Metodiche molecolari di ricerca e di analisi delle mutazioni geniche

In base al potere di risoluzione della
tecnica
Metodologie citogenetiche
Metodologie molecolari
• Formulare la domanda
• Utilizzare la metodica appropriata
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DNA
DNA
RNA
RNA
PROTEINE
Cromosomi (cariotipo, FISH, CGH)
Geni (analisi di mutazioni specifiche o ricerca di mutazioni in un gene candidato)
Genomi (Genomica Strutturale, Genomica funzionale, Genomica comparata)
Studi espressione di un singolo gene codificante proteine (o di pochi geni)
Studi di RNA non codificanti
Trascrittomica (studi di espressione di tutti i trascritti presenti in una specifica
cellula in uno specifico momemento)
Proteine
Analisi Western - Microscopia
Proteomica
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Metodologie molecolari
Analisi Southern (DNA)
Analisi Northern (RNA)
Analisi Western (Proteine)
PCR (DNA)
RT-PCR (RNA)
Microarray (DNA – RNA – Proteine)
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Sonde Molecolari
Sequenze nucleotidiche marcate a singolo
filamento in grado di riconoscere
sequenze complementari
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• Denaturazione di una molecola di acido
nucleico a doppia elica
• Rinaturazione o ibridazione di
polinucleotidi a filamento singolo in una
molecola a doppia elica
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Marcatura
• Radioisotopi (32P, 3H, 35S)
• Fluorescenti (biotina-avidina)
• Chemiluminescenti (fosfatasi alcanica)
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Analisi Southern
• Estrazione del DNA
• Quantificazione e Controllo Qualità
• Digestione con Enzimi di Restrizione
• Elettroforesi preparativa
• Trasferimento del DNA dal gel ad un supporto di nylon
• Ibridazione con la sonda
• Autoradiografia
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Enzimi di Restrizione
Endonucleasi che riconoscono e tagliano il DNA a
livello di specifiche sequenze
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Elettroforesi
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Elettroforesi di DNA genomico umano
tagliato con enzimi di restrizione
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Immagine ottenuta
dopo:
ibridazione della
membrana con una
specifica sonda
esposizione della
membrana su lastra
autoradiografica
sviluppo della lastra
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Diagnosi di malattie da espansione
di triplette ripetute
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Analisi Northern
• Estrazione dell’RNA totale
• Isolamento degli mRNA o Arricchimento dei miRNA
• Elettroforesi
• Trasferimento del RNA dal gel ad un supporto di nylon
• Ibridazione con la sonda
• Autoradiografia
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Elettroforesi di RNA totale
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Limiti
• Notevole quantità di DNA - RNA – Proteine
(numero elevato di cellule da analizzare)
• Uso di sostanze radioattive
• Tempo impiegato
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PCR - Polymerase Chain Reaction
ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il
premio Nobel per la chimica (1993).
Questa tecnica, utilizzando i principi della
duplicazione del DNA,
permette di ottenere in poco tempo
notevoli quantità di materiale specifico
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PCR schema
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•
•
•
•
•
DNA bersaglio
Primers
Enzima
Nucleotidi trifosfati
Ioni Mg++
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Campione
DNA bersaglio
Primers
Enzima
Oligonucleotidi sintetici complementari
a sequenze fiancheggianti il tratto di
DNA da studiare 20 – 25 bp
DNA polimerasi
Nucleotidi trifosfati
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Termociclatori
Denaturazione del DNA
(94°C)
Ibridazione dei primers al bersaglio
(40°C – 60°C)
Sintesi del DNA
(72°C)
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Denaturazione
Ibridazione
Sintesi
Denaturazione
Ibridazione
Sintesi
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Vantaggi
• Si può evitare l’uso di tecniche più
laboriose. Velocità di esecuzione
• Si possono analizzare campioni di poche
cellule (anche 1 cellula). Elevata
sensibilità
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Biopsie
Analisi prenatale e Analisi preimpianto
Tracce di infezioni virali
Malattia mimima residua
Medicina forense
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Real Time PCR
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Permette di quantificare
il DNA del campione
analizzato
•Ricerca di DNA virali
•Ricerca di OGM negli
alimenti
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RT-PCR
Reverse transcription-PCR
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Sequenziamento
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