ONCOLOGIA MOLECOLARE E GENETICA DEI TUMORI
Genetica del cancro e studio del
microambiente tumorale
PRINCIPAL
INVESTIGATOR
Massimo Zollo
STAFF
Paquito De Antonellis
(post-doctoral fellow)
Daniela Spano
(post-doctoral fellow)
Marianeve Carotenuto
(dottorando Federico II)
Daniela De Martino
(dottorando Federico II)
Gennaro De Vita
(dottorando Federico II)
Veronica Ferrucci
(dottorando SEMM)
Nadia Aiese
(studentessa)
Daniela Magliulo
(studentessa)
Maria Cristina Chiarolla
(studentessa)
Alessandro Alonzi
(studente)
ACHIEVEMENTS
Presentazione della Patente
Internazionale PCT presso
l’Ufficio Europeo Brevetti EPO
Titolo” WO 2012/000828/
“PYRIMIDO[5,4-d]
PYRIMIDINE COMPOUNDS
AND USES THEREOF IN THE
TREATMENT OF CANCER”,
grazie ai dati ottenuti e presentati nel lavoro Virgilio A., Spano
D. et al. Eur J Med Chem. 2012.
International patent application
PCT - WO 2012/000828/
“PYRIMIDO[5,4-d]PYRIMIDINE
COMPOUNDS AND
USES THEREOF IN THE
TREATMENT OF CANCER”.
Results presented in reference
Virgilio A., Spano D. et al. Eur J
Med Chem. 2012 were part of
the patent file.
70
Il cancro è regolato da segnali intrinseci
ed estrinseci che ne promuovono la progressione attraverso cinque fasi: iniziazione, promozione, conversione maligna,
progressione e metastasi. Tali processi
sono guidati da variazioni genetiche che
guidano la transizione epitelio-mesenchimale (da cellule in adesione a cellule con
capacità migratoria); creando pertanto,
un “network” di comunicazione citochinemediato tra le cellule del sistema immunitario caratteristico del microambiente
tumorale (Fig.1). Sono state perseguite
due principali linee di ricerca: lo studio
di h-Prune, promotore di metastasi che
influenza la comunicazione tra le cellule
tumorali e le cellule immunitarie nel mi-
croambiente insieme all’identificazione di
nuove molecole che ne inibiscono l’attività; lo studio della genetica del Medulloblastoma, tumore del sistema nervoso
centrale, finalizzato all’identificazione di
alterazioni nel genoma che comportano la de-regolazione di geni, proteine e
miRNAs coinvolti nella tumorigenesi. In
particolare è stata studiata la funzione
di due miRNAs (miR199b-5p e miR34a)
nella biologia delle Cellule Tumorali Staminali e nel suo microambiente. Questi
studi mirano alla comprensione dei meccanismi di progressione tumorale per lo
sviluppo di nuove applicazioni terapeutiche nell’uomo.
Linee di ricerca
H-prune, una proteina
multifunzionale nel cancro
La proteina h-prune è coinvolta nel carcinoma della mammella, del polmone, del
colon-retto, del gastrico e dell’esofago, e
la sua over-espressione correla con il grado di invasione e di metastasi linfonodale.
Tuttavia, non è del tutto noto come hprune influenzi questo fenomeno.
A questo scopo, abbiamo identificato
una proteina “ASAP1” che controlla gli
effetti di h-prune in vitro e in vivo nel cancro del colon-retto (Müller T. et al; Oncogene. 2010).
Inoltre, abbiamo usato il Dipiridamolo
(DP) (un farmaco anti-aggregante piastrinico utilizzato per disturbi ischemici
nel cervello). Inoltre, abbiamo utilizzato il DP in modelli animali di carcinoma
mammario dimostrando la sua efficacia
in vivo nel compromettere l’azione del
microambiente tumorale (Spano D. et
al; Clin Exp Metastasis. 2012). Inoltre abbiamo identificato nuovi derivati del DP
che mostrano la loro attività specifica
nell’inibire la proliferazione e la motilità
di linee cellulari di carcinoma mammario
indotte all’espressione del gene/proteina
h-prune (Virgilio A., Spano D. et al; Eur J
Med Chem. 2012)
In conclusione abbiamo dissezionato il
network di comunicazione che è stato
trovato alterato grazie alla super espressione di h-prune e studiato i suoi effetti
nel microambiente tumorale.
La dis-regolazione dei miRNA e
studi di genetica molecolare in
tumori pediatrici
I miRNA sono regolatori che agiscono a
livello post-trascrizionale e la loro missfunzionalità è stata correlata a varie neoplasie maligne, tra cui il cancro. Nel Medulloblastoma (MB) abbiamo identificato
il ruolo del miR199b-5p come fattore di
inibizione delle cellule tumorali staminali (inficia l’espressione di HES1) e la sua
regolazione epigenetica (Andolfo I. et al.
Neuro Oncol. 2012). Inoltre, abbiamo studiato il ruolo del miR34a come inibitore
del gene/proteina Notch ligand of deltalike 1 (DLL-1), mostrando la sua funzione
sulle cellule tumorali positive ai marcatori
(CD15+/CD133+).
Infine, nella ricerca sul Medulloblastoma (MB), studiando oltre 1000 tumori,
all’interno di un consorzio internazionale, abbiamo classificato il MB in quattro
principali sottogruppi genetici con differenti caratteristiche cliniche. Questi risultati sono risultati pionieri nella oncologia
pediatrica clinica (Northcott PA, et al.
Nature. 2012).
MOLECULAR ONCOLOGY AND TUMOR GENETICS
Focus
H-prune and its multi
functions in cancer
H-Prune drives interactions with
several proteins that retain a strict
naturally unfolded carboxy-terminal
domain, which regulates interaction
and functionalities of protein targets
(Nm23-H1, GSK-3b, Gelsolin and
ASAP1). To obtain new, more potent
agents that specifically inhibit h-prune
activity, using structure and activity
relationship methodologies starting
from dipyridamole (DP), we synthesized eight new pyrimido-pyrimidine derivatives. We analyzed these
compounds for specificity towards
h-prune activities in vitro in cellular
models using scintillation proximity
assay of cAMP-PDE activity, cell proliferation assays and two-dimensional
cell migration following a top-down
strategy of selection. We found that
two pyrimido[5,4-d]pyrimidine compounds are more effective than DP
in two highly metastatic cellular models of breast cancer in vitro (Virgilio A,
Spano D. et al. Eur J Med Chem. 2012).
We then tested DP in vivo in a preclinical model of cancer to investigate
its clinical potential in the treatment
of breast cancer. Xenograft mice
bearing triple-negative breast cancer 4T1-Luc or MDA-MB-231T cells
were generated. In these in vivo models, we investigated the effects of DP
on primary tumor growth, metastasis
formation, cell cycle, apoptosis, signaling pathways, immune cell infiltration, and serum levels of inflammatory cytokines (Spano D. et al. Clin
Exp Metastasis 2012). Dipyridamole
significantly reduced primary tumor
growth and metastasis formation.
Moreover, it significantly decreased
the infiltration of tumor-associated
macrophages and myeloid-derived
suppressor cells in primary tumors
(p value < 0.005), as well as inflammatory cytokine levels in the sera of
the treated mice. Overall, our data
indicate that DP is a good candidate
for new therapies against solid cancers because it impairs inflammatory
cell responses during the formation
of the tumor–stroma niche microenvironment. These results open the
door to preclinical studies using new
DP derivatives.
Fig. 2:
Xenograft ortotopici
di cellule Daoy di
MB over-esprimenti
il miR34a tramite
infezione adenovirale:
effetti funzionali del
miR34a in vivo.
Grazie a Tecniche di
Bioluminiscenza in vivo
(BLI) applicati a cinque
topi in cui sono state
iniettate
nel
quarto
ventricolo
cerebellare,
le
cellule
Daoy-Luc
precedentemente infettate con AdV-miR-34a o con AdV-GFP-mock, abbiamo studiato
l’effetto del miR34a in vivo.
L’emissione di fotoni mostra che durante la carcinogenesi (25 giorni di analisi) vi è lo sviluppo
e l’attecchimento della massa tumorale nel cervelletto grazie all’utilizzo dell’adenovirus “AdVGFP-mock” (controllo), invece risulta una emissione ridotta quando le cellule sono trattate con
l’adenovirus “l’AdV-miR34a”, che esprime tante copie di miR34a nelle cellule di MB infettate.
Fonte: De Antonellis et al. PLoSOne. 2011
Orthotopic xenografts of medulloblastoma Daoy cells overexpressing miR34a induced by adenovirus infection: functional effects of miR-34a in vivo. A.
Bioluminescent imaging of five mice injected in the fourth cerebellar ventricle with Daoy-Luc cells
previously infected with AdV-miR-34a or AdV-GFP-mock viruses. Photon emission, after 25 days,
shows a larger tumor in AdV-GFP-mock-infected cells than in AdV-miR-34a-infected cells.
Source: De Antonellis et al. PLoSOne 2011.
Molecular genetic studies
related to genome analyses
and miRNA dysregulation in
childhood tumors
Medulloblastoma, the most common malignant pediatric brain
tumor, is currently treated with
nonspecific cytotoxic therapies including surgery, whole-brain radiation and aggressive chemotherapy.
We reported somatic copy number
aberrations in 1,087 unique medulloblastomas analyzed in the MAGIC
consortium. Furthermore, using
clonal genetic selection, we identified four main subgroups with distinct clinical characteristics: group 1
tumors show mutations in SHH and
its receptors; group 2 tumors are
driven by changes in WNT signaling,
generally through its main effector
gene b-catenin; group 3 tumors are
driven by changes in TGF-b-OTX2
signalling; and group 4 tumors are
driven by mutations in the MYC
and MYCN genes. These studies
are important for the future clinical
treatment of these high aggressive
pediatric tumors of central nervous
system origin (Northcott PA et al;
Nature. 2012).
We also investigated the role of
miRNAs in medulloblastoma tumors, in which Notch signaling is
involved in many of the cell-fatedetermining stages. In a screening
of potential targets in Notch signaling, miR-34a was found to regulate
the Notch pathway by targetting
Notch ligand Delta-like 1 (Dll1) (de
Antonellis P. et al. PLoS One 2011).
We then evaluated its effect on
apoptosis and neural differentiation,
and found that it impaired CD133+/
CD15+ tumor-propagating cells. Using reverse-phase proteomic arrays,
we identified Akt and Stat3 signaling
and their down-regulation in primary medulloblastoma tumors and in
medulloblastoma cell lines. In vivo, in
the medulloblastoma animal model
(Patch1+/- p53-/), we obtained evidence that the miR-34a/Dll1 axis
controls both the autonomous and
non autonomous signaling of Notch,
which indicates that miR-34a exerts
an anti-tumorigenic role in vivo (Fig.
2). Lastly, we studied the miR-17-92
microRNA cluster, and identified its
targets by mass spectrometry, and
verified that the miR-17-92 cluster
activates global protein expression
in neuroblastoma by targeting TGFb signaling (Mestdagh P. et al. Mol
Cell. 2010).
73
ONCOLOGIA MOLECOLARE E GENETICA DEI TUMORI
Focus
H-prune e la sua multifunzionalità
nel cancro
H-prune guida le interazioni con diverse proteine coinvolte nel riarrangiamento del citoscheletro, noi ora
sappiamo che questo avviene attraverso il dominio C-terminale di hprune che agisce sulla funzionalità di
proteine bersaglio (Nm23-H1, GSK3b, Gelsolin and ASAP1).
Partendo dalla struttura e dalla funzione del dipyridamole (DP), con lo
scopo di ottenere nuovi e più potenti
agenti specifici nell’inibire la funzione
di h-prune, abbiamo sintetizzato otto
nuovi derivati pyrimido-pyrimidine
(Virgilio A., Spano D. et al. Eur J Med
Chem, 2012) Questi nuovi composti
generati sono stati analizzati in modelli cellulari in vitro utilizzando la tecnica
di “scintillation proximity assay” (SPA)
per misurare l’attività del cAMP-PDE,
il saggio di proliferazione cellulare e
il saggio di migrazione bidimensionale
seguendo una strategia “top-down”
di selezione del miglior derivato. I nostri risultati hanno mostrato che due
composti, pyrimido[5,4-d]pyrimidine,
sono molto più efficaci del DP in due
modelli cellulari in vitro (noti essere
sistemi cellulari con alto potere invasivo del tumore al seno).
In seguito il DP è stato testato in vivo
in modelli preclinici nel topo, studiando il suo potenziale uso come farmaco per il trattamento del cancro al
seno. Sono stati generati topi xenotrapiantati e privi di parte del sistema
immunitario (topi Nudi) utilizzando
le cellule umane MDA-MB-231T e
topi singenici portanti cellule tumorali
murine del tumore al seno “triplenegative” 4T1-Luc. In questi modelli
in vivo è stato esaminato l’effetto del
DP sulla crescita del tumore primario, la formazione di metastasi, il ciclo
cellulare, l’apoptosi, i segnali di attivazione del cancro, l’infiltrazione di cellule immunitarie ed infine, i livelli di
citochine infiammatorie iniziatrici del
processo tumorale nel siero dei topi
stessi (Spano D. et al. Clin Exp Metastasis. 2012; Spano D. and Zollo M.,
Clin Exp Metastasis, 2012). Il DP, infatti, riduce significativamente la crescita
del tumore primario e la formazione
di metastasi, ed inoltre abbassa l’infiltrazione delle cellule note “macrofagi
associati alle cellule tumorali” (TAM)
ed infine delle cellule mieloidi soppressori (MDSC), nei tumori primari
generati (p value< 0.005), infine riducendo i livelli di citochine infiammato72
Fig. 1:
Network molecolare nel microambiente tumorale.
L’analisi String definisce i geni che mantengono la loro l’attività nei networks
che regolano le metastasi nel microambiente tumorale (attraverso ricerche in letteratura e dati identificati
nel nostro laboratorio). Sono indicati
in figura i gruppi di proteine (classificati con colori diversi) e la loro azione
di interazione specifica (annotazione
disponibile attraverso il software
DAVID: http://david.abcc.ncifcrf.gov).
Fonte: Spano et al. Semin Cancer Biol. 2012
Molecular networks within a tumor microenvironment.
String analyses through a literature
search and data produced in our laboratory, define genes that activate networks that regulate metastasis within
a tumor microenvironment. Each color
indicates proteins grouped in functional activities correlated to cancer initiation and progression; the connections between their
specific interaction networks within their gene functional classification are indicated (using the
DAVID functional annotation system available at http://david.abcc.ncifcrf.gov).
Source: Spano et al. Semin Cancer Biol. 2012.
rie presenti nel siero dei topi trattati.
Questi risultati sono utili per futuri
studi preclinici utilizzando i nuovi derivati del DP da noi precedentemente
identificati.
Studi di genetica molecolare
correlati ad analisi genomiche
e deregolazione di miRNA in
tumori pediatrici.
Il medulloblastoma, il più comune
tra i tumori pediatrici, è solitamente
trattato con terapie citotossiche non
specifiche che includono chirurgia,
radioterapia e chemioterapia aggressiva. Abbiamo identificato le aberrazioni somatiche nel numero di copie
(SCNAs) in 1087 medulloblastomi
analizzati nell’ambito del consorzio
internazionale MAGIC.
Inoltre sono stati identificati quattro
maggiori sottogruppi con distinte
caratteristiche cliniche: i tumori del
gruppo 1 presentano mutazioni in
SHH e nei suoi recettori; i tumori del
gruppo 2 sono guidati da variazioni
nel segnale WNT, generalmente nel
suo maggiore effettore, il gene b-catenina; i tumori del gruppo 3 presentano da mutazioni nella via del TGFBOTX2; nel gruppo 4 si riscontrano
mutazioni nei geni MYC e MYCN.
Questi studi sono fondamentali per i
futuri approcci terapeutici (Northcott
PA et al; Nature. 2012).
Seguendo questa linea di ricerca
abbiamo altresì studiato il ruolo dei
miRNA nei medulloblastomi (MBs)
in cui il segnale di Notch è coinvolto nella determinazione del destino
cellulare. In uno screening di potenziali bersagli del segnale di Notch ed
all’interno della sua via di trasduzione del segnale, il miR-34a è emerso
come suo regolatore bersagliando il
ligando di Notch Delta-like1 (DII1)
(de Antonellis P. et al; PLoS One. 2011).
Questi studi hanno descritto il ruolo di miR34a nell’apoptosi, nel differenziamento neurale, identificando
le sue funzioni nell’inficiare la attività delle cellule iniziatrici del tumore
(TPC) CD133+/CD15+. Infine attraverso saggi proteomici in fase inversa,
abbiamo identificato la regolazione
negativa di miR34a sui segnali cellulari
indotti dalle proteine Akt e Stat3.
Inoltre nei modelli animali di MB
(patch1+/- p53-/-) abbiamo evidenze che l’asse miR-34a/Dll1 controlli il
segnale autonomo e non autonomo
della funzione della proteina Notch,
confermando un effetto anti-tumorigenico del miR-34a in vivo (Fig. 2).
Infine, è stato studiato il gruppo dei
microRNAs 17-92, identificando mediante tecniche di spettrometria di
massa i suoi target molecolari genici
e verificando gli effetti della sua attivazione sull’espressione globale proteica delle cellule di neuroblastoma
(NB), dimostrando una forte intensificazione del segnale guidato dalla
proteina TGF-b (Mestdagh P. et al.
Mol Cell. 2010).
MOLECULAR ONCOLOGY AND TUMOR GENETICS
Focus
H-prune and its multi
functions in cancer
H-Prune drives interactions with
several proteins that retain a strict
naturally unfolded carboxy-terminal
domain, which regulates interaction
and functionalities of protein targets
(Nm23-H1, GSK-3b, Gelsolin and
ASAP1). To obtain new, more potent
agents that specifically inhibit h-prune
activity, using structure and activity
relationship methodologies starting
from dipyridamole (DP), we synthesized eight new pyrimido-pyrimidine derivatives. We analyzed these
compounds for specificity towards
h-prune activities in vitro in cellular
models using scintillation proximity
assay of cAMP-PDE activity, cell proliferation assays and two-dimensional
cell migration following a top-down
strategy of selection. We found that
two pyrimido[5,4-d]pyrimidine compounds are more effective than DP
in two highly metastatic cellular models of breast cancer in vitro (Virgilio A,
Spano D. et al. Eur J Med Chem. 2012).
We then tested DP in vivo in a preclinical model of cancer to investigate
its clinical potential in the treatment
of breast cancer. Xenograft mice
bearing triple-negative breast cancer 4T1-Luc or MDA-MB-231T cells
were generated. In these in vivo models, we investigated the effects of DP
on primary tumor growth, metastasis
formation, cell cycle, apoptosis, signaling pathways, immune cell infiltration, and serum levels of inflammatory cytokines (Spano D. et al. Clin
Exp Metastasis 2012). Dipyridamole
significantly reduced primary tumor
growth and metastasis formation.
Moreover, it significantly decreased
the infiltration of tumor-associated
macrophages and myeloid-derived
suppressor cells in primary tumors
(p value < 0.005), as well as inflammatory cytokine levels in the sera of
the treated mice. Overall, our data
indicate that DP is a good candidate
for new therapies against solid cancers because it impairs inflammatory
cell responses during the formation
of the tumor–stroma niche microenvironment. These results open the
door to preclinical studies using new
DP derivatives.
Fig. 2:
Xenograft ortotopici
di cellule Daoy di
MB over-esprimenti
il miR34a tramite
infezione adenovirale:
effetti funzionali del
miR34a in vivo.
Grazie a Tecniche di
Bioluminiscenza in vivo
(BLI) applicati a cinque
topi in cui sono state
iniettate
nel
quarto
ventricolo
cerebellare,
le
cellule
Daoy-Luc
precedentemente infettate con AdV-miR-34a o con AdV-GFP-mock, abbiamo studiato
l’effetto del miR34a in vivo.
L’emissione di fotoni mostra che durante la carcinogenesi (25 giorni di analisi) vi è lo sviluppo
e l’attecchimento della massa tumorale nel cervelletto grazie all’utilizzo dell’adenovirus “AdVGFP-mock” (controllo), invece risulta una emissione ridotta quando le cellule sono trattate con
l’adenovirus “l’AdV-miR34a”, che esprime tante copie di miR34a nelle cellule di MB infettate.
Fonte: De Antonellis et al. PLoSOne. 2011
Orthotopic xenografts of medulloblastoma Daoy cells overexpressing miR34a induced by adenovirus infection: functional effects of miR-34a in vivo. A.
Bioluminescent imaging of five mice injected in the fourth cerebellar ventricle with Daoy-Luc cells
previously infected with AdV-miR-34a or AdV-GFP-mock viruses. Photon emission, after 25 days,
shows a larger tumor in AdV-GFP-mock-infected cells than in AdV-miR-34a-infected cells.
Source: De Antonellis et al. PLoSOne 2011.
Molecular genetic studies
related to genome analyses
and miRNA dysregulation in
childhood tumors
Medulloblastoma, the most common malignant pediatric brain
tumor, is currently treated with
nonspecific cytotoxic therapies including surgery, whole-brain radiation and aggressive chemotherapy.
We reported somatic copy number
aberrations in 1,087 unique medulloblastomas analyzed in the MAGIC
consortium. Furthermore, using
clonal genetic selection, we identified four main subgroups with distinct clinical characteristics: group 1
tumors show mutations in SHH and
its receptors; group 2 tumors are
driven by changes in WNT signaling,
generally through its main effector
gene b-catenin; group 3 tumors are
driven by changes in TGF-b-OTX2
signalling; and group 4 tumors are
driven by mutations in the MYC
and MYCN genes. These studies
are important for the future clinical
treatment of these high aggressive
pediatric tumors of central nervous
system origin (Northcott PA et al;
Nature. 2012).
We also investigated the role of
miRNAs in medulloblastoma tumors, in which Notch signaling is
involved in many of the cell-fatedetermining stages. In a screening
of potential targets in Notch signaling, miR-34a was found to regulate
the Notch pathway by targetting
Notch ligand Delta-like 1 (Dll1) (de
Antonellis P. et al. PLoS One 2011).
We then evaluated its effect on
apoptosis and neural differentiation,
and found that it impaired CD133+/
CD15+ tumor-propagating cells. Using reverse-phase proteomic arrays,
we identified Akt and Stat3 signaling
and their down-regulation in primary medulloblastoma tumors and in
medulloblastoma cell lines. In vivo, in
the medulloblastoma animal model
(Patch1+/- p53-/), we obtained evidence that the miR-34a/Dll1 axis
controls both the autonomous and
non autonomous signaling of Notch,
which indicates that miR-34a exerts
an anti-tumorigenic role in vivo (Fig.
2). Lastly, we studied the miR-17-92
microRNA cluster, and identified its
targets by mass spectrometry, and
verified that the miR-17-92 cluster
activates global protein expression
in neuroblastoma by targeting TGFb signaling (Mestdagh P. et al. Mol
Cell. 2010).
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