Tecnologia del dna ricombinante e genomica

Unità 3
La tecnologia del DNA
ricombinante e la genomica
Unità 3
La tecnologia del DNA
ricombinante e la genomica
Obiettivi
 Conoscere le principali tecniche utilizzate per
produrre cloni di geni specifici
 Sapere come vengono ottenuti gli organismi
geneticamente modificati, per quali scopi sono
utilizzati e quali rischi comportano
 Conoscere i principali metodi di analisi del DNA
 Capire l’importanza dei risultati della genomica
e, in particolare, del Progetto Genoma Umano
Prova di competenza – Conoscere i propri geni
Qual è la vera portata dei
recenti successi della ricerca
in ambito genetico e dove ci
può portare il progresso
nelle tecniche di analisi e
studio del nostro genoma?
3
Lezione 1
LA CLONAZIONE GENICA
4
3.1 È possibile ottenere molte copie di un gene
inserendolo all’interno di un batterio
 Le biotecnologie permettono di manipolare gli
organismi o i loro costituenti molecolari per
ottenere prodotti utili
– In particolare, la tecnologia del DNA
ricombinante permette di manipolare il DNA
– I plasmidi sono molecole di DNA circolare che si
riproducono autonomamente nei batteri
– Sono strumenti fondamentali per l’ingegneria
genetica e la clonazione genica in particolare
5
3.1 È possibile ottenere molte copie di un gene
inserendolo all’interno di un batterio
 Come si clona un gene
1. Si isola un DNA plasmidico, che farà da vettore
2. Si isola il DNA donatore da cui si vuole estrarre il
gene
3. Si taglia il DNA plasmidico con un enzima di
restrizione
4. Si taglia il DNA donatore con lo stesso enzima,
ottenendo molti frammenti
5. Si mescolano DNA plasmidico e DNA donatore
6
3.1 È possibile ottenere molte copie di un gene
inserendolo all’interno di un batterio
6. Si aggiunge DNA ligasi, che catalizza la
formazione di legami covalenti tra il DNA
plasmidico e i frammenti di DNA donatore. Si
ottengono così plasmidi ricombinanti che
contengono frammenti del DNA donatore
7. Si inserisce il DNA plasmidico in una colonia di
batteri, ottenendo batteri ricombinanti
8. Riproducendosi le cellule batteriche daranno
origine a cloni di cellule identiche, ognuno
contenente un frammento del DNA donatore
7
Batterio E. coli
Plasmide
Cromosoma
batterico
1
Cellula contenente
Il gene che si vuole clonare
Isolamento
del plasmide
3
Isolamento
del DNA
2
DNA
Taglio del plasmide
con l’enzima
Gene che si vuole clonare
4
Taglio del DNA cellulare
con lo stesso enzima
Gene
che si vuole clonare
5
6
Plasmide
con DNA
ricombinante
Integrazione del frammento
di DNA del donatore nel plasmide
Esempi
di uso dei geni
Aggiunta della DNA ligasi,
che chiude l’anello
formando
I geni possono essere
legami covalenti
inseriti in altri organismi
Gene
che si vuole clonare
9
7
Inserzione del
plasmide nel batterio
(trasformazione)
Batterio
ricombinante
8
Cloni
di cellule
Duplicazione
del batterio
in coltura
Isolamento dei geni
o delle proteine dal batterio clonato
Le proteine
ricavate possono
essere usate
direttamente
Esempi di uso
delle proteine
8
Batterio E. coli
Plasmide
Cromosoma
batterico
1
Isolamento
del plasmide
Cellula contenente
il gene che si vuole clonare
2
Isolamento
del DNA
DNA
Gene
che si vuole clonare
9
Batterio E. coli
Plasmide
Cromosoma
batterico
1
Cellula contenente
il gene che si vuole clonare
Isolamento
del plasmide
3
2
Taglio del plasmide
con l’enzima
Isolamento
del DNA
DNA
Gene
che si vuole clonare
4
Taglio del DNA cellulare
con lo stesso enzima
Gene
che si vuole clonare
10
Batterio E. coli
Plasmide
Cromosoma
batterico
1
Cellula contenente
il gene che si vuole clonare
Isolamento
del plasmide
3
2
Taglio del plasmide
con l’enzima
Isolamento
del DNA
DNA
Gene
che si vuole clonare
4
Taglio del DNA cellulare
con lo stesso enzima
Gene
che si vuole clonare
5
Integrazione del frammento
di DNA del donatore nel plasmide
11
Batterio E. coli
Plasmide
Cromosoma
batterico
1
Cellula contenente
il gene che si vuole clonare
Isolamento
del plasmide
3
2
Taglio del plasmide
con l’enzima
Isolamento
del DNA
DNA
Gene
che si vuole clonare
4
Taglio del DNA cellulare
con lo stesso enzima
Gene
che si vuole clonare
Plasmide
con DNA
ricombinante
5
Integrazione del frammento
di DNA del donatore nel plasmide
6
Aggiunta della DNA ligasi,
che chiude l’anello
formando
legami covalenti
Gene
che si vuole clonare
12
Plasmide
con DNA
ricombinante
Gene
che si vuole clonare
7
Inserzione del
plasmide nel batterio
(trasformazione)
Batterio
ricombinante
13
Plasmide
con DNA
ricombinante
Gene
che si vuole clonare
7
Inserzione del
plasmide nel batterio
(trasformazione)
Batterio
ricombinante
8
Duplicazione
del batterio
in coltura
Cloni
di cellule
14
Esempi
di uso dei geni
I geni possono essere
inseriti in altri organismi
Plasmide
con DNA
ricombinante
Gene
che si vuole clonare
9
7
Inserzione del
plasmide nel batterio
(trasformazione)
Batterio
ricombinante
8
Duplicazione
del batterio
in coltura
Isolamento dei geni
o delle proteine dal batterio clonato
Le proteine
ricavate possono
essere usate
direttamente
Cloni
di cellule
Esempi di uso
delle proteine
15
3.1 È possibile ottenere molte copie di un gene
inserendolo all’interno di un batterio
STEP BY STEP
Perché la velocità con cui i batteri si
duplicano è utile quando si vuole clonare un
gene?
16
3.2 Il DNA viene “tagliato e incollato” utilizzando
enzimi specifici
 Gli enzimi di restrizione tagliano il DNA in
corrispondenza di sequenze specifiche
– Ognuno di questi enzimi lega il DNA in corrispondenza
di una specifica sequenza, il sito di restrizione
– Molti enzimi di restrizione producono frammenti di
restrizione dotati di estremità coesive, cioè a
filamento singolo
– Frammenti dotati di estremità coesive complementari
possono legarsi tra loro
– La DNA ligasi permette di formare legami permanenti
tra i frammenti formando una molecola di DNA
ricombinante
17
Sequenza di riconoscimento
dell’enzima di restrizione
1
DNA
L’enzima di restrizione
taglia il DNA in frammenti
2
Estremità coesiva
18
Sequenza di riconoscimento
dell’enzima di restrizione
1
DNA
L’enzima di restrizione
taglia il DNA in frammenti
2
Estremità coesiva
Aggiunta di un
frammento di DNA
proveniente da
un’altra fonte
3
19
Sequenza di riconoscimento
dell’enzima di restrizione
1
DNA
L’enzima di restrizione
taglia il DNA in frammenti
2
Estremità coesiva
Aggiunta di un
frammento di DNA
proveniente da
un’altra fonte
3
Due (o più) frammenti
si legano mediante
appaiamento delle basi
complementari
4
20
Sequenza di riconoscimento
dell’enzima di restrizione
1
DNA
L’enzima di restrizione
taglia il DNA in frammenti
2
Estremità coesiva
Aggiunta di un
frammento di DNA
proveniente da
un’altra fonte
3
Due (o più) frammenti
si legano mediante
appaiamento delle basi
complementari
4
La DNA ligasi
incolla i filamenti
5
Molecola
di DNA ricombinante
21
3.2 Il DNA viene “tagliato e incollato” utilizzando
enzimi specifici
STEP BY STEP
Che cosa sono le estremità coesive?
22
3.3 I geni clonati possono essere archiviati in
“librerie” genomiche
 Una libreria genomica raccoglie tutti i
frammenti di DNA clonati provenienti da un
genoma
 I frammenti sono inseriti in vettori necessari
alla loro conservazione e duplicazione
– Plasmidi batterici
– DNA fagico
– BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
23
Genoma tagliato
con l’enzima
di restrizione
Plasmide
ricombinante
oppure
Clone
batterico
Libreria plasmidica
DNA ricombinante
del fago
Clone
del fago
Libreria fagica
24
3.3 I geni clonati possono essere archiviati in
“librerie” genomiche
STEP BY STEP
Si può dire che una libreria genomica contiene
numerose copie di ciascun “libro”
Che cosa si intende con questa affermazione?
25
3.4 La trascrittasi inversa può essere utilizzata
per produrre geni da clonare
 È possibile creare una libreria che contiene tutti
i geni espressi da un organismo partendo dal
suo mRNA
– Una volta isolato l’mRNA si utilizza l’enzima
trascrittasi inversa per sintetizzare i filamenti di
DNA complementari a quelli di mRNA
– Si elimina l’RNA con un enzima che lo degrada
– Si sintetizzano filamenti di DNA complementari a
quelli già ottenuti
– Il risultato sono dei frammenti di DNA a doppio
filamento detti cDNA (DNA complementare)
26
3.4 La trascrittasi inversa può essere utilizzata
per produrre geni da clonare
 Una libreria di cDNA è utile per studiare i
geni responsabili delle funzioni
specializzate di un particolare tipo di
cellule
 Essendo prive di introni, le molecole di
cDNA sono più corte e “maneggevoli”
rispetto alle versioni complete dei geni
27
Nucleo della cellula
Esone Introne Esone Introne Esone
DNA
di un gene
eucariote
1 Trascrizione
Trascritto
di RNA
2 Splicing dell’RNA
mRNA
3 Isolamento dell’mRNA dalla
Provetta
cellula e aggiunta di trascrittasi
inversa; sintesi del filamento
di DNA complementare
Trascrittasi inversa
Sintesi del
filamento di cDNA
4 Demolizione dell’RNA
5 Sintesi del secondo
filamento di DNA
cDNA del gene
(senza introni)
28
3.4 La trascrittasi inversa può essere utilizzata
per produrre geni da clonare
STEP BY STEP
Perché un gene di cDNA ottenuto utilizzando la
trascrittasi inversa è spesso più corto di un gene
naturale?
29
3.5 Le sonde nucleotidiche riconoscono cloni
contenenti geni specifici
 Per individuare un determinato gene all’interno
di una libreria genetica possiamo usare una
sonda nucleotidica
– Costituita da DNA o RNA fluorescente o marcato
radioattivamente
– Contiene una breve sequenza nucleotidica
complementare a una porzione del gene di
interesse
30
3.5 Le sonde nucleotidiche riconoscono cloni
contenenti geni specifici
 Come si può usare una sonda nucleotidica
– Si trasferiscono alcune cellule dalle colonie di batteri di
una libreria genica su un disco di carta da filtro
– Si tratta il disco in modo da lisare le cellule e separare
i filamenti di DNA
– Si aggiunge una soluzione contenente la sonda
– La colonia contenente il gene di interesse risulterà
marcata
– Si prelevano cellule della colonia di partenza e si
coltivano in modo da ottenere grandi quantità del gene
di interesse
31
Sonda
radioattiva
DNA
a singolo filamento
Aggiunta di DNA
a singolo filamento
proveniente da una
libreria genomica
L’appaiamento
complementare
marca il gene
desiderato
32
3.5 Le sonde nucleotidiche riconoscono cloni
contenenti geni specifici
STEP BY STEP
In che modo una sonda costituita da DNA o RNA
radioattivo permette di individuare i cloni batterici
contenenti un particolare gene?
33
Lezione 2
GLI ORGANISMI
GENETICAMENTE MODIFICATI
34
3.6 Cellule e organismi ricombinanti sono usati per
produrre grandi quantità di prodotti genici
specifici
- Le cellule e gli organismi ricombinanti ottenuti
con la tecnologia del DNA sono usati per
sintetizzare proteine e altre molecole utili
- È possibile utilizzare diversi tipi di organismi
ricombinanti a seconda delle caratteristiche
della molecola che si desidera produrre
– Procarioti: per esempio Escherichia coli
– Facilmente manipolabili geneticamente ed economici
– Possono secernere le sostanze prodotte nel terreno di
coltura
35
3.6 Cellule e organismi ricombinanti sono usati
per produrre grandi quantità di prodotti
genici specifici
– Eucarioti
– Saccharomyces cerevisiae
– Può produrre e secernere complesse proteine
eucariotiche
– Colture di cellule di mammiferi
– Sono indispensabili per produrre glicoproteine
– Mammiferi ricombinanti
– Possono produrre molecole utili e secernerle nel
propprio latte
36
37
38
3.6 Cellule e organismi ricombinanti sono usati
per produrre grandi quantità di prodotti
genici specifici
STEP BY STEP
Perché le glicoproteine non possono essere
prodotte su vasta scala utilizzando batteri o cellule
di lievito geneticamente modificate?
39
La tecnologia del DNA ha trasformato l’industria
farmaceutica e la ricerca biomedica
salute
COLLEGAMENTO
 La tecnologia del DNA ricombinante è molto
utilizzata per la produzione di medicinali e la
diagnosi di malattie
- Terapie ormonali
– Ormoni identici a quelli umani sicuri, puri ed economici
– Per esempio: insulina, HGH, TPA
- Diagnosi
– Diagnosi precoce di malattie ereditarie
– Diagnosi di infezioni da virus difficilmente identificabili
(HIV)
40
La tecnologia del DNA ha trasformato l’industria
farmaceutica e la ricerca biomedica
salute
COLLEGAMENTO
- Vaccini
– La tecnologia del DNA ricombinante è utile sia
per ottenere i vaccini che per produrli su larga
scala
41
42
3.7 Gli organismi geneticamente modificati
stanno trasformando l’agricoltura e
l’allevamento
 OGM (Organismi Geneticamente
Modificati) hanno un patrimonio genetico
modificato
 Organismi transgenici contengono materiale
genetico derivante da altre specie
43
3.7 Gli organismi geneticamente modificati
stanno trasformando l’agricoltura e
l’allevamento
 Piante GM modificate per
– Resistere a erbicidi, parassiti
– Maggiore produttività
– Migliori valori nutritivi
 Animali GM
– Attualmente sono utilizzati solo nella ricerca
biologica o per produrre molecole utili in campo
farmaceutico
44
Agrobacterium tumefaciens
DNA contenente
il gene utile
1
Plasmide
Ti
Sito
di restrizione
Inserimento del
gene nel plasmide
mediante l’enzima
di restrizione
e la DNA ligasi
Plasmide
Ti
ricombinante
45
Agrobacterium tumefaciens
Cellula vegetale modificata
DNA containing
gene for desired trait
1
Plasmide
Ti
Sito
di restrizione
Inserimento del
gene nel plasmide
mediante l’enzima
di restrizione
e la DNA ligasi
Plasmide
Ti
ricombinante
2
Introduzione
del plasmide
in cellule
Vegetali
DNA contenente il nuovo
Coltivate
gene in un cromosoma
della pianta
in vitro
46
Agrobacterium tumefaciens
Cellula vegetale modificata
DNA containing
gene for desired trait
1
Plasmide
Ti
Sito
di restrizione
Inserimento del
gene nel plasmide
mediante l’enzima
di restrizione
e la DNA ligasi
Plasmide
Ti
ricombinante
2
3
Introduzione
Sviluppo
del plasmide
della pianta
in cellule
Vegetali
DNA contenente il nuovo
Coltivate
gene in un cromosoma
della pianta
in vitro
Pianta con il
nuovo carattere
47
3.7 Gli organismi geneticamente modificati
stanno trasformando l’agricoltura e
l’allevamento
STEP BY STEP
Qual è la funzione del plasmide Ti nella produzione
di piante transgeniche?
48
Chi ha paura degli OGM
COLLEGAMENTO
ambiente
- Esistono diverse norme e procedure indispensabili
per limitare i pericoli legati all’utilizzo di OGM
- Timori comuni
– Piante GM possono introdurre allergeni negli alimenti
– Le proteine transgeniche possono essere testate
– Prodotti contenenti OGM devono indicarne la presenza in
etichetta
- Rischi per le specie naturali
– Trasmissione dei geni modificati a specie selvatiche
– Riduzione della biodiversità
49
50
Geni di ricambio
COLLEGAMENTO
salute
 Terapia genica: curare malattie genetiche
modificando i geni degli individui malati
 Una possibile procedura
– Si clona il gene normale e si inserisce in un vettore
retrovirale
– Si prelevano cellule del paziente interessate dalla
malattia e si infettano con il vettore
– Il retrovirus inserisce nel genoma delle cellule il
proprio DNA insieme al gene clonato
– Le cellule vengono reinserite nel paziente
51
Geni di ricambio
COLLEGAMENTO
salute
 Sperimentazione clinica
– Nel 2000 è stata avviata una sperimentazione
clinica di terapia genica su 10 bambini malati di
SCID
– 9 hanno avuto miglioramenti significativi, 3 si sono
ammalati di leucemia (1 è morto), in 2 casi si è
visto che il sito di integrazione del gene era la
causa della leucemia
 Problemi tecnici e dubbi etici
– Come integrare i meccanismi di controllo genico
– Come evitare il rischio di danneggiare altre funzioni
– Eugenetica e altri dubbi etici
52
Gene clonato
(allele normale)
1
Inserimento del gene normale
in un retrovirus vettore
Acido nucleico virale
Retrovirus
2
Una cellula del midollo osseo
viene infettata con il virus
3
Il DNA virale si integra
nel cromosoma della cellula
Cellula di midollo osseo del paziente
Midollo
osseo
4
Iniezione
delle cellule nel paziente
53
54
Lezione 3
I METODI DI ANALISI DEL DNA
55
3.8 Ogni individuo è caratterizzato
da un diverso profilo del DNA
 Il DNA profiling è una procedura che prevede
l’analisi di frammenti di DNA per stabilire se essi
derivino da un particolare individuo
– Vengono confrontati marcatori genetici che
variano da persona a persona
– I marcatori contenuti nei campioni biologici
vengono amplificati
– L’amplificazione permette di avere a disposizione
quantità sufficienti per il confronto
56
Scena del delitto Sospettato 1 Sospettato 2
1 Isolamento
del DNA
2 Amplificazione
del DNA
di marcatori
selezionati
3 Confronto
dei DNA
amplificati
57
3.8
Ogni individuo è caratterizzato
da un diverso profilo del DNA
STEP BY STEP
Perché il profilo genetico viene ottenuto
confrontando specifici marcatori genetici e non
interi genomi?
58
3.9 Per amplificare le sequenze di DNA si usa la
reazione a catena della polimerasi (PCR)
 La PCR permette di amplificare specifiche
sequenze di DNA
 Si basa sull’utilizzo di una coppia di primer
– Brevi sequenze nucleotidiche complementari alle due
estremità della sequenza da amplificare
– Funzionano da punto di partenza per la sintesi delle
nuove molecole di DNA
 Fasi della PCR
– Il campione viene riscaldato per aprire le doppie eliche
– Il campione viene raffreddato facendo appaiare i
primer con le sequenze bersaglio
– Una DNA polimerasi sintetizza nuovi filamenti di DNA
allungando i primer
59
3.9 Per amplificare le sequenze di DNA si usa la
reazione a catena della polimerasi (PCR)
- Applicazioni della PCR
– Amplificare DNA preistorico
– Indagini scientifiche sulla scena di crimini
– Diagnosi prenatale di malattie genetiche
– Diagnosi di infezioni di virus difficilmente identificabili
60
Ciclo 1
produce 2 molecole
DNA estratto
dal genoma
3
1 Con il calore
3
si separano
i filamenti
di DNA
5
3
5
Sequenza
bersaglio
5
3
5
5
3
2
Ciclo 2
produce 4 molecole
5
Nella miscela
3
raffreddata i primer
formano legami
idrogeno con le
estremità delle
sequenze bersaglio
5
5
3
Primer
3
Ciclo 3
produce 8 molecole
5
La DNA
polimerasi
aggiunge
nucleotidi
all’estremità 3
di ogni primer
5
3
Nuovo DNA
61
Ciclo 1
produce 2 molecole
DNA estratto
dal genoma
3
3
5
3
5
Sequenza
bersaglio
5
3
5
3
5
Nella miscela
3
1 Con il calore 2
raffreddata i primer
si separano
formano legami
i filamenti
idrogeno con le
di DNA
estremità delle
sequenze bersaglio
5
3
5
5
3
Primer
5
La DNA
polimerasi
aggiunge
nucleotidi
all’estremità 3
di ogni primer
5
3
Nuovo DNA
62
Ciclo 2
produce 4 molecole
Ciclo 3
produce 8 molecole
63
3.9 Per amplificare le sequenze di DNA si usa
la reazione a catena della polimerasi (PCR)
STEP BY STEP
Perché la PCR è adatta all’analisi di DNA molto
antichi?
64
3.10 L’elettroforesi su gel separa le molecole di
DNA in base alle loro dimensioni
 L’elettroforesi su gel del DNA
– Campioni di DNA vengono posti a un capo di una
lastra di gel
– Un elettrodo negativo e posto dal lato del DNA, uno
positivo dall’altro
– Le molecole di DNA migrano verso il polo positivo
– Più sono grandi più si muovono lentamente nel gel
– Quando la corrente viene staccata, sul gel si osserva
una serie di bande ognuna corrispondente a frammenti
di DNA della stessa lunghezza
65
Miscela di frammenti
di DNA di diverse dimensioni
Molecole
più lunghe
(più lente)
Generatore
elettrico
Gel
Molecole
più corte
(più veloci)
Elettroforesi completata
66
3.10 L’elettroforesi su gel separa le molecole di
DNA in base alle loro dimensioni
STEP BY STEP
Perché durante l’elettroforesi le molecole di DNA
migrano verso il polo positivo?
Perché le grandi molecole si spostano più lentamente
di quelle piccole?
67
3.11 Il DNA ripetitivo è utile per ottenere
i profili genetici
- DNA ripetitivo: sequenze nucleotidiche presenti
nel genoma in moltissime copie
– Le STR sono brevi sequenze ripetute molte volte di
seguito presenti nel genoma umano
- Analisi delle STR
– Il numero di ripetizioni delle STR in un particolere sito
del genoma varia da persona a persona
– Per ottenere il profilo genico di una persona, si
analizzano 13 siti specifici
68
3.11 Il DNA ripetitivo è utile per ottenere
i profili genetici
- Analisi delle STR
– Il numero di ripetizioni delle STR in un particolare sito
del genoma varia da persona a persona
– Per ottenere il profilo genico di una persona, si
analizzano 13 siti specifici
– Attraverso appositi primer si amplificano le sequenze di
DNA contenute in questi siti con una PCR
– I prodotti della PCR vengono sottoposti a elettroforesi
– La lunghezza dei frammenti ottenuti permette di
determinare il numero di STR presenti in ogni sito e
confrontarli nei diversi campioni
69
Sito di STR 1
Sito di STR 2
DNA prelevato
sulla scena
del delitto
Il numero di STR
corrisponde
Il numero di STR
non corrisponde
DNA dell’individuo
sospettato
70
DNA
DNA
prelevato sulla scena dell’individuo
sospetto
del delitto
71
3.11 Il DNA ripetitivo è utile per ottenere
i profili genetici
STEP BY STEP
Che cosa sono le STR?
72
La parola ai geni
COLLEGAMENTO
società
 Alcune applicazioni del profilo genetico
– Indagini di polizia
– Determinare la paternità o i legami parentali
– Identificazione di resti umani
– Identificazione di specie animali e vegetali
 Attendibilità del test del DNA
– Salvo errori procedurali, la probabilità che due
individui a caso abbiano lo stesso profilo genetico è
di 1 su 10 miliardi
73
74
75
3.12 Per individuare le differenze nelle sequenze di
DNA si possono usare i RFLP
 SNP: sono variazioni presenti nel genoma
umano che interessano singole coppie di basi
 RFLP: sono particolari SNP presenti su siti di
restrizione che alterano la lunghezza dei
frammenti di DNA ottenibili con il taglio da parte
dell’enzima di restrizione
– L’analisi dei RFLP viene effettuata separando
mediante elettroforesi su gel i frammenti di
restrizione ottenuti dai campioni che si vogliono
confrontare
76
Aggiunta
degli enzimi
di restrizione
Campione 1
Campione 2
w
Taglio
z
x
Taglio
Taglio
y
y
Frammenti
più lunghi
z
x
Frammenti
più corti
w
y
y
77
3.12 Per individuare le differenze nelle sequenze di
DNA si possono usare i RFLP
STEP BY STEP
Come viene effettuata l’analisi dei RFLP?
78
3.13 Tramite il metodo Sanger è possibile
determinare la sequenza di un frammento di
DNA
- Il sequenziamento con il metodo di Sanger si
basa sulla possibilità di interrompere la
duplicazione di un filamento di DNA e individuare
l’ultimo nucleotide inserito
79
1. il frammento di DNA di cui si desidera determinare
la sequenza viene separato nei due filamenti che lo
compongono aumentando la temperatura e viene
poi mescolato in una provetta ai reagenti necessari
per la sintesi del DNA
80
2. la sintesi dei nuovi filamenti di DNA inizia
all’estremità 3 del filamento stampo e procede
finché non viene casualmente incorporato un
didesossiribonucleotide, che ne blocca
l’allungamento; alla fine si otterrà una miscela di
frammenti di varie lunghezze che terminano con un
nucleotide marcato
81
3. i frammenti vengono separati per
mezzo di un’elettroforesi, che avviene
all’interno di un capillare pieno di gel
in questo modo i filamenti migrano lungo il capillare verso il
polo negativo disponendosi secondo la loro lunghezza e
un lettore fluorescente può identificare al loro passaggio il
tipo di nucleotide che corrisponde all’ultima posizione di
ciascun frammento
82
4. i dati possono essere letti sotto forma di
uno spettrogramma che indica la sequenza
complementare al filamento stampo
83
3.13 Tramite il metodo Sanger è possibile
determinare la sequenza di un frammento di
DNA
STEP BY STEP
Qual è la funzione dei didesossiribonucleotidi
fluorescenti nel sequenziamento tramite il metodo
Sanger?
84
Lezione 4
LA GENOMICA
85
3.14 La genomica è lo studio scientifico di interi
genomi
 Un genoma è l’intero corredo di geni di un
organismo
– I primi studi genomica si sono focalizzati su
organismi semplici come i procarioti
– Gli studi recenti hanno permesso il sequenziamento
del genoma di molti eucarioti, compreso quello umano
 La comparazione di genomi di diversi organismi
– Permette di individuare le relazioni evolutive
– Aiuta a individuare le funzioni dei geni
86
87
3.14 La genomica è lo studio scientifico di interi
genomi
STEP BY STEP
Perché è utile sequenziare genomi non umani?
88
3.15 Si possono ottenere molte informazioni
diverse dallo studio dei genomi
 Una volta sequenziato il genoma di un organismo
– Si individuano gli Open Reading Frames
– In caso di geni codificanti si può dedurra le sequenza
amminoacidica
– Si identificano le sequenze regolatrici
 Queste informazioni possono essere analizzate con
due approcci
– Funzionale: approfondendo il ruolo di ciascun gene
– Comparativo: confrontando i genomi di diversi
organismi
89
90
3.15 Si possono ottenere molte informazioni
diverse dallo studio dei genomi
- Oltre al genoma di un organismo è possibile
studiare
– Il suo trascrittoma: l’insieme di molecole di RNA
effettivamente trascritte
– Il suo proteoma: l’insieme di tutte le proteine
espresse
- L’analisi di informazioni così ricche e complesse è
resa possibile dagli strumenti forniti dalla
bioinformatica
91
3.15 Si possono ottenere molte informazioni
diverse dallo studio dei genomi
STEP BY STEP
Perché la bioinformatica è uno strumento
fondamentale nello studio del proteoma?
92
Cacciatori di geni
COLLEGAMENTO
società
- Il Progetto Genoma Umano è un progetto
pubblico di ricerca che ha lo scopo di
determinare l’intera sequenza nucleotidica del
genoma umano
– Il DNA è stato prelevato da 5 donatori
statisticamente rilevanti
– Lo scopo era quello di identificare la sequenza e la
posizione di ogni gene presente nel nostro genoma
– Nel 2000 ha raggiunto il suo scopo
93
Cacciatori di geni
COLLEGAMENTO
società
- Celera Genomics è una società privata che ha
lavorato allo stesso scopo, in parallelo con un
sistema diverso
– Con questo metodo ha sostenuto costi più di 10
volte inferiori rispetto al Progetto Genoma Umano
– Pur iniziando in un secondo momento è arrivata ad
ottenere il sequenziamento completo in
contemporanea
94
95
Cacciatori di geni
COLLEGAMENTO
società
- Risultati e applicazioni
– Gli esseri umani hanno circa 2100 geni che
rappresentano solo l’1,5 % del DNA
– Il resto è composto da introni, sequenze regolatrici,
e in gran parte da sequenze ripetute ed elementi
trasponibili
– La mappatura del genoma umano ha permesso di
individuare centinaia di geni associati a malattie
96
Esoni (regioni dei geni codificanti per
una proteina o trascritte in rRNA o tRNA)
(1,5%)
DNA ripetitivo
comprendente
elementi
trasponibili
e sequenze
affini (44%)
Introni
e sequenze
regolatrici (24%)
DNA
non codificante
(15%)
DNA
ripetitivo
privo di
elementi
trasponibili
(15%)
97
3.16 Il metodo di sequenziamento shotgun
applicato a interi genomi può fornire
rapidamente una grande quantità di dati
 Il Progetto Genoma Umano ha applicato una
procedura in tre stadi
– Mappa genetica a bassa risoluzione creata
analizzando 5000 RFLP
– Mappa fisica indicante il numero di basi compreso
tra un marcatore e l’altro
– Sequenziamento dell’insieme di frammenti di DNA
precedentemente mappati
98
Cromosoma
Frammentazione mediante
enzima di restrizione
Frammenti di DNA
Sequenziamento
dei frammenti
Allineamento
dei frammenti
Riassemblaggio della
sequenza completa
99
3.16 Il metodo di sequenziamento shotgun
applicato a interi genomi può fornire
rapidamente una grande quantità di dati
STEP BY STEP
Qual è il vantaggio principale del metodo shotgun?
100
3.17 I genomi contengono indizi sulla divergenza
evolutiva tra esseri umani e scimpanzé
alla luce dell’evoluzione
- Il confronto tra genomi di specie affini permette
di fare luce su eventi evolutivi recenti
- Confronti tra specie più lontane permettono di
indagare la storia evolutiva più remota
101
3.17 I genomi contengono indizi sulla divergenza
evolutiva tra esseri umani e scimpanzé
alla luce dell’evoluzione
- Confronto tra genoma umano e di scimpanzé
– Differenza dell’1,2% per sostituzioni di singole basi
– Differenza del 2,7% per inserzioni o delezioni di
porzioni più estese
– Una importante differenza riguarda il gene FOXP2
– Sembra abbia subito un veloce cambiamento nella
specie umana
– Mutazioni associate a problemi nel linguaggio
– Le differenze individuate potrebbero essere importanti
per spiegare l’evoluzione del linguaggio esclusiva della
nostra specie
102
3.17 I genomi contengono indizi sulla divergenza
evolutiva tra esseri umani e scimpanzé
alla luce dell’evoluzione
STEP BY STEP
In che modo il confronto delle sequenze
nucleotidiche di un gene in specie diverse può
fornirci informazioni sulla loro relazione evolutiva?
103