarsa praticità ti ità / economicità i ità scarsa sensibilità ELISA 10 4-6 individuazione solo di alcuni ceppi pp virali praticità scarsa sensibilità 24 (RT) PCR 10 2-4 (RT)-PCR rt-(RT)-PCR 10 0-1 colture 10 0 colt re cellulari i di id i l di alcuni l i ceppii virali i li individuazione solo sensibilità non disponibili tutti i virus scarsa praticità Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA 8 Metodi di ricerca dei virus ELISA EL S / ssist. st. immunoenzimatici mmuno nz mat c Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA 9 Metodi di ricerca dei virus metodica LOD caratteristiche EM/IEM 10 6-7 individuazione di tutti i ceppi virali scarsa praticità ti ità / economicità i ità scarsa sensibilità ELISA 10 4-6 individuazione solo di alcuni ceppi pp virali praticità scarsa sensibilità 24 (RT) PCR 10 2-4 (RT)-PCR rt-(RT)-PCR 10 0-1 colture 10 0 colt re cellulari i di id i l di alcuni l i ceppii virali i li individuazione solo sensibilità non disponibili tutti i virus scarsa praticità Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA10 Metodi di ricerca dei virus ((RT)-PCR ) con convenzionale nz ona o real-time r a tm Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA11 Metodi di ricerca dei virus ((RT)-PCR ) con convenzionale nz ona o real-time r a tm Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA12 Metodi di ricerca dei virus metodica LOD caratteristiche EM/IEM 10 6-7 individuazione di tutti i ceppi virali scarsa praticità ti ità / economicità i ità scarsa sensibilità ELISA 10 4-6 individuazione solo di alcuni ceppi pp virali praticità scarsa sensibilità 24 (RT) PCR 10 2-4 (RT)-PCR rt-(RT)-PCR 10 0-1 colture 10 0 colt re cellulari i di id i l di alcuni l i ceppii virali i li individuazione solo sensibilità non disponibili tutti i virus scarsa praticità Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA13 Metodi di ricerca dei virus Colture o tur c cellulari u ar AdV HAV Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA14 Metodi di ricerca dei virus metodica LOD caratteristiche EM/IEM 10 6-7 individuazione di tutti i ceppi virali scarsa praticità / economicità scarsa sensibilità ELISA 10 4-6 individuazione solo di alcuni ceppi virali elevata praticità scarsa sensibilità ( ) (RT)-PCR 10 2-4 rt-(RT)-PCR 10 0-1 colture 10 0 cellulari individuazione solo di alcuni ceppi virali elevata sensibilità non disponibili per tutti i virus scarsa praticità i ià verifica infettività Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA15 Metodi di ricerca dei virus Microscopia Mi i elettronica l i Saggi immunoenzimatici (ELISA) S Sensibilità ibilità Matrice Colture cellulari Virus difficilmente o affatto coltivabili Metodi molecolari METODO DI ELEZIONE Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA16 Metodi: CEN/TC275/WG6/TAG4 2004: istituzione del gruppo CEN/TC275/WG6/TAG4 “Horizontal method for detection of Norovirus and Hepatitis A virus in food by RT-PCR RT-PCR” (ISO ISO 1521615216-1 e 15216 15216--2) Definizione metodi di riferimento per NV (GGI e GGII) e HAV: • Superfici • Frutta e vegetali • Acqua • Molluschi bivalvi Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA17 Applicazione pp della PCR su matrici alimentari Natura complessa e non omogenea del campione Basso numero di virus presenti Concentrazione del virus (matrice-dipendente) (matrice dipendente) E t i ifi i NA ((rimozione i i iinibenti) ib ti) Estrazione e purificazione (R t t (Retrotrascrizione i i e)) PCR (sensibilità ( ibilità & specificità) ifi ità) Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA18 PCR su matrici alimentari: trattamento del campione Natura complessa e non omogenea del campione Basso numero di microrganismi presenti Concentrazione del virus (matrice (matrice-dipendente) dipendente) > differenza con le altre analisi molecolari > differenza con le altre analisi microbiologiche colturali Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA19 PCR su matrici alimentari: trattamento del campione > Soft fruits & vegetables: riduzione i piccoli pezzi, gg con tampone mp (controllo ( del p pH), ), lavaggio centrifugazione, PEG, centrifugazione > Acqua in bottiglia: filtrazione, “lavaggio filtro” e contenitore t it ((controllo t ll pH), H) centrifugazione t if i > MBV: dissezione tessuto, omogenizzazione, digestione, centrifugazione Fino al 70% del tempo analitico nella preparazione del campione > organizzazione & automazione Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA20 PCR su matrici alimentari: trattamento del campione recupero HAV NoV GI NoV GII lab L2 L3 L4 L5 L6 S1 S2 L2 L3 L4 L5 L6 S1 S2 L2 L3 L4 L5 L6 S1 S2 1 - + - - + - + - - - - + + - - - + - + + + 2 - + - - + - - - - - - - + - - - - - + + - 3 - + - - + + + - - - - + + + - - + - + + + 4 - - - - + + + - - - - + + - - - - - + + - 5 - + - - + - - - - - - - - - - - + - + + - 6 - + - - + - - - - - - - + - - - - - + + - 7 - + - - + - - - - - - + + - - - + - + + - 8 - + - - + - + - - - - + + - - - + - + + + ref - + - - + + + - - - - + + + - - + - + + + Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA21 PCR su matrici alimentari: trattamento del campione • Utilizzo di un “controllo di processo” (virus) • Calcolo del recupero dalla matrice, valutazione processo di estrazione e dell’efficacia del p concentrazione del virus Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA22 PCR su matrici alimentari: estrazione degli AN Varietà delle matrici Volumi Target (DNA/RNA) Automazione Estrazione e p purificazione AN (rimozione inibenti)) ( Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA23 PCR su matrici alimentari: estrazione degli AN Frutta e vegetali: vegetali: fenoli polisaccaridi pectina polifenoli xylano Molluschi: Molluschi: glicogeno g polisaccaridi alghe al ghe Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA24 PCR su matrici alimentari: estrazione degli AN • > Sistema di estrazione: guanidina tiocianato + silice, Vol estraibile/Vol eluizione HAV ext L2 1 2 3 4 ref L4 L5 L6 L6 S1 S2 L2 L3 L4 L5 L6 S1 S2 68% 37% 91% 97% <1 9% -7% 13% Avg32%: 42%51% (range 131) 74% 53% 29% 84% 11% 6% 1% 1% 0% 9% 1% 7% 15% 18% 16% 5% 2% 7% 2% 2% 0% 11% NT 82% 83% 78% 86% 107% 104% 88% 115% 116% 72% 66% 60% 76% 59% 56% 17% 50% 104% 101% 89% 99% 117% 40% 50% 29% 62% 44% 131% 101% 102% S1 S2 L2 L3 L4 7% 35% 120% 123% 74% NoV GII L5 64% L3 NoV GI 84% NT NT NT NT NT NT 69% 77% 77% 56% 66%(range 48% 84% 88% 49% 61% 93% - 99) Avg61%: 90%69% 44 68% 100% 149% 105% 97% 87% 63% 83% 145% 139% 141% 120% 128% Avg : 79% (range 10 - 149) 81% 70% 76% 87% 73% 10% 87% 98% 100% 66% 53% 10% 96% Avg : 101% (range 50 - 165) 86% 53% 109% 50% 83% 111% 86% 81% 153% 77% 99% 147% 163% 165% 112% 68% 96% 80% 105% 88% 129% 118% 153% 94% 105% 106% 102% 110% 82% 52% 87% 89% 45% 99% 80% 100% 29% 40% 81% 87% 107% 90% 66% 91% 101% 94% 105% 82% 71% 27% 44% 56% 87% 27% 94% 109% 125% 90% 132% 100% 130% 108% 97% 103% 105% 106% 121% 102% 102% 112% 108% 115% 103% 104% 63% Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA25 PCR su matrici alimentari alimentari: estrazione degli AN • Utilizzo di un controllo esterno di amplificazione ((RNA di sintesi)) • Calcolo dell’efficienza di amplificazione, p valutazione dell’efficacia del processo di estrazione degli acidi nucleici e rimozione degli inibenti Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA26 PCR su matrici alimentari: amplificazione Varianti genetiche Livelli di contaminazione Amplificazione ((inclusività e sensibilità)) Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA27 Metodi di PCR adottati per la determinazione d i i di virus i enterici i i neii molluschi ll hi PubMed review (2010): • • • • • • • • • NoV HAV Enteric viruses Enterovirus Adenovirus Rotavirus Astrovirus HEV Aichivirus 70 55 46 36 14 14 11 2 1 > Scelta real-time real- > Definizioni regioni da amplificare Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA28 GIII GI GII Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA29 Retrotrascrizione e PCR: one-step q p TaqMan probes: FAM-TAMRA ((NoV)) GI - GII FAM-MGB (HAV) NoV 5’VPG ORF 1 NV Proteine non strutturali (hel-prot-polimerasi) ORF 2 Proteina capsidica Istituto Superiore di Sanità - Roma ORF 3 AAA3’ Proteina strutturale DSPVSA30 PCR su matrici alimentari: amplificazione • > primers/probe pubblicati • > inclusività (sulle varianti) DSPVSA Istituto Superiore di Sanità - Roma 31 PCR su matrici alimentari: amplificazione > primers/probe pubblicati > inclusività (sulle varianti) > esclusività (altri virus – incluso controllo di processo – flora microbica) > LOD (kit per analisi clinica vs. analisi su alimenti) Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA32 PCR per la ricerca/quantizzazione di virus in matrici alimentari: kfl t d analitico liti workflow metodo Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA33 NoV Controllo processo Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA34 Efficienza di estrazione: controllo di processo Caratteristiche: - Virus coltivabile - Caratteristiche strutturali simili al target - Non presente naturalmente nella matrice - Assenza di interferenza nelle PCR Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA virus virus process control Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA36 Controllo di p processo / recupero p • 5 l campione vs. 5 l virus CP Ct = Ct camp – Ct virus CP R = 2-Ct x d Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA process control recupero dal campione Stima della quantità di virus nel campione Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA38 Efficienza di estrazione NA: controllo di inibizione Caratteristiche: q target g - Sequenza - Acidi nucleici di sintesi (puri) - Quantizzato/quantizzabile Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA plasmide con nserto d di ssintesi ntes inserto promotore RNA polimerasi estrazione del plasmide con inserto coltura trasformazione E. coli Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA sito di taglio enzimaico i i linearizzazione del plasmide standard a RNA trascrizione in vitro seq a RNA digestione g DNA quantizzazione spettrofotometrica Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA virus virus process control Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA42 Controllo di inibizione / efficienza di PCR • 5 l campione • + • 1 l RNA RNA-EC EC vs. 5 l H2O + 1 l RNA RNA-EC EC Ct = Ct camp – Ct stand E = 2-Ct Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA virus efficienza della PCR Stima della quantità di virus nel campione Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA44 Determinazione del target Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA virus virus process control Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA46 virus virus virus process control numero di copie del target analizzato + efficienza della PCR + recupero dal campione Stima della quantità di virus nel campione Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA47 ASSESSMENT OF SHELLFISH VIRAL CONTAMINATION IN ITALY: QUALITATIVE AND QUANTITATIVE DATA VENETO (Northern Adriatic sea) Year Species n HAV (%) NoV (%) † 2008‐2009 Tapes Mytilus Crassostrea 24 23 23 (70) 0 0 0 11 (45.8) 14 (60.9) 11 (45.8) (51 4) (51.4) † NoV results are considered as “presence of either GI or GII” copies/g † Mytilus (n=14) Tapes (n=11) Crassostrea (n=11) MIN 4,8E+01 * 1,4E+01 * 1,5E+02 MAX 3,1E+04 1,4E+05 2,2E+04 geom MEAN 1,8E+03 4,9E+03 2,0E+03 4,7E+01 ‐ 1,1E+04 3,3E+02 ‐ 7,4E+04 4,2E+02 ‐ 9,6E+03 range (geom mean±DS) (geom mean±DS) † NoV results are considered as “sum of GI and GII”; * estimated values (LOQ GI: 175-260 copies/g; LOQ GII: 120-180 copies/g) Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA48 ASSESSMENT OF SHELLFISH VIRAL CONTAMINATION IN ITALY: QUALITATIVE AND QUANTITATIVE DATA GULF OF NAPLES (Thyrrenian sea) Year Species 2007‐2010 Mytilus M til Mytilus Mytilus others ‐ class A ‐ class l B ‐ retailers * ‐ retailers * n NoV (%) † 58 59 19+16 7+4 (=163) 13 (22.4) 47 (79 7) 47 (79.7) 27 (77.1) 7 (63.6) † NoV results are considered as “presence of either GI or GII”; * registered + street vendors Years 2009 Years 2009‐‐2010 copies/g † Mytilus M til ‐ cl.A lA (n=6) Mytilus M til ‐ cl.B lB (n=21) Mytilus y ‐ retailers (n=25) th ‐ retailers t il others (n=6) MIN 3,6E+01 * 3,8E+01 * 1,0E+01 * 2,8E+01 * MAX 7,4E+02 1,3E+05 2,4E+06 1,6E+04 geom MEAN 2,0E+02 3,4E+03 4,8E+03 1,7E+03 1,4E+01 ‐ 7,8E+02 2,1E+01 ‐ 4,3E+04 2,6E+01 ‐ 6,4E+04 2,0E+01 ‐ 1,5E+04 range (geom mean±DS) (geom mean±DS) † NoV results are considered as “sum of GI and GII” * estimated values (LOQ GI: 175‐260 copies/g; LOQ GII: 120‐180 copies/g) Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA49 ASSESSMENT OF SHELLFISH VIRAL CONTAMINATION IN ITALY: QUALITATIVE AND QUANTITATIVE DATA OUTBREAKS La Spezia Time NoV days copies/g † batch 28.12.2012 0 5,2E+03 b h batch 09.01.2013 +11 5,9E+03 batch 13.02.2013 +46 2,9E+03 batch 26.02.2013 +59 5,3E+02 Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA50 Istituto Superiore di Sanità - Roma DSPVSA51
