Programma di ricerca relativo al bando per un assegno di ricerca
NUOVI AGENTI ANTITUMORALI PER IL TRATTAMENTO DI NEOPLASIE
EMATOLOGICHE E SOLIDE: STUDI IN VITRO E IN VIVO
La ricerca oggetto di questo assegno riguarda la caratterizzazione di nuovi inibitori delle
deacetilasi istoniche (HDAC inibitori; HDACi) che per la loro capacità di indurre arresto
della crescita e/o apoptosi e/o differenziamento in cellule di tumori ematologici e solidi
umani offrano opportunità traslazionali di interesse clinico.
Dal punto di vista della struttura chimica, questi composti sono benzodiazepine (BZD)derivati, generati dalla coniugazione di BZD (usate come cap) tramite una catena (linker)
con un gruppo idrossammato, funzionale per chelare lo ione Zn++ nella tasca delle HDACs.
Variando la lunghezza della catena e il suo punto d’inserzione sul nucleo benzodiazepinico è
stata sintetizzata una serie di ibridi idrossammato-BZD con elevata attività HDAC-inibitoria,
citostatica e pro-apoptotica nelle cellule tumorali in vitro (ma non nelle cellule normali) e
con apparente bassa tossicità in vivo.
I nuovi HDACi sono protetti da un brevetto europeo (#PCT/IB20087055424) e statunitense
(#US8,324,202 B2) e i loro effetti su diverse linee di sottotipi di leucemia mieloide acuta
(AML) e di carcinoma prostatico sono già stati pubblicati (1-3). Va segnalato che alcuni dei
questi composti hanno dimostrato attività HDAC-inibitoria comparabile a quella dell’acido
suberoilanilide idrossamato (SAHA o Zolinza, vedi più avanti) un ben noto HDACi già
approvato dall’agenzia statunitense Food & Drug Administration (FDA) per il trattamento
del linfoma cutaneo a cellule T (4).
Negli ultimi anni è stata riportata e discussa l'efficacia dei differenti HDACi che sono in fase
I/III dei trials clinici. Comunque, molti degli HDACi sviluppati e impiegati ad oggi (tra cui
esteri del forbolo, n-butirrati, esametilene bisacetamide, acido valproico e diversi altri) si
dimostrano molto efficaci in vitro, mentre in vivo manifestano un certo grado di tossicità a
livelli terapeutici (5-8) e vengono quindi impiegati preferibilmente nei casi di neoplasie
resistenti alla terapia standard o recidivanti. Più di recente, gli HDACi idrossammati come il
SAHA sono stati proposti come agenti differenziativi e/o apoptotici delle cellule tumorali
attraverso l'interazione della catena idrossamica con lo ione Zn++ nel sito attivo delle
HDACs. Va detto che oltre agli HDACi-idrossammati, anche gli HDACi non-idrossammati
tra cui chetoni elettrofilici (MS-275) acido valproico e peptidi ciclici (Depsipeptide) sono di
grande interesse clinico per il trattamento di vari tipi di tumori.
Inoltre, si ricorda che gli istoni non rappresentano i soli bersagli del sistema HDAC-HDACi
e che una serie di altre proteine non-istoniche (tra cui fattori di trascrizione) non ancora
chiaramente identificate vanno incontro a processi di acetilazione/deacetilazione che ne
modificano profondamente e in maniera dinamica l’attività fisiologica. Queste interferenze
farmaco-indotte sul metabolismo cellulare, a livello citoplasmatico e nucleare, sono
particolarmente evidenti nelle cellule tumorali (ma non nelle cellule normali) e che per
questa specifica e sensibile risposta all’azione degli HDACi rappresentano un bersaglio
molto promettente della loro attività anti-tumorale.
Per questo motivo si guarda con molto interesse allo sviluppo e caratterizzazione di nuovi
HDACi meno tossici e più potenti che, da soli o in combinazione con altri agenti possano
modificare l'espressione di geni targets nelle cellule tumorali e siano utilizzabili per trattare
alcune tra le neoplasie ematologiche e solide più frequenti. Infatti, dalla letteratura
specializzata emerge che, oltre all'uso di HDACi in monoterapia, lo sviluppo di protocolli
clinici opportuni per il trattamento dei tumori debba puntare alla combinazione di farmaci
che includono insieme agli HDACi anche agenti demetilanti e citotossici convenzionali e di
altri composti. Saranno quindi usati in combinazione: As2O3, ATRA, TNF-alfa; composti
demetilanti (5-aza-2'-deoxycytidine e 5-azacytidine); antimetaboliti (5-fluoro-deoxyuridina e
gemcitabina); doxorubicina e cisplatino, tutti impiegati a basse dosi per trarre vantaggio
dalle loro eventuali attività sinergiche per ridurre le concentrazioni terapeutiche efficaci dei
farmaci e limitare così gli effetti indesiderati nell'ospite.
I nuovi HDACi saranno anche testati con preparazioni di singole isoforme di HDAC
ricombinanti per valutare mediante dosaggi “cell-free” con kit commerciali colorimetrici o
fluorimetrici, l'efficacia e la specificità di un dato ibrido verso singoli isoenzimi delle varie
classi (I, IIa, IIb e IV). I risultati di questo tipo di saggio si confrontano con quelli dei test
cosiddetti “cell-based” con cui viene invece valutata la capacità di uno specifico HDACi, sia
questo chirale o non-chirale, di penetrare all’interno delle cellule e di interagire in maniera
appropriata/efficace con i target naturali rappresentati dalle varie isoforme delle HDAC.
Lo scopo previsto da questo assegno di ricerca è quello di fornire maggiori informazioni
sugli effetti degli HDACi nelle cellule neoplastiche e in particolare su i meccanismi di
azione degli HDACi che devono essere approfonditi ulteriormente per comprendere quali
siano tra le varie isoforme di HDACs quelle più specificamente coinvolte e quali siano i loro
target che più ancora delle proteine proteine istoniche dovrebbero riguardare in modo
particolare le proteine non-istoniche. Queste ultime infatti sono ancora in gran parte bersagli
sconosciuti sia delle HDAC che della loro modulazione in risposta al trattamento con
HDACi e che sembrano decisivi nel governare passaggi importanti del metabolismo
cellulare.
Questo aspetto dei meccanismi di azione degli HDACi rappresenta un punto cruciale della
presente ricerca per le implicazioni che comportano nella posibile identificazione di nuovi
bersagli terapeutici e di controllo della progressione del processo neoplastico.
Le metodologie utili allo svolgimento del progetto di ricerca riguardano genericamente una
serie di saggi morfologici, immunologici, biochimici e molecolari per monitorare le
modificazioni farmaco-mediate legate all’arresto della crescita cellulare, al differenziamento e alll’inesco del processo apoptotico. Più in dettaglio si richiede: un’esperienza
pluriennale in un laboratorio di Biologia Cellulare e Molecolare con competenze: (i) nella
separazione delle proteine mediante elettroforesi, Western blot e immunorivelazione con
anticorpi specifici; (2) separazione e analisi di RNA/DNA mediante rt-PCR e Q-PCR.; (3)
analisi citofluorimetriche mediante marcatura con ioduro di propidio (PI) per valutare il
ciclo cellulare oppure con la marcatura con Annessina V/PI per quantificare la morte
cellulare programmata nelle popolazioni trattate; (4) nell’istopatologia e immunoistochimica
dei campioni; (5) nell’analisi in microscopia (ottica, contrasto di fase e fluorescenza); (6)
modificazione dell’espressione genica con procedure di trasfezione cellulare sia con
plasmidi per over-esprimere oppure che con i siRNA per silenziare specifici geni.
Alcuni degli obiettivi di questa ricerca possono essere riassunti come riportato di seguito.
Gli ibridi BZD-idrossammati saranno testati in vitro su una serie di linee di leucemia
mieloide acuta (AML) e su cellule derivate da neoplasie mieloproliferative croniche (MPN)
monitorando la sensibilità delle cellule neoplastiche (rispetto a quelle normali) al trattamento
con i nuovi HDACi. Questi aspetti riguardano le modificazioni nei livelli di acetilazione
delle proteine istoniche e non-istoniche, ma anche i cambiamenti farmaco-indotti sul ciclo e
sulla vitalità e crescita cellulare così come sulla morfologia e motilità delle cellule,
sull’espressione di geni e di proteine chiave coinvolti/coinvolte nel controllo della crescita
cellulare, del differenziamento e dell’apoptosi.
Alcuni Riferimenti bibliografici
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3. Laurenzana A et al. (2013) Effectiveness of the Histone Deacetylase Inhibitor (S)-2 against
LNCaP
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Human
Prostate
Cancer
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PLoS
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8(3):
e58267.doi:10.1371/journal.pone.0058267
4. Mann BS et al. (2007) FDA approval summary: vorinostat for treatment of advanced
primary cutaneous T-cell lymphoma. Oncologist;12(10):1247-52
5. Minucci S, Pelicci PG. (2006) Histone deacetylase inhibitors and the promise of epigenetic
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7. Marks PA et al. (2007) Dimethyl sufoxide to vorinostat: Development of this histone
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Prof. Alessandro M. Vannucchi
