Oncologia Sperimentale I - II
METASTASI SPERIMENTALI
RIPRODUZIONE DEL PROCESSO METASTATICO
IN VIVO
5° S. Beninati
Dr. Angelo De Martino
Principi di tumorigenesi
EZIOPATOLOGIA DELLE
NEOPLASIE
• Cause chimiche
• Cause fisiche
• Cause biologiche
•
•
•
•
•
•
•
Idrocarburi aromatici policiclici ed eterociclici
Aflatossine
Amine aromatiche e composti azoici
Nitrosamine aromatiche
Idrocarburi alogenati
Cancerogeni presenti in natura
Cancerogernesi ormonale
Chemical Carcinogens
• Direct-acting
• Indirect-acting (must be metabolized to
activated metabolic forms)
Electrophiles
• Direct-acting carcinogens are already
electrophilic
• Indirect-acting carcinogens are
metabolically activated into electrophilic
species
Electrophilic Theory of Chemical
Carcinogenesis
• Electrophilic (electron-seeking)
molecules will bind to nucleophilic
(electron-rich) macromolecules in the
cell
– DNA
– RNA
– Proteins
Electrophiles
• Direct-acting carcinogens are already
electrophilic
• Indirect-acting carcinogens are
metabolically activated into electrophilic
species
Electrophilic Theory of Chemical
Carcinogenesis
• Electrophilic (electron-seeking)
molecules will bind to nucleophilic
(electron-rich) macromolecules in the
cell
– DNA
– RNA
– Proteins
•
•
•
•
Radiazioni ionizzanti
Radiazioni ultraviolette
Cancerogenesi da corpi estranei
Traumi
Skin cancer is one of the most
common human cancer and one
of the most preventable
• ~106 cases of BCC and SCC are
diagnosed per year
• This is more than all other types of
cancer combined
• Most of these will be caused by
exposure to ultraviolet (UV) irradiation
Asbestos
• Widely used in construction, insulation,
and manufacturing
• Family of related fibrous silicates
• Chrysotile
• Crocidolite
Malignant Mesothelioma
• Mainly occurs in pleural and peritoneal
cavities
• Rare in general population
• Latent period of ≥20 years
Ionizing Radiation
• Death of pioneer radiation researchers
from neoplasms
• High incidence of leukemia among
radiologists recognized in 1940s
• Osteosarcoma incidence in radium dial
painters
•
•
•
•
Virus oncogeni
Ruolo dei retrovirus
Ruolo dei fattori ereditari
I parassiti
Viral Carcinogenesis
• Viral infections account for an estimated
one in seven human cancers worldwide
• Majority of these are due to infection
with two DNA viruses
– HBV - linked to hepatocellular carcinoma
– HPV - linked to cervical carcinoma
Oncogenic Viruses
•
•
•
•
•
•
Human papillomaviruses - HPV
Epstein-Barr Virus (EBV)
Human herpesvirus 8 (HHV8)
Hepatitis B virus - HBV
Hepatitis C virus - HCV
HTLV-I, HTLV-II
Human papilloma virus (HPV)
• Over 70 subtypes
• DNA virus with small double-stranded
circular genome
• Subtypes possess varying degrees of low
risk and high risk
Low and High Risk HPV
• HPV subtypes classified as low risk or
high risk based on whether the genital
tract lesions with which these HPVs are
associated are at significant risk for
malignant progression
Viral Carcinogenesis
• Viral infections account for an estimated
one in seven human cancers worldwide
• Majority of these are due to infection
with two DNA viruses
– HBV - linked to hepatocellular carcinoma
– HPV - linked to cervical carcinoma
Oncogenic Viruses
•
•
•
•
•
•
Human papillomaviruses - HPV
Epstein-Barr Virus (EBV) monoclueosi
Human herpesvirus 8 (HHV8)
Hepatitis B virus - HBV
Hepatitis C virus - HCV
HTLV-I, HTLV-II
Human papilloma virus (HPV)
• Over 70 subtypes
• DNA virus with small double-stranded
circular genome
• Subtypes possess varying degrees of low
risk and high risk
Low and High Risk HPV
• HPV subtypes classified as low risk or
high risk based on whether the genital
tract lesions with which these HPVs are
associated are at significant risk for
malignant progression
EBV - Involvement in Human
Tumors
• African Burkitt lymphoma
• B-cell lymphomas of immunosuppressed
patients
• Some cases of Hodgkin lymphoma
• Nasopharyngeal carcinomas
How Do Viruses like HPV and
HBV Cause Cancer?
• Very small viruses
• Can integrate their viral DNA into host
genome
• They code for viral proteins which block
tumor suppressor proteins in cells
Helicobacter pylori
• Gastric infection linked to gastric
lymphomas and adenocarcinomas
• Detection of H pylori in majority of cases of
gastric lymphomas
• Antibiotic treatment results in gastric
lymphoma regression in most cases
ONCOGENI VIRALI ELEMENTI ESSENZIALI DI
CANCEROGENESI VIRALE
onco-DNAvirus
Infezione in cellule permissive
- proteine precoci
- proteine tardive
Infezione in cellule non permissive
- proteine precoci (oncoproteine)
Rb
X
p53
X
ONCOGENI: DEREGOLAZIONE
• Mutazione puntiforme
• Amplificazione
• Traslocazione
• Inversione
• Mutagenesi inserzionale
• Alterazione stato di metilazione
• Meccanismi Epigenetici
I tumori si comportano come tessuti aberranti in cui
vengono “dirottate” funzioni fondamentali
dell’omeostasi tissutale e della crescita cellulare
Cos’é un tumore?
“The most generally accepted definition of a tumor is that it is a tissue
overgrowth which is independent of the laws governing the remainder of the
body.
It is usual to add as a qualifying phrase to separate tumors from reparative
processes, such as bone callus, that the neoplasm serves non useful purpose to
the organism
.”
La definizione generalmente accettata di un tumore è che si tratta di
una crescita eccessiva di tessuto, e questa crescita è indipendente
dalle leggi che regolano il resto del corpo.
Si è soliti aggiungere come frase qualificante per separare i tumori da
processi riparativi, come il callo osseo, è che la neoplasia ha scopo
non utile per l'organismo.
1922, P.C. Wood, Textbook of Pathology
Cancer: General Etiology and
Pathogenesis
Tumore = malattia dei geni
80 % tumori: fattori ambientali
20 % tumori: fattori endogeni
di cui 1-5 % ereditari
Environmental vs. Hereditary
Cancer
100
85
80
60
40
15
20
0
Cancer Etiology
Environmental
Hereditary
Tumore del seno
Tessuto ghiandolare normale
Tessuto tumorale
Tumore del Colon
Lesione pre-tumorale
Cellule trasformate
normale
trasformata
Il tumore: malattia genetica!
-Esistono tumori ereditari
-Esistono tumori umani indotti da virus
-Una cellula tumorale orgina una progenie con caratteristiche tumorali
-Esistono alterazioni cromosomiche associate a insorgenza di tumori
-L’esposizioni ad agenti mutageni aumenta l’incidenza di tumori
La perdita di regolazione della
crescita cellulare che é alla base
dell’insorgenza dei tumori é dovuta a
un danno del DNA
Il danno é indotto da
agenti carcinogeni o spontaneo.
Quali sono gli obiettivi delle
mutazioni?
LA CELLULA E’ COME UN AUTOMOBILE
PERFETTA SE BEN TENUTA
ACCELERATORE
FRENO
MECCANICO
= ONCOGENE
= GATEKEEPER
= CARETAKER
ONCOSOPPRESORI
SE L’ACCELERATORE RIMANE PIGIATO,
SE IL FRENO SI ROMPE
SE IL MECCANICO TRASCURA IL MEZZO…
Quali geni vengono mutati nei tumori?
ONCOGENI
ONCOSOPPRESSORI
(tumor suppressor)
Regolazione della
proliferazione
stimolazione
inibizione
Tipo mutazione
Gain of
Function
Loss of Function
modello
Acceleratore
Freno
Cellule del corpo umano: 10.000 trilioni (1018)…
Il DNA é soggetto a continue mutazioni
104-106/giorno /cellula:
agenti mutageni - replicazione DNA - metabolismo cellulare
Se si tiene conto di questo elevato turn over
cellulare, la comparsa di una cellula
tumorale é un evento raro:
- Eliminazione/riparo
- Multi hit model
Destino di una cellula il cui DNA é mutato:
Una cellula che ha subito un danno genomico non
necessariamente origina un tumore:
- Apoptosi
-Riparo del danno
- Eliminazione a opera del SISTEMA IMMUNITARIO
MULTI-HIT MODEL
MUTAZIONI MULTIPLE
Cellula normale
Cellula maligna
Il tumore si origina per selezione clonale!
“survival of the fittest”
Sopravvive il più Adatto
Lo sviluppo del tumore é guidato dall’acquisizione
sequenziale di alterazioni genetiche il cui effetto é
l’attivazione costitutiva di oncogeni e l’inattivazione
di oncosoppressori.
L’effetto finale é l’acquisizione di alcune capacitá
comuni a tumori di origine diversa
Capacitá Acquisite
Hanahan e Weinberg, Cell 2000
Tappe della progressione tumorale:
modello multi-stadio
Iniziazione:
Cellula normale -> cellula neoplastica latente
Promozione:
A seguito di ulteriori mutazioni cellula neoplastica latente
origina un tumore clinicamente evidente
Progressione:
Il tumore acquisisce nuove caratteristiche aggressive che
lo rendono invasivo e metastatico.
MULTI HIT MODEL: una semplice evidenza
Frequenza di mutazioni negli eucarioti é 10-4
to 10-6 per gene per generazione
Statistica: multiple mutazioni richiedono tempo
Infatti: Il rischio di tumore aumenta con l’etá
Infiammazione e cancro
Introduzione
Evidenze di legame infiammazione-cancro
Perché infiammazione aumenta rischio tumore
•Via intrinseca/ Via Estrinseca
•
•Oncogeni e infiammazione
•
•Relazione infiammazione cancro: il caso di NF-kB
Rudolf Virchow 1863
Osservazione:
Infiltrato leucocitario presente in biopsie di tumori
Ipotesi
Tumore si sviluppa in siti di infiammazione cronica
Oggi: evidenze
15% dei tumori ha origine da un infezione:
Agente patogeno causa una situazione di infezione cronica associata a infezione persistente
-Helicobacter pylori: tumore del stomaco
-Herpes virus: tumore della cervice uterina
-HBV/HCV: tumore del fegato
Infiammazione cronica aumenta rischio tumore:
Malattie infiammatorie del colon (chron disease, colite ulcerosa): carcinoma del colon
Pancreatite cronica: carcinoma del pancreas
Epatite: Hepatocellular carcinoma
Oncogeni inducono pathway infiammatorio
Cellule infiammatorie, citochine e chemochine presenti in fasi precoci
sviluppo tumore
Inibizione dei pathway infiammatori (inattivazione genetica o
farmacologica) inibiscono incidenza tumore
Un sito di infiammazione cronica é
un’ambiente che favorisce stadi iniziali
dell’insorgenza tumori: perché?
Un richiamo alle tappe della
carcinogenesi chimica aiuta a
comprendere questo
fenomeno
Occorrono piú mutazioni per
avere un tumore:
multi hit model
Tappe della progressione tumorale:
modello multi-stadio
Iniziazione:
Cellula normale -> cellula neoplastica latente
Promozione:
A seguito di ulteriori mutazioni cellula neoplastica latente
origina un tumore clinicamente evidente
Progressione:
Il tumore acquisisce nuove caratteristiche aggressive che
lo rendono invasivo e metastatico.
Tappe della progressione tumorale:
modello multi-stadio
Iniziazione:
Cellula normale -> cellula neoplastica latente
Promozione:
Agenti promotori :
Agenti chimici (esteri del forbolo), fattori rilasciati nelle
ferite, resezione parziale di un organo, ormoni,
infiammazione cronica.
Agenti promotori:
inducono proliferazione
Progressione:
cell. infiammatorie
Ilrichiamano
tumore acquisisce
nuove caratteristiche aggressive che
lo rendono invasivo e metastatico.
Favoriscono l’insorgenza di nuove mutazioni
DMBA-TPA
7,12-dimetilbenz [a] antracene (DMBA) è un immunosoppressore e un potente cancerogeno organospecifico usato in laboratorio. DMBA è ampiamente usato in molti laboratori di ricerca che studiano il
cancro. DMBA serve come iniziatore di tumore.
Promozione tumore può essere indotta con trattamenti di 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetato (TPA) in
alcuni modelli di carcinogenesi in due fasi. Questo permette un tasso notevolmente accelerato della
crescita tumorale, rendendo possibili molti studi tumorali.
Cancerogeno
(DANNO)
- DMBA (DiMetilBenzAntracene)
Co-cancerogeno (PROMOZIONE) - TPA
Induzione di papillomi su cute di topo:
-1 trattamento con DMBA
-Due trattamenti settimanali con TPA, per 12 - 24 settimane
monitoraggio
ESEMPIO
Un sito di infiammazione cronica é
un’ambiente che favorisce :
-stadi iniziali dell’insorgenza tumori
-fasi successive della tumorigenesi
Le fasi iniziali
1) Danno leucocitario:
Rilascio di sostanze tossiche,
azoto
2) Rigenerazione tissutale
CIOÉ:
Danno al DNA + stimolo proliferativo
Rischio tumore
e
Gli attori dell’infiammazione
sono coinvolti anche in fasi
successive della tumorigenesi
-interazione leucociti-tumore
-Tumor Associated Macrophages (TAM)
Interazione tra leucociti e
cellule tumorali
Citochine possono influenzare la migrazione/crescita di
cellule tumorali che esprimono il recettori corrispondente:
TUMORIGENESI/METASTASI
COME:
Melanomi esprimono numerosi recettori per chemochine, infatti
altamente metastatici.
Oncogeni inducono espressione dei recettori o di citochine
(caso RET, vedi dopo)
Cellule tumorali rispondono a citochine/chemochine
infiammatorie.
es.: TNF-IL6 inducono recettori su cellule tumorali che ora
“sentono” il ligando e crescono di piú e diventano invasive.
Infiltrato leucocitario e tumori
Ruolo dei TAM
Bilancia macrofagica:
I macrofagi possono avere due tipi di fenotipo:
• M1: funzione citotossica
• M2: proliferazione, angiogenesi, degradazione ECM
Nei tumori sono presenti Macrofagi richiamati da
chemochine specifiche per (CCL2):
sono chiamati TAM (Tumor Associated Macrophage)
Sono macrofagi di fenotipo M2:
→Stimolano proliferazione, angiogenesi, metastasi!
Infiammazione e cancro
Introduzione
Evidenze di legame infiammazione-cancro
Perché infiammazione aumenta rischio tumore
Via intrinseca/ Via Estrinseca
Oncogeni e infiammazione
Relazione infiammazione cancro: il caso di NF-kB
Infiammazione - rischio tumori
VIA ESTRINSECA
Un sito di infiammazione cronica é un micromabiente ricco in
fattori che possono alterare il controllo della crescita cellulare e
indurre danno al DNA
le leggi che normalmente regolano la morte/proliferazione sono
alterate:
si puó avere la replicazione del DNA e duplicazione di cellule
con alterati meccanismi di controllo della crescita.
Oncogeni e rischio tumore
VIA INTRINSECA
Perché infiltrato leucocitario e mediatori dell’infiammazione
sono presenti nella maggior parte tumori, quindi anche in
casi per cui non c’é una base epidemiologica per
l’infiammazione?
Esistono alterazioni genetiche (oncogeni) che determinano
un ambiente infiammatorio:
attivano gli stessi pathway attivati durante l’infiammazione
Prima evidenza via intrinseca
un oncogene attiva pathway infiammatori:
RET/PTC
Tumore: carcinoma papillare della tiroide (PTC)
Proto-oncogene: RET, tirosin-chinasi
Sistema cellulare: tirociti umani normali esprimenti RET/PTC
Risultato: trasformazione + attivazione pathway infiammatorio
REarranged during Transfection/Papillary Thyroid Carcinoma
Trasduzione del segnale
RTK attivate da ligando solubile: es.: EGF, PDGF
Trasduzione del segnale
RET/PTC
RET is an abbreviation for "rearranged during transfection”: exp in 3t3 cells, genomic DNA from Lymphomas
Tyrosin Kinase
Il proto-oncogene RET codifica per un recettore tirosinchinasico:
mutationi RET gain of function: associate a vari tumori
umani, tra cui carcinoma della tiroide.
RET/PTC1 overespresso
• Cellule crescono di piú
• acquisiscono un fenotipo “trasformato”
NB:
PTC=Carcinoma Papillare della Tiroide
H4 = il gene con cui avviene la fusione
Y451F: mutazione inattivante
RET induce proteine
infiammatorie -1
sunto
RET induce proteine
infiammatorie - 2
Alti livelli di proteine infiammatorie sono state
ritrovate anche in biopsie di pazienti affetti
da PTC e portatori di mutazioni RET.
Se affetti da metastasi ai linfonodi, I livelli
sono ancora piú alti.
Ras e IL6
RAS: famiglia di GTPasi di membrana
non legata a recettori (H-Ras, N-Ras , K-Ras)
•Esempio di GAP:
•NF1:codifica per Neurofibromin.
•Tumor suppressor in Neurofibromatosi!
•
GEF: GTP Exchange Factor
• GAP: GTPase Activating
Protein
RAS: trasduzione del segnale
Ligando
Recettori
Trasduzione
del segnale
RAS
trascrizione
Segnale a valle di RAS
Mitogeno
RAS
G0⇒G1: Early Response Genes (jun, fos)
Segnale a valle di RAS
Mitogeno
RAS
G0⇒G1: Early Response Genes (jun, fos)
Regolazione del ciclo cellulare
Segnale a valle di RAS
Mitogeno
RAS
Raf
chinasi attivata da interazione con RAS - cambio conformazione
MAPKK
Attivate da fosforilazione da Raf
MAPK
Attivate da fosforilazione da MEK
G0⇒G1: Early Response Genes (jun, fos)
conclusioni
• Oncogeni sono in grado di modulare i
pathway infiammatori
• Tale capacitá é essenziale per la
tumorigenesi
messaggio
• Gli eventi genetici necessari e sufficienti per
l’insorgenza di un tumore umano risultano associati
all’attivazione di un ambiente infiammatorio
• Un ambiente infiammatorio favorisce tumore
domanda
Qual é la cooperazione tra oncogeni e infiammazione?
RASV12 e pancreatite cronica
Sistema:
-Attivazione tessuto specifica di RASv12 nel pancreas
-Induzione di pancreatite tramite trattamento con un analogo della Colecistochinina(*)
RASV12 induce carcinoma del pancreas solo se é in atto pancreatite
(*) Caeruleina: analogo della colecistochinina, induce rilascio di enzimipancreatici
Modello:
carcinoma insorge in seguito a cooperazione tra
infiammazione cronica e mutazione di un oncogene
Topo adulto
pancreatite
attivazione
RASV12
No tumore
attivazione
RASV12
tumore
Modelli sperimentali in vivo
• Permettono di valutare due parametri:
• proliferazione
• Colonizzazione/invasione
• Ogni altro parametro non è valutabile
IL MODELLO ANIMALE
• SONO
UTILIZZATI
DIVERSI
MODELLI
ANIMALI
PER
RIPRODURRE
IL
PROCESSO
METASTATICO
E
LA
SUCCESSIVA INVASIONE E COLONIZZAZIONE DELL’ORGANO
BERSAGLIO
• I MODELLI CHE SI USANO COMUNEMENTE PERMETTONO DI
INOCULARE
CELLULE
TUMORALI
DIRETTAMENTE
NELL’ANIMALE IN DIVERSE PARTI DEL CORPO:
• INTRAMUSCOLO
• INTRAPERITONEALE
• INTRAOCULARE
INTRASPLENICA
ENDOVENA
SOTTOCUTANEA
Parametri:
Volume,Peso,Aspetto,
angiogenesi, necrosi
tumore
Capsula connettivale
Tumore primario indotto con inoculo
intramuscolare di cellule di melanoma murino
MODELLI ANIMALE DI MELANOMA
• Due modelli animali sono utilizzati per lo
studio del melanoma:
• Il modello polmonare
• Il modello splenico
Animali
• I topi del ceppo C57BL/6 sono utili se si
usano linee cellulari di melanoma murino
(B16-F10;B16-FLr6)
• Utilizzando topi singenici*, cioè dai quali
sono state ottenute le linee tumorali, è
ridotto drasticamente il fenomeno del
rigetto.
•
*individui della stessa specie che sono geneticamente identici, per esempio animali
dello stesso ceppo consanguineo. Cellule proveniente da individui singenici possono
essere usate per modelli di trapianto d'organo e tumorali.
C57BL/6
Modello splenico
• Una sospensione di cellule di melanoma
viene iniettata direttamente nella milza
dell’animale.
Inoculo nella milza
Le cellule di melanoma passano in circolo
e invadono il fegato.
Le metastasi sono visibili poichè ricche di
melanina nera.
Fegato con
metastasi
Modello Polmonare
• Le cellule di melanoma murino C57BL/6
sospese nel mezzo di coltura vengono
iniettate endovena nella vena caudale
dell’animale.
Vena caudale
Attraverso il circolo raggiungono un solo
organo bersaglio: il polmone
Anche in questo caso le metastasi sono
visibili poiché ricche di melanina.
Polmoni di
controllo
metastasi
Polmone di topo C57BL/6 invaso da
cellule tumorali di melanoma B16-F10
Valutazione del potere metastatico
• E’ possibile valutare il numero di metastasi
superficiale per mezzo di una conta visiva. Il
metodo risulta empirico e poco preciso in
particolare in presenza di un alto numero di
metastasi.
• E’ necessario considerare che l’organo bersaglio
è invaso anche nel suo stroma interno.
• Quindi la conta superficiale è sicuramente poco
significativa
Polmone di topo C57BL/6
invaso da metastasi di cellule
B16-F10
Polmone di topo C57BL/6
invaso da metastasi di
cellule B16-F10 trattato con
antineoplastici
Modello istologico di valutazione del
potere metastatico
• Per poter effettuare una conta delle
metastasi attendibile è necessario
considerare anche le metastasi interne.
• A tal fine l’organo bersaglio viene
sezionato in sottili fettine, per mezzo di un
microtomo.
• Il microtomo permette di ottenere fettine
sottilissime e trasparenti, denominate
“sezioni istologiche seriate”
Sezioni istologiche
seriate di polmone
di topo C57BL/6
inoculato con
cellule B16-F10
Analisi di immagine computerizzata
• Ogni singola sezione viene analizzata al
computer con un software adatto per la
misura di cinque parametri principali:
• 1. area della sezione istologica
• 2. area delle metastasi
• 3. numero di metastasi
• 4. area occupata dalle metastasi
• 5. percentuale di colonizzaione
Elaborazione morfometrica
• Il computer elabora i parametri precedenti
e il risultato permette di valutare:
• 1. area totale della sezione istologica (TA)
• 2. area media di una metastasi (AAMF)
• 3. area metastatica totale (TMA)
Invasione e proliferazione
• IL modello di calcolo nasce da due
considerazioni:
• La cellula tumorale invade l’organo
bersaglio e quindi inizia a proliferare.
• L’invasione può essere valutata
considerando il numero di metastasi
• Mentre la proliferazione valutando le
dimensioni delle metastasi
Elaborazione dei dati
• L’analizzatore di immagini permette quindi
di calcolare:
• L’area totale della sezione istologica TA
• L’area metastatica totale MTA
• L’area media di una metastasi AAMF.
• Attraverso questi parametri si ricavano tre
indici.
Indice di invasione
• Il rapporto
•
TMA/AAMF
• Si definisce Indice di Invasione o “Invasion
Index” (II)
•
•
•
II=TMA/AAMF
TMA= area metastatica totale
AAMF= area media di una metastasi
Invasione
• Infatti il rapporto TMA/AAMF definisce il
numero di metastasi totale, poiché deriva
da:
• TMA= area metastatica totale
• AAMF= area media di una metastasi
Indice di proliferazione
• Il rapporto
•
AAMF/TA
• Si definisce come indice di crescita o “Growth
Index” (GI)
•
•
•
GI=AAMF/TA
AAMF= area media di una metastasi
TA= area totale della sezione istologica
Indice di colonizzazione
• Il rapporto
•
TMA/TA x 100
• Esprime la percentuale di colonizzazione,
indicando quanta area è stata occupata
dalle metastasi. Si indica come %CI
•
•
TMA= area metastatica totale
TA= area totale della sezione istologica
