Identificazione degli OGM

“SperimentailBioLab”
Iden4ficazionedegliOGM
UniversitàdegliStudidiMilano
Se3oreDida5co,viaCeloria20,Milano
Laboratorio105
Indice
1.Conoscenzepropedeu4che
• 1.1CosaèilDNA
• 1.2Lastru3uradelDNA
• 1.3DalDNAalcromosoma • 1.4GenoHpoefenoHpo
• 1.5ReplicazionedelDNA
• 1.6Ve3oridiclonaggio • 1.7Trasformazione
2.IntroduzioneagliOGM • 2.1ComesifannogliOGM • 2.2PerchésifannogliOGM?
• 2.3Fasidell’analisidiunOGM
3.Primadiandareinlaboratorio .3.1Preparazionedelcampione
p.3
p.3
p.4
p.4
p.5
p.5
p.5
p.6
p.9
p.6
p.6
p.7
p.8
4.Tecnicheu4lizzate nell’aHvitàdilaboratorio
p.11
p.22 p.30
!2
p.9
5.Iden4ficazionediunOGM
p.14
• 5.1Resistenzaagliinse5
p.14
• 5.2Tolleranzaaglierbicidi
p.15
• 5.3Ilcostru3ousatopertrasformarelapiantep.16
• 5.4Protocollosperimentale p.17
5.4.1Ele3roforesisugeldiagarosio;soluzioniereagenH
p.17
5.4.2Preparazionedelgeldiagarosio p.17
5.4.3Corsaele3roforeHca
p.18
5.4.4Interpretazionedelrisultatodellacorsaele3roforeHca p.19
6.Normegeneralidisicurezzainlaboratorio
p.20
7.Quizdiautovalutazione 8.Glossario 1.Conoscenzepropedeu4che
1.1Cos’èilDNA?
DNAstaperDeoxyriboNucleicAcid;èunacomplessasostanzachimicachesitrovanelnucleodi
tu3elecelluleeportal’informazioneperlosviluppodegliorganismi.
• Il DNA è il materiale ereditario responsabile delle cara3erisHche degli individui e quindi
dellesomiglianzeedifferenzetraglistessi.
• IlDNAèunico,diversodaindividuoaindividuo,ecce3ocheperigemellimonozigo4ci,il
cuiDNAèidenHco.
• IlDNAèvisualizzatoso3oformadicromosomiduranteladivisionecellulare.
1.2LastruUuradelDNA
La molecola del DNA è un polimero, ossia è un insieme di tanH monomeri: i nucleoHdi. Ogni
nucleoHde è cosHtuito da tre componenH:
u n g r u p p o fo s fa t o , u n o z u c c h e r o
(desossiribosio) e una base azotata. La
molecola di DNA è formata da due catene
polinucleo4diche avvolte l’una intorno
all’altra con andamento destrorso. Le due
catenesonoan4parallele,cioèiduesingoli
filamenH sono orientaH uno in direzione 5’
→3’el’altro3’→5’.Glischeletrizucchero
– fosfato si trovano all’esterno, le basi
azotateall’interno.Lebasidelleduecatene
sono unite tra loro mediante legami a
idrogeno (Fig. 1). Le basi sono
complementarieilloroappaiamentoè:
A=TAdenina-Timina
G≡CGuanina-Citosina
L’informazione geneHca risiede nella
sequenzadibasi.
Fig. 1. Struttura della doppia elica del DNA.
!3
1.3DalDNAalcromosoma
Ciascun cromosoma eucarioHco conHene una lunga doppia elica di DNA che si estende da una
estremitàall’altradelcromosomastesso.LalunghezzacomplesssivadelDNAdei46cromosomidi
una cellula umana, è circa 2 metri; ne deriva quindi la necessità di compa3are (spiralizzare) la
molecola,perchèlasualunghezzasiacompaHbileconledimensionidelnucleo.
Alla molecola di DNA sono associaH gli istoni (proteine basiche), essenziali per perme3ere
l’avvolgimento e il ripiegamento del DNA in stru3ure estremamente compa3e, vale a dire i
cromosomi,visibilisoloduranteladivisionecellulare.IlprocessodispiralizzazionedelDNA(Fig.2)
prevedelivellisuccessividiavvolgimento(compa3amento).
a)
b)
Fig. 2. I livelli di organizzazione della cromatina che
danno origine ad un cromosoma euariotico.
a)
Doppia elica di DNA
c)
d)
e)
f)
!4
b)
“Collana di perle” di nucleosomi
c)
Fibre di nucleosomi addensati a forma di
solenoide
d)
Domini ad anse
e)
Spirali condensate
f)
Cromosoma metafasico
1.4Geno4poefeno4po
Il geno4po è la cosHtuzione geneHca di una singola cellula o di un singolo organismo, mentre il
feno4poèl’insiemedellecara3erisHchevisibilioinqualchemodoevidenziabilidiunacellulaodi
unorganismo.Adesempio,fenoHpoènonsoloilcoloredegliocchi,ilcoloredellapelleol’altezza
(cara3erisHche visibili), ma anche il Hpo di gruppo sanguigno (cara3erisHca non visibile, ma
evidenziabileconsaggidilaboratorio),cosìpureunamodificazionegeneHcainunapiantanonsi
vedeosservandola,mapuòessereevidenziataconlaPCResuccessivaele3roforesi(vedi§2.3).Il
fenoHpo non è determinato solo dai geni, ma dipende anche dall’interazione del genoHpo con
l’ambiente. La statura di una persona, ad esempio, è influenzata dai geni, tu3avia la loro
espressione può essere modificata dalle interazioni con l’ambiente esterno (ad esempio,
alimentazione)ointerno(adesempio,ormoni).
1.5ReplicazionedelDNA
LareplicazionedelDNAintu3elecellulevivenH,daiba3eriall’uomo,èunprocessocomplesso,
che richiede l’intervento di più di una dozzina di enzimi diversi. La replicazione comincia in
corrispondenza di siH de5 origine di replicazione
presenH ad intervalli lungo i cromosomi. In quesH
siH, alcune proteine srotolano la doppia elica di
DNA, rompendo i legami a idrogeno tra le basi dei
filamenHcomplementari.
Fig. 3. Rappresentazione grafica della replicazione del DNA, con
la formazione dei due nuovi filamenti complementari ai filamenti
“stampo” della molecola originaria.
L’allineamento e unione tra loro dei nucleoHdi
complementari avviene per azione della DNA
polimerasi che procede solo in direzione 5’→3’. La
DNA polimerasi per iniziare il processo ha anche
bisogno di un innesco (de3o anche primer), a cui
a3accarsi e procedere con la polimerizzazione.
Durante la replicazione del DNA, il primer è
cosHtuitodaunacortasequenzapolinucleoHdicadi
RNA. La replicazione è semiconservaHva: ogni emielica(singolofilamento)dellamolecolamadreserve
dastampoperlasintesidiunnuovofilamento,per
cui ogni doppia elica figlia sarà cosHtuita da un
filamento vecchio e da un filamento nuovo. Le
molecole risultanH sono copie esa3e dell’originale.
Da una doppia elica madre derivano due doppie
eliche figlie uguali tra loro e uguali alla molecola
madre(Fig.3).
1.6VeUoridiclonaggio
Un ve3ore è una molecola di DNA capace di replicarsi in una cellula ospite. I ve3ori più
frequentemente usaH in biotecnologia sono i plasmidi del ba3erio Escherichia. coli. I plasmidi
sono piccole molecole di DNA circolare a doppio filamento extracromosomici che esistono
naturalmenteneiba3eri,concuiconvivonocomesimbionH.Sireplicanoautonomamentenella
cellulaospite,grazieallapresenzadiunasequenzadiorigine(ORI)dellareplicazione(Fig.4).
!5
MolH plasmidi contengono geni che
forniscono benefici alla cellula ospite (per
esempio geni che codificano enzimi che
i n a 5 v a n o g l i a n H b i o H c i , e q u i n d i
conferiscono resistenza ad essi), o geni di
trasferimento,checodificanoproteinecapaci
di formare un tubo macromolecolare
a3raverso cui il DNA plasmidico può essere
trasferito ad altre cellule. E’ il caso del
plasmide Ti contenuto nel ba3erio
Agrobacteriumtumefaciens.
Per il clonaggio del DNA si usano plasmidi
modificaH geneHcamente in laboratorio, da
cui sono staH eliminaH praHcamente tu5 i
geni e che contenegono solamente una
origine di replicazione del DNA (ORI), un
Fig 4. Struttura di un plasmide: OR = origine di replicazione del DNA
ampr = gene per la resistenza all’antibiotico ampicillina
genecheconsentelaselezione(ingenereun
gene per la resistenza a un anHbioHco, ad
esempioilgeneampr;checonferisceresistenzaall’anHbioHcoampicillina)eunaregioneincui
possonoessereinseriHisegmenHdiDNAesogeno.
1.7Trasformazione
Latrasformazioneèun’alterazionegeneHcadiunacellula,ba3ericaoeucarioHca,causatadalla
assunzione e dalla espressione di DNA esogeno. Incubando ve3ori plasmidici geneHcamente
modificaH con cellule ba3eriche, quest’ulHme possono acquisire il DNA plasmidico ed essere
trasformate. Per produrre piante geneHcamente modificate (PGM), il plasmide Ti
opportunamentemodificatovienereintrodo3onelba3erioAgrobacteriumtumefaciensconcui
successivamente si infe3ano le cellule vegetali che si vogliono trasformare. Perché la
trasformazionesiastabile(ecioèereditabile)ènecessariocheilDNAplasmidicodiTisiintegri
nelcromosomadellacellulavegetale.
2.IntroduzioneagliOGM
2.1ComesifannogliOGM?
Gli Organismi GeneHcamente ModificaH (OGM) sono virus, ba3eri, funghi, piante e animali le
cuicara3erisHchegeneHchesonostatemodificateinlaboratoriomediantel’inserimentodiun
gene estraneo, de3o transgene. In genere uno o più geni presi da altri organismi vengono
introdo5nelpatrimonioereditariodell’organismochesivuolemodificarea3raversoparHcolari
ve3ori, tra i quali i più usaH sono plasmidi e virus. In parHcolare, per o3enere piante
geneHcamente modificate (PGM) si uHlizza un ve3ore naturale, il plasmide Ti, presente nel
ba3erioAgrobacteriumtumefaciens,comeillustratonellafigura(Fig.5).
Nel plasmide Ti viene introdo3o, con tecniche di ingegneria geneHca, il gene che si vuole
trasferireallapianta,insiemeadungenecheconsentadiselezionarelecelluletrasformate(per
esempioungenecheconferisceresistenzaaunanHbioHco).Siinfe3anolecellulevegetalicon
l’Agrobacteriumtumefaciens“ingegnerizzato”esiselezionanolecelluletrasformate(resistenH
all’anHbioHco).
!6
A differenza delle cellule animali differenziate, le cellule vegetali sono spesso toHpotenH ed è
possibile rigenerare una intera pianta da una singola cellula vegetale. Cellule vegetali
transgeniche,quindi,possonodareorigineapiantetransgeniche.
Fig.5. La produzione di piante transgeniche resistenti alla larva della piralide è realizzata mediante tecniche di ingegneria
genetica su Agrobacterium usato come organismo vettore del gene Bt.
2.2PerchésifannogliOGM?
Lepiantevengonomodificatepermigliorarnelaqualità
damolHpunHdivista:
• a5vitàinse5cida,
• resistenzaaerbicidi,
• tolleranzaastressambientali,
• vitapiùlungaomaturazioneritardata,
• migliori qualità nutrizionali delle proteine del
seme,
• allungamentodeitempidiconservazione,
• nuovastrategiaperlaproduzionedivaccini.
!7
2.3Fasidell'analisidiunOGM
PeresserecerHcheunorganismosiageneHcamentemodificato,bisognaricercarenelsuoDNAla
presenzadiungeneestraneo(transgene)cherendel'organismoospiteingradodiesprimereun
nuovo cara3ere, non Hpico della specie di appartenenza. Gli OGM sono spesso fenoHpicamente
idenHcialHpotradizionaleequivalente,nelsensochel’aspe3ogeneralenonèdiverso,anchese
l’OGMhaacquisitounacara3erisHcaereditarianuova,dovutaaltransgene.Ledifferenzepossono
esseretrovatealivellogenoHpico,ecioènellasequenzadelDNA.DunqueperidenHficareunOGM
bisognaparHredalsuoDNA.E'possibilecomunqueancheunaviaalternaHvaperidenHficareun
OGM. Infa5, poiché un gene si esprime a3raverso la sintesi di una proteina, è anche possibile
effe3uare la ricerca del prodo3o derivante dall'espressione del gene inserito, ossia la proteina
stessa, valutarne le funzioni, ivi compresi i prodo5 che possono derivare dalla sua a5vità (per
esempio,produzionedinuovicomponenHnell'organismomodificato).
InentrambiiHpidianalisisipartedalprodo3oalimentareinquesHone,de3omatrice.
…. Quindi o si ricerca il gene o il prodotto del gene……
!8
LanostraanalisisibasasulprimometodoecomprendeleseguenHfasi:
• campionamento
• estrazionedelDNA
• amplificazioneconPCR
• ele3roforesi
• analisideirisultaH
3.Primadiandareinlaboratorio
3.1Campionamento
Il campionamento rappresenta una fase criHca in un processo di analisi. La buona riuscita
dell'analisidipendeinfa5dallemodalitàconcuiesso
è condo3o. Il campione predisposto all'analisi deve
perciò essere il più possibile rappresentaHvo della
matricedipartenzaedessereomogeneo.Lagrande
sfida durante la preparazione dei campioni è la
produzione di estra5 di DNA che siano
rappresentaHvi dell'ogge3o in analisi, che molto
spesso è dell'ordine di grandezza del carico di un
ba3ello cargo con migliaia di tonnellate di fave di
soia o di mais. A causa del miscuglio durante la
raccolta, lo stoccaggio e il trasporto, un prodo3o
OGM potrebbe non essere ben distribuito nella
matrice di partenza, essere, per esempio, più
concentratoinunpuntopiu3ostocheinaltri;perciò
quando campioniamo dobbiamo eseguire più prelievidallamatriceeinpunHdiversi.
Se i prodo5 da analizzare sono aliquote
confezionate, si eseguono prelievi casuali di alcune
aliquote,rispe3andolanormaHvavigente.
Lapreparazionedelcampionedeveessereeseguita
conmoltecautele,adesempioinambienHdedicaH,
inmododaevitareognipossibilecontaminazioneda
partediDNAestraneo.
I campioni che vengono so3oposH all’analisi per
l’idenHficazione della presenza di OGM sono
rappresentaH da semi (mais, soia), ma anche
sfarinaH e prodo5 alimentari complessi come
prodo5 da forno, prodo5 a base di cioccolato, di
!9
soia,cornflakesecc.
Un organismo gene4camente modificato (OGM) è un organismo vivente che possiede
unpatrimoniogeneHcomodificatotramitetecnichediingegneriageneHca,checonsentono
l'aggiunta,l'eliminazioneolamodificadielemenHgeneHci.
Con il termine Organismo GeneHcamente Modificato (OGM) si intendono soltanto gli
organismi in cui parte del genoma sia stato modificato tramite le moderne tecniche di
ingegneria geneHca. Non sono consideraH "organismi geneHcamente modificaH" tu5
quegliorganismiilcuipatrimoniogeneHcovienemodificatoaseguitodiprocessispontanei
(modificazionietrasferimenHdimaterialegeneHcoavvengonoinfa5innaturainmolteplici
occasioni e tali processi sono all'origine della diversità della vita sulla terra), o indo5
dall'uomo tramite altre tecniche che non sono incluse nella definizione data dalla
normaHvadiriferimento(incrociemutagenesiindo3aconradiazioniionizzanHomutageni
chimici).
Gli OGM vengono spesso indicaH come organismi transgenici: i due termini non sono
sinonimiinquantoilterminetransgenesisiriferisceall'inserimento,nelgenomadiundato
organismo,digeniprovenienHdaunorganismodispeciediversa.SonoinvecedefiniHOGM
anchequegliorganismicherisultanodamodificazionichenonprevedonol'inserimentodi
alcungene(es.sonoOGManchegliorganismidalcuigenomasonostaHtolHdeigeni),così
come gli organismi in cui il materiale geneHco inserito proviene da un organismo
"donatore"dellastessaspecie(cisgenici).
In Europa l'uHlizzo di OGM è so3oposto a regole molto rigorose e procedure di
autorizzazionecomplesseperlalorocolHvazioneecommercializzazione.Daaprile2015,i
paesipossonodecidereseconsenHrelacolHvazionediOGMsulloroterritorio.Tu3avia,per
quanto riguarda la commercializzazione, il Parlamento europeo ha votato contro i divieH
nazionali.
All'interno dell'Unione europea, ad oggi, sono solo 2 gli OGM che hanno o3enuto
l'approvazioneperlacolHvazioneinEuropa:
1. Mais Transgenico della Monsanto 810, approvato nel 1998 (colHvato in Spagna,
Portogallo,Slovacchia,RepubblicaCeca,RomaniaePolonia).
2.PatataAmflora,dellaBASF,approvatonelmarzodel2010(colHvatainGermaniaeSvezia)
maa3ualmentelaproduzionenonèpiùautorizzata.
Il mais MON810 è una varietà di mais modificata affinché produca una tossina Bt che
funzionadapesHcidaperproteggerelapiantacontroleinfestazionidipiralide(unparassita
fitofago del mais). La patata Amflora è il tubero transgenico distribuito e venduto in
EuropadallamulHnazionaleBASFnonperscopialimentarimaperl’industriacarHeradatoil
suoaltocontenutodiamilopecHnanell’amido.
Perquantoriguardal'importazionedapaesiterzi,esistono58OGMa3ualmenteautorizzaH
nell'Unione europea per il consumo di alimenH e mangimi. Comprendono mais, cotone,
soia,colza,barbabietoladazucchero.
Altrisonoina3esadiautorizzazione(vedilink).
(h3p://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm)
La maggior parte degli OGM autorizzaH nell'UE sono desHnaH ai mangimi per gli animali
d'allevamentomaalcunialimenHimportaHpossonocontenernealtri.
IlsistemadieHche3aturaalimentaredell'UEimponealleaziendediindicareseglialimenH
oimangimicheproduconocontengonoOGM(quandolapresenzaèaldisopradi0,9%del
prodo3o.
!10
InItalia,nonviècolHvazionecommercialediOGM.Sonopermessicampisperimentali,ma
soloconappositaautorizzazione.
MetodidiindagineperlaricercadiOGM
• Analisi delle proteine modificate mediante tecniche basate su saggi immunologici per
riconoscimentoanHgene–anHcorpo:ELISAoWesternBlot
•AnalisidelDNAmodificato:mediantePolymeraseChainReacHon(PCR)perilrilevamento
qualitaHvoequanHtaHvo
MetodologieanaliHcheperilrilevamentodiOGM
Analisidelleproteine
AnalisidelDNA
TipoELISA
PCReRealTimePCR(°)
• Facileesecuzione,conpossibilitàdiautomazione
• Elevatasensibilitàespecificità
• Rapidi,effe3uabilianchesucampoTESTSTRIP
• ApplicabileadalimenHfiniH
• Pococostosi,disponibilikitcommerciali
• QuanHtaHvi
• QuanHtaHvi
• Costosi
• Sensibilitànonelevata
• Richiedonostru3uredilaboratorioadeguate
• Sononecessarieproteinenondenaturate
AiseguenHsiHsipuòtrovarel’elencocompletodegliOGMautorizzaHdallaUnioneEuropea
conicara3eriinseriHeirelaHviscopietu3elerispe5vemetodologieanaliHche
h3p://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm
h3p://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp
4.Tecnicheu4lizzatenell’aHvitàdilaboratorio
EstrazionedelDNA
Per estrarre il DNA dai nuclei delle cellule vegetali si devono prima rompere (lisare) le pareH
cellulari(ricordarechelecellulevegetali,adifferenzadellecelluleanimali,possiedonounaparete),
le membrane plasmaHche e le membrane nucleari; ciò viene effe3uato ponendo il campione in
una soluzione omogeneizzante - lisante contenente un detergente che facilita la ro3ura delle
membrane cellulari e nucleari al fine di liberare il DNA nella frazione solubile ed uHlizzando un
omogeneizzatore.
In taluni casi, per esempio se il campione è rappresentato da semi secchi, è richiesta un'azione
meccanicapreliminarecomelatriturazioneperridurrelamatricedipartenzainpiccoleparH.
PoichéilDNAèassociatoalleproteineistoniche(vedipar.1.3),l'aggiuntadisalecomeilclorurodi
sodio (NaCl) alla soluzione, facilita la separazione del DNA dalle proteine. Dopo centrifugazione,
nel supernatante saranno presenH DNA, RNA, proteine, polisaccaridi e lipidi. L'aggiunta di
proteinasi e di ribonucleasi facilita la digesHone delle proteine (istoniche e non istoniche) e
dell'RNA.
!11
BisognaoraeseguirelaprecipitazionedelDNAdallasoluzione:essaavvienepermezzodell'etanolo
ghiacciato. Il DNA è insolubile in etanolo ghiacciato, perciò aggiungendolo alla soluzione il DNA
precipitaso3oformadifilamenHgelaHnosibianchi.
LasoluzioneverràpoicentrifugataeilprecipitatodiDNA,risospesoinacquadisHllatasterileoin
unaopportunasoluzionetampone,saràprontoperlesuccessivedeterminazioni.
PCR(PolymeraseChainReac4on)
Si tra3a di una tecnica innovaHva che consiste nell’amplificazione specifica di segmenH di DNA
mediantereazioniacatenadellaDNApolimerasi(Fig.6).
Ilprincipioèmoltosemplice.DataunasequenzadiDNAadoppiofilamentoeduecortesequenze
oligonucleoHdiche (primer), di cui una complementare ad un tra3o di filamento a una estremità
delDNAdaamplificare(forwardprimer)el’altracomplementareadunaltrotra3opostoall’altra
estremità (reverse primer), in
presenza di una DNA polimerasi
termostabile e di una miscela di
desossinucleoHdi trifosfaH in
appropriate condizioni di reazione,
è possibile copiare numerosissime
volte il tra3o compreso tra i due
primers, semplicemente facendo
variareciclicamentelatemperatura
direazione.
Infa5, raggiunta la temperatura di
denaturazione (circa 95°C), la
doppia elica si apre (fase di
d e n a t u r a z i o n e ) , r e n d e n d o Fig. 6. Schema del processo di amplificazione di un frammento di DNA tramite PCR.
disponibile lo stampo per una
eventuale sintesi delle catene
complementari. Quando la temperatura si abbassa, in virtù delle loro minori dimensioni e della
loro concentrazione, i primer si legheranno (fase di appaiamento o annealing) al DNA stampo
primachesirinaturie,inpresenzadiunaDNApolimerasiconunopHmumditemperaturaelevato
(circa 72°C), inizierà la sintesi di DNA a parHre dai primer (fase di sintesi del DNA o extension),
procedendolungoifilamenHsingoli.
Al termine del primo ciclo di PCR da una doppia elica di DNA se ne o3engono due. Ripetendo il
ciclo"denaturazione–annealing–extension"numerosevolte(ingenereda20a30),sio5eneuna
massiccia amplificazione specifica di un dato tra3o di DNA che può quindi essere analizzato e
studiatoinde3aglio.IlmetododianalisidelDNAmediantePCRpresentavantaggimoltoevidenH:
♦èmoltorapido(da60a90minuH),
♦lamanualitàèsemplicissima,
♦èautomaHzzato,
♦irisultaHsonovisualizzabiliconfacilitàmedianteele3roforesidelDNA
ImportanHambiHdiuHlizzodellaPCRsonoladiagnosiprenataledimala5egeneHcheeleindagini
dimedicinalegale(siacivilechepenale).
Termociclatori
IlsuccessodellaPCRèdovutoingranparteallapossibilitàdifaravvenirel’interoprocessoinmodo
automaHco all’interno di strumenH de5 termociclatori (thermal cyclers), in grado di variare
ciclicamente la temperatura tra le varie fasi di ogni ciclo di PCR. Il costo di un thermal cycler si
aggirasui10.000euro.
!12
Fig.7Termociclatore
Unesempiodiprofilodiamplificazionestandardimpostatomedianteuntermociclatore(Fig.7)èil
seguente:
1.
denaturazionedelDNA:30seca94°C
2.
appaiamento(annealing)deiprimers:30seca50°-60°C 30-35cicli
3.
sintesi(extension)diDNA:30sec-5minuHa72°C
Taqpolimerasi
Il successo della PCR è stato possibile grazie anche all’uso di una DNA polimerasi termostabile
estra3a da baUeri termofili (che vivono ad elevate temperature). Una DNA polimerasi uHlizzata
nellereazionidellaPCRèlaTaqpolimerasi,estra3adalba3erioThermusaqua>cus.L’isolamento
diDNApolimerasitermostabilihasollevatoglioperatoridall’ingratocompitodiaggiungereenzima
frescoadogniciclodireazione!
Sceltadeiprimer
PerogniPCR,ènecessariousaredueprimer(forwardereverse)
La scelta della coppia di primer è criHca per una buona riuscita della PCR, ovvero per o3enere
l’amplificazionediuntra3odiDNAinmodospecifico.
I primer devono essere “disegnaH” a livello di sequenze uniche nel genoma (presenH una sola
volta),inmodochepossanoappaiarsialDNAsolonellazonadiinteresseenoninaltrezone.
EleUroforesisugeldiagarosio
E’ una tecnica che consente di separare in base alle loro
dimensioni (peso molecolare) molecole dotate di carica,
facendolemigraresuungelinpresenzadiuncampoele3rico.Il
gel può essere immaginato come una rete tridimensionale
a3raverso le cui maglie migrano le molecole so3o l’azione di un
campoele3rico.Ilcampoele3ricoègeneratodaunapparecchio,
de3oalimentatore(Fig8).
Per separare molecole di DNA si usano gel di agarosio. Le
molecole di DNA sono cariche negaHvamente per la presenza di Fig. 8. Cella elettroforetica e alimentatore.
gruppifosfatoemigranodalpolonegaHvoversoilpoloposiHvo.
Peruncertointervallodipesimolecolari,lavelocitàdimigrazioneè
funzione del loro peso molecolare: tanto più grande è la molecola di DNA, tanto minore è la
velocità di migrazione, tanto più piccola è la molecola di DNA, tanto più velocemente migra. Le
!13
molecole di DNA di diversa lunghezza vengono pertanto separate in base alla diversa velocità di
migrazione.
Per poter determinare la lunghezza delle molecole di DNA in esame separate mediante
ele3roforesi,viene“caricato”sulgelancheilcosidde3omarcatoredipesomolecolare,ossiauna
miscela di frammenH di DNA di cui è noto il peso molecolare. Confrontando la posizione dei
frammenH a peso molecolare noto con quella dei frammenH di DNA in esame, è possibile
calcolarneilpesomolecolare,ossialalunghezza.
Dato che il peso molecolare di un frammento di DNA è proporzionale al numero di coppie di
nucleoHdi(basi)chelocosHtuiscono,disolitoessovieneespressoinpaiadibasi(bp).
La separazione ele3roforeHca dura circa 1 ora. Al termine, i vari frammenH di DNA, essendo
incolori,possonoesserevisualizzaH,immergendoilgelinuncolorante.IlDNAdellediverseclassi
dipesomolecolareèvisibileso3oformadibandedisHnte:sonolecosidde3ebandediDNA.
Per poter visualizzare il DNA, durante la preparazione del gel, all’agarosio si aggiunge l’EuroSafe,
unasostanzachehalaproprietàdilegarsialDNAedieme3erefluorescenzaseespostaaluceUV.
Allafinedellacorsa,lebandesivisualizzanoesponendoilgelallaluceultraviole3a(Fig.9).
Fig. 9. Osservazione del gel alla luce ultravioletta.
5.Iden4ficazionediunOGM
Impostazionedelproblema
Ilmais(Zeamais,de3oanchegranoturco)OGMcolHvato,èstatotrasformatoperfaresìchesia
resistenteagliinse5nocivi,tolleranteaglierbicidi,oconentrambelemodificazioni.
5.1ResistenzaagliinseH
Laresistenzaèo3enutafacendoprodurreallapiantaunaproteinatossicapergliinse5prodo3a
dal Bacillus thuringiensis, un ba3erio del terreno uHlizzato anche in agricoltura biologica come
inse5cidanaturale.Questomicrorganismopossiedeungene(Bt)checodificaperlaproteinaCry,
cheèingradodilegarsisele5vamenteaspecificirece3orilocalizzaHnell'epiteliointesHnaledelle
larve di alcune specie d’inse5. Il legame della proteina con i rece3ori provoca la distruzione
dell'epiteliointesHnaleediconseguenzalamortediquesHinse5.
EsistonodiversiHpidiproteineCryprodo3edadifferenHso3ospeciediBacillusthuringiensische
esibiscono un’elevata specificità di azione nei confronH di diversi Hpi d’inse5. I mammiferi, non
avendoirece3oriperleproteineCry,sonoresistenHallasuaazionetossica.
Perconferireadunaspecievegetaleilcara3erediresistenzaneiconfronHdiunparHcolareHpodi
inse3oèsufficienteintrodurrenelsuogenomailgenechecodificaperlatossinaCryspecificaper
quell'inse3o. In tal modo la pianta sarà in grado di produrre la proteina Cry che esplica la sua
azionebioinse5cidaquandol'inse3odannosoa3accalapianta,cibandosideisuoitessuH.
!14
IlmaisBtsembrapresentarevantaggiancheriguardoaunaltroproblemadegliagronomi.Nelmais
sono spesso presenH tossine (aflatossine) dovute all’infezione da parte di muffe. Le aflatossine
hannotossicitàacutaecronicaea5vitàcancerogenasuanimalieuomo.
Adesempio,lapiralideèuninse3olecuilarvescavanogallerienellostoccoenellaspigadelmais
trasportandosporefungine,chegeneranoleinfezionisopracitate.
UHlizzare mais geneHcamente modificato resistente alla piralide potrebbe risolvere questo
problema.
Fig.10.ComelaproteinaCryagiscenellelarvedellapiralide
5.2Tolleranzaaglierbicidi
Diversi sono gli erbicidi uHlizzaH in natura per comba3ere le erbe infestanH. Il glifosato è il
principioa5vopresenteinalcunidiessi.
!15
Incondizioninormali,organismivegetali,ba3eriefunghiproduconounenzimanotocomeEPSPS
(5-enolpiruvil-shikimate-3-fosfato-sintetasi)cheagiscenellabiosintesidegliamminoacidiaromaHci
comefenilalanina,Hrosinaetriptofano.
Questo enzima è prodo3o nei ba3eri e nelle piante, mentre è assente negli animali. Il glifosato
agiscedainibitorecompeHHvodell'enzimaEPSPS.Avendounageometriamolecolaresimilealsuo
substrato (il fosfoenolpiruvato), il glifosato compete col substrato naturale per il legame al sito
a5vodell’enzima.
La tolleranza al glifosato è
o3enuta inserendo nella
WT plant
GMO plant
pianta un transgene che
codifica per una variante
EPSPS*
dell’enzimacheèpocoinibita
EPSPS*
EPSPS
dal glifosato stesso. Questa
P
PE
P
PE
EPSPS*
variante di EPSPS è o3enuta
EPSPS
EPSPS
d a u n c e p p o d i A .
P
PE
tumefaciens resistente al
EPSPS
glifosato.
EPSPS
EPSPS*
EPSPS
ph
gly
ph
gly
gly
ph
ph
gly
ph
gly
ph
gly
ph
ph
gly
ph
gly
gly
ph
gly
ph
gly
EP
P
La pianta geneHcamente
m o d i fi c a t a s o p r a v v i v e
EPSPS
EPSPS
EPSPS*
all’erbicida poiché l’a5vità
dell’enzima EPSPS di A.
P
PE
tumefaciens è sufficiente a
rimpiazzarequelladell’EPSPS
EPSPS*: transgene
P
natural substrate: phosphoenolpyruvate
from A. tumefaciens
PE
EPSPS*
endogeno, che è inibito
d a l l ’e r b i c i d a . L e e r b e
herbicide: glyphosate
infestanH, che non sono
Fig.12.Nellepiantewildtype(WT),ilglifosatocompetecolsubstrato
trasformate, muoiono a
naturale(PEP)perillegameall’enzimaEPSPS.NellepianteOGM,ilprodo3o
c a u s a d e l l ’ a z i o n e
deltransgeneEPSPS*nonlegailglifosatoeperme3elasopravvivenzadella
dell’erbicida.
pianta,anchesetra3ataconl’erbicidaglifosato.
Ciò comporta un doppio
vantaggio:sialapossibilitàdi
uHlizzare tra3amenH che discriminano tra piante uHli (geneHcamente modificate) ed erbe
infestanH, sia una riduzione dell’uso di erbicidi con conseguente riduzione dei cosH e d’impa3o
ambientale.
ph
P
PE
gly
ph
ph
gly
gly
ph
P
PE
ph
gly
gly
ph
ph
gly
gly
h
ph
p
gly
gly
ph
gly
ph
gly
5.3IlcostruUousatopertrasformarelapiante
Il transgene è stato inserito nel ve3ore di clonaggio (vedi paragrafo 1.6) in una casse3a di
espressionegenica.Amontedelgenesitrovailpromotorecheregolaillivellodiespressionedel
geneeavalleunterminatore,chefungedasegnaledistopperl’RNApolimerasiedeterminala
finedellatrascrizione(Figura13).
IgenipiùcomunementeinseriHnellacasse3adiespressionediunapiantaOGMsono:
- PromotoreCAMV35S:promotoredelgeneperl’RNA35Sdelvirusamosaicodelcavolfiore,che
ècosHtuHvoedeterminaelevaHlivellidiespressionedelgenechelosegue.
- GeneEPSPS:diAgrobacteriumtumefaciensCP4,codificaperla5-enolpiruvilshikimato3fosfatosintasi,rendelapiantatolleranteall’erbicidaglifosato.
- GeneCTP2-epsps:geneEPSPSacuièstatoaggiuntoilpepHdesegnaledelgeneEPSPSdi
Arabidopsisthalianausatoperveicolarloalcloroplasto(CTP:Chloroplast-TranspepHde-signal
sequence).
!16
GenenptII:codificaperlaneomicinafosfotransferasi,conferisceresistenzaaglianHbioHci
aminoglicosidici,comelakanamicinaelaneomicina.
Genepat:codificaperlafosfinotricinaaceHl-trasferasiderivantedalloStreptomyces
viridochromogenes,cheinduceaceHlazioneedina5vazionedell’erbicidaglufosinate.
GeneCry:produceunaproteinapresadalBacillusthuringiensis,cheformaporinell’intesHno
dellalarva.
TerminatoreNOS:Terminatoreo3enutodalgenedellanopalinasintetasidiAgrobacterium
tumefaciens.
linkpertrovareinfosemenH:
h3p://www.gmo-compass.org/eng/gmo/db/
5.4Protocollosperimentale
5.4.1EleUroforesisugeldiagarosio:soluzioniereagen4
tampone
TBE
(Tris-Borato-EDTA) 1x. Questo tampone si prepara facendo una diluizione 1:10
•
dellasoluzione“madre”TBE10x,lacuicomposizioneè:
Tris108g(0,89M)
acidoborico55g(0,89M)
EDTA7.5g(0,02M)pH8,3
H2Oa1litro
IlpH8,3vieneraggiuntoautomaHcamente.
•DNAprodo5conlaPCR,giàpronH
•marcatoredipesomolecolare(DNAdelplasmidepUC8tagliatoconl’enzimadirestrizioneHaeIII)
•agarosioinpolvere(0.6g)
•H2OdisHllata
•Eurosafe
• loadingdye6x,giàprontoineppendorfecontenente:
bludibromofenolo0.25%
xilenecianolo0.25%
glicerolo30%
5.4.2Preparazionedelgeldiagarosio
Notadilaboratorio:laconcentrazionediagarosiodelgelvienesceltadalricercatoreinbasealle
dimensioni dei frammenH di DNA da separare. Nel nostro caso, dovendo separare frammenH
linearidiDNAcompresitra100e2.000bpsiuHlizzaungeldiagarosioal2%.
!17
Normedilavoro:
❑perchihaicapellilunghi:legarsiicapelliconunelasHco
❑primadicominciarealavorare,lavarsilemani
❑ prima di cominciare l’esperimento, lo studente verrà familiarizzato con la strumentazione che
dovràuHlizzaare,inmodoparHcolareconlemicropipe3e
Operazionidasvolgereperlapreparazionedelgeldiagarosio:
❑prelevare30mlditamponeTBE1xeme3erlonellabeutacontenentel’agarosio
❑A3enzioneanonsprecareagarosio:costa600euroalchilo!
❑pesarelabeutacontenentelasoluzionediagarosioesegnareilpesosulprotocollo:_______
❑leggereaEentementela“Notadisicurezzasullau>lizzazionedelfornoamicroonde”
❑scioglierel’agarosionelfornoamicroondeimpostatosullapotenzadi500Vper1minuto.Aprire
poi il forno a microonde, agitare delicatamente la soluzione con una presina, facendo
a3enzione a non sco3arsi. Richiudere il forno a microonde e sciogliere la soluzione per un
ulterioreminutoallastessapotenza
❑ pesare la soluzione di agarosio (l’acqua del tampone, bollendo, è evaporata!) e riportare la
soluzionediagarosioalpesooriginale,uHlizzandounaspruzze3aconH2OdisHllata.A3enzione:
far cadere l’acqua delicatamente, facendola scivolare lungo i bordi della beuta, altrimenH si
formanodellebolle
❑prepararelavasche3aperele3roforesiconbordidi“nastroadesivodicarta”
❑aspe3are3-5minuH,coprendolabeutacontenentelasoluzionediagarosioconunpezze3odi
stagnola, per evitare l’evaporazione. L’agarosio deve raggiungere una temperatura intorno ai
60°C, altrimenH rovina il supporto di plasHca della vasche3a dell’ele3roforesi. Me3ere 1 μl di
EuroSafe e agitare la beuta dolcemente. Quindi versare la soluzione di agarosio, evitando di
formarebolle,nellavasche3aperele3roforesidoveègiàstatoinseritoilpe5ne.Ipozze5si
formanoquando,unavoltasolidificatoilgel,vienetoltoilpe5ne
❑lasciaresolidificareatemperaturaambientepercirca15min.Quandoilgelèsolidificatodiventa
opaco
❑mentresiaspe3alasolidificazionedelgel,faredelleprovedicaricamentodeipozze5delgel
(12μldiloadingdye1x)sualtrigelgiàpronH
❑togliereilnastrodicartadallavasche3aeposizionarlanellacameradicorsa
❑versareiltamponeTBE1xnellacameradicorsa(servonocirca200ml),evitandochesiformino
bolle.Sesiformanobolle,toglierledelicatamenteconunpuntale
❑ togliere lentamente il pe5ne, tenendosi perpendicolare rispe3o al gel. I pozze5 che si sono
formaHnelgelhannounvolumedicirca15μl
5.4.3CorsaeleUrofore4ca
Operazionidasvolgereperlacorsaele6rofore8ca:
❑ aggiungere 2 µl di loading dye 10x a ciascuna prove3a contenente il DNA (o3enuto per
amplificazione con la PCR). Risospendere con la micropipe3a, evitando di formare bolle. Il
glicerolopresentenelloadingdyeserveperrenderepiùdensalasoluzionediDNAdacaricare
nelpozze3oequindiafacilitarnel’entratanelpozze3o
❑sesiformanobolle,centrifugarebrevemente(1sec)inunamicrocentrifugaeppendorf(ingergo
dilaboratorio,sidice“spinnare”daspin,centrifugare)
❑leggereaEentementela“Notadisicurezzasullau>lizzazionedellacentrifuga”
❑ posizionare la vasche3a per l’ele3roforesi su un foglio nero, perchè sia più facile individuare i
pozze5
!18
❑ nel primo pozze3o a sinistra, caricare lentamente il marker di DNA a peso molecolare noto;
caricarepoiicampioni(12µl)da1a6,neipozze5successivi(ognipozze3ohaunvolumedi15
µl), ponendosi con la punta della micropipe3a in un angolo del pozze3o e perpendicolare
rispe3o al gel, facendo a3enzione a non bucare il fondo del pozze3o e a non far uscrie il
campionefuoridalpozze3o
❑chiudereilcoperchiodellacellaele3roforeHca
❑leggereaEentementela“Notadisicurezzasullau>lizzazionedell’apparatopereleEroforesi”
❑collegareimorse5allacameradicorsaeaipolidelgeneratoredicorrente,de3oanchepower
supply;ilDNAècariconegaHvamenteemigraversoilpoloposiHvo
❑ fissare il voltaggio al valore costante di 100 V e lasciare procedere la corsa ele3roforeHca per
circa50min
❑ osservare la migrazione del loading dye per valutare la migrazione del DNA, che, essendo
incolore,nonsipuòvedere.Ilbludibromofenolomigraallastessavelocitàdiunframmentodi
DNA a doppia elica di circa 300 bp, mentre lo xilene cianolo migra alla stessa velocità di un
frammentodicirca4.000bp.A3enzione:lacorsaele3roforeHcadeveesserefermataquandoil
bludibromofenolositrovaacirca1-2cmdallafinedelgel,inmododaevitarecheilDNAesca
dalgelstesso.Sedovessesuccedere,siperdonoicampionidiDNA!
Operazionidasvolgereallafinedella corsaele6rofore8ca.Questaoperazionevienesvoltadal
tutor:
❑alterminedellacorsa,osservareilgelaltransilluminatore
❑ documentare il risultato del gel, facendo una foto al gel (ricordarsi di portare una macchina
fotograficadigitale!)
5.4.4InterpretazionedelrisultatodellacorsaeleUrofore4ca
PM: marcatore di peso molecolare
corsia 1: DNA di mais non OGM (controllo negativo, contiene solo il gene della tubulina)
corsia 2: DNA di mais OGM (controllo positivo con gene Bt e gene EPSPS)
corsie 3: campionamenti
corsia 8: bianco di PCR (costituito dalle stesse soluzioni e dagli stessi tamponi utilizzati, ma che
non contiene DNA del campione. Serve per dimostrare l'assenza di DNA contaminante durante
tutte le fasi di lavoro)
campioni
OGM-
OGM+
bianco
Tubulina
EPSPS
BT
!19
SEME
BT
Maize(GA21)MON-ØØØ21-9
[Syngenta]
EPSPS
feno4po
mepsps
Tolleranzaaerbicidaglifosato
Maize(MON810)MON-ØØ81Ø-6 cry1A(b)
[Monsanto]
Maize(NK603xMON810)
MON-ØØ6Ø3-6xMON-ØØ81Ø-6
[Monsanto]
cry1Ab
Resistenzaalepido3eriinfestanH
cp4epsps
Resistenzaalepido3eriinfestanH
Tolleranzaaerbicidaglifosato
TabelladellesemenHrealmenteincommercio
6.Normegeneralidisicurezzainlaboratorio
Qui di seguito sono elencate alcune norme elementari di sicurezza, che devono essere
tassaHvamenterispe3ate.
❖
❖
❖
❖
❖
❖
❖
❖
❖
❖
❖
❖
Entrandoinlaboratorio,individuareleviedifuga,indicatedallasegnaleHcaverde.
In laboratorio indossare sempre il camice. Il camice deve essere chiuso sul davanH, con
manichelungheepolsiniadelasHco.Alterminedellea5vità,primadilasciareillaboratorio,
togliersi il camice. In ogni caso, non uscire dal laboratorio, per recarsi in altre aree
(biblioteca,uffici,bar,ecc.),senzaaverprimatoltoilcamice.
Nonintrodurreinlaboratorioborse,zainioaltromaterialenonnecessario.
Indossare guanH monouso durante la manipolazione di sangue o di materiale da esso
derivatononfissato.IguanHdevonoessererimossicona3enzioneesosHtuiHquandosono
visibilmente contaminaH. I guanH si sfilano rovesciandoli e vanno ge3aH negli apposiH
contenitori.
Gli studenH che presentano dermaHH o altre lesioni sulle mani, devono indossare guanH
prote5viintu3elefasidilavoro.
I guanH vanno tolH, quando si usino strumenH di qualsiasi natura (telefono, tasHera,
strumenHscienHfici,maniglie,ecc.).IguanHusaHnonvannoriuHlizzaH.
Lavare le mani rouHnariamente, immediatamente dopo la manipolazione di materiali
contaminaH e, in ogni caso, dopo la fine delle a5vità, anche quando sono staH indossaH i
guanH.Lavaresemprelemaniprimadilasciareillaboratorio.
In laboratorio è vietato mangiare, bere, fumare, portare ogge5 alla bocca ed applicare
cosmeHci.
Nonpipe3aremaiconlabocca,mauHlizzareleappositepropipe3e.
NonappoggiarerecipienHcontenenHliquidibiologicivicinoalbordodelbancodilavoro.
Tu3o il materiale biologico d'origine umana (sangue, ecc.) deve essere considerato come
potenzialmenteinfe3oepertantotra3atoconlenecessarieprecauzioni.
Segnalare immediatamente al personale docente ogni spargimento di materiale biologico
(ades.schizzidisangue)sulpianodilavoro,affinchésiprovvedaalladecontaminazionecon
ungermicidachimicoappropriato(candeggina,ecc.).
!20
❖
❖
❖
❖
❖
❖
Decontaminareepuliresempre,alterminedellorouHlizzo,leapparecchiaturescienHfiche
e,alterminedellaa5vità,ipianidilavoro.
Seguirescrupolosamenteleindicazionidisicurezzariportateneiprotocollidiesperimento.
Raccoglieretu5iliquidibiologici(sangue,terrenidicolturavenuHaconta3oconlecellule,
cellule,ecc.)inspecialicontenitoriperrifiuH,cheverrannosuccessivamenteeliminaHprevio
tra3amentoconcandegginaal15%.
Me3ere il materiale disposable (pipe3e, fiasche ecc.) venuto a conta3o con materiale
biologicoinunsaccoapposito,cheverràsmalHtomedianteincenerimento.
StanteicosHelevaHdellosmalHmento,ridurreilpiùpossibilel’usodelmaterialedisposable.
Segnalare immediatamente al personale docente qualsiasi incidente o la mancanza di
materialediprotezione
U4lizzodelfornoamicroonde
• nonaccendereilfornoseèvuoto
• nonuHlizzareilfornoconmaterialiinfiammabili
• non uHlizzare il forno con recipienH sigillaH (potrebbero esplodere): svitare i tappi delle
bo5glie,rimuovereicoperchi
• nonuHlizzareilfornoconogge5metalliciometallizzaH:(es.bo5gliecopertedistagnola)e
concartad’argento
• nonriempireeccessivamenteirecipienH:illiquidobollendo,potrebbetraboccare
• proporzionarelapotenzaeiltempodiriscaldamentoalcontenutoinacquadiquantoviene
riscaldato.InparHcolare,nelcasodisoluzioniacquose,illiquidopotrebbesurriscaldarsioltre
il punto di ebollizione, senza che appaiano bollicine. Ciò può portare al traboccamento
improvviso di liquido bollente. Per prevenire questo pericolo, mescolare il liquido prima di
scaldarloelasciarloriposareperqualcheminutoprimaditogliereilrecipientedalforno
• uHlizzareiguanHimbo5HpertogliereirecipienHdalforno
• dopol’usopulireilfornoconcartaspruzzatacondetersivopervetri
• incasodiincendiodelcontenutodelforno,tenerechiusalaporta,spegnereilforno,staccare
laspinadallapresadicorrentelasciandocheilfuocosiesHnguapersoffocamento
U4lizzodellacentrifuga
• chiudere accuratamente il tappo delle prove3e, per evitare la fuoriuscita di liquido e la
formazionediaerosol
• assicurarsi che il rotore sia bilanciato: prove3e di ugual peso devono essere inserite negli
alloggiamenHdiametralmenteopposH
• chiudereilcoperchiodellacentrifugaprimadiavviarla
• noncercarediaprireilcoperchioprimadelcompletoarrestodelrotore
• incasodifuoriuscitadiliquidodalleprove3e,avverHreilpersonaledocente
U4lizzodell’apparecchiaturapereleUroforesi
• assicurarsichel’alimentatoresiaspento,primadicollegareimorse5
• assicurarsicheilcoperchiodellavasche3asiacorre3amenteposizionato,primadicollegarei
morse5
• alla fine della corsa, prima di rimuovere il coperchio della cella ele3roforeHca, spegnere
l’alimentatoreestaccareimorse5
!21
7.Quizdiautovalutazione
1. Completailbrano,scegliendotraiseguen>termini:
soma>che,diploidi,aploidi,poliploidi,germinali,embrione,spora,sessuali,mitosi,meiosi,game>,
cellulauovo,spermatozoo,zigote,aneuploidi,fecondazione
Nella maggior parte degli esseri vivenH, uomo compreso, le cellule del corpo, ossia le
cellule…………, hanno un corredo cromosomico doppio e perciò sono de3e cellule…………..
Mediante il processo di………………, alcune cellule cellule, de3e………….danno origine a cellule
riprodu5ve o ……………… Queste cellule si chiamano……………. e …………………, rispe5vamente nel
maschio e nella femmina. Queste cellule si fondono durante il processo della ………….. e danno
origineallaprimacelluladelnuovoorganismo,de3a………….
2. IlDNAdell’uomoèdiversodaindividuoaindividuo,ecce3ochenelcasodi:
A.
maritoemoglie
B.
fratelloesorella
C.
genitoriefigli
D.
gemellidizigoHci
E.
gemellimonozigoHci
3. QuestodisegnorappresentaunnucleoHde.
DefiniscileparHA,BeC:
A…………………………….
B……………………………
C…………………………….
5
4. LedueemielichediunamolecoladiDNAsonoanHparallele.Questaaffermazionesignifica
che:
A.
unaemielicahaladirezione5’P3’OHel’altra3’OH5’P
B.
i legami chimici che tengono uniH i nucleoHdi in ciascuna emielica sono
diversi
C.
ledueemielichesonocomplementari
D.
unasoladelledueemielichevienetrascri3a
E.
lareplicazionedelDNAèsemiconservaHva
5. Indicareilcorre3oordinedecrescentedidimensioni:
A.gene,cromosoma,nucleoHde,codone
B.cromosoma,gene,codone,nucleoHde
C.nucleoHde,cromosoma,gene,codone
D.cromosoma,nucleoHde,gene,codone
E.gene,cromosoma,codone,nucleoHde
6. Gliistonisono:
A. tra5diDNAspecificiperl’a3accodellapolimerasi
B. proteinebasicheuHlizzatecomemarcatorinell’ele3roforesi
C. proteinebasichecoinvoltenellaspiralizzazionedelDNAneicromosomi
D. sequenzediDNAcodificanteparHcolariproteine
!22
E. sequenzeripetutediDNA,chedeterminanopolimorfismoallelico
7.LadenaturazionedelDNAconsistenelladistruzione:
A.
deilegamitranucleoHdiadiacenH
B.
deilegamitrazuccherooebaseazotatadeinucleoHdi
C.
dellastru3uraadoppiaelica
D.
dellasequenzanucleoHdicadelladoppiaelica
E.
nessunadelleprecedenH
8. InunorganismocheproducegameHcontenenH32cromosomi,ilnumerodeicromosomi
contenuHinunacellulasomaHcaè:
A. 16
B. 32
C. 4
D. 64
E. 8
9. Almicroscopioo5coèpossibileosservare:
A.
virus
B.
ribosomi
C.
proteine
D.
ba3eri
E.
molecoleinorganiche
10. DefiniteiseguenHtermini:
gene……………………………………………………………………………………
locus……………………………………………………………………………………
11. InquestodiagrammadelprocessodireplicazionedelDNA,iquadraHninericontrassegnaH
daDedEsono:
A.RNAiniziatore(primer)
B.DNAfilamentostampo(templatestrand)
C.frammenHdiOkazaki
D.DNApolimerasi
E.filamentodiDNAdinuovasintesi
12.LareplicazionedelDNA:(IdenHficarel’affermazionesbagliata)
A. ècatalizzatadall’enzimaDNApolimerasi
B. avvieneinmodosimileintu3elecelluleditu5gliorganismi
!23
C. richiedel’interventodinumerosienzimi
D. necessitadellapresenzadiuninnescoaRNA
E. avvienemedianteaggiuntadinucleoHdiindirezione3'→5'
13.LareplicazionesemiconservaHvadelDNAassicurachesianoprodo3e:
A.
due molecole idenHche di DNA, ognuna formata da una emielica già
esistenteedaunaemielicaneo-formata
B. moltemolecolediRNA,dellequalisoloalcunematuranoaRNAmessaggeri
C. qua3romolecolediDNA,dellequalisoloduevengonoconservate
D. dueemielicheidenHchediDNA,ognunacomplementarealDNAstampo
E. unasolaemielicadiDNA,copiandounosolodeiduefilamenHstampodiDNA
14.UnamolecoladiDNAèformatadaunfilamentocheinuncertotra3oècosHtuitodalla
seguentesequenzanucleoHdica:
5’ATCCATTGTGTCAATT3’
Scriviquelladelfilamentocomplementare,indicandonelapolarità.
15.
LaTaqpolimerasiè:
A. unenzimacheintervienenellareplicazionedelDNA
B. unenzimaestra3odaunba3eriotermofilo,usatonellereazionidellaPCR
C. ilcolorantecheperme3edivisualizzarelebandediDNAnell’ele3roforesi
D. l’enzimachefavoriscel’annealingdeiprimerneitermociclatori
E. unmarcatoredipesomolecolareusatonell’ele3roforesi
16.
Glienzimidirestrizione:
A. separanoladoppiaelicadiDNAneiduesingolifilamenH
B. copianounaporzioneristre3adiDNA
C. introduconogeniestraneinelDNA
D. taglianoilDNAalivellodisequenzenucleoHdichespecifiche
E. eliminanotra5diDNA
17.
Quale delle seguenH affermazioni riguardo all’ele3roforesi del DNA su gel di
agarosioècorre3a?
A. l’ele3roforesisugelseparalesingolebasiazotatedelDNA
B. nelcorsodell’ele3roforesisugeliframmenHdiDNAmigranoversol’ele3rodo
posiHvoacausadellalorocaricanegaHva
C. iframmenHpiùgrandidiDNAcopriranno,nellostessotempo,distanzemaggiori
nelgelrispe3oaiframmenHpiùpiccoli
D. questatecnicaèusataperamplificareilDNA
E. éunatecnicacheperme3editagliareilDNAinframmenH
18.
Effe3uandol’ele3roforesidelDNAspiegate:
a-qualecaricaassumeilDNAeacosaèdovuta
b-ilversodimigrazione
19.
L’acronimoPCRstaper:
……………………………………
!24
20.
La tecnica della PCR consiste di vari cicli di amplificazione della sequenza
“bersaglio”diDNA.Ogniciclodiamplificazione,asuavolta,ècosHtuitodatrefasi.Indicare
quali.
fase1:_______________________
fase2:________________________
fase3:_________________________
21.
IprimeruHlizzaHnellaPCR:
A. sonosequenzeripetutediDNA
B. sonooligonucleoHdiritagliaHdaglienzimidirestrizione
C. peressereuHlizzabilidevonoesserepresenHmoltevoltenelfilamentodiDNA
D. sono corte sequenze nucleotodiche arHficiali complementari al DNA da
amplificare
E. cosHtuiscono i marcatori di peso molecolare usaH come riferimento
nell’ele3roforesi
22. ImarkersdipesomolecolareusaHnell’ele3roforesiperindividuarelalunghezzadei
frammenHdiDNAsonomisceledi:
A. molecole proteiche, a peso molecolare noto, che vengono fa3e migrare nella
cellaele3roforeHcainsiemeaicampionidaanalizzare
B.molecolediDNA,apesomolecolarenoto,chevengonofa3emigrarenellacella
ele3roforeHcainsiemeaicampionidaanalizzare
C. varie molecole di DNA e proteine, a peso molecolare noto, che vengono fa3e
migrarenellacellaele3roforeHcainsiemeaicampionidaanalizzare
D.isotopiradioa5viusaHpermarcareiframmenHdiDNAdaanalizzare
E. coloranH a peso molecolare noto che vengono fa3e migrare nella cella
ele3roforeHcainsiemeaicampionidaanalizzare
23.LatecnicadellaPCR:(IdenHficarel’affermazionesbagliata)
A.necessitadielevatequanHtàdiDNAperpoterneeffe3uarel’amplificazione
B.consentediamplificareunaregionespecificadelgenoma
C.sibasasull’uHlizzodidueprimer
D.ècosHtuitadavariciclidiamplificazione
E.uHlizzaunaDNApolimerasitermostabile
24.UnadelleapplicazionidellatecnicadellaPCRè:
A.idenHficazionedegliOGM
B.idenHficazionedellapresenzadiunaproteinanelsangue
C.separarazionedimolecolediDNAadestremitànote
D.determinazionedellacomposizioneinbasidiunamolecoladiDNA
E. taglio di un ve3ore plasmidico per la successiva clonazione di un frammento di
DNA
25.Unorganismoincuièstatoinseritoungeneestraneoède3o:
A.mutante
B.transgenico
C.traslocato
D.poliploide
E.procarioHco
!25
26.Ive3oridiclonaggio:(idenHficarel’affermazionesbagliata)
A.nonpossonoreplicareilproprioDNAautonomamentedallacellulaospite
B.contengonounoopiùmarcatoridiselezione
C.contengonosiHdirestrizioneperl’inserimentodiDNAesogeno
D.veicolanoilframmentodiDNAinessiinserito
E.devonoesserepresenHall’internodiunacellulaospiteperpotersipropagare
27.Qualeèladefinizionecorre3adeltermine“tecnologiadelDNAricombinante”:
A. metodidiuHlizzazionespecificadicellulemodificate
B. inserimentodiungeneinuncromosoma
C. introduzionediungeneinunacellula
D. modificazionegeneHcadiunuovofecondatoodiungamete
E.inserimentoedespressionedigeniestraneineiba3erioinaltriorganismi
28.NellatecnologiadelDNAricombinante,iltermineveEoresiriferiscea:
A. l'enzimadirestrizionechetagliailDNAinframmenH
B. l'estremitàdiunframmentodiDNAgeneratadaunenzimadirestrizione
C. unamolecoladiDNAusatapertrasferireDNAesogenoinunacellulaospite
D. unorganismoounacellulageneHcamentemodificato
E. unprimeruHlizzatonellatecnicadellaPCR
29.Unve3orediclonaggioplasmidicoè:(idenHficarel’affermazionesbagliata)
A. conHeneunapropriaoriginedireplicazione
B. conHeneungeneperlaresistenzaadunanHbioHco
C. siintegranelcromosomaba3ericoricombinandosialivellodelsitodiclonazione
D. èunamolecoladiDNAincuièpossibileinserire,alivellodelsitodiclonazione,
unamolecoladiDNAesogena
E. èunamolecoladiDNAcircolareconsiHperenzimidirestrizioneconosciuH
30.RiempireglispazivuoH:
A. LasiglaOGMstaper…..
B. LepianteGMsonopianteincui,conletecnologiedelDNAricombinante,sono
staHintrodo5unoopiù………….provenienHdaaltriorganismivivenH
C. LamaggiorpartedellepianteGMa3ualmentecolHvatesonostatemodificateal
finedirenderle………..
31.AnalizzoirisultaHdiunacorsaele3roforeHcanellaqualesonostaHcaricaH5pozze5nel
seguente modo: 1=marcatore di PM, 2=campione, 3=controllo posiHvo, 4=controllo
negaHvo,5=bianco.PossodirecheilDNAdelcampioneconHenematerialegeneHcamente
modificatose:
A. ilcampionepresentaunabandadiPMdiversodaquelladelcontrolloposiHvo
B. ilcampione,ilcontrolloposiHvoeilbiancomostranounabandadellostessoPM
C. ilcampione,ilcontrolloposiHvoeilcontrollonegaHvomostranolabandadiPM
a3eso
D. ilcampioneeilcontrolloposiHvomostranolabandadiPMa3eso
E. SoloilcontrolloposiHvopresentalabandadiPMa3eso
32.ElencaalmenoduemoHvipercuivengonoprodo3epianteGM.
33.PerprodurrepianteGMinlaboratorioènecessario:(idenHficarel’affermazionesbagliata)
!26
A.
B.
C.
D.
selezionareungeneuHle
selezionarelepiantechehannoinseritoilgene
propagarelapiantaGM
incrociare piante “selvaHche” selezionate per o3enere nuove varietà nella
progenie
E. uHlizzareunve3oreba3ericoperinserireilgene“nuovo”nellecellulevegetali
34.Nellareazioneacatenadellapolimerasi(PCR),ilprimerhalafunzionedi:
A.innescoacuisia3accalaDNA-polimerasiperiniziarelapolimerizzazionedelDNA
B.indicareilprimonucleoHdedelDNA
C.provocarelasuddivisionedelDNA
D.a5vareilDNA
E.a5vareinucleoHdi
35.LaPCRvieneuHlizzataper:
A. o3enererapidamenteungrannumerodicopiediunsegmentospecificodiDNA
B. frammentareilDNA
C. duplicanrel’interocorredocromosomico
D. produrre in poco tempo una nuova colonia di cellule a parHre da una cellula
clonata
E. o3enereungrannumerodienzimidallamedesimacopiadiDNA
36.NellaPCRilprimopassaggiodiognicicloèladenaturazioneadaltatemperaturadelDNAstampo.Ladenaturazioneènecessariaper:
A.a5varelaDNApolimerasi
B.separareiduefilamenHdelladoppiuaelicadelDNA
C.perme3ereaideossiribonucleosiditrifosfaH(dNTP)diaccederealDNA-stampo
D.volgereilDNAperconsenHreallasintesidiprocedere
E. svolgere il DNA per consenHre ai filamenH complementari di riappaiarsi
corre3amente
37.NeitermociclatorisiusaunapDNApolimerasitermostabileperché:
A. èingradodifunzionareaqualsiasitemperatura
B. unisceifilamenHdiDNAadaltatemperatura
C. denaturailDNA
D. generanuovienzimi
E. nonperdelapropriaa5vitàquandoso3opostaasuccessiviciclididenaturazione
38. Quale delle seguenH affermazioni riguardo l’ele3roforesi del DNA su gel di agarosio è
corre3a?(Piùdiunarispostapuòesserecorre3a)
A. l’ele3roforesisugelseparalesingolebasiazotatedelDNA
B. nel corso dell’ele3roforesi su gel i frammenH di DNA migrano verso l’ele3rodo
posiHvoacausadellalorocaricanegaHva
C. iframmenHpiùgrandidiDNAcopriranno,nellostessotempo,distanzemaggiori
nelgelrispe3oaiframmenHpiùpiccoli
D. i frammenH più grandi di DNA copriranno, nello stesso tempo, distanze minori
nelgelrispe3oaiframmenHpiùpiccoli
E. èunatecnicacheperme3ediseparareilDNAdalleproteine
!27
39.Completarelaseguentefrase:
“Dal momento che il DNA ha carica _________ esso migra verso il polo ________ in
unacellaele3roforeHca”
A.posiHva,posiHvo
B. posiHva,negaHvo
C. negaHva,posiHvo
D.negaHva,negaHvo
E. neutra,neutro
40. Comesifaadeterminareseunapiantaètransgenica?(Piùdiunarispostapuòessere
corre3a)
A. si determina la sequenza nucleoHdica di tu3o il DNA della pianta e la si
confrontaconquelladiunapiantasicuramenteselvaHca(ossianontransgenica)
B. siamplificaunasequenzadiDNAspecificadelcloroplasto
C. siricercailprodo3oderivantedall'espressionedelgeneesogenoinserito
D. siusalatecnicadellaPCR
E. siguardal’eHche3asulprodo3o
41.UnapiantageneHcamentemodificatasiproduce:
A. trasferendoilnucleodaunacellulaadun’altra
B. inserendonuovigeniinunacellulavegetalemedianteunopportunove3ore
C. trasferendogenidaunacellulavegetaleadun’altra
D. incrociandotraloropianteappartenenHaspeciediverse
E. ilgenomadellapiantadamodificareinunplasmide
42.Peruncorre3ocampionamento,icampionivengonoselezionaHprelevando:
A. un campione a caso nella matrice, indipendentemente dalla quanHta’ di
materialedaesaminare
B. molH campioni uniformemente distribuiH nella matrice, e scegliendone uno a
caso
C. molH campioni uniformemente distribuiH nella matrice, mescolandoli ed
estraendoneuncampione
D. molH campioni adiacenH nella matrice, mescolandoli ed estraendone un
campione
E.molHcampioniuniformementedistribuiHnellamatrice,eanalizzandolitu5
43.LametodicadanoiuHlizzataperl’idenHficazionediunOGMcomprendeleseguenHfasi.
Indicarequaleèl’ordinecorre3o.
A. preparazione del campione, estrazione del DNA, amplificazione del DNA,
ele3roforesidelDNAamplificato,valutazionedeirisultaH
B. preparazionedelcampione,estrazionedelDNA,ele3roforesidelDNAestra3o,
PCR,valutazionedeirisultaH
C. preparazione del campione, estrazione della proteina, PCR, ele3roforesi del
DNAricavatodallaproteinaestra3a,valutazionedeirisultaH
D. preparazionedelcampione,PCR,ele3roforesidelDNAamplificato,valutazione
deirisultaH
E. preparazionedelcampione,PCR,estrazionedelDNAdalmaterialeamplificato
mediantePCR,ele3roforesidelDNA,valutazionedirisultaH
!28
44. Per essere cerH che una pianta è geneHcamente modificata si può ricercare: (più di una
rispostapuòesserecorre3a
A. nel suo fenoHpo la manifestazione di un cara3ere non Hpico della specie di
appartenenza
B. nelsuoDNAlapresenzadelgenecherendel’organismoingradodiesprimereun
cara3erenonHpicodellaspeciediappartenenza
C. nelsuoDNAungenepresentenelcloroplastooungenespecie–specifico
D. nelsuofenoHpolamancatamanifestazionediuncara3erefavorevoleHpicodella
speciediappartenenza
E. ilprodo3oderivantedall’espressionedelgeneinserito
45.Unorganismotransgenicoèunorganismo:(Indicarel’affermazionesbagliata)
A. incuisonostaHintrodo5genidialtraspecie
B. chehaacquisitonuovecara3erisHcheinseguitoall’inserimentodiuntransgene
C. creatoinlaboratorio
D. generatodallafusionedidueorganismi
E. incuisonostaHintrodo5geniestranei
Risposte
1.Nellamaggiorpartedegliesseriviven>,uomocompreso,lecelluledelcorpo,ossialecellulesoma8che,hanno
uncorredocromosomicodoppioeperciòsonodeEecellulediploidi.Medianteilprocessodimeiosi,alcunecellule
cellule,deEegerminalidannoorigineacelluleriproduOveogame8.Questecellulesichiamanospermatozooe
cellula uovo, rispeOvamente nel maschio e nella femmina. Queste cellule si fondono durante il processo della
fecondazioneedannoorigineallaprimacelluladelnuovoorganismo,deEazigote.
2. E
3. A.(baseazotata);B.(ribosioodesossiribosio);C.(gruppofosfato)
4. A
5. B
6. C
7. C
8. D
9. D
10.gene:unitàfunzionalediereditàchecorrispondeaunsegmentodiDNAchecodificaperunaproteinalocus:
posizionefissasuuncromosomaoccupatadaundatogeneodaunsuoallele
11. A
12. E
13. A
14. 3’TAGGTAACACAGTTAA5’
15. B
16. D
17. B
18. a-IlDNAassumecaricanegaHvaperlapresenzadigruppifosfato
b-dalpolonegaHvoalpoloposiHvo
19. PolymeraseChainReacHon
20. Fase1:denaturazionedelDNA;fase2:appaiamento(annealing)deiprimer;fase3:sintesi(extension)diDNA
21. D
22. B
23. A
24. A
25. B
26. A
!29
27. E
28. C
29. C
30. OrganismoGeneHcamenteModificato;Geni;resistenHaipesHcidi,oaidiserbanH
31. D
32. resistenzaaipesHcidi,resistenzaaidiserbanH,vaccini,valorenutrizionale
33. D
34.A
35.A
36.B
37.E
38.BeD
39.C
40.CeD
41.B
42.C
43.A
44.AeBeE
45.D
8.Glossario
Agarosio
sostanza organica estratta da alcune alghe rosse e usata come gelificante
Allele
una delle possibili forme alternative che un gene, localizzato in uno
specifico sito cromosomico, può assumere
Annealing (appaiamento)
formazione di molecole ibride di acidi nucleici basata sulla
complementarietà delle basi
Aploide
cellula o organismo con una sola copia di ciascun cromosoma dell’assetto
(n)
Basi azotate
molecole costituenti il filamento del DNA insieme allo zucchero
deossiribosio e al gruppo fosfato. Sono quattro e si classificano in basi
puriniche (A e G) e pirimidiniche (T e C)
Batteri
Biotecnologie
Campionamento
microorganismi unicellulari procariotici
utilizzo integrato della biochimica, della microbiologia e dell'ingegneria
genetica, per produrre, a partire da organismi viventi (batteri, lieviti, cellule
vegetali o animali di organismi semplici e complessi), quantità
commerciali di prodotti utili, allo scopo di migliorare le caratteristiche di
piante e animali, di sviluppare microrganismi utili per usi specifici o,
ancora, di sviluppare nuovi strumenti terapeutici nell’uomo e nell’animale.
estrarre campioni da una massa di un prodotto
Cellula
unità elementare di un organismo pluricellulare ed essa stessa, come unità
singola, un organismo elementare
Cellula germinale
cellula aploide (n) deputata alla riproduzione (cellula uovo e spermatozoo).
!30
Cellula somatica
cellula diploide (2n) destinata alla formazione del corpo (in greco “soma”)
di un organismo e contrapposta a quella della linea germinale, deputata alla
riproduzione.
Clonaggio
ottenimento di infinite copie di un gene, mediante la sua introduzione in un
vettore capace di replicare all’interno di un organismo ospite.
Cloroplasto
organello cellulare che si trova esclusivamente nelle cellule vegetali e in
alcuni protisti, deputato alla fotosintesi
Cromosoma
struttura generalmente allungata, costituita da cromatina, visibile al
microscopio ottico durante la divisione cellulare e contenente i geni in
successione lineare.
Cromosomi omologhi
coppie di cromosomi di forma generalmente simile, che contengono
informazioni per gli stessi caratteri. Portano gli stessi geni, non
necessariamente gli stessi alleli. Si appaiano alla meiosi.
Denaturazione
perdita della configurazione originale di una macromolecola, dovuta ad es.
all’aumento di temperatura, a cambiamenti estremi di pH, a trattamenti
chimici o altro; generalmente è accompagnata da una perdita dell’attività
biologica. Nel caso del DNA, la denaturazione consiste nella separazione
dei due filamenti della doppia elica, per rottura dei legami a idrogeno tra le
basi azotate
Diploide
cellula o organismo avente due copie di ciascun cromosoma dell’assetto
(2n)
DNA
abbreviazione di acido deossiribonucleico, macromolecola che costituisce
il materiale genetico di tutti gli organismi (ad eccezione di alcuni virus). E’
costituito da due catene polinucleotidiche avvolte a doppia elica.
DNA polimerasi
enzima che sintetizza DNA unendo insieme nucleotidi e usando un singolo
filamento di DNA come stampo.
DNA ricombinante
DNA costruito artificialmente unendo insieme segmenti nucleotidici
provenienti da fonti diverse.
Elettroforesi
tecnica che consente di separare molecole caricate elettricamente, mediante
la migrazione in un campo elettrico
Enzima
proteina che catalizza (accelera) una specifica reazione chimica di una via
metabolica in un sistema vivente. Ha azione specifica, in quanto riconosce
il substrato su cui agire.
Enzimi di restrizione
chiamati anche endonucleasi di restrizione o “forbici” molecolari : sono
enzimi che tagliano il DNA a doppia elica (e non quello a singolo
filamento!) in corrispondenza di specifiche sequenze nucleotidiche, dette
siti di restrizione.
Fenotipo
Insieme delle caratteristiche visibili in un organismo che risultano
dall’interazione tra genotipo e ambiente
Gemelli dizigotici
gemelli derivati dalla fertilizzazione indipendente di due cellule uovo
maturate contemporaneamente. La loro diversità genetica è equivalente a
quella di due fratelli non gemelli
Gemelli monozigotici
Gene
gemelli derivati da una singola cellula uovo, identici geneticamente
unità funzionale di eredità che corrisponde di solito al segmento di DNA
che codifica una proteina
!31
Genoma
patrimonio genetico di una cellula o di un organismo.
Genotipo
costituzione genetica di un organismo
Istoni
Locus (pl. loci)
proteine basiche ricche in arginina e lisina che partecipano alla formazione
del nucleosoma nei cromosomi eucariotici
posizione fissa su un cromosoma occupata da un dato gene. Nel
linguaggio comune il termine viene spesso usato come sinonimo di
gene.
Mutazione
cambiamento del patrimonio genetico ereditabile, raro, improvviso e
casuale; può verificarsi spontaneamente oppure essere indotto da agenti
chimici o fisici.
Nucleotide
unità base del DNA e dell'RNA, formato da gruppo fosfato, zucchero e
base azotata
Oligonucleotide
corta molecola di DNA (o RNA) a singolo filamento, costituita da poche
decine di basi, ottenuta artificialmente e utilizzata in esperimenti di
ibridazione molecolare e nella PCR.
Organismo Geneticamente
Modificato (OGM)
organismo il cui materiale genetico è stato modificato introducendo nuovo
DNA o modificandone il genoma
PCR (polymerase chain
reaction)
tecnica di biologia molecolare utilizzata per amplificare in breve tempo
segmenti specifici di DNA
Plasmide
piccola molecola di DNA extracromosomico dei procarioti che si replica
autonomamente e ha la capacità di trasferirsi da una cellula all’altra previa
duplicazione
Polimorfismo
esistenza di forme diverse. Può essere riferito a: alleli (polimorfismo
allelico), proteine (polimorfismo proteico), DNA (polimorfismo del DNA).
Polinucleotide
molecola costituita da più nucleotidi uniti da legami fosfodiesterici
Primer (innesco)
oligonucleotide di DNA o RNA al quale vengono aggiunti nuovi nucleotidi
nel corso della sintesi di DNA
Transgene
gene esogeno introdotto, con le tecniche dell'ingegneria genetica, nel
genoma di un organismo in modo da fargli acquisire caratteristiche nuove
Trasformazione
processo attraverso il quale può essere trasferita informazione genetica da
una cellula all'altra
Vettore
in biotecnologia, un agente capace di trasferire informazione genetica da
un organismo all’altro
Supervisionedi:Prof.ssaM.L.Tenchini,DiparHmentodiBiologiaeGeneHcaperleScienzeMediche,Universitàdegli
StudidiMilano.
Acuradi:
•
Prof.ssaGiovannaViale,DiparHmentodiBiologiaeGeneHcaperleScienzeMediche,UniversitàdegliStudidi
Milano;
•
Prof.ssaFlaviaBerton,LiceoVico,Corsico
•
Prof.ssaSimonaCadirola,LiceoClassicoBerchet,Milano
•
Prof.ssaTizianaCalciolari,LiceoScienHficoEinstein,Milano
•
Prof.ssaM.TeresaOliveira,IPSIAFiocchi,Lecco
•
Prof.GiovanniPavone,IPSIAFiocchi,Lecco
•
Prof.ssaMarinaPorta,LiceoBanfi,Vimercate
!32