ORMONI STEROIDEI SIERICI in LC/MS – Codice LC72310

ORMONI STEROIDEI SIERICI in LC/MS – Codice LC72310
(17-OH-Progesterone, Deidroepiandrosterone (DHEA), Deidroepiandrosterone solfato (DHEAS),
Androstenedione, Cortisolo, 11-Deossicortisolo, Corticosterone, Aldosterone, Testosterone,
Diidrotestosterone, Androsterone, Estrone, Estradiolo, Pregnenolone, 17-OH-Pregnenolone,
Progesterone, 11-Deossicorticosterone)
INTRODUZIONE
Ormoni e meccanismi dell'azione ormonale
Il termine “ormone” indica una sostanza che, prodotta da una cellula endocrina, cioè a secrezione interna,
viene liberata nel circolo sanguigno, provocando risposte funzionali in cellule localizzate a varia distanza
dalla sua sede di produzione. Per l'espletamento dell'azione ormonale sono necessari, oltre alla sintesi e alla
secrezione, il trasporto nel circolo sanguigno e la destinazione nei tessuti bersaglio dove sono presenti i
recettori, strutture specializzate che riconoscono lo stimolo specifico e ne traducono il messaggio.
I recettori possono essere sulla membrana della cellula o all'interno di essa; l'ormone che non può
attraversare la membrana (per es., un peptide) si lega a recettori localizzati sulla membrana plasmatica,
mentre quello che diffonde attraverso la membrana plasmatica all'interno della cellula (steroidi, iodotironine)
si lega a recettori intracellulari (in genere situati nel nucleo). Indipendentemente dalla struttura e dal tipo di
ormone, i recettori hanno caratteristiche comuni: tutti presentano una regione in grado di riconoscere e
legare l'ormone e un'altra deputata alla generazione di un segnale intracellulare che traduce il messaggio
ormonale in risposte funzionali della cellula bersaglio; anche le proprietà che regolano il legame dell'ormone
(affinità, specificità, saturabilità, capacità di trasduzione, cioè di evocare effetti specifici) sono comuni per tutti
i recettori.
La comunicazione affidata agli ormoni avviene per la maggior parte attraverso il circolo ematico (azione
endocrina), ma, in parte minore, anche mediante altre modalità. Alcuni ormoni agiscono infatti sulle cellule
immediatamente circostanti la cellula che li produce (azione paracrina); in altre evenienze, invece,
interagiscono con la stessa cellula secretrice (azione autocrina); altri ormoni, infine, vengono prodotti dai
neuroni del sistema nervoso (azione neurocrina, che in realtà rappresenta una forma specializzata di azione
paracrina). Sono stati identificati più di cinquanta ormoni, le cui caratteristiche funzionali vengono
determinate dalla diversa struttura molecolare. In base a questa, essi vengono suddivisi in quattro grandi
categorie: proteine e peptidi; steroidi; derivati dagli amminoacidi; derivati dagli acidi grassi polinsaturi.
Gli ormoni, interagendo con i recettori localizzati a livello dei tessuti bersaglio, evocano risposte specifiche:
regolano le attività enzimatiche, l'espressione genica e la sintesi delle proteine.
Classificazione ormoni steroidei
Sono liposolubili, diffondono liberamente all'interno della cellula ed esercitano la loro azione dopo essersi
legati a recettori localizzati nel nucleo. La loro struttura chimica, che è policiclica, deriva dal colesterolo.
Sono suddivisi, in base alla sede di produzione, in steroidi gonadici e surrenalici; vengono inclusi in questa
categoria anche la vitamina D e i suoi analoghi. Gli ormoni steroidei prodotti dal surrene e dalle gonadi si
dividono in sottogruppi in base al numero di atomi di carbonio del nucleo steroideo: il progesterone, i
glucocorticoidi e i mineralcorticoidi derivano per sintesi successive dal pregnano, una sostanza semplice che
contiene 21 atomi di carbonio, mentre gli estrogeni provengono dal nucleo dell'estrano che ha 18 atomi di
carbonio, e gli androgeni dal nucleo dell'androstano, che contiene 19 atomi di carbonio.
1
La sintesi degli ormoni steroidei segue tappe biosintetiche identiche sia nel surrene sia nell'ovaio o nel
testicolo e la differenziazione nelle tre ghiandole endocrine dipende da una diversa distribuzione tessutospecifica degli enzimi di sintesi. La steroidogenesi passa attraverso una serie di tappe enzimatiche, in
massima parte catalizzate dagli enzimi citocromo P450 (cP450) localizzati all'interno delle cellule, e inizia
dalla trasformazione del colesterolo in pregnenolone. Questa tappa enzimatica è la più importante in quanto
controlla la sintesi di tutti gli ormoni steroidei; anche in presenza di notevoli quantità di colesterolo, la
possibilità di proseguimento della via biosintetica appare limitata, poiché dipende dall'attività dagli enzimi
cP450. Il pregnenolone formato fuoriesce dal mitocondrio e viene trasferito sul reticolo endoplasmatico, dove
subisce le successive modificazioni enzimatiche da parte dei cP450. Il pregnenolone è quindi il precursore
comune dei principali ormoni steroidei.
Gli androgeni vengono sintetizzati dalle cellule di Leydig del testicolo, dalla zona reticolare del surrene e
dalle cellule della teca del follicolo e dall'interstizio dell'ovaio. La via biosintetica che procede dal
pregnenolone segue due possibili direzioni: la prima via consiste nella trasformazione del pregnenolone in
17-idrossipregnenolone, di questo in deidroepiandrosterone, quindi in androstenediolo, e infine in
testosterone, che è il principale ormone maschile. La seconda via consiste nella trasformazione del
pregnenolone in progesterone, di questo in 17-idrossiprogesterone e quindi nella formazione di
androstenedione, a sua volta successivamente trasformato in testosterone. In alcuni tessuti il testosterone
necessita di un'ulteriore reazione di trasformazione in 5α-diidrotestosterone per esplicare la sua attività. Nel
surrene dove, rispetto al testicolo, vi è una diversa distribuzione degli enzimi che catalizzano queste vie
biosintetiche, la maggior parte della produzione di androgeni surrenali è diretta verso l'elaborazione di
precursori del testosterone e, in maniera particolare, di deidroepiandrosterone e androstenedione, che
hanno un'attività ormonale di più modesta entità. Circa il 50% del pregnenolone metabolizzato nella
corteccia surrenale viene convertito in deidroepiandrosterone.
Gli estrogeni e il progesterone, i principali ormoni femminili, sono gli steroidi prodotti in maggiore quantità
dall'ovaio e sono coinvolti nella regolazione del ciclo mestruale e nella gravidanza. La formazione di questi
steroidi deriva da tappe enzimatiche diversificate nei compartimenti cellulari dell'ovaio: follicoli e cellule
interstiziali. Le cellule della granulosa, che contornano l'ovulo nel contesto del follicolo, subiscono la
trasformazione in cellule luteiniche dopo l'ovulazione e il prodotto della trasformazione del pregnenolone è
rappresentato dal progesterone. Le cellule della teca del follicolo e quelle interstiziali producono in
prevalenza androstenedione attraverso le vie biosintetiche che sono già state descritte per gli androgeni.
Anche le tappe enzimatiche coinvolte nel successivo destino metabolico dell'androstenedione hanno una
caratteristica localizzazione cellulare: infatti il testosterone è sintetizzato solamente nelle cellule dell'ilo,
mentre all'interno delle cellule della granulosa l'androstenedione viene trasformato in testosterone e a sua
volta in estrone e estradiolo. Le cellule interstiziali hanno anche la capacità di trasformare il testosterone in
diidrotestosterone.
2
Al contrario degli ormoni peptidici, la secrezione degli steroidi in circolo non procede attraverso un loro
immagazzinamento all'interno delle cellule ma segue immediatamente la sintesi. Essi viaggiano nel plasma
legati a proteine di trasporto specifiche, dotate di alta affinità, quali la globulina legante il cortisolo (CBG,
Cortisol binding protein), le globuline leganti gli steroidi sessuali (SHBG, Sex hormone binding protein) e la
proteina legante la vitamina D (DBP, Vitamin D binding protein). La CBG è una glicoproteina in grado di
legare con uguale affinità cortisolo e progesterone. Le SHGB sono globuline che legano con elevata affinità
il testosterone, mentre l'estradiolo è legato in prevalenza all'albumina. Il 98% degli steroidi gonadici, il 95%
del cortisolo e il 50% dell'aldosterone circolano legati alle rispettive proteine di trasporto. Poiché solo
l'ormone libero è in grado d'interagire con i recettori, e quindi di esprimere l'attività biologica, il legame
plasmatico costituisce un'importante fase di riserva nel metabolismo di questi ormoni. Gli steroidi sintetici
impiegati in terapia solitamente non contraggono legame con le proteine di trasporto e sono quindi in grado
di esercitare effetti biologici immediati. I glucocorticoidi e i mineralcorticoidi vengono metabolizzati attraverso
reazioni enzimatiche che determinano la perdita della loro attività ormonale oppure attraverso coniugazione
con gruppi chimici che li rendono idrosolubili e ne determinano l'eliminazione con le urine. L'unica reazione
metabolica che non si traduce in una perdita dell'attività biologica è rappresentata dalla conversione del
testosterone in diidrotestosterone nelle cellule bersaglio. *
*Bibliografia
Enciclopedia della Scienza e della Tecnica (2007)
Andreani, Cassano 1977: Andreani, Domenico - Cassano, Cataldo, Trattato italiano di endocrinologia, Roma, SEU,
1977.
Becker 1995: Becker, Kenneth L., Principles and practice of endocrinology and metabolism, 2. ed., Philadelphia,
Lippincott, 1995 (1. ed.: 1990).
Faglia 1998: Faglia, Giovanni, Malattie del sistema endocrino e del metabolismo, 2. ed., Milano, McGraw-Hill, 1998
(1. ed.: 1993).
Felig 1995: Felig, Philip - Baxter, John D. - Frohman, Lawrence A., Endocrinology and metabolism, 3. ed., New York,
McGraw-Hill, 1995 (1. ed.: 1981).
Giusti, Serio 1988: Giusti, Giorgio - Serio, Mario, Endocrinologia, fisiopatologia e clinica, Firenze, USES, 1988.
Pinchera 1991: Pinchera, Aldo e altri, Endocrinologia e metabolismo. Fisiopatologia e clinica, Milano, Ambrosiana,
1991.
Williams 1998: Williams, Robert H., Williams textbook of endocrinology, 9. ed., edited by Jean D. Wilson e altri,
Philadelphia-London, Saunders, 1998 (1. ed.: 1950).
3
Schema della via biosintetica
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Questo prodotto adempie a tutte le esigenze della Direttiva 98/79/CE del 27/10/1998 e del Dl.ivo n.332 del 08/09/2000 sui
dispositivi medico-diagnostici in vitro (IVD). La dichiarazione di conformità CE è disponibile su richiesta.
Release N° 004
Ormoni steroidei sierici in LC/MS
4
Febbraio 2015
CARATTERISTICHE DEL METODO
Principio del Metodo:
Gli Ormoni steroidei vengono deproteinizzati con un opportuno reagente contenente lo standard interno, centrifugati,
essiccato il surnatante che poi viene ripreso con opportuna soluzione prima di venire iniettato in LC/MS.
Recupero del Metodo :
100%
Sensibilità del Metodo (LLOD) : 17-OH-Progesterone
Androstenedione
DHEAS
DHEA
Testosterone
Cortisolo
Corticosterone
Aldosterone
11-Deossicortisolo
Diidrotestosterone
Androsterone
Estrone
Estradiolo
Pregnenolone
17-OH-Pregnenolone
Progesterone
11-Deossicorticosterone
Sensibilità del Metodo (LLOQ) :
Range di Linearità :
ESI
17-OH-Progesterone
Androstenedione
DHEAS
DHEA
Testosterone
Cortisolo
Corticosterone
Aldosterone
11-Deossicortisolo
Diidrotestosterone
Androsterone
Estrone
Estradiolo
Pregnenolone
17-OH-Pregnenolone
Progesterone
11-Deossicorticosterone
17-OH-Progesterone
Androstenedione
DHEAS
DHEA
Testosterone
Cortisolo
Corticosterone
Aldosterone
11-Deossicortisolo
Diidrotestosterone
Androsterone
Estrone
Estradiolo
Pregnenolone
17-OH-Pregnenolone
Progesterone
11-Deossicorticosterone
5
0,005 ng/ml ESI
0,005 ng/ml ESI
10 ng/ml ESI
0,05 ng/ml ESI
0,002 ng/ml ESI
0,005 ng/ml ESI
0,05 ng/ml APCI
0,01 ng/ml APCI
0,007 ng/ml ESI
0,03 ng/ml APCI
0,05 ng/ml APCI
0,03 ng/ml ESI
0,01 ng/ml APCI
0,02 ng/ml ESI
0,02 ng/ml APCI
0,002 ng/ml ESI
0,007 ng/ml ESI
0,02 ng/ml
0,016 ng/ml
15 ng/ml
0,1 ng/ml
0,006 ng/ml
0,015 ng/ml
0,036 ng/ml
0,02 ng/ml
0,02 ng/ml
0,08 ng/ml
0,13 ng/ml
0,01 ng/ml
0,01 ng/ml
0,06 ng/ml
0,06 ng/ml
0,005 ng/ml
0,02 mg/ml
APCI
17-OH-Progesterone
Androstenedione
DHEAS
DHEA
Testosterone
Cortisolo
Corticosterone
Aldosterone
11-Deossicortisolo
Diidrotestosterone
Androsterone
Estrone
Estradiolo
Pregnenolone
17-OH-Pregnenolone
Progesterone
11-Deossicorticosterone
0,02 – 570 ng/ml ESI
0,016 - 1060 ng/ml ESI
0,15 – 852.900 ng/ml ESI
0,1 - 500 ng/ml ESI
0,006 - 260 ng/ml ESI
0,015 – 3.020 ng/ml ESI
0,16 – 3.020 ng/ml APCI
0,04 – 560 ng/ml APCI
0,02 – 250 ng/ml ESI
0,08 – 1.630 ng/ml APCI
0,13 – 2.200 ng/ml APCI
0,01 - 510 ng/ml ESI
0,03 - 510 ng/ml APCI
0,06 - 64 ng/ml ESI
0,06 - 250 ng/ml APCI
0,005 – 4.000 ng/ml ESI
0,02 – 6.000 ng/ml ESI
0,08 ng/ml
0,05 ng/ml
35 ng/ml
0,27 ng/ml
0,04 ng/ml
3,5 ng/ml
0,16 ng/ml
0,04 ng/ml
0,07 ng/ml
0,08 ng/ml
0,13 ng/ml
0,1 ng/ml
0,03 ng/ml
0,06 ng/ml
0,06 ng/ml
0,5 ng/ml
0,23 mg/ml
ANALITA
Precisione intra-giorno
Precisione inter-giorno
(CV%)
(CV %)
Calibratore
Calibratore
Inferiore Medio Superiore Inferiore Medio Superiore
17-OH-Progesterone ESI
Androstenedione ESI
DHEAS ESI
DHEA ESI
Testosterone ESI
Cortisolo ESI
Corticosterone APCI
Aldosterone APCI
11-Deossicortisolo ESI
Diidrotestosterone APCI
Androsterone APCI
Estrone ESI
Estradiolo APCI
Pregnenolone ESI
17-OH-Pregnenolone APCI
Progesterone ESI
11-Deossicorticosterone ESI
10,6%
5,7%
9,1%
10,2%
4,7%
2,3%
7,3%
11,0%
11,4%
8,7%
14,5%
3,5%
9,3%
12,8%
9,3%
5,9%
10,1%
4,5%
5,1%
8,4%
3,3%
2,1%
2,0%
8,0%
4,2%
6,0%
7,0%
3,1%
2,2%
3,9%
7,8%
6,3%
3,9%
4,5%
3,7%
4,6%
4,0%
1,3%
3,6%
0,8%
4,4%
3,5%
4,9%
1,8%
2,8%
1,4%
3,0%
5,1%
1,0%
2,2%
4,3%
9,0%
8,2%
9,2%
11,5%
5,2%
9,0%
8,1%
13,2%
12,4%
11,1%
17,4%
3,0%
7,8%
11,6%
8,0%
5,9%
11,9%
ANALITA
R2
17-OH-Progesterone ESI
Androstenedione ESI
DHEAS ESI
DHEA ESI
Testosterone ESI
Cortisolo ESI
Corticosterone APCI
Aldosterone APCI
11-Deossicortisolo ESI
Diidrotestosterone APCI
Androsterone APCI
Estrone ESI
Estradiolo APCI
Pregnenolone ESI
17-OH-Pregnenolone APCI
Progesterone ESI
11-Deossicorticosterone ESI
0,9979 + 0,0026
0,9943 + 0,0007
0,9967 + 0,0004
0,9952 + 0,0003
0,9980 + 0,0007
0,9932 + 0,0064
0,9968 + 0,0020
0,9970 + 0,0014
0,9971 + 0,0004
0,9957 + 0,0034
0,9962 + 0,0026
0,9972 + 0,0016
0,9946 + 0,0049
0,9951 + 0,0051
0,9986 + 0,0016
0,9981 + 0,0001
0,9926 + 0,0086
6
4,8%
6,1%
6,8%
6,1%
4,8%
3,9%
7,9%
7,7%
5,0%
5,9%
3,8%
3,5%
6,5%
9,1%
6,3%
4,1%
7,6%
3,9%
6,3%
3,3%
5,3%
3,0%
1,4%
4,1%
3,2%
4,5%
3,5%
2,8%
2,4%
2,7%
4,5%
2,4%
3,3%
6,7%
ANALITA
Accuratezza intra-giorno Accuratezza inter-giorno
(Errore %)
(Errore %)
Calibratore
Calibratore
17-OH-Progesterone ESI
Androstenedione ESI
DHEAS ESI
DHEA ESI
Testosterone ESI
Cortisolo ESI
Corticosterone APCI
Aldosterone APCI
11-Deossicortisolo ESI
Diidrotestosterone APCI
Androsterone APCI
Estrone ESI
Estradiolo APCI
Pregnenolone ESI
17-OH-Pregnenolone APCI
Progesterone ESI
11-Deossicorticosterone ESI
ANALITA
17-OH-Progesterone ESI
Androstenedione ESI
DHEAS ESI
DHEA ESI
Testosterone ESI
Cortisolo ESI
Corticosterone APCI
Aldosterone APCI
11-Deossicortisolo ESI
Diidrotestosterone APCI
Androsterone APCI
Estrone ESI
Estradiolo APCI
Pregnenolone ESI
17-OH-Pregnenolone APCI
Progesterone ESI
11-Deossicorticosterone ESI
Basso
Alto
Basso
Alto
16,4%
8,1%
12,9%
9,0%
7,3%
5,4%
7,4%
7,1%
4,5%
7,0%
6,5%
6,4%
6,8%
9,9%
4,6%
4,4%
11,3%
7,6%
2,8%
4,0%
3,9%
4,1%
2,2%
5,3%
3,8%
3,1%
4,7%
3,9%
3,6%
4,5%
3,1%
4,0%
2,6%
4,6%
13,7%
11,0%
13,6%
9,0%
7,6%
6,5%
11,2%
10,2%
5,1%
7,0%
12,9%
6,8%
8,6%
12,1%
6,9%
4,3%
11,5%
7,8%
7,1%
4,2%
5,5%
4,4%
2,7%
5,3%
5,1%
3,9%
2,9%
5,5%
4,2%
5,1%
4,5%
4,2%
4,0%
5,6%
Concentrazioni utilizzate per calcolare Precisione e Accuratezza
Calibratore (ng/ml)
Inferiore
Basso
Medio
Alto
Superiore
0,08
0,05
37,2
0,27
0,09
3,7
0,18
0,04
0,07
0,08
0,13
0,03
0,03
0,06
0,06
3,0
0,23
0,09
0,1
96,2
0,71
0,1
5,7
0,4
0,05
0,14
0,2
0,2
0,07
0,06
0,07
0,18
5,8
0,7
1,3
0,8
550,5
5,7
1,0
45,4
2,5
0,5
0,9
1,2
1,9
0,4
0,4
0,33
1,1
42,0
5,0
7,1
4,1
2.978,6
21,6
6,8
305,6
15,7
3,3
7,2
6,6
10,5
2,5
2,8
1,24
5,5
260,1
28,0
15,5
10,6
8.529,0
51,0
13,9
618,7
30,2
5,6
16,5
16,3
22,2
5,1
5,1
2,1
16,8
402,3
60,0
7
Contenuto della confezione (50 tests) :
Tutti i reagenti sono pronti all'uso e stabili 3 anni a 2–8 °C.
Reagente A – Soluzione Deproteinizzante, 2 x 25 ml
Reagente B – Soluzione Standard Interni, 1 x 500 µl
Stoccare a –20 °C
Vedere Avvertenze
Reagente C – Soluzione Diluente, 1 x 3 ml
Reagente D1 – Calibratore liofilo sierico – Livello 1, 1 x 1 ml
Vedi Avvertenze
Reagente D2 – Calibratore liofilo sierico – Livello 2, 1 x 1 ml
Vedi Avvertenze
Reagente D3 – Calibratore liofilo sierico – Livello 3, 1 x 1 ml
Vedi Avvertenze
Reagente D4 – Calibratore liofilo sierico – Livello 4, 1 x 1 ml
Vedi Avvertenze
Reagente D5 – Calibratore liofilo sierico – Livello 5, 1 x 1 ml
Vedi Avvertenze
Reagente D6 – Calibratore liofilo sierico – Livello 6, 1 x 1 ml
Vedi Avvertenze
Reagente M1 – Fase Mobile M1, 1 x 500 ml
Reagente M2 – Fase Mobile M2, 2 x 500 ml
Dotazione strumentale minima richiesta :
Strumento LC-MS triplo quadrupolo ESI+ e/o APCI a
seconda delle molecole che si necessita analizzare
Evaporatore a centrifuga
Modalità per il prelievo ematico :
Prelevare 3 ml di sangue venoso in una provetta con
EDTA come anticoagulante. Centrifugare a 4000 rpm
per 5 minuti. Separare il plasma e stoccarlo a – 20
°C. Stabile 4 settimane.
8
PROCEDURA ANALITICA
IMPORTANTE: NON VANNO USATE PROVETTE O VIALS DI VETRO DURANTE NESSUNO
STEP PREPARATIVO.
FASE 1 : Ricostituzione del Reagente Deproteinizzante

Aggiungere al Reagente A – Sol. Deproteinizzante 250 µl di Reagente B – Sol. Standard interno
(Stabile 3 mesi a - 20 °C)
FASE 2 : In provette eppendorf dispensare in sequenza.
Calibratore
Reagente D1-D6 –
Calibratore
Campione
Controlli
Reagente A – Soluzione
Deproteinizzante (come
ricostituito nella Fase 1)
Campione
Controlli
400 µl
400 µl
1000 µl
1000 µl
400 µl
1000 µl
Deproteinizzare direttamente sul vortex per 10 secondi
FASE 3 : Centrifugare a 14.000 giri per 10 minuti.
FASE 4 : Prelevare il surnatante e portare a secco con l’ausilio di un evaporatore (temperatura massima 55
°C) (stabile 1 mese a – 20 °C)
FASE 5 : Aggiungere nelle eppendorf portate a secco 50 µl di Reagente C – Soluzione Diluente
Vortex per 20 secondi
FASE 6 : Centrifugare a 14.000 giri per 5 minuti.
FASE 7 : Trasferire il surnatante in vial in polipropilene da 250 µl
INIEZIONE :

Iniettare 15 µl della soluzione nel sistema LC
N.B: il campione è stabile 2 giorni a 2-8 °C.
Release N° 004
Ormoni steroidei sierici in LC/MS
9
Febbraio 2015
ORMONI STEROIDEI - Avvertenze
REAGENTE D1-D2-D3-D4-D5-D6 : CALIBRATORI LIOFILI Lot. 006
17-OH-PROGESTERONE (ng/ml)
ANDROSTENEDIONE (ng/ml)
DHEAS (ng/ml)
DHEA (ng/ml)
TESTOSTERONE (ng/ml)
CORTISOLO (ng/ml)
CORTICOSTERONE (ng/ml)
ALDOSTERONE (ng/ml)
11-DEOSSICORTISOLO (ng/ml)
DIIDROTESTOSTERONE (ng/ml)
ANDROSTERONE (ng/ml)
ESTRONE (ng/ml)
ESTRADIOLO (ng/ml)
PREGNENOLONE (ng/ml)
17-OH-PREGNENOLONE (ng/ml)
PROGESTERONE (ng/ml)
11-DEOSSICORTICOSTERONE
(ng/ml)
Modalità d’uso e Ricostituzione: i
Calibratori devono essere usati per
calibrare il sistema LC. Aggiungere
esattamente 1 ml di H2O di grado
HPLC e agitare delicatamente per
30 min. fino a quando tutto il
materiale non è dissolto. Prima del
campionamento
rimescolare
gentilmente
per
assicurarne
l’omogeneità.
Conservazione e stabilità: i
Calibratori sono stabili 36 mesi se
conservati a 2-8 °C. Una volta
ricostituiti 7 giorni se conservati a 2
– 8 °C e 6 mesi a – 20 °C. Non
usarli dopo la data di scadenza.
Confezionamento : 6 x 1 ml
Precauzioni: questo calibratore in
matrice umana deve essere trattato
con cura e considerato come
potenzialmente infettivo.
LIVELLO 1
LIVELLO 2
LIVELLO 3
LIVELLO 4
LIVELLO 5
LIVELLO 6
0,08
0,05
37,2
0,27
0,09
3,7
0,18
0,04
0,07
0,08
0,13
0,01
0,03
0,06
0,06
3,0
0,23
0,76
0,45
499,9
4,5
0,74
33,6
1,65
0,3
0,6
0,9
1,37
0,09
0,3
0,19
0,75
30,0
3,3
1,3
0,8
558,5
5,7
1,0
45,4
2,5
0,5
0,9
1,2
1,9
0,16
0,4
0,33
1,1
42,0
5,0
2,7
2,1
1.585,3
11,9
2,6
114,7
6,2
1,0
2,5
3,1
5,1
0,4
1,1
0,64
2,7
110,0
11,6
5,7
4,3
3.472,3
20,2
5,4
244,0
11,9
2,5
6,0
5,6
7,6
0,8
2,0
1,16
5,3
213,7
26,0
15,5
10,6
8.529,0
51,0
13,9
618,7
30,2
5,6
16,5
16,3
22,2
2,1
5,1
2,1
16,8
402,3
60,0
10
REAGENTE B – SOLUZIONE STANDARD INTERNI:
Soluzione contenente: Aldosterone-d7, Cortisolo-d4, Testosterone-d3. Stoccare a – 20 °C.
Ormoni:
Standard interno da utilizzare per la calibrazione:
ANDROSTENEDIONE
DHEAS
DHEA
TESTOSTERONE
DIIDROTESTOSTERONE
ANDROSTERONE
ESTRONE
ESTRADIOLO
PROGESTERONE
11-DEOSSICORTICOSTERONE
CORTICOSTERONE
Testosterone-d3
Testosterone-d3
Testosterone-d3
Testosterone-d3
Testosterone-d3
Testosterone-d3
Testosterone-d3
Testosterone-d3
Aldosterone-d7
Aldosterone-d7
Aldosterone-d7
ALDOSTERONE
11-DEOSSICORTISOLO
PREGNENOLONE
17-OH-PREGNENOLONE
CORTISOLO
17-OH-PROGESTERONE
Aldosterone-d7
Cortisolo-d4
Cortisolo-d4
Cortisolo-d4
Cortisolo-d4
Cortisolo-d4
CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA
Installare la colonna analitica nuova RRHD Eclipse Plus C18 (50 x 2,1 mm, 1,8 um), termostatata a 90
°C Disconnettere il detector e far passare una soluzione di Acetonitrile : Acqua (95 : 5 v/v) al flusso di
600 ul / minuto per 15 minuti. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Condizionare la colonna con una
soluzione di Fase Mobile M1 : Acqua (85 : 15 v/v) al flusso di 600 ul / minuto per 15 minuti. Effettuare
due iniezioni di Acqua di grado HPLC prima di procedere con la serie analitica.
NON è possibile effettuare analisi a ricircolo di fase.
Se la T Amb del Laboratorio è  25°C si consiglia di conservare a 2-8°C la Fase Mobile fra una seduta
analitica e l’altra.
PULIZIA DELLA COLONNA
Lavare con una soluzione contenente Fase Mobile M2 : Acqua (95 : 5 v/v) al flusso di 600 ul / minuto
per 15 minuti. La colonna va stoccata in una soluzione contenente Fase Mobile M2 : Acqua (95 : 5 v/v).
LAVAGGIO AGO DI INIEZIONE
Lavare con una soluzione contenente Metanolo.
11
PARAMETRI SETTATI SU TRIPLO QUADRUPOLO AGILENT 6460
Parametri ESI 6460
Gas Temperature 290 °C
Gas Flow 11 L/min
Nebulizer 60 psi
Sheath Gas Heater 400 °C
Sheath Gas Flow 12 L/min
Capillary 4500 V
Parametri APCI 6460
Gas Temperature 325 °C
APCI heater 500 °C
Gas Flow 8 L/min
Nebulizer 40 psi
Capillary 4500 V
SETTAGGIO DEI FLUSSI
GRADIENTE
Tempo (min)
% M1 (POMPA A)
% M2 (POMPA B)
Flusso (µl/min)
0
85
15
600
0.25
85
15
600
0.50
75
25
600
1.70
71.5
28.5
600
3.80
60
40
600
4.20
50
50
600
5.00
5
95
600
5.50
5
95
600
5.60
85
15
600
7.00
85
15
600
12
Frammentazioni (ottimizzate su TRIPLO QUADRUPOLO AGILENT 6460)
Analita
17-OH-Progesterone *
Androstenedione
DHEAS**
DHEA**
Cortisolo
11-Deossicortisolo
Testosterone
Corticosterone
Aldosterone
Diidrotestosterone
Androsterone
Estrone**
Estradiolo
Pregnenolone
17-OH-Pregnenolone
Progesterone
11-Deossicorticosterone*
Q1
Q3
331
109
271,1
109
271,1
253
271,1
253
363,1
105,1
347,1
109
289,1
97
347,1
97,1
361,1
109
273,1
255
273,1
161
271,1
253
255
159,1
299,1
85,1
297,1
105,1
315,1
97
331
97
ENERGIA DI
COLLISIONE
32
20
8
8
44
28
25
36
40
8
20
8
16
8
36
20
28
* ** LE MOLECOLE CONTRASSEGNATE DALLO STESSO NUMERO DI ASTERISCHI HANNO LE
MEDESIME TRANSIZIONI, PERTANTO VA POSTA ATTENZIONE AI TEMPI DI RITENZIONE
ACCESSORI E CONSUMABILI
CODICE
DESCRIZIONE
CONFEZIONE
LC72316
Calibratore sierico per Ormoni Steroidei
LC72317
Controllo sierico per Ormoni Steroidei – Livello 1
5 x 1 ml
LC72318
Controllo sierico per Ormoni Steroidei – Livello 2
5 x 1 ml
LC72319
Controllo sierico per Ormoni Steroidei – Livelli 1 e 2
SK72310
Starter kit Ormoni Steroidei
Z959757902
S29057U
S24722
6 x 2 x 1 ml
2 x 5 x 1 ml
1 Pz
Colonna analitica RRHD Eclipse Plus C 18 (50 x 2.1 mm. 1.8 um)
1 Pz
Vial di vetro da 2 ml con tappo a vite
1 x 100 Pz
Riduttori di volume in polipropilene per vials da 2 ml
1 x 100 Pz
13
BIBLIOGRAFIA:
Quantification of corticosteroids in human plasma by liquid chromatography-thermospray mass
spectrometry using stable isotope dilution
Hiromi Shibasaki, Takashi Furuta, Yasuji Kasuya
Steroid Hormone Analysis by Tandem Mass Spectrometry
Steven J. Soldin and Offie P.Soldin
Quantification of anabolic hormones and their metabolites in bovine serum and urine by liquid
chromatography-tandem mass spectroscophy
R. Draisci, L. Palleschi, E. Ferretti, L.Lucentini, P. Cammarata
Identification of ten corticosteroids in human hair by liquid chromatography-ionspray mass
spectrometry
V. Cirimele, P.Kintz, J.P. Goullè, B. Ludes
A Confirmatory HPLC-MS/MS Method for Ten Synthetic Corticosteroids in Bovine Urines, JOURNAL
OF MASS SPECTROMETRY
S. Rhea Savu, L. Silvestro, A. Haag and F. Sorgel, VOL. 31, 1351-1363 (1996).
Automated solid-phase extraction for concentration and clean-up of female steroid hormones prior
to liquid chromatography–electrospray ionization–tandem mass spectrometry.
B. Alvarez Sanchez, F. Priego Capote, J. Ruiz Jimenez, M.D. Luque de Castro. An approach to lipidomics,
Journal of Chromatography A, 1207 (2008) 46–54.
Detection, quantification and confirmation of anabolic steroids in equine plasma by liquid
chromatography and tandem mass spectrometry
Fuyu Guan, Cornelius E. Uboh, Lawrence R. Soma, Yi Luo, Jeffery Rudy, Thomas Tobin., Journal of
Chromatography B, 829 (2005) 56–68.
Liquid chromatography–electrospray ionization mass spectrometric analysis of corticosterone in rat
plasma using selected ion monitoring,
Ashok Marwah, Padma Marwah, Henry Lardy. Journal of Chromatography B, 757 (2001) 333–342.
Quantification of corticosteroids in human plasma by liquid chromatography–thermospray mass
spectrometry using stable isotope dilution,
Ashok Marwah, Padma Marwah, Henry Lardy, Journal of Chromatography B, 692 (1997) 7–14
14
ORMONI STEROIDEI SIERICI
( Cromatogrammi di Riferimento, Calibratore livello 3 )
TESTOSTERONE
PROGESTERONE
ESTRADIOLO
x10 2 Cpd 18: TESTOSTERONE-1: +ESI MRM Frag=150.0V CF=0.000 DF=0.000 [email protected] (289.1000 -> 109.1000) K6-2.d
1.1
x10 2 Cpd 26: PROGESTERONE-1: +ESI MRM Frag=150.0V CF=0.000 DF=0.000 [email protected] (315.1000 -> 109.0000) K6-2.d
1.1
x10 2 Cpd 20: ESTRADIOLO-1: +ESI MRM Frag=100.0V CF=0.000 DF=0.000 [email protected] (255.1000 -> 159.0000) K6-2.d
1.1
1.075
1.075
1.075
1.05
1.05
1.025
1
1.05
1.025
1
3.930
1.025
1
5.282
0.975
0.975
0.975
0.95
0.95
0.95
0.925
0.925
0.925
0.9
0.9
0.9
0.875
0.85
0.875
0.85
0.875
0.85
0.825
0.825
0.825
0.8
0.8
0.8
0.775
0.775
0.775
0.75
0.75
0.75
0.725
0.7
0.725
0.7
0.725
0.7
0.675
0.675
0.675
0.65
0.65
0.65
0.625
0.625
0.625
0.6
0.6
0.6
0.575
0.55
0.575
0.55
0.575
0.55
0.525
0.525
0.525
0.5
0.5
0.5
0.475
0.475
0.475
0.45
0.45
0.45
0.425
0.4
0.425
0.4
0.425
0.4
0.375
0.375
0.375
0.35
0.35
0.35
0.325
0.325
0.325
0.3
0.3
0.3
0.275
0.25
0.275
0.25
0.275
0.25
0.225
0.225
0.225
0.2
0.2
0.2
0.175
0.175
0.175
0.15
0.15
0.15
0.125
0.1
0.125
0.1
0.125
0.1
0.075
0.05
0.075
0.05
0.075
0.05
0.025
0.025
0.025
0
0
0
-0.025
-0.05
-0.025
-0.05
-0.025
-0.05
-0.075
-0.1
-0.075
-0.1
-0.075
-0.1
3.75
3.8
3.85
3.9
3.95
4
4.05
4.1
4.15
4.2
4.25
4.3
4.35
Counts (%) vs. Acquisition Time (min)
4.4
4.45
4.5
4.55
4.6
4.65
3.966
4.65
4.7
4.75
4.8
4.85
4.9
4.95
5
5.05
5.1
5.15
5.2
5.25
Counts (%) vs. Acquisition Time (min)
15
5.3
5.35
5.4
5.45
5.5
5.55
3.75
3.8
3.85
3.9
3.95
4
4.05
4.1
4.15
4.2
4.25
4.3
4.35
Counts (%) vs. Acquisition Time (min)
4.4
4.45
4.5
4.55
4.6
4.65
ORMONI STEROIDEI SIERICI
( Cromatogrammi di Riferimento, Calibratore livello 3 )
CORTISOLO
ANDROSTENEDIONE
11-DEOSSICORTICOSTERONE e 17-OH-PROGESTERONE
x10 2 Cpd 5: CORTISOLO-1: +ESI MRM Frag=100.0V CF=0.000 DF=0.000 [email protected] (363.1000 -> 105.1000) K6-2.d
x10 2 Cpd 22: ANDROSTENEDIONE-1: +ESI MRM Frag=150.0V CF=0.000 DF=0.000 [email protected] (287.1000 -> 109.0000) K6-2.d
1.1
x10 2 Cpd 15: 17 OH PROGESTERONE-11 DEOSSICORTICOSTERONE -1: +ESI MRM Frag=150.0V CF=0.000 DF=0.000 [email protected] (331.0000 -> 109.…
1.1
1.075
1.075
1.05
1.075
1.05
1.05
1.025
1.025
2.124
1
0.975
1.025
4.311
1
0.975
0.95
0.925
0.925
0.925
0.9
0.875
0.9
0.9
0.875
0.875
0.85
0.85
0.85
0.825
0.825
0.825
0.8
0.775
0.8
0.8
0.775
0.775
0.75
0.75
0.75
0.725
0.725
0.725
0.7
0.675
0.7
0.7
0.675
0.675
0.65
0.65
0.65
0.625
0.625
0.625
0.6
0.575
0.6
0.6
0.575
0.575
0.55
0.55
0.55
0.525
0.525
0.525
0.5
0.475
0.5
0.5
0.475
0.475
0.45
0.45
0.45
0.425
0.4
0.425
0.4
0.425
0.4
0.375
0.375
0.375
0.35
0.35
0.35
0.325
0.3
0.325
0.3
0.325
0.3
0.275
0.275
0.275
0.25
0.25
0.25
0.225
0.2
0.225
0.2
0.225
0.2
0.175
0.175
0.175
0.15
0.15
0.15
0.125
0.1
0.125
0.1
0.125
0.1
0.075
0.075
0.075
0.05
0.05
0.05
0.025
0
0.025
0
0.025
0
-0.025
-0.025
-0.025
-0.05
-0.05
-0.05
-0.075
-0.1
-0.075
-0.1
-0.075
-0.1
1.75
1.8
1.85
1.9
1.95
2
2.05
2.1
2.15
2.2
2.25
2.3
2.35
Counts (%) vs. Acquisition Time (min)
2.4
2.45
2.5
2.55
2.6
2.65
4.05
4.1
4.15
4.2
4.25
4.3
4.181
1
0.95
0.975
0.95
4.35
4.4
4.45
4.5
4.55
4.6
4.65
Counts (%) vs. Acquisition Time (min)
16
4.7
4.75
4.8
4.85
4.9
4.95
4.567
3.6
3.7
3.8
3.9
4
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
4.8
Counts (%) vs. Acquisition Time (min)
4.9
5
5.1
5.2
5.3
5.4
Ormoni
Tempi di ritenzione
Min
1.80
4.34
5.26
2.99
Aldosterone
Androstenedione
Androsterone
Corticosterone
Cortisolo
11-Deossicortisolo
11-Deossicorticosterone
DHEA
DHEAS
Diidrotestosterone
Estradiolo
Estrone
17-OH-Pregnenolone
17-OH-Progesterone
Pregnenolone
Progesterone
Testosterone
2.10
3.15
4.20
4.0
4.55
5.16
4.0
4.45
5.26
4.60
4.90
5.26
3.93
17