REAL-TIME PCR
QUANTIFICAZIONE
DELL’ESPRESSIONE GENICA
Un metodo per misurare l’mRNA nei tessuti
biologici e in varie condizioni sperimentali
Prof.ssa: Diana Conte
Dott.ssa: Giulia Maria Camerino
Identificazione del meccanismo di azione dei farmaci…
Farmaco che modula l’espressione di una proteina!
Modificazione
POST-TRASCRIZIONALE
Tecniche di
BIOCHIMICA
Modificazione
ESPRESSIONE
GENICA
REAL-TIME
TRASCRIZIONE
RNA
DNA
POST
TRASCRIZIONE
FUNZIONE
Identificazione delle sostanze in grado di modulare
l’espressione genica di una proteina
RNA totale
Estrazione dell’RNA
totale da tessuto
cDNA
Retro-trascrizione del
mRNA tot. in cDNA
analisi
Real-time PCR
FASE 1….
TRATTAMENTO
PRELIEVO DEI
TESSUTI
CONGELAMENTO DEL
TESSUTI
CONSERVAZIONE A -8O °C
FASE 2….
OMOGENIZZAZIONE DEI TESSUTI
Per poter estrarre l’RNA dalle cellule dei tessuti è necessario frantumare il
tessuto e rompere le cellule che lo costituiscono:
Possibili metodi per la rottura delle cellule:
9Metodi meccanici
9Vibrazioni ultrasoniche
9Agenti litici responsabili della lisi celulare
METODO MECCANICO:
1. CONGELAMENTO DEL TESSUTO
IN GHIACCIO SECCO OAZOTO LIQUIDO
2. POLVERIZZAZIONE DEL
TESSUTO
CON IL PESTELLO
3. LISI CELLULARE ATTRAVERSO L’OMOGENIZZAZIONE CON IL POLITRON
(la polvere del campione in soluzione di lisi)
FASE
3….
RNA totale
Estrazione dell’RNA
totale da tessuto
cDNA
Retro-trascrizione del
mRNA tot. in cDNA
analisi
Real-time PCR
ESTRAZIONE DEL RNA TOTALE DA TESSUTO
Esistono 2 metodi fondamentali per l’estrazione degli acidi nucleici le quali
vengono scelte asseconda della quantità disponibile del materiale di partenza
METODO TRADIZIONALE
ESTRAZIONE CON FENOLO ACIDO
METODO ALTERNATIVO
UTILIZZO DI KIT CON
MEMBRANE DI SILICE
MEDTODO DEL FENOLO ACIDO:
fenolo acido-guanidina tiocianato (Trizol®)
Sostanze contenenti 2 fasi: una fase organica in qui si deposita il DNA passa nella fase
organica se il fenolo è tamponato con una soluzione a pH acido 5-6, e una fase organica
in qui si deposita l’RNA .
¾Dopo l’omogenizzazione effetuata direttamente in
Trizol® i campioni vengono centrifugati per consentire
eliminazione dei residui cellulari
¾Dopo un incubazione a temperatura ambiente, al
campione viene aggiunto il cloroformio e miscelato
¾Dopo una seconda centrifugazione, la soluzione sarà
divisa in tre fasi:
FASE AQUOSA:Contenente L’RNA
INTERFASE:Contenente le proteine
FASE FENOLICA:Contenente il DNA
¾La fase acquosa separata dalle altre viene miscelata con
isopropanolo centrifugata per ottenere un pellet di RNA
che viene prima lavato con una soluzione contenete etanolo
(75%) e acqua e poi risospeso in acqua RNAsi free.
MEDTODO ALTERNATIVO:
COLONNINE DI SILICE
Principio: gli acidi nucleici si legano alla matrice di silicio in presenza di Sali di caotropici
(presenti nelle soluzioni di lisi cellulari), la matrice di silicio non lega sostanze contaminati
presenti nei campioni come proteine e residui cellulari
Tessuto
Il campione nella soluzione di lisi viene
caricato nella colonnina al silice e
centrifugato
Tessuto in soluzione
di
lisi,
viene
omogeneizzato con
il potter
La membrana alla quale sono legati gli
acidi nucleici, viene lavata con soluzioni
saline in modo da eliminare i residui
contaminati dei tessuti e gliacidi nucleici
rimangono legati alla membrana
Alla soluzione viene
addizionato etanolo
Con una soluzione acquosa senza sali di
caotropici l’RNA si slega dalla membrana
e vinene recuperato
Maggiore efficienza di estrazione e un più elevato livello di purificazione del RNA rispetto ai
metodi classici
RNasi PRESENTI NEL AMBINETE
POSSONO DEGRADARE L’RNA DEI
CMPIONI
PROTEZIONE DALL’ATTIVITA’ DELLE RNasi:
¾RNase inibitor: proteine in grado di legare covalentemente l’RNasi e inibire al
90% la loro attività
¾SOLUZIONI CONTENENTI DIETILPIROCARBONATO (DEPC) agente
alchilante che reagisce con le proteine attaccando i residui istidinici
determinando la perdita del attività enzimatica
¾Evitare che l’RNasi presenti sulla pelle degradino l’RNA dei campioni (utilizzo
costante di guanti)
FASE
4….
RNA totale
Estrazione dell’RNA
totale da tessuto
cDNA
Retro-trascrizione del
mRNA tot. in cDNA
analisi
Real-time PCR
TRASCIZIONE INVERSA DEL RNA
La trascrizzione inversa consente di produrre una molecola di cDNA (DNA
complementare) partendo da una molecola di RNA, grazie all’utilizzo di un enzima
DNA polimerasi RNA dipendente (enzima identificato per la prima volta nei
retrovirus come ad esempio ’Avian Myeloblastosis Virus)
3’
5’
AAAAA
mRNA
5’
3’
APPAIAMENTO DEGLI
RANDOM PRIMER
oligo esa nucleotidi random
3’
mRNA
AAAAA
5’
SINTESI DEL cDNA per
ottenere una molecola ibrida
cDNA-RNA
cDNA
5’
3’
cDNA
Eliminazione dell’RNA tramite
l’utilizzo dell’ RNase
RNA totale
Estrazione dell’RNA
totale da tessuto
cDNA
Retro-trascrizione del
mRNA tot. in cDNA
FASE
4….
analisi
Real-time PCR
REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)
La Polymerase Chain Reaction (PCR) è una tecnica che permette di
amplificare una specifica sequenza di DNA milioni di volte in poche
ore.
“Inventore”della PCR nel 1983
Premio Nobel per la Chimica nel 1993
Mullis, K.B.,Faloona, F.A., Methods Enzymol. 1987, 153, 335350.
La PCR si basa sullo stesso meccanismo di duplicazione
che si svolge nelle cellule
REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)
Per effettuare una reazione di PCR, sono necessari:
•“Stampo”,una piccola quantità di DNA che si vuole amplificare
(DNA Target)
•“L’operaio”, l’enzima polimerasi che sintetizza il DNA
• i “mattoni”, una riserva di nucleotidi liberi costituita da
Adenina, Timina, Citosina, Guanina
•Innesco,2 primer: sequenze di DNA a singola filamento (2030 nucleotidi) sintetizzate artificialmente, hanno la funzione
di innescare la reazione di sintesi [un primer (for) è
complementare a un filamento di DNA all’inizio della regione
bersaglio; l’altro (Rev) è complementare all’altro filamento,
alla fine della regione bersaglio]
FASI DELLA PCR
La reazione a catena della polimerasi avviene in tre fasi successive,
ognuna delle quali si svolge ad una temperatura specifica.
STAMPO
1° FASE
Denaturazione: I 2filamenti di DNA si
96º
separano
2° FASE
Appaiamento:I primers si attaccano alle
50º
sequenze complemetari al gene target
3° FASE
72º
Taq
Taq
Taq
Taq
Taq
Taq
Legame della polimerasi e Estensione:
La Taq si lega ai primers e rapidamente
copia il DNA
In 30 cicli si ottengono un miliardo di molecole di DNA.
Polymerase Chain Reaction: resa
STAMPO
1°ciclo
2°ciclo
2 copie
4 copie
Durante la reazione di PCR la quantità di DNA cresce
in modo esponenziale
Polymerase Chain Reaction:
resa teorica e resa effettiva
1.E+09
DNA (Log)
La resa reale della PCR non è
esponenziale ma raggiunge un
plateau dove non si osserva nessun
incremento dei prodotti
PCR ideale
PCR effettiva
1.E+06
1.E+03
10
20
Cycle Number
30
Il processo di duplicazione della PCR è limitato dalla quantità dei primers, attività
della Taq polimerasi, nucleotidi e substrati
PCR reaction progression
Esponeziale: L’efficienza della reazione di amplificazione e assimilabile al 100%. il DNA
si amplifica in maniera molto precisa e specifica, i reagenti sono “freschi”.
Lineare: L’efficienza della reazione di amplificazione diminuisce. Il DNA si amplifica
piu’ lentamente, i reagenti iniziano a degradarsi.
Plateau: La reazione di amplificazione si ferma. Il DNA non è piu’ amplificato, i
Log. DNA
reagenti sono tutti degradati (END-POINT)
Gel Et Br
Real-time
Cicli di PCR
La real-time misura l'amplificazione durante la fase esponenziale della
PCR, quando cioè l'efficienza di amplificazione è influenzata minimamente
dalle variabili di reazione permettendo di ottenere risultati molto più
accurati rispetto alla PCR tradizionale "end point”
Log Concentrazine del DNA
Concentrazine del DNA
LINIARE
LOGARITMICA
Real-time-PCR
Misura l’amplificazione del DNA o cDNA
a ogni ciclo di PCR, ( in tempo reale )
durante la fase esponenziale della reazione.
Si serve di marcatori fluorescenti, cioè di molecole
che variano la loro fluorescenza quando si legano
al DNA
La fluorescenza varia in proporzione alla
“quantità” di amplificato.
SONDE FLUORESCENTI
Molecole in grado di legarsi in maniera specifica o aspecifica al DNA
amplificato ed emettere fluorescenza.
DETECTION NON SPECIFICI: emettono fluorescenza quando si intercalano
sulla doppia elica di DNA, sono definite “sonde intercalanti” (SYBR Green, YOYO)
DETECTION SPECIFICI: sono costituite
da
un
piccolo
filamento
di
DNA
complementare alla sequenza di analisi, alle
cui estremità 3’ e 5’ sono legati 2
fluorofori, sono definiti “probes” (Hydrolysis
probes, Hybridisation probes, Molecular
beacons)
Nonspecific chemistries
Specific chemistries
SYBRTM Green
TaqManTM
SYBRTM Gold
Hybridisatin
YoYoTM-1
Molecular Beacons
Yo-ProTM-1
Lanthanide
Amplifluor
ResonSenseTM
Quencher-labelled primers I
AnglerTM
Quencher-labelled primers II
HybeaconsTM
LuxTM primer
Light-upTM
EclipseTM
Ds complex probes
CycliconsTM
Nanoparticles
SYBR GREEN
E’ un intercalante del DNA, simile al EtBr, possiede
anche una lieve fluorescenza quando è in “soluzione”,che
aumenta quando si intercala con il doppio filamento di
DNA, durante la fase di estensione.
stampo
72º
96º
Denaturazione
Taq
Taq
Taq
96º
50º
Estenzione
Taq
Denaturazione
Appaiamento
Non è un marker specifico, in quanto lega qualsiasi DNA a doppia
elica in soluzione, pertanto richiede una lunga ottimizzazione.
CURVE DI DISSOCIAZIONE: TIME MELTING
Per alcuni saggi (intercalanti,
hybridisation
probe) dopo la reazione di PCR è possibileottenere
le curve di Melting: viene rivelata la fluorescenza
mentre i campioni vengono riscaldati (50°C-95
°C)
La fluorescenza aumenta quando il DNA è a
doppia elica (Tm), diminuisce quando il DNA è
denaturato
Tm
Le curve di melting sono utili nei saggi SYBER
green in quanto consentono di individuare con
precisione la presenza di un singolo amplificato, in
quanto a ogni picchio corrispone uno specifico
amplicone
82.6 88.1
TAQMAN
La sonda è costituita da una piccola sequenza di DNA complementare alla sequenza target, sui 5’ e
3’ sono coniugati il quencer e il reporter
La Taq polimerari è fornita di attività 5’-3’ eso-nucleasica che gli permette di eliminare i
nucleotidi che si trovano di fronte, in questo modo la Taq digerisce la sonda appaiata al DNA target
Estensione
stampo
5'
3'
3'
5'
5'
3'
Denaturazione
5'
3'
3'
5'
Appaiamento
5'
3'
Forward
Primer
R
Probe
R = Reporter
Q
= Quencher
Q
Forward
Primer
Taq
R
Probe
Q
p 3'
5'
Taq
5'
Digestione della sonda
Reverse
Primer
3'
5'
R
5'
3'
Q
Taq
p 3'
5'
Taq
5'
p 3'
3'
5'
5'
5'
Reverse
Primer
Polimerizzazione completata
3'
5'
R
5'
3'
5'
Q
p 3'
5'
3'
5'
MOLECULAR BEACONS
Il Probe è costituito da un piccolo filamento di DNA, con il quencer e reporter
coinigate alle 2 estremità 3’ e 5’. Il filamento di DNA è costituito da una frazione
specifica alla sequenza target e due frazioni vicine ai fluorofori disegnate in modo
da richiudere il Probe in una forma ad “anello”.
stampo
Loop:
Loop Sequenza di 15-30
basi, complemetare alla
sequenza targt.
Denaturazione
Stem:
Stem
5-7 basi (Tm 5570°C) conigata al 3´e 5´
con il
reportere e il
quencher
Appaiamento
Dyes:
• Reporter: Fluo, Fam, Hex,
Tet, Rox, Tamra, Cy3, Cy5,
• Quencher: BHQs, Dabcyl,
R
Q
Prodotto di PCR
R Q
HYBRIDISATION PROBE
Si serve di due Probe distinti, per ottenere il MASSIMO della SPECIFICITA’,
Fluorescenza FRET. 1) Probe 3’ fluoroforo Donatore (CFP)
2 )Probe 5’ fluoroforo Accettore (YFP)
I due Probes devono avere una distanza nella sequenza target 1-5 nucleotidi (20 A)
stampo
Denaturazione
(Primer in soluzione)
Annealing
I Probes sono in soluzione:
Il donatore è fluorescente (480 nm)
I fluorofori sono vicini
L’accettore è fluorescente (535 nm)
Sintesi
Denaturazione
(Primer in soluzione)
I Probes sono di nuovo in soluzione:
Il donatore è fluorescente (480 nm)
DISEGNO DELLE SONDE: PRIMER EXPRESS
Ricerca delle sequenze nucleotidiche dei geni target
Utilizzo di programmi specifici per il
disegno delle sonde (esempio TaqMan)
Il Probe è disegnato in modo da trovarsi in
una giunzione fra due esoni
ESON
INTRON
ESON
Primer For
ESON
Primer Rew
PROBE
Primer
ESON
PROBE
Primer
Diminuire il rischio di contaminazioni genomiche nel campione.
(il campione va comunque trattato con DNAse-free )
Preparazione di un esperimento di real-time
In ogni pozzetto vengono inseriti :
•Mix pre-impostata
•Primer For e Rev
•Sonda
•Campione di cDNA
Le Taq sono termostabili e si attivano a 95 °C pertanto è
possibile caricare i campioni a temperatura ambiente
1
2 3
4
5
6
7 8
9 10 11 12
Step di
attivazione
Cicli
A
B
C
D
E
F
G
Appaiamento e
estensione
H
Tutti i campioni vengono caricati sulla multiwell in
triplicato in modo da ottenere dati più accurati
Denaturazione
La quantificazione nella Real-Time PCR
Il valore della fluorescenza misurata durante ogni ciclo di PCR
rappresenta una misura della quantità di DNA amplificato a ogni ciclo.
Threshold : Linea soglia scelta in maniera da intersecare le curve di tutti i campioni
nella fase esponenziale
Log. Fluorescenza
Threshold cycle (Ct): il punto di intersezione fra il threshold e la curva di amplificazione
del DNA, numero di cicli del campione alla fluorescenza del threshold
Threshold
cicli
Ct Ct
Basso alto
A Ct più alto corrisponde una quantità di iniziale di gene target più basso, perché saranno
necessari un numero di cicli di PCR maggiori per arrivare alla fluorescenza del threshold
La quantità iniziale di DNA o cDNA è inversamente proporzionale al numero di cicli necessario
ad arrivare al threshold (Ciclo soglia, Ct)
GENE ENDOGENO: HOUSE KEEPING GENE
Per poter paragonare l’espressione del gene target in tessuti differenti è
necessario normalizzare i valori ottenuti con quelli derivanti da un gene
“endogeno”che si mantiene costante in tutti i campioni
Vandesompele et al.Genome Biology 2002
RNA totale
Estrazione dell’RNA
totale da tessuto
cDNA
Retro-trascrizione del
mRNA tot. in cDNA
FASE
6….
analisi
Real-time PCR
QUANTIFICAZIONE
RELATIVA
La quantità di RNA di partenza è calcolata
“relativamente” in base ad un RNA interno
(controllo endogeno) con il metodo Δ Δ Ct
ASSOLUTA
La quantità di RNA di partenza è identificata
utilizzando degli standard a concentrazione nota
di DNA o cDNA (interpolazione con la retta
degli standard)
QUANTIFICAZIONE ASSOLUTA DELL’RNA
In parallelo con i campioni da analizzare viene analizzato un campione a concentrazione
nota di RNA o cDNA Standard
Diluizioni seriali dello standard
Per interpolazione della retta ottenuta con
lo standard viene calcolata la concentrazione
dell’RNA dei campioni ignoti
Conc. del gene target
RATIO :
Conc. del gene endogeno
QUANTIFICAZIONE RELATIVA :
Metodo del ∆∆Ct
∆Ct= Ct campione ignoto gene target – Ct campione ignoto gene housekeeping
∆∆Ct= ∆Ct campione ignoto– ∆Ct campione di riferimento
Il campione di riferimento è un campione ignoto la qui quantità di
RNA viene arbitrariamente considerata pari a 1
Controllo
Campione
ΔCT
Questo metodo è valido se il gene
taget e l’ housekeeping possiedono
la
stessa
efficienza
di
amplificazione
APPARECHIATURA PER LA REAL TIME PCR
sistema a fluorescenza
in grado di emettere e
leggere la florescenza
(CCD CAMERA)
COMPUTER IN GRADO
DI RACOGLERE E
ELABORARE I DATI
ciclo termoregolatore
VANTAGGI
Sensibilità, 107 volte più preciso rispetto ai metodi classici
Affidabilità, grande ripetitività delle situazioni sperimentali
Specificità, possibilità di utilizzare sonde altamente specifiche
Rapidità
SVANTAGGI
Richiede un’alta conoscenza della tecnica
Alti costi della strumentazione e dei substrati
