lezione 9 piante bioreattori

• POSSIBILI PRODOTTI
- Anticorpi
- Proteine di interesse farmaceutico
- Vaccini edibili
- Metaboliti secondari
- Polimeri biodegradabili
Produzione di Anticorpi
SISTEMI DI ESPRESSIONE
- Cellule di mammifero
- Latte di animali transgenici
SISTEMI DI ESPRESSIONE
- Cellule di mammifero
producono l’anticorpo “autentico”
soprattutto in termini di glicosilazione
SVANTAGGI: costi elevati
possibile contaminazione
con patogeni umani
- Latte di animali transgenici
alta resa; le proteine possono essere
recuperate periodicamente
SVANTAGGI: necessità di produrre animali
transgenici –
possibile contaminazione con patogeni
umani
Produzione di Anticorpi in pianta
“Plantibodies”
• Vantaggi
– Il costo per la produzione in pianta è molto minore che
per la produzione in cellule animali
- La produzione nei semi rende possibile il mantenimento
della proteina per lunghi periodi di tempo
– Non ci sono rischi di contaminazione con patogeni umani
– Il pathway di sintesi proteica è conservato tra piante e
animali (corretto folding delle immunoglobuline)
– Le modificazioni post-traduzionali sono simili
(glicosilazione)
anticorpi in pianta
tipi di anticorpi ricombinanti espressi in pianta
anticorpi in pianta
Preparazione del costrutto per l’espressione
di anticorpi in pianta
- Isolamento
dell’opportuno cDNA da una linea
cellulare di ibridoma
- Inserimento
nel vettore
promotore costitutivo: CaMV 35S (dicotiledoni)
Ubiquitina (cereali)
promotore specifico per il seme
(per evitare l’accumulo nei tessuti verdi qualora
l’anticorpo interferisca con la crescita e lo sviluppo)
anticorpi in pianta
- Utilizzo di sequenze specifiche per il targeting
cellulare
anticorpi ricombinanti sono più stabili in
alcuni compartimenti piuttosto che in altri
le immunoglobuline full-length devono essere
glicosilate: pathway di secrezione
il targeting appropriato può facilitare
l’isolamento e la purificazione
rese 10000 volte superiori se l’anticorpo è
accumulato nell’ER
aggiunta della sequenza di ritenzione nell’ER
(KDEL)
“Plantibodies”
scopo diagnostico e terapeutico
CaroRx
CEA: glicoproteina tumorale
scopo diagnostico
applicazione topica previene la trasmissione del virus
CaroRx
Fase II clinical trials
Espressione di anticorpi in piante per
aumentare la difesa nei confronti di
patogeni
Anticorpi diretti contro proteine di replicazione
o del capside del virus possono interferire con
la replicazione e la diffusione del virus
aumentando la resistenza della pianta
Nature 1993
espressione in piante di tabacco di
un anticorpo contro la proteina del
capside del virus dell’ ”arricciamento
maculato del carciofo”
effetto dell’infezione virale in piante che esprimono l’anticorpo
trasformata
controllo
controllo
2 linee trasformate
% di piante infettate dopo
inoculazione con il virus
Produzione di proteine di
interesse farmaceutico
VANTAGGI
proteine di interesse
farmaceutico
L’integrazione del DNA nelle piante è stabile;
nei microrganismi può non essere stabile
Le modificazioni post-traduzionali sono più
simili a quelle che hanno luogo nelle cellule
animali
Il costo per la produzione in pianta è molto
minore che per la produzione in cellule animali
La produzione nei semi rende possibile il
mantenimento della proteina per lunghi periodi
di tempo
SVANTAGGI
proteine di interesse
farmaceutico
la purificazione delle proteine da tessuto
vegetale è molto più problematica che non
da cellule animali
(presenza della parete, polifenoli –
interferenza con le tecniche di
purificazione)
E’ necessario che i livelli di espressione siano
molto elevati per avere rese soddisfacenti
Produzione di proteine di interesse farmaceutico
Malattia di Gaucher
Alterazione del metabolismo degli sfingolipidi
Malattia da accumulo lisosomiale
Accumulo di glucosilceramide nei lisosomi dei macrofagi
proteine di interesse
farmaceutico
Per aumentare la resa della purificazione si possono
esprimere proteine di fusione con tag che permettano una
facile purificazione mediante cromatografia di affinità
proteine di interesse
farmaceutico
sito proteolitico
oleosina-pro
oleosina
trasformazione Brassica napus
irudina
ter
estratto vegetale
centrifugazione
corpi oleosi
espressione nei corpi oleosi
purificazione dei corpi oleosi
trattamento
con proteasi
centrifugazione
digestione proteolitica
irudina
VACCINI EDIBILI
• I vaccini attuali sono costosi
• Sono richieste infrastrutture per il trasporto e la
somministrazione (problemi logistici ed economici)
Problema per i paesi poveri
VACCINI EDIBILI
Vantaggi della produzione in piante
transgeniche:
Coltivazione in loco; basso costo
Non è necessario personale per la
somministrazione del preparato
Disponibili indefinitamente (ogni anno si
riseminano)
VACCINI EDIBILI
VACCINI EDIBILI
Trasformazione stabile
Espressione transiente
VETTORI VIRALI
VACCINI EDIBILI
Sistema di espressione del polipeptide
Sistema di presentazione dell’epitopo
VACCINI EDIBILI
Topi nutriti con i pomodori
transgenici risultano immunizzati
e producono sia IgG che IgA
VACCINI EDIBILI
Proteine espresse in piante transgeniche con applicazioni
come vaccini animali e umani
VACCINI EDIBILI
SVANTAGGI DEI VACCINI EDIBILI
le piante sono organismi viventi che cambiano: la continuità nella
produzione del vaccino può non essere garantita
i vaccini edibili possono essere confusi con frutti normali e
consumati senza controllo
il dosaggio è variabile e difficile da controllare: frutti di
dimensioni diverse conterranno quantità diverse di antigene
il pattern di glicosilazione è simile, ma non identico, a quello
delle cellule animali; ciò può influenzare la funzionalità del
vaccino
La plastica biodegradabile POLIIDROSSI-BUTIRRATO (PHB) è
prodotta per fermentazione dal
batterio Alcaligenes eutrophus.
Il PHB è biodegradabile, ma
impermeabile all’acqua: è però
molto piu’ costoso della plastica
convenzionale.
Operone batterico phb
phbA: β-chetotiolasi
phbB: AcetoacetilCoA-reduttasi
phbC: PHB polimerasi
Ruolo dei metaboliti secondari nelle piante
MOLECOLE DI INTERESSE FARMACOLOGICO
E’ possibile aumentare i livelli di specifici metaboliti
secondari attraverso l’ ingegnerizzazione del pathway
biosintetico
- sovraespressione di geni codificanti enzimi limitanti
nella via biosintetica
In pomodoro la sovraespressione della
licopene β-ciclasi porta ad un aumento
del 50% dei livelli di β-carotene
I livelli di flavonoidi possono
essere aumentati aumentando
l’espressione di geni codificanti
enzimi della via biosintetica
Geni DEL e ROS sotto il controllo del promotore fruttofrutto-specifico E8
Sintesi di antocianine in pomodoro esprimendo specifici fattori di
trascrizione che attivano la trascrizione del gene PAL
l’estrazione di metaboliti secondari dalla pianta comporta
generalmente la distruzione della pianta stessa
problema se:
RARA (difficile da reperire, protetta)
DI DIFFICILE COLTIVAZIONE
A CRESCITA LENTA (piante legnose)
VANTAGGI DELLA PRODUZIONE IN
VITRO DI METABOLITI SECONDARI
• Stabilizzazione ed ottimizzazione della produzione
variando le condizioni colturali e nutrizionali
• Indipendenza dalla stagione vegetativa
• Selezione di specifiche linee cellulari con alta
produttività
• Produzione di molecole “nuove”
• Possibilità di evitare la deforestazione e la perdita
di biodiversità
pianta
Espianti
fogliari
• Prelievo degli espianti
• Sterilizzazione
Espianti
caulinari
• Inoculo in mezzo callogenico
callo
callogenesi
callogenesi
Inoculo in
mezzo liquido
SOSPENSIONE
CELLULARE
BIOREATTORE
Intrappolamento delle cellule in gel
(agar, agarosio, acrilammide, gelatina)
Riutilizzo
della
biomassa
attraverso la ritenzione delle
cellule nel bioreattore e il
recupero del prodotto nel
mezzo di coltura
Utilizzo del sistema in continuo
Separazione delle cellule
mezzo di coltura, quindi
prodotti rilasciati
dal
dai
LIMITE: il metabolita deve essere
secreto nel mezzo di coltura
alcuni metaboliti secondari
sono prodotti dalle piante in
risposta a stress di tipo
biotico
l’aggiunta di elicitori (sostanze che mimano
l’attacco di un patogeno) a cellule in coltura
può indurre o aumentare la sintesi di
metaboliti
principali elicitori utilizzati:
chitosano, acido salicilico,
acido jasmonico
Taxolo
estratto dalla corteccia di Taxus brevifolia e
Taxus baccata
principio attivo utilizzato come antitumorale
cancro del polmone, mammella, ovaio
sarcoma di Kaposi
il taxolo inibisce la
depolimerizzazione della
tubulina, provocando il blocco
della mitosi
tubulina
microtubulo
polimerizzazione
depolimerizzazione
Taxolo
Il
taxolo
è
accumulato
soprattutto a livello della
corteccia, la sua estrazione
diretta
comporta
la
distruzione della pianta
il tasso è una SPECIE PROTETTA (rischio estinzione)
e a CRESCITA LENTA (gimnosperma legnosa)
il taxolo è una molecola complessa, la sintesi
chimica risulterebbe troppo dispendiosa
produzione di taxolo per via biotecnologica
(da cellule di tasso in coltura)
Non sempre le cellule in coltura, indifferenziate, producono i
metaboliti di interesse. Alcune vie biosintetiche sono:
cellula-specifiche: sono attive solo in alcune cellule specializzate
(ghiandole, latticiferi, ecc.)
tessuto-specifiche: sono attive solo in alcuni tessuti (epitelio di
dotti e cavità secretorie, parenchima corticale, tegumento)
organo-specifiche: sono localizzate solo in uno specifico organo
(radice, foglia, fiore, frutto, ecc.)
un esempio di biosintesi cellulo-specifica
In Hypericum perforatum, ipericina e iperforina
sono prodotte esclusivamente in cellule
secretorie localizzate nella foglia
iperforina
Hypericum perforatum
cellule indifferenziate in coltura non
sono in grado di sintetizzare questi
composti
un esempio di biosintesi organo-specifica
In Atropa belladonna gli alcaloidi
scopolammina e atropina sono
prodotti esclusivamente nella radice
Atropa belladonna
atropina
anche in questo caso, cellule indifferenziate in coltura
non producono tali metaboliti
L’infezione con A. rhizogenes già di per sé induce un aumento
della sintesi di metaboliti secondari
Con A. rhizogenes possono essere trasformate piante che
esprimano geni eterologhi che alterino la produzione di
metaboliti secondari nelle hairy root
Alcaloidi indolici
Vinblastina e vincristina
Catharanthus roseus
bloccano la mitosi arrestando il
ciclo in metafase
Si legano alla tubulina e ne
impediscono la polimerizzazione
Farmaci antitumorali utilizzati nella
cura di linfomi, leucemie, cancro al
seno e all’utero
Alcaloidi indolici
La vinblastina e la
vincristina derivano
dalla strictosidina,
precursore di tutti gli
alcaloidi indolici
Principale
alcaloide della
china.
Usato per la cura
della malaria
Estremamente tossica
Eccita il sistema nervoso
Si lega ai recettori della
glicina
Alcaloidi indolici
TDC (triptofano decarbossilasi)
insensibile al feedback negativo
AS (Antranilato sintasi) e STR
(Strictosidina sintasi)
overespressione
Proteine ricombinanti prodotte in colture di hairy roots