ATTENZIONE: questi file compresi testo ed immagini in essi contenuti
sono destinati esclusivaemnte agli studenti del corso per favorirne lo
studio. Nessun file, che potrebbe contenere materiale soggetto a
copyright, può essere utlizzato per altri fini senza autorizzazione
Differenziamento
linfociti T effettori
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
Linfociti T naive vs. effettori
• Linfociti T naive richiedono segnali costimolatori
– cellule presentanti l’antigene professionali
• molecole costimolatorie [come B7.1 (CD80) e B7.2 (CD86)]
• Dopo la fase di intensa proliferazione indotta da IL-2 i
linfociti T CD4 e CD8 differenziano rispettivamente in
linfociti T effettori cooperanti e citotossici
– l’espressione di diverse molecole cambia
• Linfociti T effettori non richiedono segnali costimolatori
per lo svolgimento delle funzioni effettrici indotte dai
successivi incontri con l’antigene
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
1
Linfociti T CD4
T helper 1 (Th1) / T helper 2 (Th2) / T helper 17 (Th17) /
T follicular helper (TFH)
• Differenziamento linfociti Th:
– acquisizione della capacità di produrre selettivamente citochine
effettrici specifiche
• In base alle citochine prodotte i linfociti T CD4 possono
essere divisi in sottopopolazioni
– Th1 producono IFN-g, IL-2, LT
• non producono le citochine di tipo Th2
– Th2 producono IL-4, IL-5, IL-6, IL-13
• non producono le citochine di tipo Th1
– Th17 producono IL-17, IL-22
– TFH importanti per la risposta anticorpale T-dipendente
• (V. lezione su attivazione/risposta linfociti B)
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
Citochine diverse inducono il differenziamento
in T helper effettrici diverse
Cellule CD4 naive
Stimolazione TCR, CD28, …
IL-12
IFNg
Th1
IL-4
Th2
IL-6+TGFb
Th17
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
2
T helper effettrici diverse
producono citochine diverse
Cellule CD4 naive
Stimolazione TCR, CD28, …
IL-12
IFNg
IL-4
IL-6+TGFb
Th1
Th2
Th17
IFN-g
IL2
LT
IL-4
IL-5
IL-13
IL-17
IL-21
IL-22
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
T helper effettrici diverse svolgono
funzioni effettrici diverse
Cellule CD4 naive
Stimolazione TCR, CD28, …
IL-12
IFNg
IL-4
IL-6+TGFb
Th1
Th2
Th17
Protezione da
patogeni
intracellulari
(virus, batteri)
Protezione da
patogeni
extracellulari
(parassiti,
batteri)
Protezione da
patogeni
extracellulari
(funghi, batteri)
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
3
T helper effettrici diverse svolgono
funzioni effettrici diverse
Cellule CD4 naive
Stimolazione TCR, CD28, …
IL-12
IFNg
IL-4
Th1
IL-6+TGFb
Th2
Protezione da
patogeni
extracellulari
(parassiti,
batteri)
Protezione da
patogeni
intracellulari
(virus, batteri)
TGFb
Th17
Treg
Protezione da
patogeni
extracellulari
(funghi, batteri)
Immunoregolazione
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
Citochine espresse da linfociti Th1 and Th2
Citochina
Th1
Th2
LT (TNFb)
+
-
IFN-g
+
IL-2
+
GM-CSF
+
IL-3
TNF-a
MIP-1a
MIP-1b
IL-4
IL-5
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
IL-6
-
IL-13
-
IL-9
-
-
+
+
+
+
+
+
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
4
Cross-regolazione tra Th1 e Th2
APC
IL-12
inibizione del
differenziamento in
fenotipo opposto
Cellule effettrici
Th1
T
Thp
T CD4 naive
IL-2
IL-4
Loop positivi:
rinforzo del
differenziamento
Thp
IFN-g IL-4
Th1
Th2
Th2
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
Interleuchina 12 (IL-12)
• eterodimero
– IL-12 p35 (o IL-12a)
– IL-12 p40 (o IL-12b)
• omodimero
– IL-12 p40-p40, antagonista di p35/p40 nel topo
• recettore per IL-12
– IL-12Rb1 + IL-12Rb2
• omologhe a gp130
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
5
Espressione del recettore per IL-12
• solo in cellule recentemente attivate (non ancora
differenziate) e in cellule Th1
– persa durante differenziamento in linfociti Th2
• espressione è
– aumentata da IFNg
– diminuita da IL-4
• topi Balb/c
– producono alti livelli di IL-4
– hanno bassa espressione di IL-12Rb2
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
IFNg Proliferazione
Proliferazione
Citotossicità
NK
Proliferazione
macrofagi
Th2
T
Th1
IFNg
B
IgG2a
IgE
IL-12
neutrofili
cellule
dendritiche
Patogeni attraverso TLR o altri PRR (Pathogen Recognition Receptor)
Cellule T attivate mediante CD40L, IFNg, altri segnali
Università di Roma
Tor Vergata - Corso
di Laurea
in Scienze extracellulare
Biologiche - Immunologiadi
Molecolare
- dott.
Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
Componenti
della
matrice
tessuti
infiammati
6
Effetti di IL-4
Cambio di classe a
IgG1 e IgE nel topo
IgG4 e IgE nell’uomo
Inibizione
attivazione
macrofagi
Differenziamento
e proliferazione
linfociti Th2
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
Fonti di IL-4 durante il differenziamento
•
•
•
•
•
cellule Th2
cellule T NK1+
mastociti
basofili
eosinofili
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
7
Trasduzione segnale recettori citochine
JAnus kinase
(JAK)
Il dominio citoplasmatico
delle catene dei recettori
per citochine
legano le chinasi JAK
Il legame della citochina
dimerizza il recettore;
le JAK fosforilano
i domini citoplasmatici
delle catene del recettore
Jak1
Jak2
Jak3
Tyk1
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
Trasduzione segnale recettori citochine
Gli STAT legano i domini
citoplasmatici fosforilati
e vengono
fosforilati dalle JAK
Gli STAT fosforilati
formano dimeri che
entrano nel nucleo
e attivano trascrizione
• IL-12
→ STAT4
• IFN-g
→ STAT1
• IL-4
→ STAT6
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
8
•
•
•
Recettore per IFNg attiva
STAT1 che induce
trascrizione di Tbet
Recettore per IL12 attiva
STAT4 che induce
espressione di IFNg
Recettore per IL4 attiva
STAT6 che induce
espressione di GATA3
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
Diversi fattori promuovono il differenziamento
delle diverse T helper effettrici
Cellule CD4 naive
Stimolazione TCR, CD28, …
Tbet
Th1
GATA-3
Th2
RorgT
Th17
Foxp3
Treg
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
9
T-bet e differenziamento linfociti Th1
• T-bet è necessario per il differenziamento dei
linfociti Th1
– è indotto da IFNg attraverso l’attivazione di STAT1
– induce rimodellamento della cromatina
• rendendo il locus ifng accessibile ai fattori di trascrizione
• silenziando il locus il4 (il4,il5, il13)
– a seguito di fosforilazione sequestra GATA-3 e ne
inibisce l’azione
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
GATA-3 e differenziamento linfociti Th2
• GATA-3 è necessario per il differenziamento
dei linfociti Th2
– è indotto da TCR/CD28, IL-4, Notch1
– induce l’espressione di gata-3 stesso
• quando la proteina gata3 supera una certa soglia
– inibisce l’espressione di STAT4
– induce rimodellamento cromatina
• rendendo il locus il4 (il4, il5, il13) accessibile ai fattori
di trascrizione
• silenziando il locus ifng
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
10
Differenziamento Th1/Th2
• Fase iniziale:
– vengono attivati sia Tbet che GATA3
– entrambi i loci ifng e il4 sono accessibili
– co-espressione mRNA per citochine Th1 e Th2
– differenziamento dipendente da citochine
polarizzanti
– avvio dei processi di rimodellamento della
cromatina secondo i segnali che prevarranno
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
Differenziamento Th1/Th2
• Fase successiva:
– il differenziamento diventa progressivamente meno
dipendente dalle citochine polarizzanti
– prevale uno dei fattori, Tbet o GATA3
– progressiva stabilizzazione dell’espressione del locus
rilevante (ifng o il4) e aumento dell’espressione delle relative
citochine
– progressiva repressione del locus non rilevante (il4 o ifng)
– alla successiva (sola) stimolazione del TCR la cellula
risponde producendo citochine o Th1 o Th2
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
11
Mantenimento fenotipo / memoria epigenetica
• Massiccia riprogrammazione dell’espressione
genica durante il differenziamento
– centinaia di geni espressi differentemente in linfociti
Th1 e Th2
• La regolazione epigenetica conferisce una
stabilizzazione ereditabile dei pattern di
espressione genica
– ruolo fondamentale nel determinare e mantenere il
differenziamento cellulare
• Meccanismi epigenetici “liberano” le cellule dalla
necessità di citochine polarizzanti
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
Funzioni effettrici delle cellule Th1
Proliferazione e
differenziamento
Attivazione
macrofagi
(aumentata capacità
di uccidere batteri)
Opsonizzazione
e fagocitosi
Attivazione
neutrofili
Attivazione
linfociti T
citossici
(aumentata capacità
di uccidere batteri)
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
12
Funzioni effettrici delle cellule Th2
M0 attivato
IL-10
Ab neutralizzanti
topo IgG1
uomo IgG4
Inibizione
attivazione M0
Degranulazione
mastociti
Attivazione
eosinofili
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
Leismaniosi cutanea
• Leishmania major, protozoo parassita
– risiede e si replica obbligatoriamente nei macrofagi
dell’ospite
• Topi del ceppo C57Bl/6
– sono resistenti a L. major
– geneticamente predisposti a sviluppare risposte Th1
– IFN-g attiva iNOS, inducible nitric oxide synthase
controllo del patogeno
• Topi del ceppo Balb/c
– sono sucettibili a L. major
– geneticamente predisposti a sviluppare risposte Th2
– IL-10 e IL-4 inibiscono attivazione iNOS
peggioramento patologia
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
13
Importanza della giusta scelta Th1/Th2 nella risposta
immunitaria; l’esempio del morbo di Hansen (lebbra)
Risposta cellulo-mediata
Gravità patologia
Forma tubercolare
Forma lepromatosa
Linfociti Th1 IFN-g
Attivazione macrofagi
Linfociti Th2 non attivano (o
inibiscono) i macrofagi
Infezione da M. leprae
Eliminazione batteri
intracellulari
Malattia meno grave
Sopravvivenza
Infezione da M. leprae
Proliferazione dei batteri
intracellulari non controllata
Gravi danni ai tessuti
Morte
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
Cellule T regolatorie (Treg)
• Cellule CD4 esprimenti CD25 (catena a
recettore IL2) costitutivamente
– esprimono CTLA-4, PD1 e GITR
• Controllano l’ampiezza della risposta
immunitaria e assicurano la tolleranza
– inibiscono attivazione linfociti T e cellule
dendritiche
• Foxp3 fattore di trascrizione richiesto per
differenziamento e funzioni Treg
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
14
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
Origine delle cellule T regolatorie (Treg)
• Originano nel timo come
popolazione CD4+CD8-CD25+
IL-2
TGFb?
IL-2
TGFb
– migrano in tessuti periferici dove
mantengono tolleranza
– «natural Treg» or «thymic
Treg»
• Possono differenziare anche
in tessuti periferici a partire
da linfociti T CD4 naive
– in particolari condizioni di
stimolazione
– “induced Treg”
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
15
FOXP3
N
C
PROLINE-RICH DOMAIN
ZINC-FINGER
LEUCINE
ZIPPER
FORKHEAD DOMAIN
• Repressore trascrizionale a livello di diversi
promotori di citochine
• La sua espressione è ristretta principalmente alla
popolazione CD4+CD25+ nel timo e in periferia:
TIMO
PERIFERIA
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
Cross-regolazione del differenziamento
Foxp3
• inibisce l’attivazione dei
fattori che inducono il
differenziamento dei
linfociti effettori
• promuove la propria
espressione
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
16
Foxp3 agisce sia come repressore
che attivatore trascrizionale
• “... a large number of Foxp3bound genes are up- or
downregulated in Foxp3+ T
cells”
– Foxp3 acts as both a
transcriptional activator and
repressor
Zheng et al, Nature 445: 936, 2007
• Foxp3 regulates, among
others, genes encoding
nuclear factors that control
gene expression and
chromatin remodelling
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
Foxp3, forkhead box P3
• Mutazioni in Foxp3 provocano
– fenotipo scurfy nel topo
– IPEX (immunodysregulation, polyendocrinopathy and
enteropathy, X-linked syndrome) nell’uomo
– mancanza di Treg
– rottura tolleranza
– processi autoimmuni
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
17
IPEX – Clinical Findings
• First described in 1982 by Powell et al. as a syndrome
of diarrhea, polyendocrinopathy, and fatal infection in
infancy.
• Neonatal onset diabetes mellitus
• Hypothyroidism
• Enteritis (diarrhea/villous atrophy)
• Hemolytic anemia & thrombocytopenia.
• Dermatitis
•Death by 1-2 years of age
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
18
